JPH06172214A - 麻疹ウイルス核蛋白質の抗原性を有する蛋白質の製造 法及び抗麻疹ウイルス核蛋白質抗体の検出試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 麻疹ウイルス核蛋白質の抗原性を有する蛋白
質、及び該蛋白質を抗原とする麻疹診断試薬を提供す
る。 【構成】 亜急性硬化性全脳炎ウイルス(subacute scle
rosing panencephalitisvirus) 構造遺伝子領域の核蛋
白質をコ−ドするｃＤＮＡ断片を挿入した組換えバキュ
ロウイルスを昆虫細胞(Spodoptera frugiperda) に感染
させ、該核蛋白質を該昆虫細胞内に発現させ、該核蛋白
質を採取することを特徴とする麻疹ウイルス核蛋白質の
抗原性を有する蛋白質の製造法、及びこの蛋白質を抗原
とする抗麻疹ウイルス核蛋白質抗体検出試薬。 【効果】 抗麻疹ウイルス核蛋白質抗体に対して強い抗
原性を有する蛋白質、及び該蛋白質を担体に感作させた
試薬が得られ、この試薬は、熟練技術者を必要とするこ
となく、少量の検体で麻疹感染の有無、及びワクチン接
種時期とその効果の判定を簡便、迅速に行うことができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、麻疹ウイルス感染の診
断に有効な麻疹ウイルス核蛋白質の抗原性を有する蛋白
質の製造法、及び該蛋白質を抗原とする抗麻疹ウイルス
核蛋白質抗体検出試薬に関するものであり、更に詳しく
は、本発明は、亜急性硬化性全脳炎ウイルス（subacute
sclerosing panencephalitis virus 、以下ＳＳＰＥウ
イルスと記載することがある）構造遺伝子領域の核蛋白
質をコードするｃＤＮＡ断片を挿入した組換えバキュロ
ウイルスを昆虫細胞(Spodoptera frugiperda) に感染さ
せ、該核蛋白質を該昆虫細胞内に発現させ、該核蛋白質
を採取することを特徴とする麻疹ウイルス核蛋白質の抗
原性を有する蛋白質の製造法、及び該蛋白質を抗原とす
る抗麻疹ウイルス核蛋白質抗体検出試薬に関するもので
ある。

【０００２】本明細書及び添付図面において、次の記号
が次に記載する意味で用いられる。 ＡｃＮＰＶ： 夜盗蛾核多角体病ウイルス (Autograp
ha californica NuclearPolyhedorosis Virus) ＳＳＰＥ： 亜急性硬化性全脳炎(Subacute Sclero
sing Panencephalitis) ＭＶ： 麻疹ウイルス (Measles Virus) ＮＰ： 核蛋白質 (Nuclear Protein) Ｓｆ ｃｅｌｌ：昆虫(Spodoptera frugiperda) 細胞 また、本明細書において「亜急性硬化性全脳炎ウイルス
又は麻疹ウイルスの核蛋白質」は、該ウイルス粒子中の
核酸（ＲＮＡ）に結合している「蛋白質」自体を意味
し、核酸と蛋白質との複合体を意味するものではない。

【０００３】

【従来の技術】麻疹は、牛疫ウイルス、犬ジステンパー
ウイルス等と同じパラミクソウイルス科モルビリウイル
ス属に属する麻疹ウイルスによって惹起されるヒトの伝
染病の一つである。麻疹は、伝染力が非常に強く、１０
〜１２日の潜伏期の後、発熱、鼻汁、咳、発疹等の症状
を呈し、中耳炎、肺炎、脳炎、血小板減少性紫斑病、Ｓ
ＳＰＥ、等を併発する場合がある。

【０００４】最近、わが国を含めた世界各国で麻疹の発
生が報告され、患者数は、約７０００万人にも達するも
のと推定されている。現在、麻疹は、熱帯的気候の多く
の国々において小児の死亡の主要な原因の一つとなって
いるので、麻疹は、全世界の重大な感染症であり、その
予防及び早期診断は世界的な重要課題となっている。

【０００５】麻疹ウイルスは、パラミクソウイルス科モ
ルビリウイルス属に分類されるマイナス鎖ＲＮＡウイル
スであり、６種類の蛋白質から構成され、その中でも核
蛋白質の占める割合が最も大きく、かつ抗原性の変異が
少なく、ウイルス株間で高い交差反応性を示すことが知
られている。

【０００６】近年、該ウイルスの実験室株の一つである
エドモンストン株のＮＰをコードする遺伝子の全塩基配
列が明らかにされ［第７回インターナショナル・コング
レス・オブ・ウイロロジー(VII International Congres
s of Virology), 第 193ページ，1987年］、麻疹ウイル
スの変異株の一つと推測されているＳＳＰＥウイルス山
形１株のＮＰをコードする遺伝子の全塩基配列も解明さ
れた［ウイルス・ジーンズ(Virus Genes) , 第 4巻, 第
2号, 第 137ページ, 1990年］。これらの報告によれ
ば、麻疹ウイルスエドモンストン株とＳＳＰＥウイルス
山形１株のＮＰをコードする遺伝子の相同性は９７．４
％であり、ＳＳＰＥウイルスのＮＰを用いた抗麻疹ウイ
ルスＮＰ抗体検出の可能性が推測された。

【０００７】一方、麻疹の診断方法としては、感染者の
組織及び体液からのウイルス粒子の確認（国立予防衛生
研究所学友会編，「ウイルス実験学各論」，第 357ペー
ジ，丸善，1964年）が知られている。この方法は、検体
中のウイルス力価の高い感染初期に検体を採取して直ち
に検査を行うことが必要であるが、ウイルスを分離同定
できる施設が限定され、分離効率も低く、検体の保存及
び運搬が必要となり、特殊な機器及び技術を要し、しか
も、結果の判定に長時間を要すること等から、正確な検
査が実施できない不都合があり、この傾向は、特に発展
途上国において顕著である。

【０００８】更に、麻疹を血清学的に診断する方法とし
ては、従来から、ウイルス中和試験法、赤血球凝集抑制
試験法、補体結合試験法、蛍光抗体試験法（国立予防衛
生研究所学友会編，ウイルス実験学各論，第 352ペー
ジ, 丸善, 1964年）等が知られている。

【０００９】ウイルス中和試験法は、被検血清を力価が
既知の麻疹ウイルス液と反応させて中和し、麻疹ウイル
スに感受性を有するＶｅｒｏ細胞（アフリカミドリザル
由来株化細胞）又はＢ９５ａ細胞（マーモセット由来株
化細胞）と反応させ、細胞変性効果及びプラーク形成等
を観察して中和の程度を試験する。赤血球凝集抑制試験
は、麻疹ウイルスに感染したＶｅｒｏ又はＢ９５ａ細胞
を抗原として用い、公知の方法により検体中の抗麻疹ウ
イルス抗体との反応性を試験する。補体結合試験は、既
知の麻疹ウイルス抗原を用いて、これに反応できる補体
結合性の抗体を検出する。蛍光抗体法は、検体中の抗原
性物質を、蛍光標識した抗体と結合させて蛍光顕微鏡下
で検出する。

【００１０】これらの方法は、いずれも操作が標準化さ
れておらず煩雑で熟練を要すること、結果判定に長時間
を要すること、感度及び特異性が低いこと、特別な機器
を必要とすること等から、実用性に乏しい欠点があっ
た。

【００１１】一方、麻疹ウイルスに対する抗体を感度良
く測定する方法として、酵素免疫測定法［ブリティッシ
ュ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・パソロジ
ー（British Journal of Experimental Pathology ），
第57巻, 第 243ページ, 1976年］が知られている。しか
し、抗原として麻疹ウイルスに感染した培養細胞又は培
養細胞から精製したウイルス粒子を用いているために、
細胞当たりに占める抗原蛋白質の割合が少なかったり、
抗原の調製に多くの労力を必要としたり、検出感度、測
定精度、再現性、非特異反応及び試薬の安定性等の面に
問題が生じる場合もあり、更に優れた抗体価測定方法、
又は測定試薬が待望されていた。

【００１２】従来の麻疹診断方法には前記のような欠点
があるので、特に麻疹の発生が深刻な問題となっている
諸国においては、麻疹の正確な診断ができず、流行の防
止が非常に困難であった。また、ワクチン接種における
接種時期の決定及び接種後の抗体獲得調査の目的にも、
簡易で迅速に診断可能な試薬の開発が望まれている。そ
のためには、抗麻疹ウイルス抗体に対して抗原性を有す
る物質を効率よく製造する必要があった。

【００１３】前記目的を達成する一つの方法として、バ
キュロウイルスＡｃＮＰＶ ＤＮＡの多角体蛋白質構造
遺伝子部分を、有用物質である蛋白質の構造遺伝子に組
換えた組換えウイルスの、Ｓｆ細胞中における増殖方法
及び選択された遺伝子の発現方法が、提案されている
（特開昭60-37988号公報、以下先願と記載する）。

【００１４】しかしながら、該先願には前記のＳＳＰＥ
ウイルスを構成する蛋白質であるＳＳＰＥ−ＮＰの発現
方法に対して前記の方法を適用することに関しては、何
ら具体的な記載がなされていない。即ち、前記の方法に
よってＳＳＰＥ−ＮＰを発現させるには、ＳＳＰＥ−Ｎ
Ｐの構造遺伝子のいかなる部分によってＡｃＮＰＶＤＮ
Ａの多角体蛋白質構造遺伝子を組換えるか、それにより
ＳＳＰＥ−ＮＰの産生が可能であるか、更には、蛋白質
が得られた場合、これがＭＶ−ＮＰとしての抗原性を有
するか、そして検体中の抗ＭＶ−ＮＰ抗体に対して反応
性を有するか、あるいは従来の試験方法と相関性を有し
ているか否か等、不明な点が多々あり、更に多くの研究
が必要であった。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】このような従来技術の
実状に鑑みて、本発明の課題は、麻疹を迅速、かつ正確
に診断するために、麻疹ウイルス核蛋白質の抗原性を有
する分子量約６０キロダルトンの蛋白質を製造する方
法、及び該蛋白質を抗原とする麻疹診断試薬を提供する
ことにある。

【００１６】本発明は、麻疹ウイルスに対する抗体（以
下麻疹ウイルス抗体と記載することがある）測定に使用
し、測定精度、検出感度、再現性に優れた麻疹診断試薬
を提供することにある。

【００１７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するために抗麻疹ウイルス核蛋白質抗体に対して
抗原性を有する蛋白質の有効な製造方法、及び該蛋白質
を抗原として用いる診断試薬を開発すべく鋭意研究を重
ねた。その結果、ＡｃＮＰＶの多角体遺伝子をＳＳＰＥ
−ＮＰ遺伝子によって組換えた組換えウイルスをＳｆ細
胞内で増殖させることにより、本来のＳＳＰＥ−ＮＰに
極めて類似する分子量約６０キロダルトンの蛋白質が産
生されること、及び該蛋白質を抗原としたとき、抗麻疹
ウイルス核蛋白質抗体と特異的に反応することを見いだ
し、本発明を完成した。

【００１８】前記課題を解決する本発明の第１の発明
は、亜急性硬化性全脳炎ウイルス(subacute sclerosing
panencephalitis virus) 構造遺伝子領域の核蛋白質を
コードするｃＤＮＡ断片を挿入した組換えバキュロウイ
ルスを昆虫細胞(Spodoptera frugiperda) に感染させ、
該核蛋白質を該昆虫細胞内に発現させ、該核蛋白質を採
取することを特徴とする麻疹ウイルス核蛋白質の抗原性
を有する蛋白質の製造法、である。

【００１９】前記課題を解決する本発明の第２の発明
は、亜急性硬化性全脳炎ウイルス(subacute sclerosing
panencephalitis virus) 構造遺伝子領域の核蛋白質を
コードするｃＤＮＡ断片を挿入した組換えバキュロウイ
ルスを昆虫細胞(Spodoptera frugiperda) に感染させて
該核蛋白質を該昆虫細胞内に発現させて得られた麻疹ウ
イルス核蛋白質の抗原性を有する蛋白質を、抗原とする
抗麻疹ウイルス核蛋白質抗体検出試薬、である。

【００２０】更に、本発明においては、亜急性硬化性全
脳炎ウイルス構造遺伝子領域の核蛋白質をコードするｃ
ＤＮＡ断片が、遺伝子の翻訳開始コドンの５´側上流の
非翻訳領域の１２塩基を含むＤＮＡ断片であることを、
望ましい態様としてもいる。

【００２１】次に本発明について詳述する。本発明にお
いて、ＳＳＰＥ−ＮＰの発現に必要な組換えウイルスの
製造方法は、公知の方法に準じて行われるものであり、
以下に代表的な製造方法を例示するが、以下の方法に限
定されるものではない。

【００２２】先ず、公知の方法によりＳＳＰＥウイルス
（例えば、山形１株）から、ＳＳＰＥ−ＮＰをコードす
る遺伝子ＲＮＡに相補的なＤＮＡを調製し、そのＤＮＡ
の翻訳開始コドンの５´側上流の非翻訳領域の１２塩基
を含むＤＮＡ断片を調製し、得られたＤＮＡ断片を、公
知のバキュロウイルス転移ベクター（ｐＡｃＹＭ１ベク
ター）〔ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー
(Journal of GeneralVirology) , 第68巻, 第1233ペー
ジ, 1987年］のクローニング部位に挿入し、組換えベク
ターを作出する。

【００２３】次に、得られた組換えベクターを用いてＳ
ＳＰＥ−ＮＰの構造遺伝子領域に相当するＤＮＡ断片を
ＡｃＮＰＶの多角体蛋白質構造遺伝子の一部と組換える
ことにより組換えウイルスＡｃＳＳＰＥＮＰＶ１を作出
する。得られた組換えウイルスをＳｆ９細胞に感染さ
せ、該細胞中において組換えられた外来遺伝子を発現さ
せて抗ＭＶ−ＮＰ抗体に対して抗原性を有する分子量約
６０キロダルトンの蛋白質を産生させ、この蛋白質を公
知の方法により採取する。産生させた蛋白質を担体に感
作させ、抗麻疹ウイルス抗体検出試薬を得ることができ
る。

【００２４】前記本発明を図２及び図３に基づいて詳述
すれば次のとおりである。図２は、ｐＡｃＹＭ１の制限
酵素地図であり、ｐＡｃＹＭ１は、約９２００塩基であ
り、内部にアンピシリン耐性遺伝子を有し、クローニン
グサイトとしてＢａｍＨＩ及びＳｍａＩサイトが存在す
る。図３は、本発明の組換えウイルスの作出方法の概略
図であり、図中（ａ）は、ＳＳＰＥウイルス山形１株蛋
白質をコードする遺伝子の全配列を含むクローンＡ２
５、（ｂ）は、クローンＡ２５の５´側非翻訳領域の１
２塩基を含む断片、（ｃ）は、トランスファーベクター
ｐＡｃＹＭ１、（ｄ）は、ｐＡｃＹＭ１にｃＤＮＡ断片
（ｂ）を挿入した組換えトランスファーベクターｐＡｃ
ＹＭ１−ＳＳＰＥ−ＮＰ、をそれぞれ示す。

【００２５】１）ＡｃＮＰＶ 本発明において用いられるＡｃＮＰＶは、バキュロウイ
ルス発現系において一般的に用いられている市販ウイル
スであり、例えば、インビトロジェン社から容易に入手
し得る。また、ＡｃＮＰＶに感染したＳｆ細胞培養液よ
り公知の方法により単離することもできる。

【００２６】２）ＳＳＰＥ−ＮＰをコードするＤＮＡ ＳＳＰＥウイルスは、パラミクソウイルス科モルビリウ
イルス属に属するＲＮＡ（−）鎖ウイルスであり、その
ウイルス粒子の構成蛋白質のＳＳＰＥ−ＮＰをコードす
る遺伝子の塩基配列は、本発明の発明者の一人である駒
瀬等により発表されている［ウイルス・ジーンズ(Virus
Genes) ，第 4巻, 第 2号, 第 137ページ, 1990年］。
ＳＳＰＥ−ＮＰをコードするＤＮＡは、公知の方法によ
って取得でき、例えば、山形１株から次の方法により取
得することもできるが、次の方法に限定されるものでは
ない。

【００２７】ＭＶに感染したＶｅｒｏ細胞の懸濁液を超
遠心分離し、得られた上清をオリゴ（ｄＴ）セルロース
を用いたカラムクロマトグラフィーにより処理して、ポ
リアデニル酸（ｄＡ）を有するｍＲＮＡを回収する。回
収されたｍＲＮＡからオカヤマ・バーグ法でｃＤＮＡラ
イブラリーを作製する［モレキュラー・アンド・セルラ
ー・バイオロジー(Molecular and Cellular Biology)，
第 3巻, 第 280ページ, 1983年］。

【００２８】得られたｃＤＮＡライブラリーからＳＳＰ
Ｅ−ＮＰに相当するｃＤＮＡをコロニーハイブリダイゼ
ーション法によって選択し、ＳＳＰＥ−ＮＰをコードす
るＤＮＡクローンＡ２５［図３の（ａ）］を得る［ウイ
ロロジー(Virology)，第 160巻, 第48ページ, 1987
年］。得られたクローンＡ２５が約１．７Ｋｂであるこ
と、及びリン酸カルシウム法によりＣｏｓ７細胞中にお
いてＳＳＰＥ−ＮＰが産生されることを、抗原認識部位
の異なる６種類のモノクローナル抗体を用いた間接蛍光
抗体法で確認することによって、該ｃＤＮＡがＳＳＰＥ
−ＮＰをコードする遺伝子（ＲＮＡ）に相補的な完全な
ＤＮＡ配列を有することが確認できる。

【００２９】３）ｃＤＮＡからのＤＮＡ断片の切り出し クローンＡ２５を制限酵素ＸｈｏＩで処理し、翻訳開始
コドンの５´側上流の非翻訳領域の１２塩基を含むＳＳ
ＰＥ−ＮＰをコードするＤＮＡの断片［図３の（ｂ）］
を得る。

【００３０】４）ｐＡｃＹＭ１ ＡｃＮＰＶのゲノムＤＮＡは１３０Ｋｂもあり、そのプ
ロモーターの下流に発現を目的とする遺伝子（例えば、
上記ＤＮＡ断片）を直接挿入することが不可能である。
従って、本発明においては転移ベクター、ｐＡｃＹＭ１
［図２、図３の（ｃ）］を用いる。

【００３１】転移ベクタ−ｐＡｃＹＭ１は、多角体遺伝
子を含むＡｃＮＰＶゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断し
たＤＮＡ断片を、アンピシリン耐性を有するプラスミド
ｐＵＣ８にクローニングした後、プロモーター下流のリ
ーダー配列の全てと、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）のＡま
でを残し、多角体蛋白質をコードする全配列を除去した
ものである（図２）。ｐＡｃＹＭ１の発現量に関する考
察は、本発明者の一人である松浦等により行われてお
り、ｐＡｃＹＭ１は、松浦等の方法により作出すること
ができる［ジャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジ
ー(Journal of General Virology) ，第68巻，第1233ペ
ージ，1987年］。

【００３２】５）ｐＡｃＹＭ１へのＤＮＡの挿入、及び
確認 ｐＡｃＹＭ１のクローニング部位に存在する制限酵素切
断部位（図２参照）を、公知の方法で切断する。本発明
においては、制限酵素ＳｍａＩを用いて切断し、その多
角体プロモーターに関して上記ＤＮＡ断片をその読みと
り方向に配向して挿入して組換えベクターを作製する
［図３の（ｄ）］。

【００３３】この挿入部位と、挿入されたＤＮＡ断片の
配向とが正しく挿入されたことを公知の方法で確認す
る。例えば、該組換えベクターの懸濁液を任意の制限酵
素で切断した後、アガロースゲル電気泳動にかけ、エチ
ジウムブロマイドで染色する。使用した制限酵素により
それぞれの断片の分子量は塩基配列（挿入部位と挿入方
向とが正しい場合の）から予想できるので、予想される
各位置に各バンドが出現するか否かを確認すればよい。

【００３４】かくして、得られたアンピシリン耐性組換
えベクターは、アンピシリン含有ＬＢ培地（バクト社
製）に接種し、３７℃で１２〜２４時間振とう培養する
ことによって量産することができる。得られた組換えベ
クターは、前記と同様の方法で、再度挿入部位と挿入の
方向とを確認することが望ましい。前記の方法は、挿入
と、確認の方法の例示であり、前記の方法に限定される
ものではない。

【００３５】６）組換えウイルスの取得 かくして得られた組換えベクターｐＡｃＹＭ１−ＳＳＰ
Ｅ−ＮＰ［図３の（ｄ）］と、ＡｃＮＰＶの多角体蛋白
質構造遺伝子の一部とを、Ｓｆ９細胞内で相同組換えに
よって組換えて、組換えウイルスＡｃＳＳＰＥＮＰＶ１
が得られる。ここで使用されるｐＡｃＹＭ１ベクター
は、そのクローニングサイトの両側において、ＡｃＮＰ
ＶのゲノムＤＮＡと同一の塩基配列を有しているので、
相同組換えウイルスを作出することができる。

【００３６】ＡｃＮＰＶのＤＮＡと、前記の組換えベク
ター液とを、リン酸カルシウム法を用いてＳｆ９細胞に
コトランスフェクションし、組換えベクターとＡｃＮＰ
ＶのＤＮＡとの間で対立遺伝子を置き換えることにより
多角体蛋白質構造遺伝子の一部がＳＳＰＥ−ＮＰの遺伝
子に相補的なＤＮＡの配列の一部で置換された組換えウ
イルスＡｃＳＳＰＥＮＰＶ１を取得することができる。
具体的な方法を例示すれば、次のとおりである。

【００３７】１ｍＭリン酸水素ナトリウム、５ｍＭ塩化
カリウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、及び１０ｍＭグ
ルコースを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．
０５）とＡｃＮＰＶのＤＮＡ液及び組換えプラスミドＤ
ＮＡ液を混合し、該混合液をＳｆ９細胞懸濁液に添加し
てコトランスフェクションを行う。ここで得られたＳｆ
９細胞は、組換えウイルスＡｃＳＳＰＥＮＰＶ１及び／
又はＡｃＮＰＶを含む細胞の混合物である。コトランス
フェクション後、組換えウイルスを含む反応液は、２７
℃で４〜５日間培養し、培養液を回収して遠心分離し、
その上清から組換えウイルスを公知の方法（望ましくは
プラークアッセイ法）で選択する。

【００３８】コトランスフェクションして得られた培養
上清の遠心上清を適当な倍率で希釈し、該ウイルス希釈
液とＳｆ９細胞とを混合し、室温で１時間感染させる。
その後、寒天培地を重層し、２７℃で３〜４日間培養
し、ニュートラルレッドを加えて細胞を鏡検し、プラー
クの特徴により組換えウイルスの存否を確認する。尚、
組換えウイルスは多角体を産生しないので透明なプラー
クを形成し、一方、非組換えウイルスは、多角体を産生
するので透明な白色のプラークを形成する。組換えウイ
ルスの存在するプラークを回収し、更に純化するために
プラークアッセイを反復し、純粋な組換えウイルスを得
ることができる。

【００３９】７）Ｓｆ細胞 前記組換えウイルスの取得及び該ウイルスの遺伝子の発
現（後記）に用いられるＳｆ細胞は、その中でＡｃＮＰ
Ｖが増殖できるＳｆ細胞であればいかなる細胞であって
もよい。このようなＳｆ細胞として、Ｓｆ９、Ｓｆ２１
ＡＥ等の株化細胞が知られており、Ｓｆ９細胞は、ＡＴ
ＣＣ(American Type Culture Collection)からＡＴＣＣ
ＣＲＬ１７１１として容易に入手できる。また、Ｓｆ
細胞の培養条件は公知であるが、例えば、２７℃、ｐＨ
６．１であり、使用培地としては仔ウシ血清を１０％添
加したＴＣ−１００培地（シグマ社製）が例示できる
が、培養条件及び培地は前記のものに限定されない。

【００４０】８）ＳＳＰＥ−ＮＰ遺伝子の発現 得られた組換えウイルスＡｃＳＳＰＥＮＰＶ１を、Ｓｆ
９細胞に感染させ、増殖させることにより、ＳＳＰＥ−
ＮＰ遺伝子が発現される。組換えウイルスのＳｆ９細胞
への感染方法は公知の方法であってもよい。一典型例で
は、準備したＳｆ細胞の培養液を容器に入れ、該細胞を
容器の底面に付着させ、細胞が剥がれないように培養液
を除去し、付着した細胞に組換えウイルス懸濁液を滴下
する。

【００４１】感染させたＳｆ９細胞を２７℃で３〜４日
間培養して、組換えウイルスＡｃＳＳＰＥＮＰＶ１を増
殖させる。培養後の培養液中には組換えウイルスが含ま
れているので、その培養上清は、組換えウイルス液とし
て使用できる。一方、組換えウイルスに感染したＳｆ９
細胞は、ラバーポリスマンで培養容器底面から剥離し、
遠心分離し、細胞を沈澱させて回収する。得られた細胞
は、後述の蛋白質の産生の確認、抗原性の確認及び細胞
中における該蛋白質の部分精製に用いることができる。

【００４２】９）蛋白質の部分精製 産生させた蛋白質を担体に感作させる場合には、細胞中
に存在する他の不溶性蛋白質を除去することが望まし
い。例えば、組換えウイルスに感染したＳｆ９細胞の懸
濁液に２８ｋＨｚの超音波を５分間照射し、次に、遠心
分離によって上清を回収することによって行うことがで
きる。

【００４３】１０）ＳＳＰＥ−ＮＰの担体への感作 得られた蛋白質は、物理的吸着法又は化学的結合（共有
結合）法により、担体の表面に結合させる。これらの感
作方法は当該技術分野における公知の方法により実施す
ることができる。担体には、合成樹脂ラテックス、赤血
球、マイクロタイトレーションプレート、メンブレンフ
ィルター等が用いられるが、これらに限定されない。以
上のようにして、抗麻疹ウイルス核蛋白質抗体検出試薬
が得られる。

【００４４】次に、試験例を示して本発明を詳述する。 （試験例１） １．ＳＳＰＥ−ＮＰ遺伝子由来のＤＮＡの取得 ＳＳＰＥ山形１株に感染したＶｅｒｏ細胞のｍＲＮＡか
ら逆転写酵素を用いて作製したｃＤＮＡライブラリー
［ウイルス・ジーンズ(Virus Genes) ，第 5巻,第 1号,
第 5ページ, 1991年］から、麻疹ウイルスＮＰ遺伝子
をプローブとしてクロスハイブリダイゼーションにより
スクリーニングを行い、ＳＳＰＥ−ＮＰ遺伝子に相補的
なｃＤＮＡのクローンを得た。該クローンは、約１．７
Ｋｂのサイズであり、リン酸カルシウム法［ウイロロジ
ー(Virology)，第52巻，第 456ページ, 1973年］を用い
たトランスフェクションにより、Ｃｏｓ７細胞中におい
て蛋白質を産生した。該蛋白質は、抗原認識部位の異な
る６種類のモノクローナル抗体を用いた間接蛍光抗体法
でその反応性を確認した。

【００４５】該ｃＤＮＡの核酸塩基配列をデオキシ法
［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステ
ーツ・オブ・アメリカ(Proceedings of the National A
cademy of Sciences of the United States of Americ
a) , 第74巻, 第5463ページ, 1977年］により決定し、
アミノ酸配列を推定した。これらの結果は、図１（配列
表の配列番号１）及び図６（配列表の配列番号２）に示
すとおりである。

【００４６】図１は、ＳＳＰＥウイルス山形１株のＮＰ
遺伝子に相補的なＤＮＡの塩基配列を示す。ＮＰのコー
ド領域は、図１の５３のＡＴＧから１６２８のＴＡＧま
でであり、開始コドンと終止コドンを、それぞれ、アン
ダーラインを付して表示してある。図６は、図１に示す
ＳＳＰＥウイルス山形１株のＮＰ遺伝子に相補的なＤＮ
Ａの塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。図１
及び図６から明らかなように、該クロ−ンのｃＤＮＡ
は、１６８３塩基からなり、５２５のアミノ酸をコード
しているものと推定される。本発明者らは、このクロー
ンをＡ２５と命名した。

【００４７】２．組換えウイルスの作出 オカヤマ・バーグ・ベクター［モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー (Molecular and Cellular Bio
logy) , 第 3巻, 第 280ページ, 1983年］から制限酵素
ＸｈｏＩ処理により分離したＳＳＰＥ−ＮＰ遺伝子と相
補的なＤＮＡの翻訳開始コドンの５´側非翻訳領域の１
２塩基を含む断片を制限酵素処理、及びライゲーション
処理により図２に示すｐＡｃＹＭ１ベクターに挿入し、
組換えベクターｐＡｃＹＭ１−ＳＳＰＥ−ＮＰを作出し
た。得られた組換えベクターとＡｃＮＰＶのＤＮＡとを
Ｓｆ９細胞内でリン酸カルシウム法によりコトランスフ
ェクトし、相同組換えを行った。

【００４８】得られた組換えウイルスのクローンのう
ち、図３には、クローン、ＡｃＳＳＰＥＮＰＶ１、Ａｃ
ＳＳＰＥＮＰＶ２、ＡｃＳＳＰＥＮＰＶ３、及びＡｃＳ
ＳＰＥＮＰＶ４が示されている。これらの内、発現させ
た蛋白質が抗モルビリウイルス核蛋白質モノクローナル
抗体に対して良好な反応性を示したクローンはＡｃＳＳ
ＰＥＮＰＶ１であった。

【００４９】図２は、バキュロウイルス転移ベクターｐ
ＡｃＹＭ１の制限酵素地図である。該ベクターは、約
９．２Ｋｂであり、アンピシリン耐性遺伝子及び多角体
プロモーターを含んでいる。

【００５０】図３は、組換えウイルスの作出手順を示
す。図中（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）は、それ
ぞれ、ＳＳＰＥウイルス山形１株感染Ｖｅｒｏ細胞を用
いて作出したｃＤＮＡのクローンＡ２５、該クローンの
ＳＳＰＥ−ＮＰ遺伝子に相補的なＤＮＡ配列から翻訳開
始コドンの５´側非翻訳領域の１２塩基対を含むＳＳＰ
Ｅ−ＮＰをコードするＤＮＡ断片、バキュロウイルス転
移ベクターｐＡｃＹＭ１、及び（ｃ）に（ｄ）を挿入し
た組換え転移ベクターｐＡｃＹＭ１−ＳＳＰＥ−ＮＰを
示す。

【００５１】３．蛋白質の製造 前記１で得られたウイルスを含む液（５×１０⁷ ｐｆｕ
／ｍｌ）６ｍｌを、３×１０⁷ 個のＳｆ９細胞に加え、
室温で１時間感染させた後、２７℃で３〜４日培養し、
培養物を回収して遠心分離し（１０００ｒｐｍ、５分
間）、沈澱物を無血清ＴＣ−１００培地で洗浄し、ｐＨ
９．６の炭酸緩衝液１ｍｌに懸濁する。次いで、該懸濁
液に２８ＫＨｚの超音波を５分間照射して細胞を破壊
し、遠心分離し（１５０００ｒｐｍで１５分間）、上清
の蛋白質含量をＢＣＡプロテインアッセイキット（ピア
ス社製）により測定した結果、約１ｍｇであった。Ｌａ
ｅｍｍｌｉの方法［ネイチャー(Nature)，第 227巻, 第
680ページ, 1970年］により、該上清に処理液５００μ
ｌを添加して懸濁し、煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの試料
とした。

【００５２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、試料中にはＳＳ
ＰＥ−ＮＰのアミノ酸配列から予想される分子量に相当
する約６０Ｋｄの位置に、図４に示すようなバンドが検
出された。図４は、Ｓｆ９細胞懸濁液のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ及びウエスタンブロット像である。図４において、レ
ーン１は、組換えウイルス感染Ｓｆ９細胞、レーン２
は、ＡｃＮＰＶ感染Ｓｆ９細胞、レーン３は、ウイルス
非感染Ｓｆ９細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。

【００５３】一次抗体として、杉山等の方法により調製
した抗モルビリウイルス−ＮＰモノクローナル抗体［ジ
ャーナル・オブ・ジェネラル・ウイロロジー(Journal o
f General Virology) , 第70巻, 第2605ページ, 1989
年］を１０００倍に希釈し、二次抗体としてＨＲＰ標識
抗マウスＩｇＧ抗体（カペル社製）を１０００倍に希釈
したウエスタンブロット試験により、６０Ｋｄの蛋白質
が少なくともＳＳＰＥ−ＮＰあるいはＭＶ−ＮＰ類似の
抗原性を有する蛋白質であることが、図４のレーン４に
示すとおり確認された。

【００５４】尚、図４のレーン１及びレーン４は、組換
えウイルスＡｃＳＳＰＥＮＰＶ１に感染したＳｆ９細胞
の遠心上清を、図４のレーン２及びレーン５は、対照の
ＡｃＮＰＶ感染Ｓｆ９細胞の遠心上清を、図４のレーン
３及びレ−ン６は、ウイルス非感染細胞の遠心上清を、
それぞれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットで
解析したものであり、ＳＳＰＥ−Ｙａ−ＮＰ及びポリヘ
ドリンの泳動位置を矢印で示し、図の左側にマーカー蛋
白質の分子量を示した。

【００５５】（試験例２）過去に麻疹に感染した経歴を
有する健常人血清９例について、本発明の試薬による試
験を行った。実施例２と同一の方法により製造した本発
明の試薬を用い、次のように酵素免疫法により麻疹に感
染した経歴を有する健常人血清との反応性を試験した。

【００５６】実施例２で作製したマイクロタイトレーシ
ョンプレートの各ウエルに、実施例２の希釈液で希釈し
た検体溶液を０．１ｍｌ加え、３７℃で反応させ、反応
終了後、実施例２の洗浄液で３回洗浄し、次いで、実施
例２の２次抗体溶液を添加し、３７℃で反応させた。反
応終了後、洗浄液で６回洗浄し、実施例２の酵素基質溶
液を添加し、室温で１５分間反応させ、最後に実施例２
の反応停止溶液を添加し、４９２ｎｍにおける吸光度を
マイクロプレートリーダー（バイオラッド社製）で測定
し、次のように測定値を算出して試験した。

【００５７】即ち、組換えウイルスに感染した細胞破砕
物の遠心上清を固層化したウエルの吸光度（表１のＮ
Ｐ）から、野生型ウイルスに感染した細胞破砕物の遠心
上清を固層化したウエルの吸光度（表１の対照）を引い
た値を測定値とした。

【００５８】また、対照として通常のウサギ血清、麻疹
ウイルスと同じ属に属する牛疫ウイルスのみに特異的に
反応するモノクローナル抗体［ジャーナル・オブ・ジェ
ネラル・ウイロロジー(Journal of General Virology)
, 第70巻，第2605ページ, 1989年］及び希釈液も同様
に試験した．尚、各検体について、従来法による赤血球
凝集抑制試験法、補体結合試験法、ウイルス中和試験
法、ウイルス粒子を抗原とする酵素免疫測定試験法でも
測定を行った。

【００５９】この試験の結果は、表１に示したとおりで
ある。表１から明らかなように、本発明のＳＳＰＥ−Ｎ
Ｐは、すべての検体に対して反応し、ウサギ通常血清、
抗牛疫ウイルスモノクロナール抗体および検体希釈液と
はまったく反応しなかった。また、対照では、すべての
検体において反応性は認められなかった。

【００６０】更に、本発明の試薬を用いた値と従来法と
の相関を相関係数で表示すれば、赤血球凝集抑制試験法
とは０．５５、補体結合試験法とは０．９２、ウイルス
中和試験法とは０．６４、ウイルス粒子を抗原とする酵
素免疫測定試験法とは０．８０であり、本発明の試薬
は、従来法と良好な相関性を有することが判明した。し
かも、試験のために必要とする血清が極めて少量であ
り、数時間で測定が可能であり、本発明の試薬は麻疹感
染の診断及びワクチン接種効果を判定可能である試薬で
あることが明らかとなった。

【００６１】

【表１】

【００６２】（試験例３）試験例２の検体１〜９につい
て、各６回、試験例２と同一の方法を反復して同時再現
性を試験し、吸光度の分布、平均値、標準偏差及び変動
係数を求めた。その結果は、表２に示すとおりであり、
全検体において、標準偏差及び変動係数が小さい値であ
り、本発明の試薬による試験は、極めて良好な同時再現
性が得られた。

【００６３】

【表２】

【００６４】（試験例４）試験例２の検体１〜９につい
て、１週間後に、試験例２と同一の方法により日差再現
性を試験した。その結果は、表３に示すとおりであり、
試験日の間の相関係数が０．９９であり、本発明の試薬
による試験は、極めて良好な日差再現性が得られた。前
記試験例２、試験例３及びこの試験の結果から、本発明
の試薬は、検体の抗麻疹ウイルスＮＰ抗体を再現性よく
検出することが可能であり、従来法との相関性も極めて
良好であることが判明した。

【００６５】

【表３】

【００６６】（試験例５）この試験は、本発明の試薬に
より検体の抗麻疹ウイルスＮＰ抗体を検出する可能性を
調べるために行った。試験例１と同一の検体１〜９につ
いて、次の方法により試験した。

【００６７】実施例２の希釈液で希釈した検体溶液を、
実施例３で作製したメンブレン上に滴下し、３７℃で反
応させ、反応終了後、メンブレンを実施例３の洗浄液で
３回洗浄し、メンブレンを実施例２の２次抗体溶液中に
浸漬し、３７℃で１時間反応させた。反応終了後、メン
ブレンを洗浄液で洗浄し、実施例３の酵素基質溶液中に
浸漬し、特異的な発色が現れるまで反応させた。

【００６８】検体番号１の試験結果を、図５に例示し
た。図５は、Ｓｆ９細胞懸濁液とヒト血清とのイムノブ
ロット像であり、図中の（ａ）は、組換えウイルスＡｃ
ＳＳＰＥＮＶ１に感染したＳｆ９細胞の懸濁液、（ｂ）
は、ＡｃＮＰＶに感染したＳｆ９細胞の懸濁液であり、
左上、左下、右上及び右下は、それぞれ、２５０倍、５
００倍、１０００倍及び２０００倍の検体希釈倍率を示
す。

【００６９】組換えウイルスに感染した細胞破砕物の遠
心上清を吸着させたメンブレン［図５（ａ）］におい
て、検体の濃度に依存した特異的なブロット像が観察さ
れた。これに対して、野生型ウイルスＡｃＮＰＶに感染
した細胞破砕物の遠心上清を吸着させたメンブレン［図
５（ｂ）］では、ブロット像は認められなかった。他の
すべての検体について、前記と検体番号１の検体と同様
な結果が得られた。また、対照として試験例２で用いた
通常のウサギ血清、抗牛疫ウイルスモノクローナル抗
体、及び希釈液を試験した時には、特異的な発色は全く
認められなかった。尚、試験終了後のメンブレンは、長
期間の保存が可能である．

【００７０】

【実施例】以下に本発明の実施例を示して、本発明を更
に詳述するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。また、以下の実施例は、実用可能な量産方
法である。

【００７１】実施例１ （１）ＳＳＰＥ−ＮＰ遺伝子由来のＤＮＡの取得 ＳＳＰＥウイルス山形１株に感染したＶｅｒｏ細胞のｍ
ＲＮＡより作成したｃＤＮＡライブラリー［ウイルス・
ジーンズ(Virus Genes) , 第 5巻, 第 1号, 第5ページ,
1991年］から、麻疹ウイルスＮＰ遺伝子をプローブと
して公知の方法でクロスハイブリダイゼーションを行
い、クローンを得た。

【００７２】（２）組換えウイルスの作出 オカヤマ・バーグ・ベクター［モレキュラー・アンド・
セルラー・バイオロジー(Molecular and Cellular Biol
ogy), 第 3巻, 第 280ページ, 1983年］から制限酵素Ｘ
ｈｏＩ処理により分離したＳＳＰＥ−ＮＰ遺伝子と相補
的なＤＮＡの翻訳開始コドンの５´側非翻訳領域の１２
塩基を含む断片を制限酵素処理、及びライゲーション処
理により図２に示すｐＡｃＹＭ１ベクターに挿入し、組
換えベクターｐＡｃＹＭ１−ＳＳＰＥ−ＮＰを作出し
た。得られた組換えベクターとＡｃＮＰＶのＤＮＡとを
Ｓｆ９細胞内でリン酸カルシウム法によりコトランスフ
ェクトし、相同組換えを行った。得られたクローンのう
ち、抗モルビリウイルス−ＮＰモノクローナル抗体に対
して良好な反応性を示したクローンＡｃＳＳＰＥＮＰＶ
１を得た。

【００７３】（３）蛋白質の製造 前記２で得た組換えウイルス液（５×１０⁷ ｐｆｕ／ｍ
ｌ）６ｍｌを、３×１０⁷ 個のＳｆ９細胞に加え、室温
で１時間感染させた後、２７℃で３〜４日間培養し、培
養物を回収して遠心分離し（１０００ｒｐｍで５分
間）、沈澱したウイルス感染細胞を無血清ＴＣ−１００
培地（シグマ社製）で洗浄し、炭酸緩衝液１ｍｌに懸濁
し、超音波処理により細胞を破壊し、遠心分離し（１５
０００ｒｐｍで１５分間）、麻疹ウイルス核蛋白質の抗
原性を有する蛋白質を含有する上清を得た。

【００７４】実施例２ （１）ＳＳＰＥ−ＮＰを固層化したマイクロタイトレー
ションプレートの作製 実施例１で得られた組換えウイルスＡｃＳＳＰＥＮＰＶ
１に感染した細胞破砕物の遠心上清を、炭酸緩衝液（ｐ
Ｈ９．６）で３μｇ／ｍｌに希釈し、この溶液を９６ウ
エルのマイクロタイトレーションプレート（ヌンク社
製）の各ウエルに加え、４℃にて一晩放置し、ウエル内
部の液を除去し、Ｔｗｅｅｎ−２０（バイオラッド社
製）を添加したＰＢＳ緩衝液（以後洗浄液と記載する）
でウエル内部を満たした後、除去してウエル内部を洗浄
した。次いで、ゼラチン（メルク社製）を添加したＰＢ
Ｓ緩衝液を各ウエルに分注し、３７℃で反応させ、反応
終了後、各ウエルを前記と同様の方法で洗浄し、ＳＳＰ
Ｅ−ＮＰを固層化した本発明の試薬（マイクロタイトレ
ーションプレート）を作製した。

【００７５】（２）２次抗体溶液の作製 パーオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（カペル社製）
を、Ｔｗｅｅｎ−２０及びウシ血清アルブミンを添加し
たＰＢＳ緩衝液（以後希釈液と記載する）で１０００倍
に希釈して２次抗体液とした。

【００７６】（３）酵素基質溶液の作製 オルトフェニレンジアミン（シグマ社製）２０ｍｇを過
ホウ酸ナトリウム含有リン酸クエン酸緩衝液（シグマ社
製）５０ｍｌに溶解し、酵素基質溶液とした。

【００７７】（４）反応停止溶液の作製 硫酸を２Ｍの濃度に調整し、反応停止溶液を調製した。
尚、前記（２）〜（４）は、本発明の試薬により試験を
実施するための付属的試薬である。

【００７８】実施例３ （１）ＳＳＰＥ−ＮＰを吸着したメンブレンフィルター
の作製 実施例１で得られた組換えウイルスＡｃＳＳＰＥＮＰＶ
１に感染した細胞破砕物の遠心上清を、炭酸緩衝液（ｐ
Ｈ９．６）で、３００μｇ／ｍｌに希釈し、この溶液を
ポリビニリデンジフルオライドメンブレン（ミリポア社
製）上に滴下し、３７℃で静置した後、ウシ血清アルブ
ミンを添加したＰＢＳ緩衝液（以後洗浄液と記載する）
に浸漬させ、室温で５分間振盪した。この操作を計３回
反復し、ＳＳＰＥ−ＮＰを吸着した本発明の試薬（メン
ブレンフィルター）を作製した．

【００７９】（２）２次抗体溶液の作製 パーオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（カペル社製）
を、Ｔｗｅｅｎ−２０及びウシ血清アルブミンを添加し
たＰＢＳ緩衝液（以後希釈液と記載する）で１０００倍
に希釈して２次抗体液とした。

【００８０】（３）酵素基質溶液の作製 ３−アミノ−９−エチルカルバゾール（シグマ社製）２
０ｍｇを、ジメチルホルムアミド（シグマ社製）２．５
ｍｌ、酢酸緩衝液（ＰＨ５．０）４７．５ｍｌ及び過酸
化水素水２５μｌに溶解し、０．２２μｍのフィルター
（ミリポア社製）で濾過し、酵素基質溶液とした。尚、
前記（２）及び（３）は、本発明の試薬により試験を実
施するための付属的試薬である。

【００８１】

【発明の効果】本発明によって奏せられる効果は次のと
おりである。 （１）抗麻疹ウイルス核蛋白質抗体に対して強い抗原性
を有する蛋白質、及び該蛋白質で適切な担体を感作した
麻疹診断試薬を量産、提供できる。

【００８２】（２）本発明の麻疹診断試薬は、熟練技術
者を必要とすることなく、少量の検体で麻疹感染の有
無、及びワクチン接種時期とその効果の判定を簡便、迅
速に行うことができるので、利用価値が極めて大きい。 （以下余白）

【００８３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１，６８３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡ ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ フラグメント型：全フラグメント 起源 生物名：亜急性硬化性全脳炎ウイルス (subacute scler
osing encephalitisvirus) 株名：山形１株 セルライン：Ｖｅｒｏ細胞 直接の起源 クロ−ン名：Ａ２５ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｍＲＮＡ 存在位置：５３．．１６２８ 特徴を決定した方法：Ｅ（塩基配列決定方法はＭ−１３
−ジデオキシ法） 他の情報：亜急性硬化性全脳炎（以下ＳＳＰＥと記載す
る）ウイルスと同一のパラミクソウイルス科モルビリウ
イルス属である牛疫ウイルスのＬ株（以下ＲＰＶと記載
する）、及びイヌジステンパーウイルスのオンデルシュ
テボート株（以下ＣＤＶと記載する）のＮＰ遺伝子とＳ
ＳＰＥウイルス−ＮＰの塩基配列を比較した。ＲＰＶ−
ＮＰ及びＣＤＶ−ＮＰとの比較では、それぞれ６７％及
び７７％の遺伝子が保存されていた。 配列 AGGATTCAAG ATACTATTAT CAGGGACAAG AGCAGGATTC GGGATATCCG AG ATG 55 GCC ACG CTT TTA AGG AGC TTA GCA TTG TTC AAA AGA AAC AAG GAC AAA 103 CCA CCC ATT ACA TCA GGA TCC GGT GGA GCC ATC AGA GGA ATC AAA CAC 151 ATT ATT ATA GTA CCA ATC CCT GGA GAC TCC TCA ATT ACT ACT CGA TCC 199 AGA CTT CTG GAC CGG TTG GTC AGG TTA ATT GGA AAC CCG GAT GTG AGC 247 GGG CCC AAA CTA ACA GGG GCA CTA ATA GGT ATA TTA TCC TTA TTT GTG 295 GAG TCT CCA GGT CAA TTG ATT CAG AGA ATC ACC GAT GAC CCT GAC GTT 343 AGC ATA AGG CTG TTA GAG GTT GTC CAG AGT GAC CAG TCA CAA TCT GGC 391 CTT ACC TTC GCA TCA AGA GGT ACC AAC ATG GAG GAT GAG GCG GAC CAA 439 TAC TTT TCA CAT GAT GAT CCA AGT AGT AGT GAT CAA CCC AGG TTC GGA 487 TGG TTC GAG AAC AAG GAA ATC TCA GAT ATT GAA GTG CAA GAC CCG GAG 535 GGA TTC AAC ATG ATT CTG GGT ACC ATC CTA GCC CAA ATT TGG GTC TTG 583 CTC GCA AAG GCG GTT ACG GCC CCA GAC ACG GCA GCT GAT TCG GAG CTA 631 AGA AGG TGG ATA AAG TAC ACC CAA CAA AGA AGA GTA GTT GGT GAA TTT 679 AGA TTG GAG AGA AAA TGG TTG GAT GTG GTG AGG AAC AGG ATT GCC GAG 727 GAC CTC TCC TTA CGC CGA TTC ATG GTC GCT CTA ATC CAG GAT ATC AAG 775 AGA ACA CCG GGA AAC AAA CCC AGG ATT GCT GAA ATG ATA TGT GAC ATT 823 GAT ACA TAT ATC GTA GAG GCA GGA TTA GCC AGT TTT ATC CTG ACT ATT 871 AAG TTT GGG ATA GAA ACT ATG TAT CCT GCT CTT GGA TTG CAT GAA TTT 919 GCT GGT GAG TTA TCC ACA CTT GAG TCC TTG ATG AAT CTT TAC CAG CAA 967 ATG GGG GAA ACT GCA CCC TAC ATG GTA ATC CTG GAG AAC TCA ATT CAG 1015 AAC AAG TTC AGT GCA GGA TCA TAC CCT CTG CTC TGG AGC TAT GCT ATG 1063 GGA GTA GGA GTT GAA CTT GAA AAC TCC ATG GGA GGT TTG AAC TTT GGC 1111 CGA TCT TAC TTT GAT CCA GCA TAT TTT AGA TTA GGG CAA GAG ATG GTA 1159 AGG AGG TCA GCT GGA AAG GTC AGC TCC ACA TTG GCA TCT GAA CTC GGT 1207 ATC ACT GCC GAG GAT GCA AGG CTT GTT TCA GAG ATT GCA ATG CAT ACT 1255 ACT GAG GAC AGG ATC AGT AGA GCG GTT GGA CCC AGA CAA GCC CAA GTG 1303 TCA TTT CTA CAC GGT GAT CAA AGT GAA AAT GAG CTA CCG AGA TGG GAG 1351 GGC AAG GAA GAT ATG AGG GTC AAA CAG AGT CGA GGA GAA GCC AGG GAG 1399 AGC TAC AGA GAA ACC GGG CCC AGT AGA GCA AGT GAT GCG AGA GCT GCC 1447 CAT CTT CCA ACC GAC ACA CCC CTA GAC ATT GAC ACT GCA TCG GAG CCC 1495 AGC CAA GAT CCG CAG GAC AGT CGA AGG TCA GCT GAA GCT CTG CTC AGG 1543 CTT CAA GCC ATG GCA GGA ATC TCG GAA GAA CAA GGC TCA GAC ACG GAC 1591 ACC CCT AGA GTG TAC AAT GAC AGA GAT CTT CTA GAA TAG GTGCGAGAGG 1640 CCGAGGACCA GAACACCATC CGCCTACCCT CCATCATTGT TAT 1683

【００８４】配列番号：２ 配列の長さ：５２５ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ala Thr Leu Leu Arg Ser Leu Ala Leu Phe Lys Arg Asn Lys Asp 1 5 10 15 Lys Pro Pro Ile Thr Ser Gly Ser Gly Gly Ala Ile Arg Gly Ile Lys 20 25 30 His Ile Ile Ile Val Pro Ile Pro Gly Asp Ser Ser Ile Thr Thr Arg 35 40 45 Ser Arg Leu Leu Asp Arg Leu Val Arg Leu Ile Gly Asn Pro Asp Val 50 55 60 Ser Gly Pro Lys Leu Thr Gly Ala Leu Ile Gly Ile Leu Ser Leu Phe 65 70 75 80 Val Glu Ser Pro Gly Gln Leu Ile Gln Arg Ile Thr Asp Asp Pro Asp 85 90 95 Val Ser Ile Arg Leu Leu Glu Val Val Gln Ser Asp Gln Ser Gln Ser 100 105 110 Gly Leu Thr Phe Ala Ser Arg Gly Thr Asn Met Glu Asp Glu Ala Asp 115 120 125 Gln Tyr Phe Ser His Asp Asp Pro Ser Ser Ser Asp Gln Pro Arg Phe 130 135 140 Gly Trp Phe Glu Asn Lys Glu Ile Ser Asp Ile Glu Val Gln Asp Pro 145 150 155 160 Glu Gly Phe Asn Met Ile Leu Gly Thr Ile Leu Ala Gln Ile Trp Val 165 170 175 Leu Leu Ala Lys Ala Val Thr Ala Pro Asp Thr Ala Ala Asp Ser Glu 180 185 190 Leu Arg Arg Trp Ile Lys Tyr Thr Gln Gln Arg Arg Val Val Gly Glu 195 200 205 Phe Arg Leu Glu Arg Lys Trp Leu Asp Val Val Arg Asn Arg Ile Ala 210 215 220 Glu Asp Leu Ser Leu Arg Arg Phe Met Val Ala Leu Ile Gln Asp Ile 225 230 235 240 Lys Arg Thr Pro Gly Asn Lys Pro Arg Ile Ala Glu Met Ile Cys Asp 245 250 255 Ile Asp Thr Tyr Ile Val Glu Ala Gly Leu Ala Ser Phe Ile Leu Thr 260 265 270 Ile Lys Phe Gly Ile Glu Thr Met Tyr Pro Ala Leu Gly Leu His Glu 275 280 285 Phe Ala Gly Glu Leu Ser Thr Leu Glu Ser Leu Met Asn Leu Tyr Gln 290 295 300 Gln Met Gly Glu Thr Ala Pro Tyr Met Val Ile Leu Glu Asn Ser Ile 305 310 315 320 Gln Asn Lys Phe Ser Ala Gly Ser Tyr Pro Leu Leu Trp Ser Tyr Ala 325 330 335 Met Gly Val Gly Val Glu Leu Glu Asn Ser Met Gly Gly Leu Asn Phe 340 345 350 Gly Arg Ser Tyr Phe Asp Pro Ala Tyr Phe Arg Leu Gly Gln Glu Met 355 360 365 Val Arg Arg Ser Ala Gly Lys Val Ser Ser Thr Leu Ala Ser Glu Leu 370 375 380 Gly Ile Thr Ala Glu Asp Ala Arg Leu Val Ser Glu Ile Ala Met His 385 390 395 400 Thr Thr Glu Asp Arg Ile Ser Arg Ala Val Gly Pro Arg Gln Ala Gln 405 410 415 Val Ser Phe Leu His Gly Asp Gln Ser Glu Asn Glu Leu Pro Arg Trp 420 425 430 Glu Gly Lys Glu Asp Met Arg Val Lys Gln Ser Arg Gly Glu Ala Arg 435 440 445 Glu Ser Tyr Arg Glu Thr Gly Pro Ser Arg Ala Ser Asp Ala Arg Ala 450 455 460 Ala His Leu Pro Thr Asp Thr Pro Leu Asp Ile Asp Thr Ala Ser Glu 465 470 475 480 Pro Ser Gln Asp Pro Gln Asp Ser Arg Arg Ser Ala Glu Ala Leu Leu 485 490 495 Arg Leu Gln Ala Met Ala Gly Ile Ser Glu Glu Gln Gly Ser Asp Thr 500 505 510 Asp Thr Pro Arg Val Tyr Asn Asp Arg Asp Leu Leu Glu 515 520 525

【図面の簡単な説明】

【図１】ＳＳＰＥ−ＮＰ遺伝子に相補的なＤＮＡの塩基
配列を示す。

【図２】ｐＡｃＹＭ１ベクタ−の制限酵素地図である。

【図３】組換えウイルス作出方法の概略を示す。

【図４】Ｓｆ９細胞内でのＳＳＰＥ−ＮＰの発現を示す
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット像である。

【図５】発現させたＳＳＰＥ−ＮＰとヒト血清との反応
性を示すイムノブロット像である。

【図６】図１のＳＳＰＥ−ＮＰ遺伝子に相補的なＤＮＡ
の塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/569 Ｌ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 亜急性硬化性全脳炎ウイルス(subacute
   sclerosing panencephalitis virus) 構造遺伝子領域の
   核蛋白質をコードするｃＤＮＡ断片を挿入した組換えバ
   キュロウイルスを昆虫細胞(Spodoptera frugiperda) に
   感染させ、該核蛋白質を該昆虫細胞内に発現させ、該核
   蛋白質を採取することを特徴とする麻疹ウイルス核蛋白
   質の抗原性を有する蛋白質の製造法。
2. 【請求項２】 亜急性硬化性全脳炎ウイルス構造遺伝子
   領域の核蛋白質をコードするｃＤＮＡ断片が、遺伝子の
   翻訳開始コドンの５´側上流の非翻訳領域の１２塩基を
   含むＤＮＡ断片である請求項１に記載の麻疹ウイルス核
   蛋白質の抗原性を有する蛋白質の製造法。
3. 【請求項３】 亜急性硬化性全脳炎ウイルス(subacute
   sclerosing panencephalitis virus) 構造遺伝子領域の
   核蛋白質をコードするｃＤＮＡ断片を挿入した組換えバ
   キュロウイルスを昆虫細胞(Spodoptera frugiperda) に
   感染させて該核蛋白質を該昆虫細胞内に発現させて得ら
   れた麻疹ウイルス核蛋白質の抗原性を有する蛋白質を、
   抗原とする抗麻疹ウイルス核蛋白質抗体検出試薬。
4. 【請求項４】 亜急性硬化性全脳炎ウイルス構造遺伝子
   領域の核蛋白質をコードするｃＤＮＡ断片が、遺伝子の
   翻訳開始コドンの５´側上流の非翻訳領域の１２塩基を
   含むＤＮＡ断片である請求項３に記載の抗麻疹ウイルス
   核蛋白質抗体検出試薬。