JPH06157326A - ハイブリッド型人工膵臓 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 自然抗体及び／または移植膵ラ島に対する抗
体を有する動物間の移植に用いた場合であっても、免疫
抑制剤を併用することなく、長期間に渡り血糖値を正常
化することを可能とするハイブリッド型人工膵臓を提供
する。 【構成】 アセタール化されたアガロース誘導体濃度が
７〜５０重量％であるアガロース誘導体ゲルに膵ランゲ
ルハンス島が包括固定されていることを特徴とする、ハ
イブリッド型人工膵臓。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、膵臓の機能が侵された
り低下したりしている糖尿病患者に対し、膵臓の機能を
代行させるための人工膵臓に関し、特に、ハイブリッド
型の人工膵臓に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体内ではホルモンあるいはその他の物
質が産出され、これらが有効に各器官に作用して生命体
を維持している。しかしながら、これらの体内で産出さ
れる物質の一部が欠如すると種々の病的疾患が生じ、外
的にこれらを補わなければならない状態が起こる。例え
ば、糖尿病はインスリンの不足が原因であり、この糖尿
病を治療するにはインスリンを投与する必要がある。

【０００３】現在、糖尿病の治療法としては、インスリ
ン製剤を注射する方法が主流を占めている。すなわち、
前もって測定された患者の血中グルコース濃度に応じ、
必要量のインスリン製剤を注射により投与する方法が採
用されている。しかしながら、患者の血中グルコース濃
度は連続的に変化する。従って、上記インスリン製剤の
注射によっては、血中グルコース濃度の連続的な変化に
応じてインスリンを投与することはできない。よって、
インスリン製剤を注射する方法では、患者のグルコース
代謝を生理的にコントロールすることができず、血管障
害や腎臓障害等の併発症を防止することは非常に困難で
あった。

【０００４】そこで、患者の血中グルコース濃度の連続
的な変化に応じたインスリンの投与を可能とするものと
して、ハイブリッド型人工膵臓が注目を集めている。ハ
イブリッド型人工膵臓とは、生体内においてインスリン
を分泌する組織、すなわち膵ランゲルハンス島（以下、
膵ラ島と略す。）を半透膜内に包括固定化した構成を有
し、患者の生体防御系（免疫系等）から隔離した後に体
内に移植して用いられるものである。

【０００５】上記ハイブリッド型人工膵臓において膵ラ
島を包括固定化する材料としては、下記の文献〜に
示されているように、２．５〜５重量％のアガロースゲ
ルまたは１０〜３０重量％のアガロース分解物ゲルが提
案されている。 文献…岩田博夫，雨宮 治，松田武久，林 良輔，高
野久輝，阿久津哲造；ハイブリッド型人工膵臓、人工臓
器、１６（３），１２６３（１９８７）。

【０００６】文献…岩田博夫，小林和生，清水 浩，
雨宮 治，阿久津哲造；ハイブリッド型人工膵臓、アガ
ロースマイクロビーズ封入ラ島のマウス間同種移植への
適用、人工臓器、２０（１），２１３（１９９１）。 文献…高木達也，岩田博夫，雨宮 治；マイクロカプ
セル化ラ島の異種移植への適用、第２９回人工臓器学会
予稿集Ｐ８７。 文献…特開昭６２−２１５５３０号。

【０００７】組織または細胞をマイクロカプセルに封入
する目的は、組織または細胞を維持しかつその正常な代
謝機能を支えるのに必要な栄養、イオン及び酸素等を透
過せせるが、他方、リンパ球や抗体蛋白等を通さない免
疫隔離膜内に、組織または細胞を生きたまま、しかも保
護された状態で維持することにある。しかしながら、現
在のところマイクロカプセル化した組織や細胞を動物の
体内で長期間安定に生存させ得る免疫隔離膜は実現され
ていない。

【０００８】上記文献では、アガロース濃度が５重量
％のアガロースマイクロカプセルを用いてハイブリッド
型人工膵臓を作製し、マウス間の同種移植を行った場
合、長期間の生着が認められている。しかしながら、ハ
ムスター−マウス間の異種移植を行った場合には、７例
中２例において長期間血糖値が正常化したものの、残り
の５例については１０日以内に血糖値が上昇し、糖尿病
状態に戻ることが確かめられている（文献）。従っ
て、アガロース濃度が５重量％のマイクロカプセルを用
いた場合には、再現性に優れ、かつ長期間に渡り人工膵
臓として機能するものを得ることはできなかった。ま
た、ＩｇＧのような液性抗体が通過した場合の免疫反応
等により拒絶されることがあった。

【０００９】マイクロカプセルを作成するときに使用す
るアガロースの濃度を変化させることにより、このマイ
クロカプセルのアガロースゲル部分を通過できる分子の
分子量を大きく変化させることができる。すなわち、ア
ガロース濃度が高い場合にはアガロースの網目構造は小
さく、アガロース濃度が低い場合にはアガロースの網目
構造は大きくなることが考えられる。網目構造が大き過
ぎると、抗体等の侵入によりカプセル内の生組織または
生細胞は死滅し、特定物質（例えば、インスリン）の産
生が阻害される。そこで、液性抗体の通過を阻止するた
めに、高濃度のアガロースマイクロカプセルへの膵ラ島
の封入を試みたが、市販のアガロースを用いた場合には
高濃度のアガロース溶液では粘度が高くなりすぎ、マイ
クロカプセルを容易に作成することができず、従来の方
法では７．５重量％濃度が限界であり、高濃度化するこ
とは困難であった。

【００１０】マイクロカプセル以外の形態として、タブ
レット状のものやロッド状のものが検討されているが
（第２１回医用高分子シンポジウム予稿集Ｐ８３），マ
イクロカプセル状のものは免疫抑制剤の併用で、移植後
１００日近く血糖値は正常化したが、タブレット状のも
のやロッド状のものは移植後１０日前後で拒絶された。
その理由として、形状の違いによる異物反応の違いや酸
素や栄養素の拡散条件が悪いことが挙げられている。

【００１１】他方、上記文献では、高濃度のアガロー
スゲルを作製するために、アガロースを酸で加水分解し
たものが用いられており、該アガロース酸分解物濃度が
１１〜２０重量％であるハイブリッド型人工膵臓が作製
されている。しかしながら、このハイブリッド型人工膵
臓について、ハムスター−マウス間の異種移植を行った
場合には、６例中２例では血糖値が正常化した期間は２
９日であり、１例については５４日であり、残りの３例
については１０日前後に過ぎなかった。従って、アガロ
ース酸分解物濃度が１１〜２０重量％のハイブリッド型
人工膵臓においても、やはり再現性に優れ、かつ長期間
に渡り人工膵臓として機能し得るものを得ることはでき
なかった。

【００１２】また、免疫抑制剤を併用することにより免
疫反応が関与する拒絶反応を回避し、ハムスター−マウ
ス間の異種移植において長期間生着を可能としている例
も存在するが（文献）、この場合には免疫抑制剤によ
る毒性が問題になると考えられる。

【００１３】これまで行われている実験は、ハムスター
−マウス間のような比較的近縁の関係にある動物間の移
植である。すなわち、移植される膵ラ島に対してレシピ
エントが生まれながらにして有している液性抗体すなわ
ち自然抗体があまり問題にならない動物間の移植であ
る。これに対して、ハイブリッド型人工膵臓のヒトへの
適用を考えた場合、ブタやウシ等のヒトとは離れた種の
膵ラ島を用いることになるため、ヒトが有している自然
抗体が問題になると考えられる。

【００１４】さらに、ハイブリッド型人工膵臓を移植し
た際に、移植された膵ラ島の抗原性により、レシピエン
トの免疫系が腑活されることも考慮しなければならな
い。従って、移植膵ラ島によって予め免疫することによ
り移植膵ラ島に対する抗体が産生されている動物に対し
ても有効なハイブリッド型人工膵臓を開発する必要があ
る。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
アガロースを用いたハイブリッド型人工膵臓の諸問題を
解消するものであり、自然抗体及び／または移植膵ラ島
に対する抗体を有する動物間の移植に用いた場合におい
ても免疫抑制剤を併用することなしに、長期間に渡り血
糖値を正常化することを可能とするハイブリッド型人工
膵臓を提供することにある。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明は、アセタール化
されたアガロース誘導体の濃度が７〜５０重量％、好ま
しくは７〜４０重量％であるアガロース誘導体ゲルのマ
イクロカプセルに、膵ラ島が包括固定化されていること
を特徴とするハイブリッド型人工膵臓である。本発明に
おいて、膵ラ島は、上記アガロース誘導体ゲルからなる
マイクロカプセルに包括固定化されるが、このアガロー
スは、通常、寒天中に含まれるものである。

【００１７】本発明で用いられる上記アガロース誘導体
ゲルは、アガロースに鎖式アルデヒドを反応させること
により得られ、上記鎖式アルデヒドとしては、例えばホ
ルムアルデヒド、アセトアルデヒドまたはブチルアルデ
ヒド等が用いられる。上記アセタール化の方法としては
従来公知の方法を使用することができ、例えば、ホルマ
ール化アガロース誘導体ゲルは以下のようにして作製さ
れる。

【００１８】まず、水にアガロースを加え、８０〜９０
℃に加熱し溶解させる。しかる後、反応系を４０℃程度
に冷却後、所定量のホルムアルデヒドと適当な酸触媒す
なわち塩酸、硫酸等を加えて反応させる。アガロース濃
度は、反応系がゲル化しない範囲で選択され，反応温度
は４０〜１００℃、反応時間は１〜２４時間程度とされ
ている。反応完了後、反応系を５０℃以下に冷却し、ア
ルカリで酸を中和させる。その後、水及びホルムアルデ
ヒドを減圧除去し、生成物を慣用されている方法により
得る。例えば生成物を水に溶解し、冷却により凍結し、
凍結乾燥することができる。或いは、反応溶液を生成物
に対して非溶媒である水混和性有機溶媒（例えばメタノ
ール，エタノール，アセトン等）と混和することによっ
て生成物を沈澱させ、ろ過し、上記非溶媒で洗浄し，乾
燥させることにより得ることができる。

【００１９】使用するホルムアルデヒドの正確な量は、
所望とするホルマール化アガロース誘導体の置換の程度
すなわちホルマール化度に依存する。ホルマール化反応
は平衡反応であるため、通常、理論的に必要な量に比べ
て過剰量のホルムアルデヒドを使用する。ホルマール化
度は、アガロースの主要な構造単位であるＤ−ガラクト
ースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースからなる
二糖類分子中に存在する４個の水酸基の中で、理論上有
効な反応サイト（Ｄ−ガラクトースの４，６位の水酸
基）のホルマール化の程度によりにより定義され得る。
従って、この反応サイトが完全にホルマール化されてい
る場合、ホルマール化度が１００％である。このホルマ
ール化度は、赤外吸収スペクトルより求められる。即
ち、メチン基（νＣＨ：２９５０ｃｍ^-1）の吸光度を内
部基準とした反応前後の水酸基の吸収帯（νＯＨ：３８
００〜２８００ｃｍ^-1）の面積強度Ｄ_OH ⁰ 、Ｄ_OHから次
式（１）で求められる。なお、Ｄ_OH ⁰ が反応前，Ｄ_OHが
反応後の面積強度を示す。

【００２０】

【数１】

【００２１】なお、それぞれの吸光度は、赤外吸収スペ
クトルの強度Ｉとベースラインの強度Ｉ₀ より、下記の
式（２）により求めることができる。

【００２２】

【数２】

【００２３】ホルマール化度は２％以上が好ましい。ホ
ルマール化度２％未満ではポリマー溶液の著しい粘度低
下が見られない。また、本反応では、ホルムアルデヒド
の仕込量を増やしてもホルマール化度６０％以上のもの
は得られない。

【００２４】上記のようにして、ホルマール化アガロー
ス誘導体ゲルが得られるが，アセトアセタール化及びブ
チラール化アガロース誘導体ゲルも、上記ホルムアルデ
ヒドに代えて、アセトアルデヒド及びブチルアルデチド
を用いることにより、同様にして得ることができる。

【００２５】アセトアセタール化度及びブチラール化度
も、ホルマール化度同様に赤外吸収スペクトルより求め
ることができる。すなわち、メチン基（μＣＨ：２９０
０ｃｍ^-1）の吸光度を内部基準とした反応前後の水酸基
（μＯＨ：３４１８ｃｍ^-1）の吸光度Ａ_OH ⁰ 、Ａ_OHから
次の式（３）により求めることができる。

【００２６】

【数３】

【００２７】ただし、式（３）において、Ａ_OH ⁰ は反応
前の水酸基の吸光度をＡ_OHは反応後の水酸基の吸光度を
示す。アセトアセタール化度は２％以上であることが好
ましい。アセトアセタール化度が２％未満ではポリマー
溶液の粘度の低下が充分でない。また、上記アセトアセ
タール化に際してはアセトアルデヒドの仕込み量を増や
すと、アセトアセタール化度１００％のものが得られ
る。

【００２８】さらに、ブチルアルデヒドを用いてブチラ
ール化アガロース誘導体ゲルを作成する場合においても
ブチラール化度は、２％以上であることが好ましい。ブ
チラール化度が２％未満ではポリマー溶液の粘度の充分
な低下がみられない。また、ブチラール化に際しては、
ブチルアルデヒドの仕込み量を増加することにより、ブ
チラール化度１００％のものを得ることができる。

【００２９】本発明において用いられる上記アガロース
誘導体ゲルでは、ホルマール化、アセタール化またはブ
チラール化アガロース誘導体の濃度すなわち該アガロー
ス誘導体ゲルのポリマー濃度が７重量％〜５０重量％、
好ましくは、７〜４０重量％以上であることが必要であ
る。これは、７重量％未満では、ゲルにおいて、グルコ
ース等の栄養素や膵ラ島から分泌されたインスリン（分
子量：６，０００）を透過させる必要があるため、並び
に移植の際に膵ラ島が液性抗体（ＩｇＧ：分子量１６０
０００）と接触することを防止するために液性抗体が通
過し得ない膜で包括固定化する必要があるからである。

【００３０】なお、上記ポリマー濃度とは、上記アガロ
ース誘導体を溶解させるのに適当な溶媒（例えば、Ｅａ
ｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ液、生理食塩水、リン酸緩衝生理食
塩水等）に対するアガロース含有割合（重量％）を示
す。上記ポリマー濃度が７重量％未満では、液性抗体の
侵入を阻止することができず、他方、５０重量％を超え
ると、アガロース誘導体が溶媒に溶解しなくなる。

【００３１】上記膵ラ島としては、人、牛、豚、ハムス
ターまたはマウス等から単離されたものを適宜用いるこ
とができる。膵ラ島の単離は、例えば、摘出した膵臓を
コラゲナーゼにより一定時間消化し、しかる後、比重遠
心法により分別することにより行われる。ハムスターか
らの膵ラ島の単離方法の一例を説明する。

【００３２】ハムスターをエーテルで麻酔し、開腹し、
膵臓を摘出する。摘出した膵臓をハサミで１ｍｍ程度の
長さに細切し、ハンクス液に浸漬し、数回洗浄する。次
に、８ｍｇ／ｍｌの濃度となるようにコラゲナーゼをハ
ンクス液に溶解し、その１０ｍｌを、上記のようにして
洗浄されたハムスター６匹分の膵臓細片に加え、３７℃
の水浴中で６〜８分間振とうし、消化する。この消化物
に、ハンクス液を加え、ピペッティングした後、１２０
０ｒｐｍで２分間遠心分離する。

【００３３】遠心分離により得られた沈査を１５ｍｌの
遠沈管６本に分注し、ハンクス液を加え、ピペッティン
グし、再び１２００ｒｐｍで２分間遠心する。得られた
沈査に、フィコール−コンレイ液（比重＝１．０９５）
５ｍｌを加え分散させる。この分散液上に、比重１．０
７２及び１．０４８の２種のフィコール−コンレイ液を
重層する。次に、２０００ｒｐｍで１５分間遠心し、比
重１．０７２及び１．０４８の層の界面に集まった組織
片を回収する。

【００３４】回収した組織片を、ハンクス液で洗浄した
後、５重量％の牛胎児血清を含むＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥ
Ｍ培養液中に分散し、実体顕微鏡下で膵ラ島を分取す
る。このようにして、ハムスターの膵臓１個あたり約２
００個の膵ラ島を回収することができる。

【００３５】本発明のハイブリッド型人工膵臓では、上
記のようにして回収した膵ラ島を、上記アガロース誘導
体ゲルにより包括固定化する。包括固定化する方法とし
ては、具体的には、加熱溶融後、温度４０℃近辺まで冷
却したホルマール化アガロース誘導体含有Ｅａｇｌｅ’
ｓ ＭＥＭ培養液３ｍｌに対して，回収した膵ラ島１，
０００〜３，０００個程度を分散させる。得られた分散
液に、４０℃近辺に加温した水と混合しない疎水性の液
体（流動パラフィン、シリコンオイル等）をホルマール
化アガロース誘導体溶液に対して約５〜１０倍量加えて
充分に攪拌し、ホルマール化アガロース誘導体溶液を懸
濁させる。次に、懸濁液を冷却することにより、ホルマ
ール化アガロース誘導体溶液をゲル化させる。この場
合、懸濁液の凝集を防止するために、攪拌しつつ冷却す
ることが必要である。次に、疎水性の液体を除去するた
めに、ハンクス液を懸濁液に加え、遠心分離し、下層に
沈んだホルマール化アガロース誘導体ゲルのマイクロカ
プセルを回収する。

【００３６】上記のようにして数十μｍ〜数ｍｍ程度の
粒径のハイブリッド型人工膵臓を得ることができる。ま
た、ノズルから膵ラ島を分散したホルマール化アガロー
ス誘導体含有Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培養液を、４℃付
近に冷却した水と混合しない疎水性の液体（流動パラフ
ィン，シリコンオイル等）中に滴下してマイクロカプセ
ルを作ることもできる。このようなマイクロカプセル型
のハイブリッド型人工膵臓の作製は、ホルマール化アガ
ロース誘導体濃度が１〜５０重量％の範囲で可能であ
る。

【００３７】ホルマール化アガロース誘導体を用いた例
を説明したが，アセトアセタール化又はブチラール化ア
ガロース誘導体を用いた場合も同様にしてハイブリッド
型人工膵臓を得ることができる。

【００３８】作製したハイブリッド型人工膵臓は、例え
ば５重量％の牛胎児血清含有Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培
養液中に分散し、３７℃の温度下において５％炭酸ガス
下で培養され、移植の際にはＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培
養液やハンクス液等で洗浄し、血清を除去した後に用い
る。培養期間は、１日前後でもよく、あるいは抗原性を
低下させるために長期間培養してもよく、さらに２４℃
のような低温下において培養してもよい。

【００３９】

【作用】本発明では、アガロースをアセタール化するこ
とにより、４０℃における溶液粘度を充分に低くするこ
とが可能とされており、従って、上記ポリマー濃度が充
分に高いマイクロカプセルを得ることができる。

【００４０】また、アガロース誘導体ゲルで膵ラ島を包
括固定化する際、上記ポリマー濃度が７重量％未満では
ゲルにおける液性抗体を阻止する能力が不十分であり、
異種移植を行った場合、液性抗体が関与する細胞障害か
ら膵ラ島を保護することが難しかったが、本発明では、
上記ポリマー濃度が７重量％以上のアガロース誘導体ゲ
ルにより膵ラ島が包括固定されているため、液性抗体の
侵入が確実に阻止され得る。

【００４１】

【発明の効果】よって、本発明によれば、アセタール化
されたアガロース誘導体濃度が７〜５０重量％のアガロ
ース誘導体ゲルにより膵ラ島が包括固定されているた
め、液性抗体が関与する細胞障害から膵ラ島を保護する
ことができる。従って、自然抗体及び／または移植膵ラ
島に対する抗体を有する動物間の移植においても、免疫
抑制剤を併用することなく長期間生着させることができ
る可能なハイブリッド型人工膵臓を提供することができ
る。

【００４２】

【実施例】実施例１ アガロースＬＧＴ（ナカライテスク社製）３ｇを水５０
０ｍｌに加熱溶解後、この溶液を４０℃に冷却した。こ
の溶液に３７重量％ホルムアルデヒド水溶液０．２０ｇ
を加え、次いで０．５Ｎ塩酸溶液１ｍｌを低下し，１２
０ｒｐｍで攪拌しながら５５℃で４時間保持した。反応
溶液を４０℃に冷却後、０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液
で中和し、水及びホルムアルデヒドを減圧除去した。生
成物を水１００ｍｌに溶解させ，エタノール１リットル
中に注ぎ、沈澱させ、ろ過により沈澱物を回収し、エタ
ノールで洗浄後、５０℃で８時間真空乾燥した。錠剤成
形機を用いて得られたホルマール化アガロース誘導体の
ＫＢｒ錠剤を作製し、赤外分光分析装置（パーキンエル
マージャパン社；１６００シリーズ フーリエ変換赤外
分光分析装置）を用いて赤外吸収スペクトルを測定し
た。その結果、ホルマール化度は２２％であった。

【００４３】得られたホルマール化アガロース誘導体
（ホルマール化度：２２％）２２５ｍｇをＥａｇｌｅ’
ｓ ＭＥＭ溶液３．０ｍｌに加えて溶媒に対するポリマ
ー濃度を７．５重量％にし、オートクレーブにて１２０
℃で２０分間加熱滅菌し、同時にホルマール化アガロー
ス誘導体を溶解させ，次に、４０℃に保った。このホル
マール化アガロース誘導体溶液に、ハムスターの膵臓か
らコラゲナーゼ処理法により単離した膵ら島約２０００
個をＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ溶液０．１ｍｌに分散した
ものを加えて攪拌した後，さらに４０℃に加温した流動
パラフィン約２０ｍｌを加え攪拌し、ホルマール化アガ
ロース誘導体を分散させた。次に、攪拌下において上記
のようにして得た分散液を氷冷し、ホルマール化アガロ
ース誘導体をゲル化させ、さらにハンクス液約３０ｍｌ
を加え２０００ｒｐｍで１０分間遠心し、沈澱したマイ
クロカプセルを回収し、５％の牛胎児血清を含むＥａｇ
ｌｅ’ｓ ＭＥＭ溶液中に分散して３７℃５％炭酸ガス
下で２０日間培養した。

【００４４】培養後、実体顕微鏡にて膵ラ島が包括固定
されたマイクロカプセルのみを回収し、実施例１のハイ
ブリッド型人工膵臓を製造した。

【００４５】実施例２ 実施例１で合成したホルマール化アガロース誘導体（ホ
ルマール化度：２２％）３００ｍｇをＥａｇｌｅ’ｓ
ＭＥＭ溶液３．０ｍｌに加えて、溶媒に対するポリマー
濃度を１０重量％にしたこと以外は、実施例１と同様に
して、実施例２のハイブリッド型人工膵臓を製造した。

【００４６】実施例３ ３７重量％ホルムアルデヒド水溶液の使用量を０．４０
ｇとしたこと、及び０．５Ｎ塩酸溶液２ｍｌを滴下した
こと以外は、実施例１と同様にしてホルマール化アガロ
ース誘導体を合成した。実施例１と同様にして、赤外吸
収スペクトルを測定した結果、ホルマール化度は４３％
であった。得られたホルマール化アガロース誘導体（ホ
ルマール化度：４３％）６００ｍｇをＥａｇｌｅ’ｓ
ＭＥＭ溶液３．０ｍｌに加えて溶媒に対するポリマー濃
度を２０重量％にしたこと以外は、実施例１と同様にし
て、実施例３のハイブリッド型人工膵臓を製造した。

【００４７】実施例４ 実施例３で合成したホルマール化アガロース誘導体（ホ
ルマール化度：４３％）９００ｍｇをＥａｇｌｅ’ｓ
ＭＥＭ溶液３．０ｍｌに加えて、溶媒に対するポリマー
濃度を３０重量％にしたこと以外は、実施例３と同様に
して、実施例４のハイブリッド型人工膵臓を製造した。

【００４８】実施例５ アガロースＬＧＴ（ナカライテスク社製）４ｇを水５０
０ｍｌに加熱溶解後、この溶液を４０℃に冷却した。こ
の溶液にアセトアルデヒド０．２９ｇを加え，次いで
０．５Ｎ塩酸溶液２．６ｍｌを滴下し、１２０ｒｐｍで
攪拌しながら５５℃で４時間保持した。反応溶液を４０
℃に冷却した後、０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で中和
し，水及びアセトアルデヒドを減圧除去した。生成物を
水１００ｍｌに溶解させ，エタノール１リットル中に注
ぎ沈澱させ、ろ過により沈澱物を回収し、エタノールで
洗浄後、５０℃で８時間真空乾燥した。得られたアセト
アセタール化アガロース誘導体をジメチルホルムアルデ
ヒドに溶解させキャストフィルムを作製し、赤外分光分
析装置（パーキンエルマージャパン；１６００シリーズ
フーリエ変換赤外分光分析装置）を用いて赤外吸収スペ
クトルを測定した。その結果、アセトアセタール化度は
２８％であった。上記アセトアセタール化アガロース誘
導体（アセトアセタール化度：２８％）を用いたこと以
外は、実施例１と同様にして、実施例５のハイブリッド
型人工膵臓を製造した。

【００４９】実施例６ 実施例５で合成したアセトアセタール化アガロース誘導
体（アセトアセタール化度：２８％）３００ｍｇをＥａ
ｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ溶液３．０ｍｌに加えて、溶媒に対
するポリマー濃度を１０重量％にしたこと以外は、実施
例５と同様にして、実施例６のハイブリッド型人工膵臓
を製造した。

【００５０】実施例７ アセトアルデヒド使用量を０．４３ｇとしたこと、及び
０．５Ｎ塩酸溶液３．９ｍｌを滴下したこと以外は、実
施例５と同様にしてアセトアセタール化アガロース誘導
体を合成した。実施例５と同様にして、赤外吸収スペク
トルを測定した結果、ホルマール化度は４３％であっ
た。得られたアセトアセタール化アガロース誘導体（ア
セトアセタール化度：４３％）６００ｍｇをＥａｇｌ
ｅ’ｓ ＭＥＭ溶液３．０ｍｌに加えて溶媒に対するポ
リマー濃度を２０重量％にしたこと以外は、実施例５と
同様にして、実施例７のハイブリッド型人工膵臓を製造
した。

【００５１】実施例８ 実施例７で合成したアセトアセタール化アガロース誘導
体（アセトアセタール化度：４３％）９００ｍｇをＥａ
ｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ溶液３．０ｍｌに加えて、溶媒に対
するポリマー濃度を３０重量％にしたこと以外は、実施
例７と同様にして、実施例８のハイブリッド型人工膵臓
を製造した。

【００５２】実施例９ アガロースＬＧＴ（ナカライテスク社製）４ｇを水５０
０ｍｌに加熱溶解後、この溶液を４０℃に冷却した。こ
の溶液にブチルアルデヒド０．４８ｇを加え，次いで
０．５Ｎ塩酸溶液２．６ｍｌを滴下し、１２０ｒｐｍで
攪拌しながら５５℃で４時間保持した。反応溶液を４０
℃に冷却後、０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で中和し，
水及びブチルアルデヒドを減圧除去した。生成物を水１
００ｍｌに溶解させ，エタノール１リットル中に注ぎ、
沈澱させ、ろ過により沈澱物を回収し、エタノールで洗
浄後、５０℃で８時間真空乾燥した。得られたブチラー
ル化アガロース誘導体をジメチルホルムアルデヒドに溶
解させ、キャストフィルムを作製し、実施例４と同様に
して、赤外吸収スペクトルを測定した。その結果、ブチ
ラール化度は３７％であった。

【００５３】得られたブチラール化アガロース誘導体
（ブチラール化度：３７％）を用い、他は実施例１と同
様にして、実施例９のハイブリッド型人工膵臓を製造し
た。

【００５４】実施例１０ 実施例９で合成したブチラール化アガロース誘導体（ブ
チラール化度：３７％）３００ｍｇをＥａｇｌｅ’ｓ
ＭＥＭ溶液３．０ｍｌに加えて、溶媒に対するポリマー
濃度を１０重量％にしたこと以外は、実施例９と同様に
して、実施例１０のハイブリッド型人工膵臓を製造し
た。

【００５５】実施例１１ ブチルアルデヒドの使用量を０．７１ｇとしたこと、及
び０．５Ｎ塩酸溶液３．９ｍｌを滴下したこと以外は、
実施例９と同様にしてブチラール化アガロース誘導体を
合成した。実施例９と同様にして、赤外吸収スペクトル
を測定した結果、ブチラール化度は６６％であった。

【００５６】得られたブチラール化アガロース誘導体
（ブチラール化度：６６％）６００ｍｇをＥａｇｌｅ’
ｓ ＭＥＭ溶液３．０ｍｌに加えて溶媒に対するポリマ
ー濃度を２０重量％にしたこと以外は、実施例９と同様
にして、実施例１１のハイブリッド型人工膵臓を製造し
た。

【００５７】実施例１２ 実施例１１で合成したブチラール化アガロース誘導体
（ブチラール化度：６６％）９００ｍｇをＥａｇｌｅ’
ｓ ＭＥＭ溶液３．０ｍｌに加えて、溶媒に対するポリ
マー濃度を３０重量％にしたこと以外は、実施例１１と
同様にして、実施例１２のハイブリッド型人工膵臓を製
造した。

【００５８】比較例１ ホルマール化アガロース誘導体に代えてアガロースＬＧ
Ｔ（ナカラテスク社製）１５０ｍｇをＥａｇｌｅ’ｓ
ＭＥＭ溶液３．０ｍｌに加えて溶媒に対するポリマー濃
度を５重量％としたこと以外は、実施例１と同様にし
て、比較例１のハイブリッド型人工膵臓を製造した。

【００５９】比較例２ ホルマール化アガロース誘導体に代えてアガロースＬＧ
Ｔ（ナカラテスク社製）３００ｍｇをＥａｇｌｅ’ｓ
ＭＥＭ溶液３．０ｍｌに加えて溶媒に対するポリマー濃
度を１０重量％としたこと以外は、実施例１と同様にし
て、比較例２のハイブリッド型人工膵臓の製造を試みた
が、４０℃におけるポリマー溶液の粘度が高すぎるた
め、膵ラ島を分散することができず、マイクロカプセル
化することができなかった。

【００６０】比較例３ ハイブリッド型人工膵臓の代わりに、ハムスターの膵ラ
島そのものを比較例３として用意した。 （溶液粘度）

【００６１】実施例１で合成したホルマール化アガロー
ス誘導体（ホルマール化度：２２％）、実施例３で合成
したホルマール化アガロース誘導体（ホルマール化度：
４３％）、実施例５で合成したアセトアセタール化アガ
ロース誘導体（アセトアセタール化度：２８％）、実施
例７で合成したアセトアセタール化アガロース誘導体
（アセトアセタール化度：４３％）、実施例９で合成し
たブチラール化アガロース誘導体（ブチラール化度：３
７％）及び実施例１１で合成したブチラール化アガロー
ス誘導体（ブチラール化度：６６％）の１０、１５及び
２０重量％水溶液（実施例３，７及び１１で合成したア
ガロース誘導体については３０重量％水溶液も）を調製
し、Ｂ型粘度計（トキメック社製Ｂ８Ｍ型）を用いて、
４０℃における絶対粘度を測定した。また、比較例１で
用いたホルマール化されていないアガロースＬＧＴの
５、７．５及び１０重量％水溶液を調製し、先と同様に
４０℃における絶対粘度を測定した。これらの測定結果
を表１に示した。

【００６２】

【表１】

【００６３】表１に示すように、未処理のアガロース
（比較例１）は、ポリマー濃度の増加に従い絶対粘度が
顕著に上昇した。これに対して、ホルマール化、アセト
アセタール化、又はブチラール化アガロース誘導体で
は、ポリマー濃度が増加しても、絶対粘度がさほど上昇
しなかった。すなわち、アガロースをホルマール化、ア
セトアセタール化又はブチラール化することにより、４
０℃における溶液粘度を低下させることができ、高濃度
においてもマイクロカプセル化が可能となることがわか
る。

【００６４】（電気泳動）実施例１で合成したホルマー
ル化アガロース誘導体（ホルマール過度２２％）、実施
例３で合成したホルマール化アガロース誘導体（ホルマ
ール化度：４３％）、実施例５で合成したアセトアセタ
ール化アガロース誘導体（アセトアセタール化度：２８
％）、実施例７で合成したアセトアセタール化アガロー
ス誘導体（アセトアセタール化度：４３％）、実施例９
で合成したブチラール化アガロース誘導体（ブチラール
化度：３７％）及び実施例１１で合成したブチラール化
アガロース誘導体（ブチラール化度：６６％）をポリマ
ー濃度が５、１０及び１５重量％になるように電気泳動
緩衝液を用いて各誘導体分散液を調製した。また、比較
例１で用いたアガロースＬＧＴを用い、ポリマー濃度が
５及び７．５重量％になるように電気泳動を緩衝液を用
いてアガロース分散液を調製した。使用した電気泳動緩
衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン４．
８ｇ、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム０．７４ｇ
及び酢酸１．１４ｍｌに蒸留水を加えて１リットルとし
たものを用いた。

【００６５】水平様式で各種調整を行った電気泳動装置
（アドバンス社製ミューピッド−２）を用いて、Ｇａｍ
ｍｍａ Ｇｌｏｂｕｌｉｎｓ（Ｈｕｍａｎ）（ＳＲＭ社
製）を１００Ｖで２，３及び４時間電気泳動させ、各種
ゲルにおけるＧａｍｍｍａＧｌｏｂｕｌｉｎｓ（Ｈｕｍ
ａｎ）の移動速度を測定した。この移動速度からアガロ
ースＬＧＴ５重量％ゲルにおける移動速度に対する相対
移動速度を算出した。これらの測定結果を表２に示し
た。

【００６６】

【表２】

【００６７】表２に示すようにいずれのアガロースもポ
リマー濃度の上昇に伴い相対移動度が減少した。すなわ
ちポリマー濃度を上げることによりゲルの網目が小さく
なり、分子サイズの大きな液性抗体Ｇａｍｍｍａ Ｇｌ
ｏｂｕｌｉｎｓ：Ｍｗ１６００００等）はゲルの網目内
を移動し難くなることを示した。ホルマール化、アセト
アセタール化及びブチラール化アガロース誘導体は、未
処理のアガロースＬＧＴ５重量％ゲルより液性抗体の隔
離性能に優れ、高濃度化により高い免疫隔離性能を有す
る膜の作製が可能となることがわかる。 （移植試験）

【００６８】マウスの腹腔内に２５０ｍｇ／ｋｇのスト
レプトゾトシンを投与して糖尿病にした。週に１〜２回
鎖骨下静脈よりヘパリン採血し、非絶食時のプラズマ中
のグルコース濃度を測定した。プラズマグルコース濃度
が２回連続４００ｍｇ／ｄｌ以上の糖尿病マウスを移植
試験に用いた。この糖尿病マウスの腹腔内に、封入され
ていないハムスターの膵ラ島１０００個を移植して感作
した。この感作した糖尿病マウスを自然抗体が問題にな
る動物モデルとして使用した。感作後１４日目にハイブ
リッド型人工膵臓約１５００個を腹腔内に再移植した。
週に１〜２回採血し、非絶食時プラズマグルコース濃度
が２回連続して２５０ｍｇ／ｄｌを越えたマウスを糖尿
病に戻ったとし、その最初の日までを血糖値正常化日数
として表３に示した。

【００６９】

【表３】

【００７０】表３に示すように、感作した糖尿病マウス
に比較例３のようにハムスターの膵ラ島をそのまま移植
すると血糖値は全く正常化しない。これに対して、ハイ
ブリッド型にすると比較例１のように血糖値正常化期間
は延長するが、その結果は不十分である。これに対して
実施例１〜１２では血糖値正常化期間が著しく延長し、
１００日以上機能することがわかった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アセタール化されたアガロース誘導体の
   濃度が７〜５０重量％であるアガロース誘導体ゲルのマ
   イクロカプセルに、膵ランゲルハンス島が包括固定され
   ていることを特徴とする、ハイブリッド型人工膵臓。