JPH06153996A - ポリヌクレオチド検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 標的ＲＮＡを標識物で標識すると共に、リボ
ソームを固定した担体を用い該標的ＲＮＡを捕捉するこ
とを特徴とするＲＮＡ検出方法。標的ＤＮＡを標識物で
標識し該標的ＤＮＡを、担体に固定したリボソーム及び
リンカーポリヌクレオチドのうちのリンカーポリヌクレ
オチド部位にハイブリダイズさせてリボソームを固定し
た担体に捕捉することを特徴とする標的ＤＮＡの検出方
法。上記検出方法に用いる蛍光検出装置。 【効果】 本発明により、放射性同位元素を用いずに試
料中のウイルスなどの被測定ポリムクレオチドを感度よ
く定量測定することが可能となる。さらに，本発明で
は，ランダムアクセスが可能な自動化に適した標的ポリ
ヌクレオチド測定法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、疾病の原因となるウィ
ルス、リケッチャ、細菌等の外来性ポリヌクイレオチ
ド、あるいは、細胞中の遺伝子発現を担うｍＲＮＡ、並
びに特定の遺伝子部位の検出方法並び該検出方法に用い
る蛍光検出装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】標的となるポリヌクレオチド（ＤＮＡま
たはＲＮＡ）試料を固相に捕捉する方法、並びに、血液
や排泄物等の試料中の細菌やウィルス等の外来性の標的
ポリヌクレオチドを検出する方法が、特開昭５８−３１
９９８に開示されている。この方法では、試料中のポリ
ヌクレオチドを加熱等により変性させて一本鎖とした
後、これを、ニトロセルロース膜に固定する。次に、検
査したい細菌やウィルスのポリヌクレオチドと相補的な
塩基配列を持つ放射性同位元素標識されたポリヌクレオ
チドプローブを反応させた後、この膜を洗浄する。も
し、試料中に細菌やウィルスのポリヌクレオチドが含ま
れていれば、これに標識ポリヌクレオチドプローブがハ
イブリダイゼーション反応により会合して膜上に残る。
これをオートラジオグラフィーにより検出することで標
的ポリヌクレオチドの有無を判定できる。

【０００３】標的となるポリヌクレオチド（ＤＮＡまた
はＲＮＡ）試料を固相に捕捉する他の方法は、アナリテ
ィカル バイオケミストリー １９８巻（１９９１
年）、１３８頁から１４２頁（Ｓφｒｅｎ Ｒｉｃｈａ
ｒｄ Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔａｌ，Ａｎａｌｉｔｉ
ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８，１２８〜
１４２（１９９１））にエス．アール．ラスムッセンら
の方法が記載されている。この方法では、ポリヌクレオ
チドの５’末端のリン酸基を１−メチルイミダゾールと
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カ
ルボジイミドを用いて活性化し、表面に２級アミンを導
入したポリスチレンマイクロプレートに固定する。この
方法では２級アミンと活性化した５’末端のリン酸基が
反応するのでポリヌクレオチドの５’末端側がマイクロ
プレート表面に共有結合で固定される。この例では、固
定化されたポリヌクレオチドを用いて試料中の標的オリ
ゴヌクレオチドを捕捉することをできる。いずれの方法
でも、³²Ｐ等で標識したプローブを用いて特定のオリゴ
ヌクレオチドを検出することができる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】特開昭５８−３１９９
８記載のポリヌクレオチド検出法では、標的ポリヌクレ
オチドをニトロセルロースやナイロン等の担体膜に物理
吸着により固定している。担体膜上の単位面積当りの吸
着席は限られているので、試料溶液中にタンパク質や目
的外のポリヌクレオチド等の夾雑物が多量に含まれると
相対的に標的ポリヌクレオチドの固定量が低下する問題
点がある。また、ナイロン担体膜等のような布状物質を
水溶液中で扱うことは自動化が困難である上、オートラ
ジオグラフィーを用いるため標的ポリヌクレオチドの有
無の判定かせいぜいフィルムの黒化度から半定量測定が
行われるにすぎない。アナリティカル バイオケミスト
リー１９８巻（１９９１年）、１３８頁から１４２頁
（Ｓφｒｅｎ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ
ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌｉｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ １９８，１２８〜１４２（１９９１））記載
のポリヌクレオチド検出法では、標的ポリヌクレオチド
に相補的なオリゴヌクレオチドを化学的に固定したマイ
クロプレート担体を用いる。この方法では標的ポリヌク
レオチドを特異的に捕捉できるので、上記吸着席の問題
は回避できる。また、マイクロプレートを担体として用
いるため装置化に際しても対応できる。しかし、測定対
象となる標的ポリヌクレオチド毎に相補的なオリゴヌク
レオチドを合成し、担体毎に固定する必要があるので、
担体調製に手間がかかる問題点がある。また、あらかじ
めオリゴヌクレオチドを固定したマイクロプレートを準
備する都合上、複数の測定対象物に対してランダムアク
セスすることが難しい。ランダムアクセス機構は検体ご
とに異なる検査項目を処理する上で特に臨床フィールド
では重要である。加えて上記測定方法では標識に放射性
同位元素を使用するために、作業者の放射線被爆を考慮
する必要があり、臨床フィールドで使用するには不都合
な面が指摘されている。本発明は、定量的な測定が可能
で、かつ臨床フィールドで複数種の標的ポリヌクレオチ
ドをランダムアクセスが可能で、スループットの高い自
動化装置の構築が可能な手法を提供することにある。加
えて，本発明では，従来法には無い機能として，転写活
性を持つＲＮＡを選択的に検出できる手段を提供するこ
とにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、標的ポ
リヌクレオチドがＲＮＡであって、該標的ＲＮＡを標識
物で標識するとともに担体に固定して標的ＲＮＡを検出
する方法において、リボソームを固定した担体を用い該
標的ＲＮＡを捕捉することを特徴とするポリヌクレオチ
ド検出方法にある。ここで、標的ＲＮＡの標識は予め標
識しておいてもよく、またリボソームを固定した担体に
捕捉した後に標識してもよい。

【０００６】さらに、本発明は、標的ポリヌクレオチド
がＤＮＡであって、該標的ＤＮＡを標識物で標識し担体
に捕捉して検出する方法において、リボソームを固定し
た担体を用いるとともに該リボソームに、該リボソーム
と結合しうるＲＮＡ配列及び前記標的ＤＮＡに相補的な
リンカーポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを結
合し、かつ前記リンカーポリヌクレオチドと前記標的Ｄ
ＮＡとをハイブリダイズさせてポリヌクレオチド会合体
を形成させることにより、標的ＤＮＡを捕捉することを
特徴とする標的ポリヌクレオチドの検出方法にある。こ
こで、標的ＤＮＡの標識は予め標識しておいてもよく、
またリボソームを固定した担体に捕捉した後に標識して
もよい。

【０００７】上記ＲＮＡとしてはＲＮＡウィルス、ｍＲ
ＮＡが挙げられ、リボソームとしては真核生物のリボソ
ームあるいは原核生物のリボソームが挙げられる。ま
た、標識物としては、蛍光体があげられる。さらに、本
発明は、少なくとも一種以上の励起光を発射する光源、
該光源から発射された励起光のビーム径を拡大するビー
ムエクスパンダー、ビーム径が拡大された励起光を一定
方向に曲折させるとともに反応担体が発する蛍光を透過
させることのできる鏡、当該鏡により曲折させた励起光
を架台上に載置した反応担体上に照射するための集光レ
ンズ、反応担体が発する蛍光を検出する蛍光検出機構、
反応担体の下部に該反応担体を透過した励起光を受ける
フォトダイオード、前記フォトダイオードの信号が最大
となるように反応担体を載置した架台を一定方向に駆動
する駆動機構、前記蛍光検出機構からの信号をフォトダ
イオードからの位置情報と同期させて計数する装置から
なることを特徴とする蛍光検出装置にある。

【０００８】先ず、本発明のポリヌクレオチド検出法が
ＲＮＡウィルス由来のＲＮＡやｍＲＮＡに対して適応さ
れる場合について説明する。その試料調製法としては、
具体的被測定対象の種類に応じ田公知の方法を用いるこ
とができる。これらＲＮＡは１本鎖であることが多く、
多くの場合その５’末端あるいはその近傍にリボソーム
結合部位を含む。例えば、真核生物のｍＲＮＡは５’末
端にキャップ構造を有しこれがリボソームと結合しう
る。もちろんこれにはキャップ結合タンパク質とよばれ
る一群の因子が必要である。あるいは、ＲＮＡウィルス
の１種であるＣ型肝炎ウィルスでは５’末端近傍の約３
３０塩基のノンコーディング部位の一部がリボソームと
結合しうる。このように５’末端キャップ構造ではなく
５’末端近傍のノンコーディング部位がリボソームと結
合する他の例としては、ピコナウィルスが知られてい
る。そこで、適当な方法で担体上に固定したリボソーム
を用意することができれば、これらＲＮＡを捕捉するこ
とができる。リボソームを固定した担体の調製法として
は、例えば担体としてガラス、光学的に透明なプラスチ
ック、シリコンウエファース、セルロース膜等を用い、
表面にシランカップリング反応を用いて官能基を導入し
リボソームの官能基との間で架橋することで得られる。
例えばアミノ基を導入したガラスとリボソームのアミノ
基のあいだをグルタルアルデヒドで架橋することで調製
することができる。 本発明のポリヌクレオチド検出法
がＤＮＡ等で直接リボソームと結合できないものに対し
て適応される場合について説明する。その試料調製法と
しては、具体的被測定対象の種類に応じた公知の方法を
用いることができる。

【０００９】ＤＮＡ等ではリボソームと結合できるよう
にする必要がある。あらかじめリボソームと結合しうる
ＲＮＡ配列を含みかつ該標的ポリヌクレオチドに相補的
なリンカーポリヌクレオチドを用意し、これを標的ポリ
ヌクレオチドとハイブリダイズさせ標的ポリヌクレオチ
ド会合体を形成させることで標的ポリヌクレオチドにリ
ボソームに結合できる部位を導入する。これにより標的
ポリヌクレオチドをリボソームを固定した担体で捕捉で
きるようになる。

【００１０】本発明で用いられるリボソームは前述のと
おり、真核生物のリボソームあるいは原核生物のリボソ
ームであるが、このリボソームには精製されたものの他
リボソームを含む動物或いは植物の器官の抽出物も含ま
れる。このリボソームとして、具体的には小麦胚芽抽出
物、肝細胞抽出物、うさぎ等の網状赤血球抽出物、大腸
菌抽出物等が用いられる。

【００１１】リボソームを固定した担体に捕捉した標的
ポリヌクレオチドを検出するには、蛍光体を用いて標的
ポリヌクレオチドを標識する。標的ポリヌクレオチドの
標識は、標的ポリヌクレオチドをリボソームを固定した
担体に捕捉する前でも後でも良い。標識法としては、標
的ポリヌクレオチドに相補的な合成オリゴヌクレオチド
に蛍光体を導入したものを用意し、これを標的ポリヌク
レオチドにハイブリダイゼーション反応により結合させ
る方法や、標的ポリヌクレオチドが２本鎖の場合、リガ
ーゼ反応を用いて蛍光標識プライマーを導入する方法、
ポリメラーゼを用いて蛍光標識ジデオキシリボヌクレオ
チドを導入する方法などが可能である。

【００１２】

【作用】標的ポリヌクレオチドがｍＲＮＡやウィルスＤ
ＮＡではそれ自体がリボソームと結合できるので、これ
ら標的ポリヌクレオチドをリボソーム固定担体で捕捉す
ることができる。標的ポリヌクレオチドがＤＮＡなどの
リボソームと直接結合できないものでは、リボソームと
結合しうる配列のポリヌクレオチドをあらかじめ標的ポ
リヌクレオチドに結合させることでリボソーム固定担体
で捕捉することができる。標的ポリヌクレオチドに標識
体を結合させておけば、標的ポリヌクレオチドを中心と
したリボソームと標識体のサンドイッチハイブリッドが
形成される。この時、リボソームは担体に固定されてい
るので、標識体は標的ポリヌクレオチドの量に相関のあ
る値として担体表面に固定される。よって、担体表面に
残存する標識体量を調べることで試料中の標的ポリヌク
レオチドの量がわかる。

【００１３】標識体としては蛍光体、酵素、化学発光物
質、アイソトープ等が利用できる。標識用の蛍光体とし
ては、Ｂ−フィコエリスリンやＲ−フィコエリスリン等
のフィコビリプロテイン、ローダミン、フルオレッセイ
ン、４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１、３−ジアゾー
ル、フタロシアニン等とこれらの誘導体、ならびにこれ
ら蛍光体を含むポリマーを用いることができる。ただ
し、フィコビリプロテインは熱安定性や変性剤に対する
安定性に問題があるため、あらかじめ標的ポリヌクレオ
チドに会合したプローブにビオチン−アビジンあるい
は、ハプテン−抗−ハプテン抗体等を用いて標識する必
要がある。また、フルオレッセイン等の短波長蛍光体は
散乱光や背景光の影響を受けやすいので、かかる蛍光体
としてはローダミン系のスルホローダミン１０１がよ
い。これら蛍光体のポリヌクレオチドへの結合方法は特
に限定されるものではない。例えば、標識プローブを標
的ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせて標識するに
は、標識プローブを用意する必要がある。標識プローブ
の調製法としてはアミノ基導入試薬で５’末端に蛍光体
を標識する方法や、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，９６８−９７２（１９８
５）記載のアミノ化チミジンを用いて任意のチミン位置
に蛍光体を導入する方法、あるいは特開昭６１−４４３
５３号開示の方法、即ちポリヌクレオチドのリン酸基を
官能機を有するスルホン酸基に置き換え、この官能基に
蛍光体を結合させることにより蛍光標識プローブを調製
し、標的ポリヌクレオチドの任意の位置に標識体を導入
することができる。

【００１４】

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。ただし、これら実施例は本発明の技術的範囲を限定
するものではない。 （実施例１）リボソーム固定担体の調製 本発明のリボソーム固定担体の一調製法を示す。 使用
するリボソームは小麦胚芽抽出物として用いる。この小
麦胚芽抽出物はｍＲＮＡの情報からペプチドを合成する
能力があり（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｓ．Ｓｐｉｒｉｎ
ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２４２，１１６
２−１１６４（１９８８））、真核生物由来のｍＲＮＡ
や真核生物に感染するＲＮＡウィルスを捕捉するのに適
している。ここでは市販のタンパク質無細胞合成系小麦
胚芽抽出物を各０．１μｇ／ｍｌのアプロチニン、ペプ
スタチン、ロイペプチンと１１２ｍＭ酢酸カリウム、
１．９ｍＭ酢酸マグネシウム、２％グリセリン等を含む
４０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）で希釈透析して用
いる。抽出物の濃度は約１０μｇ／ｍｌである。

【００１５】これとは別に、リボソーム固定用担体を用
意する。図１は反応担体の一実施形態である。担体上
に、直径２ｍｍの反応部２が設けられ周囲のフッ化エチ
レン樹脂でできた堤１で溶液を保持する構造となってい
る。かかる反応担体の素材は、リボソームを固定する適
当な反応残基が容易に導入可能で、標識物からの信号を
検出可能な限りにおいて特に限定されるものではない。
例えば、ガラス、シリコンウェハー、光学的に平坦な構
造を有するプラスチックを用いるのが好ましい。

【００１６】本実施例では担体として無蛍光ガラスを用
いる例について説明する。先ずガラス担体表面を十分に
洗浄し、３６ｍＭの３−（２アミノエチルアミノプロピ
ル）トリメトキシシラン水溶液中で３０分間処理し、水
洗後１０５℃で１時間風乾する。次に２．５％グルタル
アルデヒド水溶液50mlで６時間処理し表面を活性化した
無蛍光ガラスを得る。 次に、前記したリボソーム混合
液１０μｌを添加し２時間反応させる。各０．１μｇ／
ｍｌのアプロチニン、ペプスタチン、ロイペプチンと１
１２ｍＭ酢酸カリウム、１．９ｍＭ酢酸マグネシウム、
０．２５ｍＭスペルミジン、６ｍＭジチオスレイトー
ル、２％グリセリンを含む４０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ
７．６）で洗浄する。以上の操作でリボソームを含むＳ
３０抽出物を固定した無蛍光ガラス担体を得る。 ここ
では担体にアミノ基を導入した無蛍光ガラスを用いた
が、リボソームを固定できる残基を持つものであれば特
に限定する必要はないことは前にも述べた。具体的に
は、表面にアミノ基を持つマイクロプレート（例えば、
住友ベークライト株式会社製、アミノプレート）をグル
タルアルデヒドで活性化して用いても同様にリボソーム
を固定した担体を得ることができる。表面を酸化したシ
リコンウェハーをシランカップリング処理してアミノ基
を導入し、グルタルアルデヒドで活性化して用いてもよ
い。カルボキシル基を持つマイクロプレート（例えば、
住友ベークライト株式会社製、カルボプレート）を０．
２Ｍ １−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミドのｐＨ５〜６の水溶液で活性化した後、水
洗し、該リボソームを固定しても良い。 （実施例２）リボソーム結合性の特異的ＲＮＡの検出 ここでは肝細胞由来のリボソームを実施例１の方法に従
い固定したマイクロプレートを用いてＣ型肝炎ウィルス
のＲＮＡを定量検出する例を示す。

【００１７】Ｃ型肝炎ウィルスのＲＮＡには５’末端近
傍に約３５０塩基長からなるタンパク質非翻訳部位があ
り、該非翻訳部位をリボソームが認識することが知られ
ている（小原恭子、実験医学ｖｏｌ．９（増刊）１３３
−１３８（１９９１））。試料は濃度既知のＣ型肝炎ウ
ィルスのＲＮＡを、５ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、５
０％ホルムアミド、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナト
リウム）、１００μｇ／ｍｌキャリヤーＤＮＡ（変性サ
ケＤＮＡ）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、を含むｐＨ７の５０
ｍＭハイブリダイゼージョン用バッファーで順次希釈し
調製したものである。

【００１８】検出に使用する蛍光標識プローブは、配列
番号１記載のポリヌクレオチドにスルホローダミン１０
１蛍光体を結合させて用いる。配列番号１のポリヌクレ
オチドは標的Ｃ型肝炎ウィルスのＲＮＡの３’近傍に相
補的に結合する。以下該蛍光標識プローブの調製法を説
明する。配列番号１の構造の５１塩基のポリヌクレオチ
ドをホスホアミダイト法（Ｍｃ Ｂｒｉｄｅ，Ｌ．Ｊ．
ａｎｄＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｅｔｒａｈ
ｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ．２４，２４５−
３４８（１９８３）に従い合成する。この際、合成の最
終段において、Ｎ−モノメトキシトリチルアミノヘキサ
−６−オキシ−β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロ
ピルアミノホスホアミダイトを反応させてアミノ基を
５’末端に導入する。また、１２番、２５番、３９番、
５１番、のチミン残基には、ウリジンの５位にアミノ基
を導入した式１記載の

【００１９】

【化１】

【００２０】アミノ化チミジンの５’水酸基を４、４’
−ジメトキシトリチル基保護したものを用いる。この構
造のアミノ化チミジンはＧｅｏｆｆｒｅｙ Ｂ． ｅｔ
ａｌ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８２，９６８−９７２（１９８５）の方法
に従い調製する。遊離のアミノ基をトリフルオロアセチ
ル化し、３’水酸基をクロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル
アミノメトキシホスフィンで活性化して用いる。次に、
上記手法により合成した組成ポリヌクレオチドは３０％
アンモニア水に溶解している。氷冷下酢酸で中和した後
２．５倍容量のエタノールを加え合成ポリヌクレオチド
を回収する。沈殿を１Ｍ ＮａＣｌに溶解し再度２．５
倍容量のエタノールで沈殿させる。この操作をさらに２
回繰り返すことにより、アンモニアや未反応ヌクレオチ
ド等の低分子の反応夾雑物が除かれる。次に合成ポリヌ
クレオチドを０．５Ｍ 炭酸緩衝液（ｐＨ９）に溶解
し、２５０倍ｍｏｌのスルホローダミン１０１酸クロラ
イドを添加する。スルホローダミン１０１酸クロライド
はあらかじめアセトニトリルに溶解して使用するが、ア
セトニトリルは反応時に２０％前後になることが重要で
ある。アセトニトリル濃度が高すぎるとポリヌクレオチ
ドが沈殿しやすく、低すぎるとスルホローダミン１０１
酸クロライドが沈殿しやすくなる。遮光下１６時間室温
で反応させた後、塩酸で中和し、２．５倍容量のエタノ
ールを加え沈殿を回収する。沈殿を１Ｍ ＮａＣｌに溶
解し再度２．５倍容量のエタノールで沈殿させる。この
ようにして調製した粗製のスルホローダミン１０１標識
プローブを５０％ホルムアミド共存下で熱変性した後、
７Ｍ尿素を含む１９％ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により精製する。このようにして調製した標識プローブ
は電気泳動的に単一バンドの純品である。

【００２１】実際のＣ型肝炎ウィルスのＲＮＡの測定手
順について説明する。濃度既知のＣ型肝炎ウィルスのＲ
ＮＡを含む試料溶液１０μｌに上記手法により調製した
スルホローダミン１０１標識プローブ１ｐｍｏｌを添加
し熱変性後ハイブリダイゼーション条件下で３０分間放
置する。５ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミン、各０．１μｇ
／ｍｌのアプロチニン、ペプスタチン、ロイペプチンと
１１２ｍＭ酢酸カリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１．９
ｍＭ酢酸マグネシウム、０．２５ｍＭスペルミジン、６
ｍＭジチオスレイトール、２％グリセリンを含む４０ｍ
Ｍヘペス緩衝液（ｐＨ７．６）９０μｌで希釈し、実施
例１記載のリボソーム固定無蛍光ガラス担体に添加す
る。４時間攪拌した後に、５ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブミ
ン、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１１２ｍＭ酢酸カリ
ウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１．９ｍＭ酢酸マグネシウ
ム、０．２５ｍＭスペルミジン、２％グリセリンを含む
４０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．６）で洗浄する。 反
応の終了した反応担体上の蛍光標識プローブの結合部を
検出するには、Ｈｅ／Ｎｅレーザー（５９４ｎｍ）（あ
るいはＮａランプなど）と光電子増倍管（あるいは高感
度半導体センサー）を用いて反応担体反応部から発する
蛍光を測定する。もちろん他の光源と蛍光体の組みあわ
せを用いてもよい。本実施例では担体に無蛍光ガラスを
用いている。図２に記載のような反射型の蛍光測定装置
を用いて反応担体上方から測定すると励起光除去が容易
なので高感度な測定系が得られる。

【００２２】図３に各種濃度のＣ型肝炎ウィルスＲＮＡ
の測定結果を実線で示す。なお従来用いられているナイ
ロン膜にＣ型肝炎ウィルスＲＮＡを直接固定し、本発明
で用いたのと同じ蛍光標識プローブを用いて測定を行っ
た結果を破線で示す。従来法でも図2記載の装置を用い
て蛍光測定を行ったが、試料反応部を自動的に検出する
ことはできないのでマニュアル操作で測定した。その結
果本発明によれば従来法に比べ約１桁高感度に定量測定
できることがわかる。測定のダイナミックレンジは4桁
以上を確保でき従来法の蛍光法（図３破線）やオートラ
ジオグラフィーを用いた検出法に比べ１桁ないし２桁広
い。これらの効果は，主にリボソームを固定する担体に
背景光の低いガラスを用いたことによる。また、従来法
ではナイロンやニトロセルロース製のメンブレンを担体
として使用するため、機械強度が弱く取扱が不便であっ
たが、本発明ではガラスやシリコンウェハー等でできた
担体を用いるため自動化に適している。また，本方法
が，転写活性のあるポリヌクレオチドのみを選択的に測
定できる利点があることを示すために，同様の実験をＭ
１３由来のＤＮＡとこれに相補的に結合する蛍光標識プ
ローブを用いて行った。その結果，Ｍ１３由来のＤＮＡ
を検出することはできなかった。Ｍ１３由来のＤＮＡそ
れ自体は転写活性を持たないので，リボソーム固定担体
で捕捉することができない。よって，本発明は，試料中
の転写活性のあるポリヌクレオチド，即ち，ＲＮＡウイ
ルスやｍＲＮＡ等を選択的に選別測定できる利点がある
ことが示された。

【００２３】（実施例３）本発明のポリヌクレオチドノ
検出方法に使用する蛍光検出装置 本発明のポリヌクレオチドの検出方法に使用する蛍光測
定装置の一例を図２により説明する。レーザー光源１０
１の光は、ビームエキスパンダー１０２でビーム径を拡
張し、ダイクロイックミラー１０３で反射される。ダイ
クロイックミラー１０３は５９４ｎｍの光を反射し、６
１０ｎｍ以上の光を８０％以上透過するものを使用す
る。ダイクロイックミラー１０３で反射された光は、ス
リット１０９を通過した後、集光レンズ１０８で集光さ
れ、反応担体１００の反応部の直径２ｍｍの範囲を照射
する。反応部に蛍光体が存在する部位にレーザースポッ
トがあたると蛍光が発生する。蛍光は集光レンズ１０８
を通り、ダイクロイックミラー１０３を通過する。バン
ドパスフィルター１１０を通過した後、光電子増倍管１
１１で検出される。これとは別に反応担体の下部にはフ
ォトダイオード１２０が配置されている。反応担体の反
応部ではレーザー光が反応担体を透過しフォトダイオー
ドに達するが、フッ化エチレン樹脂堤の部分は光の透過
率が低下する。フォトダイオード１２０の信号が最大に
なるように駆動機構１３２を用いて反応担体の反応部を
自動的に検索できる。光電子増倍管１１１検出された信
号は、マイクロプロセッサー１５１に取り込まれ、フォ
トダイオードからの位置情報と同期させて処理すること
で、各反応部における蛍光強度を算出する。この方法
で、反応部毎の蛍光強度を測定できる。

【００２４】（実施例４）特異的ＤＮＡの検出 ここでは実施例２記載のリボソーム固定無蛍光ガラス担
体を用いて直接リボソームと結合することのできないＤ
ＮＡを検出する例を示す。標的ＤＮＡは２本鎖のＭ１３
ｍｐ１８とバクテリオファージλのＥｃｏＲＩ分解物で
ある。両者は本方法のランダムアクセス性を示すために
同一反応担体上の異なる反応部で同時に測定を行う。

【００２５】Ｍ１３ｍｐ１８やバクテリオファージλは
ＤＮＡであるので、Ｃ型肝炎ウィルスのＲＮＡのような
リボソームとの結合部位をもたない。そこでリボソーム
との結合部位を導入する必要がある。そこでこれら標的
ＤＮＡとリボソームに結合しうるリンカーポリヌクレオ
チドを用いる。Ｍ１３ｍｐ１８用のリンカーポリヌクレ
エオチドは配列番号２の構造の物で、ホスホアミダイト
法（Ｍｃ Ｂｒｉｄｅ，Ｌ．Ｊ． ａｎｄ Ｃａｒｕｔ
ｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ
ｅｒｓ，ｖｏｌ．２４，２４５−３４８（１９８３）に
従い合成する。もちろん目的のリンカーが得られる限り
において合成法は限定されるものではない。リンカーポ
リヌクレオチドの５’末端から３５０番目の塩基までは
Ｃ型肝炎ウィルスＲＮＡの５’末端の非翻訳領域であ
る。３５７番目から３’末端側の３７塩基はＭ１３ｍｐ
１８に相補的な配列である。３５１番目から３５６番目
の配列はＡＡＧＣＴＴで制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩの切
断部位で、必要に応じて標的となるポリヌクレオチドに
相補的な他のプローブを導入できる構造となっている。
バクテリオファージλのＥｃｏＲ Ｉ分解物に相補的な
リンカーポリヌクレオチドは、上記Ｃ型肝炎ウィルスＲ
ＮＡの５’末端の非翻訳領域に配列番号３記載のオリゴ
ヌクレオチドを結合したものである。配列番号３記載の
オリゴヌクレオチドは５’末端に制限酵素Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩ切断部位を含み、バクテリオファージλのＥｃｏＲ
Ｉ分解物に相補的な配列のポリヌクレオチドである。

【００２６】標的ポリヌクレオチドであるＭ１３ｍｐ１
８やバクテリオファージλのＥｃｏＲＩ分解物はあらか
じめ蛍光標識して用いる。目的とするＭ１３ｍｐ１８と
バクテリオファージλをＥｃｏＲ Ｉで切断し、切断部
に蛍光体を導入する。蛍光体導入法には蛍光標識ヌクレ
オチドモノマーをＤＮＡポリメラーゼで導入する方法、
蛍光標識付きオリゴヌクレオチドをライゲーション反応
でつける方法、あるいは全ＤＮＡ鎖にビオチンを導入し
蛍光標識アビジン等を結合させる方法やエテノ化反応に
よりＤＮＡ自身を蛍光性に変換する方法があるが、ここ
ではライゲーションによる蛍光標識オリゴマーの導入を
行う。ここで使用する螢光標識オリゴマーは配列番号４
記載の構造の２本鎖ＤＮＡで、３’末端は制限酵素Ｅｃ
ｏＲ Ｉの切断部位に一致する。５’末端と５’末端か
ら１２塩基目、２４塩基目にはスルホローダミン１０１
蛍光体が結合している。スルホローダミン１０１の標識
法は前記実施例１における標的Ｃ型肝炎ウィルスのＲＮ
Ａの３’近傍に相補的に結合する該蛍光標識プライマー
の調製法に従う。即ち、該螢光標識部位の塩基としてア
ミノ化チミジンを用いてオリゴマーを合成し、該アミノ
基にスルホローダミン１０１酸クロライドで修飾した物
である。 実際のＭ１３ｍｐ１８とバクテリオファージ
λのＥｃｏＲ Ｉ分解物の測定手順について説明する。
スルホローダミン１０１標識した濃度既知のＭ１３ｍｐ
１８とバクテリオファージλを含む試料溶液１０μｌに
上記手法により調製したリンカーポリヌクレオチド１ｐ
ｍｏｌ（１μｌ）を添加し５６℃ハイブリダイゼーショ
ン条件下で６時間放置する。５ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブ
ミン、各０．１μｇ／ｍｌのアプロチニン、ペプスタチ
ン、ロイペプチンと１１２ｍＭ酢酸カリウム、０．５Ｍ
ＮａＣｌ、１．９ｍＭ酢酸マグネシウム、０．２５ｍ
Ｍスペルミジン、６ｍＭジチオスレイトール、２％グリ
セリンを含む４０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．６）９０
μｌで希釈し、実施例１記載のリボソーム固定無蛍光ガ
ラス担体に添加する。４時間反応させた後に、５ｍｇ／
ｍｌ牛血清アルブミン、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、
１１２ｍＭ酢酸カリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１．９
ｍＭ酢酸マグネシウム、０．２５ｍＭスペルミジン、２
％グリセリンを含む４０ｍＭヘペス緩衝液（ｐＨ７．
６）で洗浄する。

【００２７】反応の終了した反応担体上の蛍光標識プロ
ーブの結合部を検出するには、実施例２と同様にＨｅ／
Ｎｅレーザー（５９４ｎｍ）（あるいはＮａランプな
ど）と光電子増倍管（あるいは高感度半導体センサー）
を用いて図２に記載の反射型の蛍光測定装置を用いて反
応担体反応部から発する蛍光を測定する。図４に各種濃
度のＭ１３ｍｐ１８とバクテリオファージλのＥｃｏＲ
Ｉ分解物の測定結果を示す。その結果本発明によれば、
Ｍ１３ｍｐ１８とバクテリオファージλのＥｃｏＲＩ分
解物を定量的に測定できる。また、螢光が検出された反
応部を加熱し、遊離して来るポリヌクレオチドを螢光式
電気泳動で分析したところ、Ｍ１３ｍｐ１８を反応させ
た反応部からはＭ１３ｍｐ１８由来の約７２００塩基長
の螢光標識ポリヌクレオチドが検出された。また、バク
テリオファージλのＥｃｏＲＩ分解物を反応させた反応
部からは、バクテリオファージλのＥｃｏＲＩ分解物由
来の約７４００塩基長の螢光標識ポリヌクレオチドが検
出された。このように、リボソームに直接結合しないよ
うなＤＮＡ等でも本発明のリンカーポリヌクレオチドを
用いることで捕捉できるようになるので、任意のＤＮＡ
等をリボソーム固定担体を用いて測定できる。また、任
意の測定対象物を同一担体上で測定出来るので異なる測
定対象物にたいしてランダムアクセス出来る利点がある
ので，本リボソーム固定担体を用いる方法は自動化に適
している。

【００２８】また、本発明ではガラスやシリコンウェハ
ー等でできた担体を用いるため自動化に適している。

【００２９】

【発明の効果】本発明により、放射性同位元素を用いず
に試料中のウイルスなどの被測定ポリムクレオチドを感
度よく定量測定することが可能となる。さらに，本発明
では，任意の試料ポリヌクレオチドを単一の試料捕捉用
担体で共通に測定可能である利点があるので，ランダム
アクセスが可能な自動化に適した標的ポリヌクレオチド
測定法が提供される。また，本発明では，転写活性のあ
るＲＮＡを選択的に捕捉検出できる利点がある。

【００３０】

【配列表】

配列番号 ：１ 配列の長さ：５１ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：標識物を含む合成ポリヌクレオチド 配列 ： GCCTATTGGCCTGGAGTGTTTATCTCCCCGTTCATCGGTTGGGGAGCAGGT 配列番号 ：２ 配列の長さ：３９３ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ポリヌクレオチド 配列 ： CGAUUGGGGGCGACACUCCACCAUAGAUCACUCCCC 36 UGUGAGGAACUACUGUCUUCACGCAGAAAGCGUCUA 72 GCCAUGGCGUUAGUAUGAGUGUCGUGCAGCCUCCAG 108 GACCCCCCCUCCCGGGAGAGCCAUAGUGGUCUGCGG 144 AACCGGUGAGUACACCGGAAUUGCCAGGACGACCGG 180 GUCCUUUCUUGGAUCAACCCGCUCAAUGCCUGGAGA 216 UUUGGGCGUGCCCCCGCGAGACUGCUAGCCGAGUAG 252 UGUUGGGUCGCGAAAGGCCUUGUGGUACUGCCUGAU 288 AGGGUGCUUGCGAGUGCCCCGGGAGGUCUCGUAGAC 324 CGUGCACCAUGAGCACGAAUCCUAAAAAGCTTGTTT 360 TCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT 393 配列番号 ：３ 配列の長さ：４３ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ポリヌクレオチド 配列 ： AAGCTTATTGCATAATCTTTCAGGGTTATGCGTTGTTCCATAC 配列番号 ：４ 配列の長さ：３２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖を含む２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：標識物を含む合成ポリヌクレオチド 配列 ： AAACAGATCACTCGCTGAGCGGGTTATGGTTG TTTGTCTAGTGAGCGACTCGCCCAATACCAACTTAAG

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明に使用するリボソーム固定担体を示す
図である。

【図２】 本発明での蛍光測定装置を示す図である。

【図３】 Ｃ型肝炎ウイルスの測定結果を示す図であ
る。

【図４】 Ｍ１３ｍｐ１８とバクテリオファージλのＥ
ｃｏＲＩ分解物の測定結果を示す図である。

【符号の説明】

１…フッ化エチレン樹脂堤、２…反応部、１００…反応
担体、１０１…Ｈｅ／Ｎｅレーザー、１０２…ビームエ
キスパンダー、１０３…ダイクロイックミラー、１０８
…集光レンズ、１０９…スリット、１１０…バンドパス
フィルター、１１１…光電子増倍管、１２０…フォトダ
イオード、１３１…架台、１３２…駆動機構、１５１…
マイクロプロセッサー

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 永井 啓一 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者 神原 秀記 東京都国分寺市東恋ケ窪１丁目280番地 株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者 杉浦 正彦 東京都杉並区高円寺南１丁目34番５号 株 式会社ビー・エム・エル内 (72)発明者 片山 和彦 東京都杉並区高円寺南１丁目34番５号 株 式会社ビー・エム・エル内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 標的ポリヌクレオチドがＲＮＡであっ
   て、該標的ＲＮＡを標識物で標識するとともに担体に固
   定して標的ＲＮＡを検出する方法において、リボソーム
   を固定した担体を用い該標的ＲＮＡを捕捉することを特
   徴とするポリヌクレオチド検出方法。
2. 【請求項２】 標的ポリヌクレオチドがＤＮＡであっ
   て、該標的ＤＮＡを標識物で標識し担体に捕捉して検出
   する方法において、リボソームを固定した担体を用いる
   とともに該リボソームに、該リボソームと結合しうるＲ
   ＮＡ配列及び前記標的ＤＮＡに相補的なリンカーポリヌ
   クレオチドを含むポリヌクレオチドを結合し、かつ前記
   リンカーポリヌクレオチドと前記標的ＤＮＡとをハイブ
   リダイズさせてポリヌクレオチド会合体を形成させるこ
   とにより、標的ＤＮＡを捕捉することを特徴とする標的
   ポリヌクレオチドの検出方法。
3. 【請求項３】 ＲＮＡがＲＮＡウィルスであることを特
   徴とする特許請求範囲１記載のポリヌクレオチド検出方
   法。
4. 【請求項４】 リボソームが真核生物のリボソームある
   いは原核生物のリボソームであることを特徴とする請求
   項１記載のポリヌクレオチドの検出方法。
5. 【請求項５】 リボソームが真核生物のリボソームある
   いは原核生物のリボソームであることを特徴とする請求
   項２記載のポリヌクレオチドの検出方法。
6. 【請求項６】 標識物がが蛍光体であることを特徴とす
   る請求項１記載のポリヌクレオチドの検出方法。
7. 【請求項７】 標識物がが蛍光体であることを特徴とす
   る請求項２記載のポリヌクレオチドの検出方法。
8. 【請求項８】 少なくとも一種以上の励起光を発射する
   光源、該光源から発射された励起光のビーム径を拡大す
   るビームエクスパンダー、ビーム径が拡大された励起光
   を一定方向に曲折させるとともに反応担体が発する蛍光
   を透過させることのできる鏡、当該鏡により曲折させた
   励起光を架台上に載置した反応担体上に照射するための
   集光レンズ、反応担体が発する蛍光を検出する蛍光検出
   機構、反応担体の下部に該反応担体を透過した励起光を
   受けるフォトダイオード、前記フォトダイオードの信号
   が最大となるように反応担体を載置した架台を一定方向
   に駆動する駆動機構、前記蛍光検出機構からの信号をフ
   ォトダイオードからの位置情報と同期させて計数する装
   置からなることを特徴とする蛍光検出装置。