JPH06145190A - 化学的に定義されたオリゴサッカライド、その誘導体、類縁体及びそれらに対する抗体による腫瘍細胞の転移ポテンシャル及び浸潤の阻害 - Google Patents

化学的に定義されたオリゴサッカライド、その誘導体、類縁体及びそれらに対する抗体による腫瘍細胞の転移ポテンシャル及び浸潤の阻害

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JPH06145190A
JPH06145190A JP4175802A JP17580292A JPH06145190A JP H06145190 A JPH06145190 A JP H06145190A JP 4175802 A JP4175802 A JP 4175802A JP 17580292 A JP17580292 A JP 17580292A JP H06145190 A JPH06145190 A JP H06145190A
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Sen-Itiroh Hakomori
ハコモリ センイチロウ
Handa Kazuko
ハンダ カズコ
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トヨクニ タツシ
Edward Nudelman
ヌデルマン エドワード
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル
−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa 及びシアロシル−Ｌ
ｅx の類縁体(mimetics)からなる群から選ばれた少なく
とも１種の薬剤を生物学的製剤(biological preparatio
n)とインキュベートし、該薬剤が該製剤の転移ポテンシ
ャルを阻害することからなる生物学的製剤の範囲内で腫
瘍細胞の転移ポテンシャル(metastasis potential)を阻
害する方法。 【効果】 ガン細胞の転移及び炎症を抑制できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、一般的には腫瘍細胞の
転移及び浸潤阻害に関し、より詳しくは腫瘍関連炭水化
物抗原、そのオリゴサッカライド誘導体、腫瘍関連炭水
化物抗原の類縁体および腫瘍関連炭水化物抗原に対する
抗体の使用による該阻害に関する。
【０００２】
【従来の技術】多大な経済的及び人的資源の投資にも拘
らず、腫瘍は未だ主要な死亡原因の１つである。近年の
腫瘍治療では、悪性腫瘍が成長した患者の約５０％だけ
が治療されている。大抵のヒト悪性腫瘍において、転移
は主要な死因である。
【０００３】転移は、遠い部位での２次的腫瘍コロニー
の形成である。それは、腫瘍の浸潤が第１段階である多
段階過程である。腫瘍細胞は局所的に表皮基底膜（epit
helial basement menbrane) のような宿主組織の防御部
に浸潤し、間隙支質（interstitial stroma)に到達し、
そこでさらに転移するために血管（またはリンパ管）に
接触する。血管壁の内皮層に浸潤した後、循環する腫瘍
細胞は循環系に移動し、内皮細胞管腔表面または露出し
た基底膜に接着することにより標的組織の前毛細血管静
脈に止まる。腫瘍細胞は再び血管壁に浸潤し器官の実質
に入り込む。最後に、血管外にはみ出た腫瘍細胞はもと
あったところから離れた組織で成長する。 大抵のヒト
の悪性腫瘍において、遠くへの転移は１次腫瘍を治療す
る段階ではあまりに小さくしばしば検出できない。その
上、広く行き渡った転移コロニーの始まりは、通常転移
疾患の臨床症状が現れる前に起こる。転移の大きさ及び
年齢の変化、分散したところの解剖学的位置、及びその
不均一な組成は、外科的摘出を妨害し且つ転移コロニー
に分布する制癌剤の濃度を制限する原因である。
【０００４】転移の治療及び阻止に対する最近のアプロ
ーチの困難性のために、腫瘍細胞の転移ポテンシャルを
阻止するための改良された方法及び組成物が、該技術分
野において求められている。本発明は、この必要性を満
たすものであり、さらに他の関連する利益を提供するも
のである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】要約すれば、本発明は、
炭水化物構造またはそれらに対する抗体により腫瘍細胞
の接着を防止することに基く腫瘍細胞の転移のポテンシ
ャル及び浸潤を阻害する生化学的方法を提供するもので
ある。このアプローチの理論的根拠は以下のようなもの
である： ｉ） 転移のポテンシャルが高いもの及び低いもののマ
ウスメラノーマＢ１６変異株を用いたモデル実験で、転
移のポテンシャルが高い変異株ＢＬ６及びＦ１０は、転
移のポテンシャルが低いまたは転移しないＦ１またはＷ
Ａ４よりもより多くＧＭ３を発現する。内皮細胞表面へ
の転移ポテンシャルの高い変異株の接着は、転移ポテン
シャルの低い変異株よりも大きく、該接着はＭｅ−β−
ラクトシド、ＧＭ３またはＬａｃＣｅｒ（リポソーム
中）または他のラクトシド誘導体により阻害される。こ
れらの糖およびその誘導体は、Ｂ１６メラノーマの転移
ポテンシャルも阻害する。
【０００６】ii） ヒトの腫瘍において、１次腫瘍が
（モノクローナル抗体ＭＩＡ−１５−５により定義され
る）Ｈ／Ｌｅy ／Ｌｅb 、シアロシル（sialosyl) Ｔｎ
（モノクローナル抗体ＴＫＨ２により定義される）、シ
アロシル−Ｌｅx （モノクローナル抗体ＦＨ６またはＳ
ＮＨ３もしくは４により定義される）のような定義され
た腫瘍関連炭水化物抗原を発現する患者は、１次腫瘍が
これらの抗原を発現しないかまたは弱く発現する患者よ
りも生存率がより短い。
【０００７】iii) ヒト腫瘍におけるそれらの腫瘍関連
炭水化物抗原（マウスメラノーマモデルのＧＭ３）およ
びＨ／Ｌｅb ／Ｌｅy 、シアロシル−Ｌｅx 、シアロシ
ルＴｎは、標的細胞、特に血小板または内皮細胞により
認識される必須の接着分子である。
【０００８】iv） 腫瘍細胞と内皮細胞および血小板と
の相互作用は、ＬＥＣＣＡＭ（またはセレクチン（sele
ctin））、ＥＬＡＭ−１またはＧＭＰ−１４０により媒
介され、それらは活性化された内皮細胞および活性化さ
れた血小板上に発現される。シアロシル−Ｌｅx 抗原
は、これらのＬＥＣＣＡＭを認識することが知られてい
る。ｖ） 血小板または内皮細胞表面でのその発現がト
ロンビン、ＡＤＰまたは（ＡＭＰ）フォルボールエステ
ルにより誘導されるＧＭＰ−１４０は、血小板−腫瘍細
胞相互作用に重要な役割を果たし且つ腫瘍細胞の転移を
媒介するかもしれない。このセレクチンにより認識され
るエピトープは以前にシアロシル−Ｌｅx として同定さ
れているが（ポリー（Polley）ら、Proc. Natl. Acad.
Sci., ８８：６２２４， １９９１）、 本発明者はシ
アロシル−Ｌｅa （モノシアロシル−Ｌｅa Ｉとしても
知られている）、モノシアロシル−Ｌｅa ＩＩ（シアロ
シル−Ｌｅa の位置異性体）およびジシアロシル−Ｌｅ
a もＧＭＰ−１４０により認識されることを同定した。
ＧＭＰ−１４０は、シアロシル−Ｌｅx よりもシアロシ
ル−Ｌｅa により良く結合する。ハンダ（Handa)ら、Bi
ochem. Biophys Res. Comm., １８１：１２２３（１９
９１）も、ＧＭＰ−１４０により認識されるエピトープ
としてシアロシル−Ｌｅa を同定している。
【０００９】vi） 内皮細胞上でのその発現がインター
ロイキン１、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−αまたはリポポリサ
ッカライドにより誘導されるＥＬＡＭ−１は、内皮細胞
−腫瘍細胞相互作用に重要な役割を果たし且つ腫瘍細胞
の転移を媒介するかもしれない。このセレクチンにより
認識されるエピトープは、以前にシアロシル−Ｌｅx お
よびシアロシル−Ｌｅa として同定され（フィリップス
（Phillips）ら、サイエンス、２５０：１１３０（１９
９０）；バーグ（Berg) ら、J. Biol. Chem., ２６６：
１４８６９（１９９１）；タカダ（Takada) ら、Bioche
m. Bioph ys Res. Comm., １７９：７１３（１９９
１）、一方本発明者はモノシアロシル−Ｌｅa IIおよび
ジシアロシル−Ｌｅa もＥＬＡＭ−１及び他のセレクテ
ィブ（selectives) により、特にダイナミックフローシ
ステム（dynamic flow system)において認識されること
を明らかにした。
【００１０】vii) ヌードマウス中で転移ポテンシャル
の異なる発現を示すヒト結腸腫瘍細胞は、シアロシル−
Ｌｅx の発現と密接な関係を示し、すなわち転移ポテン
シャルの高い細胞は高度にシアロシル−Ｌｅx を発現
し、その逆も起こる。
【００１１】viii) ヒト内皮細胞は、Ｈ（Ｆｕｃα１
→２Ｇａｌ）の高い発現を特徴とし、ヒト腫瘍の多くの
タイプは、モノクローナル抗体ＭＩＡ−１５−５により
定義されるＬｅy 、ＨまたはＬｅb の発現を特徴とす
る。ＨとＬｅy またはＨとＨの相互作用は、明確に確立
され、それゆえ、Ｈ／Ｌｅy ／Ｌｅb を発現するそれら
のヒト腫瘍は、Ｌｅy −ＨまたはＨ−Ｈ相互作用により
媒介されるＨ−発現内皮細胞に接着するかもしれない。
【００１２】ix） Ｈ／Ｌｅy ／Ｌｅb に対するモノク
ローナル抗体ＭＩＡ−１５−５は、マウスの肺のＢ１６
マウスメラノーマ転移の変異株である高転移性のＦ１０
およびＢＬ６の肺転移を阻害した。そのうえ、ジシアロ
シル−Ｌｅa およびモノシアロシル−Ｌｅa IIに対する
モノクローナル抗体ＦＨ７は、ダイナミックフローシス
テムにおいてこれらの抗原を発現するヒトガン細胞の接
着を阻害した。
【００１３】これらの種々の観察及び考察に基づき、本
発明は以下の方法を提供する。
【００１４】ａ） 炭水化物抗原により媒介される腫瘍
細胞接着に基づく腫瘍細胞の転移が、ＧＭ３、Ｈ、Ｌｅ
y 、Ｌｅb 、シアロシル−Ｌｅx 、モノシアロシル−Ｌ
ｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa ＩＩ、シアロシルＴ
ｎ、ラクトシルおよび実施例３の構造式１〜１３に示さ
れる他の構造物からなるオリゴサッカライドにより阻害
され得る。
【００１５】ｂ） オリゴサッカライド誘導体がこれら
の構造式に基づき、適当な担体に結合される。
【００１６】ｃ） 糖構造が、オリゴサッカライド−レ
クチン（セレクチン；ＬＥＣＣＡＭ）またはオリゴサッ
カライド−オリゴサッカライド相互作用に基づき腫瘍細
胞接着のより良い阻止活性を示すよう適当に修飾された
オリゴサッカライド誘導体。
【００１７】ｄ） 腫瘍細胞の内皮細胞、血小板または
標的細胞への接着を阻止し、且つ転移を阻止し得る、腫
瘍関連炭水化物抗原を表現することを含むオリゴサッカ
ライドを認識する抗体の利用。
【００１８】すなわち、本発明の１つの側面は、腫瘍細
胞の転移ポテンシャルを阻止するための生物学的製剤と
インキュベートを提供することにある。該製剤は、
（ａ）異なる予後の重要性を示す腫瘍関連炭水化物抗
原、（ｂ）これらの抗原に特異的に結合する抗体、
（ｃ）これらの抗原のオリゴサッカライド成分、（ｄ）
これらの抗原またはオリゴサッカライドの複合体、及び
（ｅ）腫瘍関連炭水化物抗原の類縁体からなる群から選
ばれた少なくとも１種の薬剤と混合することからなり、
該薬剤が上記製剤の転移ポテンシャルを阻害する。好適
な生物学的製剤は、細胞培養物と生物学的液体（biolog
ical fluid) を含有する。
【００１９】本発明の他の側面は、温血動物における腫
瘍細胞の転移ポテンシャルを阻害する方法を提供するこ
とにある。該方法は、（ａ）異なる予後の重要性を示す
腫瘍関連炭水化物抗原、（ｂ）これらの抗原に特異的に
結合する抗体、（ｃ）これらの抗原のオリゴサッカライ
ド成分、（ｄ）これらの抗原またはオリゴサッカライド
成分の複合体、及び（ｅ）腫瘍関連炭水化物抗原の類縁
体(mimetics)からなる群から選ばれた少なくとも１種の
薬剤の有効量を温血動物に投与することからなり、該薬
剤が腫瘍細胞の転移ポテンシャルを阻害する。
【００２０】関連する本発明の側面の範囲内で、本発明
はオリゴサッカライド成分のインビボ(in vivo) での寿
命を延長するのに有用な数多くの糖複合体(glycoconjug
ates) を提供する。該複合体は、ポリ（エチレングリコ
ール）に結合したオリゴサッカライドからなる。
【００２１】本発明の方法及び組成物の範囲内で使用す
る他のオリゴサッカライド成分は、ラクトース、ラクト
−Ｎ−テトロース、メチル β−Ｄ−ラクトシド及びフ
ェニル β−Ｄ−チオラクトシドを含む。オリゴサッカ
ライド成分は、単独でまたは混合物として用いることが
できる。
【００２２】本発明はさらに、腫瘍部位では転移を、あ
る部位では炎症応答を引き起こすＧＭＰ−１４０−媒介
またはＥＬＡＭ−１−媒介の細胞凝集または接着を阻害
する種々の方法を提供するものである。
【００２３】そのような方法の１つは、生物学的製剤の
範囲内でＧＭＰ−１４０−媒介またはＥＬＡＭ−１−媒
介の細胞凝集または接着を阻害するもので、それは
（ａ）モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌ
ｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa またはシアロシル−Ｌｅ
x 、（ｂ）モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル
−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa またはシアロシル−
Ｌｅx に特異的に結合する抗体、（ｃ）モノシアロシル
−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa II、ジシアロシル
−Ｌｅa またはシアロシル−Ｌｅx のオリゴサッカライ
ド成分、（ｄ）モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロ
シル−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa またはシアロシ
ル−Ｌｅx 、或いはオリゴサッカライド成分の複合体、
及び（ｅ）モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル
−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa 、またはシアロシル
−Ｌｅx の類縁体からなる群から選ばれた少なくとも１
種の薬剤と生物学的製剤とをインキュベートすることか
らなり、該薬剤が細胞の凝集及び接着を阻害する。
【００２４】本発明の他の方法は、温血動物の腫瘍細胞
部位でＧＭＰ−１４０−媒介またはＥＬＡＭ−１−媒介
の細胞凝集または接着を阻害し、それにより該部位での
転移のポテンシャルを低減させるものであり、それは、
（ａ）モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌ
ｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa またはシアロシル−Ｌｅ
x 、（ｂ）モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル
−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa またはシアロシル−
Ｌｅx に特異的に結合する抗体、（ｃ）モノシアロシル
−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa II、ジシアロシル
−Ｌｅa またはシアロシル−Ｌｅx のオリゴサッカライ
ド成分、（ｄ）モノシアロシル−ＬｅaＩ、モノシアロ
シル−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa またはシアロシ
ル−Ｌｅx 、或いはオリゴサッカライド成分の複合体、
及び（ｅ）モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル
−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa またはシアロシル−
Ｌｅx の類縁体からなる群から選ばれた少なくとも１種
の薬剤の有効量を温血動物に投与することからなり、該
薬剤が温血動物の腫瘍細胞部位での転移ポテンシャルを
低減する。
【００２５】本発明はまた、温血動物の炎症部位におけ
るＧＭＰ−１４０−媒介の細胞凝集または接着を阻害
し、それにより該部位での炎症ポテンシャルを低減する
ものであり、それは（ａ）モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、
モノシアロシル−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa 、ま
たはシアロシル−Ｌｅx 、（ｂ）モノシアロシル−Ｌｅ
a Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅ
a またはシアロシル−Ｌｅx に特異的に結合する抗体、
（ｃ）モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌ
ｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa またはシアロシル−Ｌｅ
x のオリゴサッカライド成分、（ｄ）モノシアロシル−
Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa II、ジシアロシル−
Ｌｅa またはシアロシル−Ｌｅx 、或いはオリゴサッカ
ライド成分の複合体、及び（ｅ）モノシアロシル−Ｌｅ
a Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅ
a またはシアロシル−Ｌｅx の類縁体からなる群から選
ばれた少なくとも１種の薬剤の有効量を温血動物に投与
することからなり、該薬剤が温血動物の炎症部位での炎
症ポテンシャルを低減する。
【００２６】他の側面において、本発明はＧＭＰ−１４
０のレクチン活性に関する腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡ
ＴＡ）エピトープを同定するための方法を提供するもの
であり、それは：（Ａ）ＧＭＰ−１４０により標的化さ
れると思われるＴＡＴＡエピトープでコートされた蛍光
プラスチックビーズからなる蛍光プローブを構築し、；
（Ｂ）該蛍光プローブを血小板の懸濁液とインキュベー
トし；及び（Ｃ）蛍光プローブの血小板に対する結合の
程度を測定することからなる。
【００２７】これら及び本発明の他の側面は、以下の詳
細な記載及び添付した図面を参照すれば明らかになるで
あろう。
【００２８】上述したように、本発明は、腫瘍細胞の転
移ポテンシャル（potential ）及び浸潤を阻害するため
の方法及び組成物に関する。多くの腫瘍細胞が、転移能
力、即ち、離れた部位に２次的な腫瘍コロニーを形成す
る能力を保有している。悪性腫瘍細胞の源は、メラノー
マ、肺、胸部、結腸直腸及び膀胱や前立腺癌の様な尿性
器癌を含む。本発明において、腫瘍細胞の転移ポテンシ
ャルの阻害（即ち、腫瘍細胞の転移する能力の阻害）
は、（ａ）腫瘍関連の炭水化物（carbohydrate）抗原類
（ＴＡＣＡｓ）、（ｂ）これらＴＡＣＡｓに対する抗
体、（ｃ）これらＴＡＣＡｓのオリゴサッカライド成
分、（ｄ）そのようなＴＡＣＡｓやＴＡＣＡｓのオリゴ
サッカライド成分との複合体（conjugates）、例えば、
リジルリジンの多価結合性の複合体又はＴＡＣＡ保有グ
リコスフィンゴリピド（ＧＳＬ）リポソーム；又は
（ｅ）ＴＡＣＡｓの類縁体（mimetics）の使用によって
起こる。
【００２９】ＴＡＣＡエピトープは、内皮細胞、血小板
及び基底膜との相互作用を通じて、腫瘍細胞接着に本質
的な役割をはたし、それによって腫瘍転移及び浸潤がお
こる。接着（adhesion）の機構は、炭水化物（ＣＨＯ）
−ＣＨＯ相互作用、ＣＨＯ−レクチン相互作用又はセレ
クチン（selectin）ファミリーの相互作用が基になって
いる。種々の腫瘍細胞の活性化された内皮細胞及び血小
板表面への接着は、第一にＬＥＣＣＡＭ又はセレクチン
スーパーファミリー（例えば、ＥＬＡＭ−１、ＧＭＰ−
１４０）によって媒介される。シアロシル−Ｌｅx によ
って媒介される腫瘍細胞接着は、抗シアロシル−Ｌｅx
モノクローナル抗体（ＦＨ６、ＣＳＬＥＸ、ＳＮＨ３、
ＳＮＨ４）によって阻害され、モノシアロシル−Ｌｅa
Ｉによって媒介される腫瘍細胞接着は、このエピトープ
に対するモノクローナル抗体（ＣＡ１９−９、ＣＳＬＥ
Ａ、ＮＫＨ１、ＮＫＨ２）によって阻害される。また、
優先的にタイプ１のシアロシル−Ｌｅa 鎖を発現し、よ
り少ない程度でシアロシル−Ｌｅx を発現するＣｏｌｏ
２０５腫瘍細胞は、内皮細胞に接着する。この接着は、
抗−シアロシル−Ｌｅa モノクローナル抗体及びより少
ない程度の抗シアロシル−Ｌｅx モノクローナル抗体に
よって阻害される。これらの発見によって、シアロシル
−Ｌｅx だけでなく、シアロシル−Ｌｅa が（以前はＣ
Ｄ６２又はＰＡＤＧＥＭと呼ばれた）ＥＬＡＭ−１及び
ＧＭＰ−１４０によって認識される重要なリガンドであ
ることが示唆される。本発明者らは、活性化された内皮
細胞上への腫瘍細胞の接着は、またモノシアロシル−Ｌ
ｅa II及びジシアロシル−Ｌｅa の認識を基にしている
ことを発見した。モノシアロシル−Ｌｅa II及びジシア
ロシル−Ｌｅa は共に、モノクローナル抗体ＦＨ７によ
って定義され、それは、種々のタイプの上皮癌細胞（特
に結腸直腸、胃腸および膵臓の上皮癌細胞）が、セレク
チンを介した活性化内皮細胞又は血小板への接着を強力
に阻害することが知られている。
【００３０】特に、ＧＭＰ−１４０は、血小板のα−顆
粒上又は内皮細胞（ＥＣｓ）のワイベル−パラードボデ
ィー（Weibel-Pallade bodies ）に局在する主たるセレ
クチン（ＬＥＣＣＡＭ）である。これら細胞の活性化に
おいて、ＧＭＰ−１４０は迅速に細胞表面に再分配さ
れ、そこでそれは血液細胞又は腫瘍細胞上に発現される
ある種の炭水化物エピトープへの血小板又はＥＣｓの接
着に重要な役割をし、その結果血小板や腫瘍細胞の凝集
又は毛細の内皮への接着を起こす。ＧＭＰ−１４０−媒
介細胞接着は本発明者らによって腫瘍細胞の転移沈着の
開始および炎症過程の開始に関与すると信じられてい
る。
【００３１】また、ＥＬＡＭ−１は、インターロイキン
−１、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、又はリポポリサッカラ
イドでの活性化の後、内皮細胞上に発現される。ＥＬＡ
Ｍ−１−媒介細胞接着は、また、本発明者らによって腫
瘍細胞の転移沈着の開始に関与すると信じられている。
【００３２】このように、本発明は、ＧＭＰ−１４０−
媒介又はＥＬＡＭ−１−媒介細胞凝集又は接着を、特に
腫瘍細胞部位で、阻害することにも関する。本発明にお
いては、ＧＭＰ−１４０−媒介細胞凝集又は接着は、
（ａ）ＴＡＣＡモノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロ
シル−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa 又はシアロシル
Ｌｅx 、（ｂ）特異的にモノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、
モノシアロシル−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa 又は
シアロシル Ｌｅx に結合する抗体、（ｃ）モノシアロ
シル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa II、ジシアロ
シル−Ｌｅa 又はシアロシル Ｌｅx のオリゴサッカラ
イド成分、（ｄ）モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシア
ロシル−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa 又はシアロシ
ル Ｌｅx の或いはオリゴサッカライド成分の複合体及
び（ｅ）モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−
Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa 又はシアロシル Ｌｅ
x の類縁体の使用を通して阻害される。
【００３３】本発明において、腫瘍転移及び浸潤は腫瘍
細胞の接着をブロックする事によって阻害され、それに
よって腫瘍細胞の広がりを非常に減少または除去する。
【００３４】本発明において、腫瘍転移及び浸潤は以下
の点を阻害することによって阻害される、即ち、 （１）（ａ）腫瘍細胞の血小板への接着、（ｂ）腫瘍細
胞の血小板を通しての腫瘍細胞への接着、（ｃ）腫瘍細
胞の血小板を通してのＥＣｓへの接着及び（ｄ）腫瘍細
胞のＧＭＰ−１４０を通して直接ＥＣｓへの接着による
腫瘍部位でのＧＭＰ−１４０−媒介細胞凝集又は接着、
及び （２）ＥＬＡＭ−１を通して直接ＥＣｓへの細胞の接着
による腫瘍部位でのＥＬＡＭ−１−媒介腫瘍細胞の凝集
又は接着。
【００３５】更に本発明において、炎症は、（ａ）血小
板への細胞の接着、（ｂ）血小板を通しての細胞への細
胞の接着、（ｃ）血小板を通してのＥＣｓへの細胞の接
着及び（ｄ）ＧＭＰ−１４０を通して直接ＥＣｓへの細
胞の接着による炎症のポテンシャル部位でＧＭＰ−１４
０−媒介細胞の凝集又は接着を阻害することによって阻
害される。
【００３６】本発明に使用される適当なＴＡＣＡｓは、
異なった予後の重要性を示すものである（即ち、浸潤又
は転移ポテンシャルに明確に関与するＴＡＣＡｓ）。本
発明の状況において、そのようなＴＡＣＡｓはＴＡＣＡ
ｓのような発現するものと発現しないものを類似の腫瘍
の浸潤、転移及び臨床の予後の比較を通して区別され
る。本発明で使用される好ましいＴＡＣＡｓは、Ｈ／Ｌ
ｅy ／Ｌｅb 、シアロシル−Ｌｅx （ＳＡ−Ｌｅx ）、
モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ（ＳＡ−Ｌｅa ）及びシアロ
シル−Ｔｎ（ＳＡ−Ｔｎ）が含まれる。そのようなＴＡ
ＣＡｓの誘導体には、二量体Ｌｅx 、シアロシル−二量
体Ｌｅx 、トリフスコシルＬｅy 、ジシアロシル−Ｌｅ
a 及びモノシアロシル−Ｌｅa IIが含まれる。
【００３７】上述したように、本発明に使用されるＴＡ
ＣＡｓは、異なった予後の重要性を示すものである。実
施例により、そのような異なった予後の重要性は、（モ
ノクローナル抗体ＭＩＡ−１５−５によって定義され
る）Ｈ／Ｌｅy ／Ｌｅb 抗原を発現する腫瘍がこれら抗
原を発現しない腫瘍よりも患者の予後が非常に悪いこと
を示す事実によって例示される。例えば、図１に示すよ
うに（但し、●はＭＩＡ−１５−５陰性(n=29)を、○は
ＭＩＡ−１５−５陽性(n=38)を示す。）、Ｈ／Ｌｅy ／
Ｌｅb 抗原を発現する扁平上皮細胞肺カルチノーマの患
者の５年後の生存率が１１％（即ち、８９％死亡）であ
るのに対し、Ｈ／Ｌｅy ／Ｌｅb 抗原を発現しない患者
の同年後の生存率は約６２％であった。同様な結果がシ
アロシル−Ｌｅx 及びシアロシル−Ｔｎ抗原の発現、非
発現を示す腫瘍においても得られる。更に詳しくは、図
２に示すように、シアロシル−Ｌｅx を発現する結腸癌
患者では５年後の生存率がたった１５％であるのに対
し、この抗原を発現しない患者の同年後の生存率は約５
０％であった。別の研究において、シアロシル−Ｔｎを
発現しない初期の段階の結腸癌患者の５年後の生存率が
１００％であるのに対し、シアロシル−Ｔｎを発現する
場合は７５％であった（図３参照）。図４に示すよう
に、同様ではあるがより明確な差が、シアロシル−Ｔｎ
抗原の発現、非発現を示す卵巣癌患者で観察された。
【００３８】また上述したように、適当なＴＡＣＡｓの
抗体は本発明に含まれる。これで使用しているように、
そのように抗体は、モノクローナル抗体及びポリクロー
ナル抗体を含有し、それは無傷の分子、そのような分子
のフラグメント、それらと機能的に同一のものである。
抗体は遺伝的に設計される。抗体のフラグメントの例に
は、Ｆ（ａｂ′）2 、Ｆａｂ′、Ｆａｂ及びＦｖが含ま
れる。
【００３９】簡潔に言えば、ポリクローナル抗体は動物
への免疫処置及びそれに続く血清の採取により得られ
る。免疫処置は、例えば、ウサギ、ラット、マウスに全
身系の投与、例えば、皮下、脾臓内、筋肉内注射によっ
てなされる。一般に好ましくは、血清を集める前に、最
初の免疫処置に続いて一度又はそれ以上の追加免疫処置
をすることが好ましい。このような方法は、公知であ
り、数多くの参考文献に記載されている。
【００４０】本発明において、ポリクローナル抗体が使
用されているが、モノクローナル抗体も好ましい。本発
明において使用される適当なモノクローナル抗体には、
マウス又はヒト起源のもの、又はヒト及びマウス抗体を
部分的に結合させたもの（即ち、ヒト抗体の不変域（co
nstant region)＋マウス抗体の抗原結合領域）のような
キメラの（chimeric）抗体が含まれる。ヒト及びキメラ
の抗体は、当業者に公知の方法によって生産される。ヒ
ト抗体及びキメラヒト−マウス抗体は、臨床的に投与す
るときに抗−抗体の産生を引き起こすことがマウス抗体
よりも少ないという点から有利である。
【００４１】モノクローナル抗体は、一般的にケーラー
及びミルステイン（Kohler and Milstein ）の方法（ネ
イチャー（Nature）、256 ：495-497 、1975；Eur.J.Im
munol. 6: 511-519 、1976）並びにケーラー及びミルス
テインの初期の方法を修飾した種々の技術（全体に参考
文献が掲載されているハーロー及びレーン（Harlow and
Lane ）(Eds.)、アンチボディーズ(Antibodies)：ア
ラボラトリー マニュアル(A Laboratory Manual) 、コ
ールド スプリング ハーバー ラボラトリー(Cold Sp
ring Harbor Laboratory) 、1988、参照）によって生産
される。簡潔に言えば、ＴＡＣＡｓ又はそれらのオリゴ
サッカライド成分の一つで免疫された動物のリンパ節及
び／又は脾臓をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリッ
ド細胞株（「ハイブリドーマ」又は「クローン」）を形
成させる。各ハイブリドーマは、一つのタイプのイムノ
グロブリンを分泌し、ミエローマ細胞のように不明確な
細胞分裂のためのポテンシャルを有する。そのような分
子をそれらの免疫原性を増大させる担体と結合させるこ
とが好ましい。適当な担体には、キーホールリンペット
ヘモシアニン、サイログロブリン、牛血清アルブミン及
びそれらの誘導体が含まれる。ハイブリドーマによるモ
ノクローナル抗体の産生に代わるものとしては、バクテ
リオファージ及びバクテリアを用いるモノクローナル抗
体発現ライブラリーの創作がある（例えば、サストリー
ら(Sastry et al.,)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、8
6：5728、1989；フセら(Huse et al.,)、サイエンス(Sc
ience)246 ：1275、1989）。適当な特異性を示す抗体の
選択は、当業者に明らかな種々の方法によって成され
る。
【００４２】本発明において使用される適当なモノクロ
ーナル抗体の代表的な例としては、ＭＩＡ−１５−５
（ミヤケ及びハコモリ(Miyake and Hakomori) 、Bioche
m.、30：3328、1991）及びハコモリ(Hakomari)、アドバ
ンシーズ イン キャンサーリサーチ(Advances In Can
cer Reseach)、52：257-331 、1989に引用されているモ
ノクローナル抗体が含まれる。
【００４３】上記で考察したように、適当なＴＡＣＡｓ
のオリゴサッカライド成分もまた本発明で使用される。
ここに記載されているように、「オリゴサッカライド」
なる用語は、本質的にＴＡＣＡオリゴサッカライド成分
の部分を含む、誘導されたオリゴサッカライド、合成し
て製造されたもの及びそれらの誘導体を包含する。
【００４４】本発明の範囲内で使用される他のオリゴサ
ッカライド成分としては、ラクトース及びラクトース誘
導体、例えば、メチル β−Ｄ−ラクトシド、ラクト−
Ｎ−テトロース（Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→３
Ｇａｌβ１→４Ｇｌｃ）及びフェニル β−Ｄ−チオラ
クトシドが含まれる。エチルまたはフェニルラクトシド
並びにメチルまたはエチルチオラクトシドを含む他のラ
クトース誘導体も含まれる。
【００４５】特定の腫瘍細胞の転移ポテンシャルを阻害
する他の適当なオリゴサッカライド成分は、転移する腫
瘍活性に関与する特異的な炭水化物鎖（chain(s)）の構
造の決定を基に同定される。転移する腫瘍活性に関与す
る炭水化物−含有分子の同定は、グリコシダーゼ及びグ
リコシルトランスフェラーゼインヒビターの使用を含む
種々の方法によって成される。脂質または蛋白質に結合
する炭水化物の構造は、分解、電子衝撃直接−プローブ
（ＥＩ）及び高速電子衝突（ＦＡＢ）を含むマススペク
トロメトリー、並びにメチル化分析（例えば、ヌデルマ
ンら(Nudelmanet al.,)J. Biol. Chem.、261 ：5487-54
95 、1986に記載の技術）を基に決定される。分解分析
は化学的に及び／又はグリコシダーゼにより酵素的に成
される。分解分析によって推察される炭水化物の配列
は、メチル化分析（ハコモリ(Hakomori)、J. Biochem.
55：205-208 1964）に続いてパーメチル化された糖類の
化学イオン化マススペクトロメトリー（ステルナーら(S
tellner et al.,)、Arch Biochem. Biophys.155 ：464-
472 、1974; レヴェリーら(Levery et al.,)、Meth.Enz
ymol.、138 ：13-25 、1987）に続いてを行うことによ
り決定される。代わりに、或いは、これらの技術と合わ
せて、ＥＩマススペクトロメトリーがパーメチル化され
たグリカン上又は適当なインタクト（intact）なグリカ
ンの適当な分解後になされる（カンナギら(Kannagi et
al.,) 、J. Biol. Chem.、259 ：8444-8451 、1984；ヌ
デルマンら(Nudelman et al.,)J. Biol. Chem.、263 ：
13942-13951 、1988）。炭水化物の同一性は、インタク
トな及びメチル化されたグリカンのプロトンＮＭＲスペ
クトロスコピー及びＦＡＢマススペクトロメトリーを種
々の含む化学的及び物理的基準を基に示される。一旦、
炭水化物配列が決定されると、腫瘍細胞の転移ポテンシ
ャルを阻害する適当なオリゴサッカライドを選択するこ
とは当業者にとって明らかである。
【００４６】上記で簡潔に論じたように、適当なＴＡＣ
Ａｓ又はそのオリゴサッカライド成分の複合体、例え
ば、リジルリジン又はＴＡＣＡ−保有グリコスフィンゴ
リピド（ＧＳＬ）リポソームとの多価複合体が、本発明
の範囲内で使用される。
【００４７】複合体の成分はお互いに直接又はリンカー
基（linker group）を介して共有結合的に結合される。
互いに他と反応可能な置換基を有している時、成分間の
直接反応が可能である。例えば、一方の成分上の、アミ
ノ又はスルフヒドリル基のような求核基は、もう一方上
にカルボニル含有基、例えば、無水物又はアシルハライ
ド、或いはハライドのような良い離脱基を含有するアル
キル基と反応することができる。
【００４８】好ましくは、リンカー基によって成分を共
有結合的に結合することが好ましい。リンカー基は置換
基の化学反応性を増大させ、その結果カップリング効率
を増大させることができる。化学反応性の増大は、ま
た、別の方法では不可能な成分上の官能基の使用を促進
させる。例えば、カルボキシル基は、活性化される。カ
ルボキシル基の活性化は、スクシンイミジルエステルの
ような「活性エステル（active ester）」の形成を含
む。「活性エステル」なる用語は、求核置換反応におい
て高い反応性を有するエステルを言う。
【００４９】代わりに、成分が非共有結合的にリンクし
た複合体を産生することが好ましい。例えば、一種又は
二種以上のＴＡＣＡｓが、ＧＳＬリポソームの外の表面
に組み込まれる。
【００５０】オリゴサッカライドのインビボ（in viv o
）での寿命を増大させることが好ましい。本発明に記
載のごとく、オリゴサッカライドは、直鎖の両染性ポリ
マー（amphophilic polymer)、例えば、ポリ（エチレン
グリコール）と結合（couple）（即ち、共有結合的に結
合）する。オリゴサッカライド−ポリ（エチレングリコ
ール）複合体を生成する代表的な方法の例としては、ス
クシンイミジル基を含有するように誘導されたオリゴサ
ッカライドと、末端にアミノ基を有するポリ（エチレン
グリコール）との反応である。後者のポリ（エチレング
リコール）は、一般式 ＮＨ2−（ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ）n−ＣＨ3 （但し、ｎは一般に平均４４．７（即ち、分子量約２，
０００）から１１２．９（即ち、分子量約５，００
０））で表される。
【００５１】さらに、セレクチン、ＥＬＡＭ−１又はＧ
ＭＰ−１４０によって媒介される細胞接着は、セレクチ
ン分子のＮ−末端領域に存在するレクチン配列ドメイン
によるシアリル化又はフコシル化されたラクトシリーズ
（lactoseries ）タイプ１及びタイプ２鎖の認識を基に
しているので、本発明においては、天然に起こるエピト
ープよりもより効果的なレクチンドメインのブロッキン
グ活性を示すいかなる構造も使用される。「類縁体（mi
metics）」と呼ばれるそのような天然でない合成化合
物、例えばシアロシル−Ｌｅx 又はシアロシル−Ｌｅa
Ｉ又はIIは、天然に生じているエピトープの表面構造と
類似しているが、より良い炭水化物−依存性接着へのブ
ロッキング活性を示すと考えられる。これに限らないが
有用な類縁体の例としては、トリフルオロ−Ｌ−フコー
ス、Ｎ−トリフルオロ−アセチル−グルコサミン或いは
トリフルオロ−Ｌ−フコース、Ｎ−トリフルオロ−アセ
チル−グルコサミン又はＮ−トリフルオロ−アセチル−
ノイラミン酸を含有するシアロシル−Ｔｎアナログを有
する天然のシアロシル−Ｌｅx 又はシアロシル−Ｌｅa
Ｉ又はII、又はＨ／Ｌｅy ／Ｌｅb 構造に見出されるの
と同一の距離及び特別な立体構造で、シアル酸アナログ
及びフコースアナログを有する複素環又は芳香環構造を
有するシアロシル−Ｌｅx 又はシアロシル−Ｌｅa Ｉ又
はIIが挙げられる。この様に天然に生じているエピトー
プよりもより効果的に腫瘍関連炭水化物を通して細胞接
着をブロックする、修飾された炭水化物エピトープ又は
炭水化物エピトープの表面構造を模倣するいかなる「類
縁体」も本発明に含まれる。
【００５２】腫瘍細胞の転移ポテンシャル及びＧＭＰ−
１４０−媒介又はＥＬＡＭ−１−媒介細胞凝集又は接着
の阻害は、多様性のあるインビトロ（in v itro）及びイ
ンビボでの用途を有している。該用途としては例えば、
同定された腫瘍細胞又は腫瘍保有宿主の治療及びＧＭＰ
−１４０又はＥＬＡＭ−１を含む疾患過程の治療が挙げ
られる。
【００５３】インビトロの見解によれば、上述したよう
に、本発明は生物学的製剤の範囲内で腫瘍細胞の転移ポ
テンシャルを阻害する方法を提供するものである。該方
法は、 （ａ）異なった予後の重要性を示す腫瘍関連炭水化物抗
原 （ｂ）特異的にこれら抗原に結合する抗体 （ｃ）これら抗原のオリゴサッカライド成分 （ｄ）これら抗原又はオリゴサッカライド成分の複合体
及び （ｅ）腫瘍関連炭水化物抗原の類縁体 からなる群から選ばれた少なくとも一種の薬剤と共に、
生物学的製剤をインキュベートすることを含有し、該薬
剤は製剤の転移ポテンシャルを阻害する。
【００５４】更にインビトロの見解によれば、本発明は
また生物学的製剤の範囲内で、ＧＭＰ−１４０−媒介又
はＥＬＡＭ−１−媒介細胞凝集又は接着を阻害する方法
を提供するものである。該方法は、（ａ）モノシアロシ
ル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa II、ジシアロシ
ル−Ｌｅa 又はシアロシル Ｌｅx 、（ｂ）特異的にモ
ノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa II、
ジシアロシル−Ｌｅa 又はシアロシル Ｌｅx に結合す
る抗体、（ｃ）モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロ
シル−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa 又はシアロシル
Ｌｅx のオリゴサッカライド成分、（ｄ）モノシアロシ
ル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa II、ジシアロシ
ル−Ｌｅa 又はシアロシル Ｌｅx の或いはオリゴサッ
カライド成分の複合体及び（ｅ）モノシアロシル−Ｌｅ
a Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅ
a 又はシアロシル Ｌｅx の類縁体からなる群から選ば
れた少なくとも一種の薬剤と共に、生物学的製剤をイン
キュベートすることを含有し、該薬剤は細胞凝集又は接
着を阻害する。
【００５５】適当な生物学的製剤は、細胞培養物及び、
例えば血液、尿、リンパ液、滑膜及び脳脊髄液のような
生物学的液体中の細胞懸濁液を含む。ＴＡＣＡｓ、オリ
ゴサッカライド又はその複合体は、一般的に終濃度約
０．１〜１Ｍ、典型的には約０．２〜０．５Ｍでインキ
ュベートされる。インキュベーションは、典型的には３
７℃で５〜１５分間成される。生物学的製剤の処理後、
該製剤は例えば、転移ポテンシャルを効果的な阻害を確
認するために、動物に注射又は移植される。
【００５６】本発明はまたヒトのような温血動物におけ
る腫瘍細胞転移を阻害する方法を提供する。該方法は、
温血動物に、 （ａ）異なった予後の重要性を示す腫瘍関連炭水化物抗
原 （ｂ）特異的にこれら抗原に結合する抗体 （ｃ）これら抗原のオリゴサッカライド成分 （ｄ）これら抗原又はオリゴサッカライド成分の複合体
及び （ｅ）モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌ
ｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa 又はシアロシル Ｌｅx
の類縁体 からなる群から選ばれた少なくとも一種の薬剤を効果的
な量を投与することを含有し、該薬剤は製剤の転移ポテ
ンシャルを阻害する。
【００５７】同様に、本発明はまた、温血動物の腫瘍細
胞部位で、ＧＭＰ−１４０−媒介又はＥＬＡＭ−１−媒
介細胞凝集又は接着を阻害する方法を提供するものであ
る。該方法は、温血動物に、（ａ）モノシアロシル−Ｌ
ｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌ
ｅa 又はシアロシル Ｌｅx 、（ｂ）特異的にモノシア
ロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa II、ジシア
ロシル−Ｌｅa 又はシアロシル Ｌｅx に結合する抗
体、（ｃ）モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル
−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa 又はシアロシルのオ
リゴサッカライド成分、（ｄ）モノシアロシル−Ｌｅa
Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa
又はシアロシル Ｌｅx の或いはオリゴサッカライド成
分の複合体及び（ｅ）モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノ
シアロシル−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa 又はシア
ロシル Ｌｅx の類縁体からなる群から選ばれた少なく
とも一種の薬剤を効果的な量を投与することを含有し、
該薬剤は温血動物の腫瘍部位で転移ポテンシャルを低減
する。
【００５８】本発明は、温血動物の炎症部位でＧＭＰ−
１４０−媒介細胞凝集又は接着を阻害する方法を提供す
るものである。
【００５９】該方法は、温血動物に、（ａ）モノシアロ
シル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa II、ジシアロ
シル−Ｌｅa 又はシアロシル Ｌｅx 、（ｂ）特異的に
モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa I
I、ジシアロシル−Ｌｅa 又はシアロシル Ｌｅx に結
合する抗体、（ｃ）モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシ
アロシル−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa 又はシアロ
シルのオリゴサッカライド成分、（ｄ）モノシアロシル
−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa II、ジシアロシル
−Ｌｅa 又はシアロシル Ｌｅx の或いはオリゴサッカ
ライド成分の複合体及び（ｅ）モノシアロシル−Ｌｅa
Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa II、ジシアロシル−Ｌｅa
又はシアロシル Ｌｅx の類縁体からなる群から選ばれ
た少なくとも一種の薬剤を効果的な量を投与することを
含有し、該薬剤は温血動物の炎症部位で炎症ポテンシャ
ルを低減する。
【００６０】両方法において、ＴＡＣＡｓ、オリゴサッ
カライド又はその複合体は、一般的に約０．１〜１Ｍ、
典型的には約０．２〜０．５Ｍの濃度で投与される。特
定の物質において最適な効果的な量を決定する方法は、
当業者には、例えば、非ヒト動物でのインビトロ及びイ
ンビボでの研究により明らかである。一般的に、投与は
静脈内又は胸腔、腹腔或いは切除された腫瘍の底のよう
な空洞内、或いは炎症部位に行われる。ＴＡＣＡ、抗
体、オリゴサッカライド又は上述したような誘導体は、
薬学的に許容される担体、生理的食塩水のような希釈剤
と共に投与してもよい。更に、転移ポテンシャルを阻害
又は低減する薬剤は、免疫療法的又は化学療法的物質と
共に、投与されても良く、炎症ポテンシャルを低減する
薬剤は、抗−炎症物質と共に投与しても良い。その様な
薬剤と物質との併用が所望の場合は、各化合物は順次、
同時に又は一つの組成物として混合された状態で投与さ
れる。ＣＡＴスキャンのような診断技術は、転移ポテン
シャル及び炎症ポテンシャルの阻害の有効性を確認する
ため投与前及び投与後に用いられる。
【００６１】腫瘍細胞の他の細胞（例えばＥＣｓ）への
接着又は凝集を測定又は接着又は凝集の成功した阻害を
測定するインビトロシステムの一つは、エム．ビー．ラ
ウレンスら（M.B.Lawrence et al.,）（ブラッド(Bloo
d) 70：1284、1987）によって記載されたものに類似の
且つ図２１〜図２４に示したダイナミックフローシステ
ム（dynamic flow system ）である。
【００６２】細管（１８）によって圧力ポンプ（２）に
接続された平行板層流チャンバー（parallel-plate lam
inar flow chamber ）（１）（便宜上さかさまに示して
いる）を、生理的微小血管環境中に存在する流れのずれ
応力（flow shear stresses ）を模擬するために使用す
る。フローチャンバー（１）は、平行な透明プラスチッ
ク表面（４）が、ゴム又はシリコンガスケット（５）上
に取り付けられたチャンバー本体（１６）上に静止して
いるプラスチック又はガラスのガバーガラス（３）から
なり、２表面間には１１４μｍのギャップがある。この
ギャップは、インレットマニホルド（８）に接続された
インレットスロット（６）及びアウトレットマニホルド
（１９）に接続されたアウトレットスロット（７）に接
続している。一定速度の層流及び壁のずれ応力が圧力ポ
ンプ（２）の操作によって成され、そのポンプは細管
（１８）によってフローチャンバーのインレットマニホ
ルド（８）に接続している。図２２に組み立てられたフ
ローチャンバー（１）を示す。
【００６３】カバーガラス（３）とチャンバー本体（１
６）とがしっかりと固定されるために、チャンバー本体
（１６）の周辺に、連続的な環状の溝空間（２０）が存
在する。この連続的な環状の溝空間は、頂部のカバーガ
ラス（３）とともにゴム又はシリコンラバーガスケット
（５）と配置され減圧ポンプに接続する。このように、
空間（２０）中の減圧ポンプ（２１）を作動させること
によって、カバーガラス（３）とチャンバー本体（１
６）とがしっかりと付着し動かなくなる。チャンバー本
体（１６）中の薄いインレット及びアウトレットスロッ
トはそれぞれインレット及びアウトレットマニホルドに
通じる。アウトレットマニホルドは、ネガティブ又はポ
ジティブな方法で操作される圧力ポンプ（２）に接続さ
れている。
【００６４】細胞（例えば、内皮細胞）は、ガラス又は
プラスチックのガバーガラス（３）上で成長し、培地中
の腫瘍細胞懸濁液をインレットマニホルド（８）からア
ウトレットマニホルド（１９）に流す。図２２に示すフ
ローチャンバー（１）の構造は、便宜上さかさまに示し
ている。このチャンバーは、倒立顕微鏡の右上のステー
ジ下に置かれ、細胞層（例えば内皮細胞層）上の腫瘍細
胞の流れは、顕微鏡下で観察される。腫瘍細胞の回転
（rolling ）及び停止（stopping）（即ち、接着パター
ン）が、ビデオテープ上に記録される。
【００６５】図２３については、細胞（９）はガバーガ
ラス（３）上で単層として成長し、腫瘍細胞懸濁液（１
４）の層流は、水浴（１７）内の管中で維持され、細管
（１８）経由でチャンバーを通過する。細胞の動きは、
倒立位相差顕微鏡（１０）で観察され、ビデオカメラ
（１２）及びデジタル画像処理装置（１３）を使用して
時間差ビデオカセットレコーダー（１１）によって記録
される。接着は細胞の回転に続く細胞停止として観察さ
れる。異なったずれ応力、例えば０．４〜４．８ダイン
（dynes ）／cm2 で、セット時間中、例えば３分間に結
合した細胞の数が、数種の領域からカウントされビデオ
テープに記録される（図２２）。壁のずれ応力（Ｔ）
は、３μＱ／２ｂａ2として計算される（μ＝粘性係
数、例えば、１．０ｃＰ、Ｑ＝容積流速（cm3 / 秒）、
ａ＝チャンネルの高さの１／２、例えば、５．７×１０
-3cm及びｂ＝チャンネルの幅、例えば１．３cm）。
【００６６】図２４は、図式的に、一つの表面が内皮細
胞（９）で覆われているチャンバーを通過する腫瘍細胞
懸濁液（１４）の層流を示したものである。回転又は停
止細胞（１５）は上述したように倒立顕微鏡で観察され
ビデオテープ上に記録される。矢印は、腫瘍細胞懸濁液
（１４）の流れの向きを示す。
【００６７】上述したように、本発明は、また、セレク
チンＧＭＰ−１４０のレクチン活性に関与するＴＡＣＡ
エピトープの同定方法も提供する。
【００６８】以前、これらＴＡＣＡエピトープが、活性
化された血小板で覆われた固相（即ちプラスチック表
面）への血液細胞又は腫瘍細胞の接着に関する種々のグ
リコスフィンゴリピド（ＧＳＬｓ）、ＧＳＬオリゴサッ
カライド又はＧＳＬ−含有リポソームの阻害効果を基に
研究された。実際問題として、これは、ゼラチンで固相
を覆うことを意味し、そのゼラチンは、次に活性化され
た血小板で覆われた。血小板は容易に、主要な血小板イ
ンテグリンレセプターであるＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａによ
ってゲラチン−被覆固相に結合する。この方法を用いる
研究において、前骨髄細胞白血病ＨＬ６０細胞の血小板
−被覆固相への結合は、シアロシル−Ｌｅ x 決定因子を
含有するリポソームによって阻害されるが、シアロシル
パラグロボシド（sialosylparagloboside ）（ＳＰＧ）
を含有するリポソームによって阻害されず、α１→３
フコシル化タイプ２鎖（Ｌｅx ）を含有するリポソーム
によって非常に弱く阻害される（以下の実施例３の表１
参照）。これに結果により、シアロシル−Ｌｅx はＧＭ
Ｐ−１４０によって定義される炭水化物エピトープであ
ることが示唆された（ポリーら(Polley et al.,)、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA、88：6224-6228 、1991）。
【００６９】しかしながら、上述の方法は、重要な制限
がある：即ち、独占的にタイプ１鎖ＧＳＬを発現する細
胞株は利用しない。骨髄性細胞株ＨＬ６０及び単球性細
胞株Ｕ９３７は独占的にタイプ２鎖を発現するが、タイ
プ１鎖を発現しない。本質的に結腸、胃又は肺カルチノ
ーマ由来の公知のヒト腫瘍細胞株は全てタイプ１鎖及び
タイプ２鎖を発現する。このような理由から、ＧＭＰ−
１４０が結合する本当のエピトープの構造を決定するの
は困難である。この問題を扱うために、以下に記載した
ような新規な方法論が開発された。
【００７０】蛍光プラスチック（例えばポリスチレン）
ビーズ（直径〜０．５μｍ）をＧＳＬで覆う。ＧＳＬｓ
は、そのようなビーズ上で強く吸着されることが知られ
ており、特定のＧＳＬｓを含有する蛍光プローブの構築
を可能にする。（活性化又は非活性化された）血小板
は、そのようなＧＳＬ−被覆ビーズと共にインキュベー
トされ、フローサイトメトリーによる血小板蛍光強度が
測定される。
【００７１】この方法を使用して、活性化された血小板
は、いかなる関係のあるＧＳＬで覆われたビーズよりも
モノシアロシル−Ｌｅa Ｉで覆われた蛍光ビーズ（表１
参照）により強く結合することが判明した。シアロシル
−Ｌｅa −被覆ビーズへの血小板の結合は、抗−ＧＭＰ
−１４０モノクローナル抗体又は抗−シアロシル−Ｌｅ
a モノクローナル抗体によって阻害されたが、抗−シア
ロシル−Ｌｅx モノクローナル抗体によって阻害されな
かった。シアロシル−Ｌｅx −被覆ビーズへの活性化血
小板の結合は、観察されるが、シアロシル−Ｌｅa −被
覆ビーズへの結合よりも非常に低い。この結果は、ＧＭ
Ｐ−１４０で定義される一次エピトープ構造がシアロシ
ル−Ｌｅx よりもむしろシアロシル−Ｌｅa であること
を示す。
【００７２】もちろん、ＧＭＰ−１４０によって定義さ
れる他のエピトープ構造は本発明の方法を使用すること
によって同定できる。
【００７３】以下の実施例は例示であって、本発明を限
定するものではない。
【００７４】
【実施例】実施例１ ラクトース誘導体の合成 Ａ．メチル β−Ｄ−ラクトシド ヘプタアセチルラクトシルイミデート（ツィンマーマン
ら(Zimmermann et al.) 、J. Carbohy dr. Chem. ７：４
３５、１９８８）を、標準的な方法に従い、トリメチル
シリルトリフルオロメタンスルホン酸を含有する無水ジ
クロロメタン中にてメタノールと反応させた（グルンド
ラー及びシュミット(Grundler and Schmit) 、Liebigs.
Ann. Chem. １９８４：１８２６，１９８４）。シリカ
ゲルカラムクロマトグラフィー（トルエン／酢酸エチル
１：１（容量））で精製後、０．０１Ｍ ナトリウム
メトキシドを加えて脱−Ｏ−アセチル化を行うと、該イ
ミデートから６８％の収率にてメチルβ−Ｄ−ラクトシ
ドを得た。
【００７５】融点 ２１１〜２１２℃（文献では２０５
℃、スミス及びヴァン クレーヴ、ジャーナル オヴ
アメリカン ケミカル ソサイエティー (Smith and va
n Cleve, J. Am. Chem. Soc.) ７７：３１５９、１９５
５）； 〔α〕D ＋１．３°（ｃ ６．９、Ｈ2 Ｏ）（文献では
＋１°、ｃ ５．０、Ｈ2 Ｏ）、同書）。
【００７６】Ｂ．フェニル β−Ｄ−チオラクトシド ラクトース オクタアセテート（ハドソン及びクンツ、
ジャーナル オヴ アメリカン ケミカル ソサイエテ
ィー （Ｈｕｄｓｏｎ ａｎｄ Ｋｕｎｚ， Ｊ． Ａ
ｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．）４７：２０５２、１９２
６）を、０℃にてジクロロメタン中、チオフェノール及
びＳｎＣｌ４ を反応させ（ニコラウら、ジャーナル
オヴ アメリカン ケミカル ソサイエティー (Nicola
ou et al., J. Am. Chem. Soc.) 、１１０：７９１０，
１９８８）、８０％の収率にてフェニルヘプタアセチル
β−Ｄ−チオラクトシドを得た。該生成物をＭｅＯＨ中
にてＮａＯＭｅを用いて脱アセチル化し、アンバーリス
ト１５（Amberlyst 15、商標名）を用いて中和した。該
生成物をバイオジェルＰ−２（BioGel P-2、商標名）カ
ラム上で溶離液として水を使用して精製し、糖含有分画
を凍結乾燥させ、フェニルβ−Ｄ−チオラクトシドを白
色無定形の粉末として得た。
【００７７】Ｃ．ラクト−Ｎ−テトロース Ｇａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４Ｇ
ｌｃで表されるオリゴサッカライドは、人乳(human mil
k)をエタノールで前処理した後、溶離液として水を使用
してバイオジェルＰ−２カラム上で精製を繰り返し、水
を用いた逆相（Ｃ18）高圧液体クロマトグラフィー(rev
ersed-phase(Ｃ18)high pressure liquid chromatograp
hy) を用いて調製した（ドュア及びブッシュ、アナリュ
ティカルバイオケミストリー(Dua and Bush, Anal. Bio
chem.)１３３：１、１９８３）。該 1Ｈ−ＮＭＲスペク
トルは、標準試料のスペクトルと一致した（バイオカー
ブ ケミカルズ、ルンド、スウェーデン(BioCarb Chemi
cals, Lund, Sweden) ）。
【００７８】Ｄ．β−Ｄ−ラクトシドのポリ（エチレン
グリコール）誘導体 反応スキームを化１に示す。
【００７９】
【化１】
【００８０】β−Ｄ−ラクトシドのポリ（エチレングリ
コール）誘導体は、入手容易な３−スクシンイミドオキ
シカルボニルプロピル−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ
−Ｏ−アセチル−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−
（１→４）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ
−グルコピラノシド１と末端にアミノ基を有するポリ
（エチレングリコール）メチルエーテル２（平均分子量
２０００；アルドリッチケミカル、ミルウォーキー(Ald
rich Chemical, Milwaukee) 、ＷＩ）とから調製した
（ツァリプスキーら、(Zalipsky et al.) Eur.Polym.J .
１９：１１７７、１９８３）。１（１００mg、０．１２
mmol）と２（１６３mg、０．０８２mmol）とを無水Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）中で室温にて２時
間処理すると、溶離液としてアセトンを用いたＬＨ−２
０クロマトグラフィーを用いて精製した後、９１％の収
率にてβ−Ｄ−ラクトシドヘプタアセテート３を得た：
〔α〕D −５．３°（ｃ ０．５、クロロホルム）。
【００８１】引き続き３を０．０５Ｍ水酸化ナトリウム
を用いて室温にて１時間けん化した後、凍結乾燥して、
所望のラクトシド４を定量的に得た： 〔α〕D −２．４°（ｃ １．０、クロロホルム）。
【００８２】実施例２ Ｂ１６メラノーマ細胞の転移ポ
テンシャルに対するラクトース及びラクト ース誘導体の
効果 Ａ．細胞及び動物 Ｂ１６メラノーマ細胞株の高転移性ＢＬ６クローンは、
最初にジーン スターキー博士(Dr. Jean Starkey)（モ
ンタナ ステート ユニヴァーシティー、ボーズマン(M
ontana State Univ., Bozeman)、ＭＴ）から得、同遺伝
子型の(syngeneic) Ｃ５７／ＢＬマウスからその転移ポ
テンシャルに応じて再選抜した。Ｃ５７／ＢＬマウスは
フィルターを通した空気雰囲気下にてプラスティックケ
ージ中で維持し、水及び固形試料を自由に摂取させた(a
d lib.) 。２ｍＭグルタミン及び１０％ウシ胎児血清
（ＦＣＳ）を補給したＲＰＭＩ １６４０中で細胞を培
養し、２ｍＭのＥＤＴＡを含有するリン酸バッファー処
理した生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して細胞を遊離し
た。生存度は、トリパンブルーイクスクルージョンテス
ト(trypan blue exclusion test)で調べた。
【００８３】Ｂ．転移ポテンシャルに対するオリゴサッ
カライドの効果 ＢＬ６細胞の懸濁液（１〜３×１０6 細胞／ｍｌ ＲＰ
ＭＩ １６４０培地）を調製し、濃度の異なる種々のオ
リゴサッカライドの存在下又は非存在下で、３７℃にて
５〜１０分間アリコット(aliquots)をインキュベートし
た。インキュベート後、２００μｌ中３×１０4 又は２
×１０4 個の細胞（オリゴサッカライド前処理の有無を
問わず）を含む懸濁液を、尾静脈経由で８週齢の雌マウ
スに注射した。１８〜２１日後にマウスを殺し、１０％
ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（ｐＨ ７．４）中で肺
を固定化して、腫瘍細胞コロニー数を解剖顕微鏡を用い
て数えた。この様にして、上記の条件下における肺中の
転移性メラノーマコロニー数の対照値(background valu
es) を求めた。コロニーの数及び大きさのデータは、分
散分析法（ＡＮＯＶＡ）により統計的に処理された。直
径１ｍｍ以上のコロニーは大きいもの、そして直径１ｍ
ｍ未満のコロニーは小さいものと見なした。
【００８４】１回の実験において、ＢＬ６細胞を、種々
の濃度のラクトース、ラクト−Ｎ−テトロース（Ｇａｌ
β１→３ＧｌｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβ１→４Ｇｌ
ｃ）、メチルβ−Ｄ−ラクトシド又はフェニルβ−Ｄ−
チオラクトシドとともに、種々の期間インキュベートし
た。実験の大多数では０．１Ｍの濃度を使用し、細胞は
３７℃にて１０分間インキュベートして、４００×ｇに
て１０分間軽く遠心分離を行なうことにより、糖を含有
する培地から分離した。ＲＰＭＩ １６４０に再び懸濁
させ、尾静脈経由で注射した（０．２ｍｌ懸濁液中３×
１０4 個の細胞を含む）。他の実験としては、２×１０
4 個の細胞を注射し、２１日後にコロニー数をカウント
した。種々の糖溶液中にて培養した後のＢＬ６細胞の生
存度及び細胞増殖能(cell growth ability) は、トリパ
ンブルーイクスクルージョンテストにより、及びイン
ヴィトロの通常の条件下でＲＰＭＩ １６４０培地にプ
レーティングすることにより調べた。また、腫瘍の増殖
を調べるために、適齢であるＣ５７／ＢＬマウスに皮下
接種をした。
【００８５】ＢＬ６細胞をラクトース及びラクト−Ｎ−
テトロースと共にプレインキュベートした後同じ条件下
で細胞を静脈注射した場合、肺中の転移性コロニーは、
ラクトース及びラクト−Ｎ−テトロースでそれぞれ２６
％及び３６％の減少を示した。上記と同じ条件下でＢＬ
６細胞を０．１Ｍ、０．０１Ｍ、又は０．００５Ｍのメ
チルβ−Ｄ−ラクトシドで処理すると、転移性肺コロニ
ー数は対照と比較してそれぞれ４３％、１６％及び８％
の減少を示した。０．１Ｍのメチルβ−Ｄ−ラクトシド
による顕著な減少は３つの異なる実験においても再現さ
れ、該減少は常に３５％と４５％の間であることが判明
した。
【００８６】第２は全く独立した実験系であり、異なっ
た条件下でメチルβ−Ｄ−ラクトシド又はフェニルβ−
Ｄ−チオラクトシドと処理すると、同様に転移性コロニ
ー化の顕著な減少が見られた。すなわち、メチルβ−Ｄ
−ラクトシド又はフェニルβ−Ｄ−チオラクトシドとと
もにプレインキュベーションを行なうと、合計コロニー
数はそれぞれ対照値の３５％及び５０％に減少した。す
べての実験において、大きいコロニーは小さいコロニー
に比べるとより明らかな減少を示しており、特にフェニ
ルβ−Ｄ−チオラクトシドで処理したものは顕著であっ
た。その結果を図５に示す。図５は、肺におけるＢＬ６
細胞付着によるコロニーの数及び大きさに及ぼすメチル
β−Ｄ−ラクトシド又はフェニルβ−Ｄ−チオラクトシ
ドの効果を図示したものである。ＢＬ６を、対照培地、
０．１Ｍメチルβ−Ｄ−ラクトシド（“Ｍｅ−β−ラク
トシド”）又は０．１Ｍフェニルβ−Ｄ−チオラクトシ
ド（“ｐｈｅ−β−Ｓ−ラクトシド”）とプレインキュ
ベートし、２×１０4 個の細胞をＣ５７／ＢＬマウスに
静脈注射した後、２１日後に肺コロニー数をカウントし
て、図中の各カラムの表示のように直径（＞１ｍｍと＜
１ｍｍ）に基づいてコロニーを分類したものである。１
個の肺に発現したコロニーの数をカウントし、実験回数
（“ｎ”）を括弧内に表示した。メチルβ−Ｄ−ラクト
シド及びフェニルβ−Ｄ−チオラクトシドは共に、細胞
数の増加及びチミジンの取り込みに対してイン ヴィト
ロでわずかなの刺激効果を示した。従って、腫瘍付着(t
umor deposition)の阻害効果は、イン ヴィトロ又はイ
ン ビボにおける細胞増殖に対する効果とは関連性がな
い。
【００８７】別の実験では、メチルβ−Ｄ−ラクトシド
のメラノーマ細胞の転移に対する効果は、オリゴサッカ
ライドを投与した後、腫瘍細胞を接種することにより決
定された。特に、メチルβ−Ｄ−ラクトシドの１ｍｌの
用量（０．２５Ｍ又は０．５Ｍの濃度）をマウスに腹腔
内注射した。１０分後、Ｂ１６メラノーマ細胞を静脈内
に注射し、１９日後に肺コロニー数をカウントした。腫
瘍細胞の接種前にあらかじめメチルβ−Ｄ−ラクトシド
を注射すると、肺転移性コロニーの形成は顕著に減少す
る。その結果を図６に示す。図６中、Ａはメチルβ−Ｄ
−ラクトシドを投与していない対照群を示し、Ｂ及びＣ
はそれぞれ０．２５Ｍ及び０．５Ｍのメチルβ−Ｄ−ラ
クトシドを注射した群を示す。それぞれの群において第
１カラムは合計コロニー数を、第２カラムは直径＞１ｍ
ｍのコロニー数を、第３カラムは直径＜１ｍｍのコロニ
ー数を示す。実験数は“ｎ”で表示した。
【００８８】他の別個の実験では、異なった転移ポテン
シャル程度を示すマウスメラノーマＢ１６変異株（ＢＬ
６／Ｆ１０／Ｆ１／ＷＡ４）は、既にメラノーマ結合性
抗原(melanoma-associated antigen) （平林ら、ジャー
ナル オヴ バイオロジカルケミストリー(Hirabayashi
et al., J. Biol. Chem.)、２６０：１３３２８，１９
８５；ノアーズら、ジャーナル オヴ イムノロジー(N
ores et al., J. Immunol.) 、１３９：３１７１、１９
８７）と同定されたＧＭ３ガングリオシドと同順序の発
現を示した。ＧＭ３は内皮細胞上で多く発現するＬａｃ
Ｃｅｒと相互作用する。ＬａｃＣｅｒでコートされた固
形層上又は内皮細胞上へのＢ１６変異株の接着順序も、
これらの転移ポテンシャルの順序（ＢＬ６＞Ｆ１０＞＞
ＷＡ４）と同様であった。これとは対照的に、Ｂ１６変
異株のインテグリン依存性接着(integrin-dependent ad
hesion) は、ＢＬ６、Ｆ１０、及びＦ１とほぼ等しかっ
た。その概要を図７、図８及び図９に示す。図７はＬａ
ｃＣｅｒでコートされた固形層上へのメラノーマ細胞の
接着順序を、図８はＬａｃＣｅｒ／フィブロネクチン
（ＦＮ）とともにコートされた固形層上へのメラノーマ
細胞の接着順序を、図９はのインテグリン依存性細胞接
着順序を示す。これらの実験結果から、ＬａｃＣｅｒの
Ｂ１６接着はＧＭ３−ＬａｃＣｅｒの分子間相互作用に
基づくものと示唆される。さらに、内皮細胞上へのＢ１
６メラノーマ接着は、メチルβ−Ｄ−ラクトシドのみに
阻害されるのではなく、ＬａｃＣｅｒリポソーム、Ｇｇ
３Ｃｅｒリポソーム及びＧＭ３リポソームによっても阻
害されることが証明された。メラノーマ細胞（ＢＬ６）
のＬａｃＣｅｒ上及び内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）上への接
着がＬａｃＣｅｒ及びＧＭ３により阻害される様子を、
それぞれ図１０及び図１１に示す。図１０及び図１１
中、▽はリポソームのみ、○はＧＭ３、▲はＧｇ３、●
はメチルβ−Ｄ−ラクトシド及び△はＬａｃＣｅｒによ
す阻害を、それぞれ示している。
【００８９】さらに、上述したメチルβ−Ｄ−ラクトシ
ドの転移阻害効果の観察は、別個のメチルβ−Ｄ−ラク
トシド注射へと発展した。つまり、腫瘍細胞を静脈注射
した後、メチルβ−Ｄ−ラクトシドを腹腔内に注射する
ものである。これら実験において０．２５〜０．５Ｍの
メチルβ−Ｄ−ラクトシドを注射すると、肺転移性コロ
ニー数が４０〜７０％減少した。その結果を図１２に示
す。図１２中のＡはＰＢＳ対照、Ｂは０．２５Ｍのメチ
ルβ−Ｄ−ラクトシド、Ｃは０．５Ｍのメチルβ−Ｄ−
ラクトシド、Ｄは０．５Ｍのラクトース、Ｅは０．２５
ＭのＮ−アセチルラクトサミン、Ｆは０．５Ｍのメチル
−β−ガラクトシドをそれぞれ腹腔内に注射したときの
転移阻害効果を図示したものである。
【００９０】実施例３ 人肺アデノカルチノーマ細胞株
におけるシアロシル−二量体ＬＥ x の発現及び転移ポテ
ンシャル Ａ．細胞株 ＫＵＭ−ＬＫ−２は、ヌードマウスにおいて自然肺転移
を起こすことを特徴とするヒトの非アデノカルチノーマ
細胞株である。ヌードマウス中で増殖した３５のヒトカ
ルチノーマ細胞株をスクリーニングしたところ、この細
胞株のみがヌードマウスの肺に転移付着を起した。限界
希釈法により静脈注射後に肺転移を起すサブ細胞株(sub
-cell lines)を得るために、ＫＵＭ−ＬＫ−２が親細胞
株(parent cell lines) として使用された。
【００９１】限界希釈技術の手順は下記の通りである。
ＫＵＭ−ＬＫ−２を、１０％ＦＣＳ（ハイクローン、ロ
ーガン(Hyclone, Logan)、ＵＴ）を補給したＲＰＭＩ
１６４０ 培地（ＧＩＢＣＯ、グランド アイランド(G
rand Island)、ＮＹ）中で、３７℃、５％ＣＯ2 ／９５
％空気雰囲気中にて培養した。細胞を２ｍＭ ＥＤＴＡ
溶液で簡単に処理し、ＲＰＭＩ １６４０で２度洗浄し
て、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ中に細胞を１個含有す
る懸濁液を得た。トリパンブルー除去染色で調べた結
果、細胞生存度は＞９８％であった。１００μｌ中細胞
１個を含む細胞懸濁液を、９６個のウェルのマイクロタ
イタープレート(microtiter plate)（コーニング グラ
ス ワークス、コーニング（Corning Glass Works, Cor
ning) 、ＮＹ）の各ウェルに移し、２４時間培養した。
その後、各ウェルを位相差顕微鏡で観察した。
【００９２】異なった転移ポテンシャル（“ＭＰ”）を
有する３つの細胞株（ＨＡＬ−８、ＨＡＬ−２４及びＨ
ＡＬ−３３）を、細胞の形態が安定であることに基づき
限界希釈技術により得られた２５のクローンから選抜し
た。これら２５個のクローンは、イン ヴィトロの細胞
増殖において安定かつ一定の形態を示す６３のクローン
から、最初に選抜したものである。これらすべてのクロ
ーンは自然肺転移を起した。しかし静脈注射をすると、
肺転移付着を形成する点において、これらクローン間で
は明らかな相違が見受けられた。高ＭＰの２つのクロー
ン、低ＭＰの５つのクローン及びＭＰを有しない１８の
クローンに区別された。これらクローンを静脈注射して
繰り返し選抜を行うことにより、一定したＭＰを示す最
も安定したサブ細胞株を確立した。これらはＨＡＬ−
８、−３３及び−２４であり、ｎｕ／ｎｕ（ヌードマウ
ス）の肺に対してそれぞれ高、低及び無ＭＰを示した。
その結果を、下記の表１に示す。肉眼的及び顕微鏡的観
察によると、これら３つのサブ細胞株中どのラインも、
他の器官又はリンパ節において転移を示さなかった。該
サブ細胞株は、ＫＵＭ−ＬＫ−２に最初から存在する安
定した変異株を表す。染色体分析に基づくと、これらサ
ブクローンは独立である。
【００９３】 表１ ヌードマウスにおけるＨＡＬ−８、−２４及び−３３クローンの 転移ポテンシャル a クローン ＃世 代 ＃５６日後の肺小節 b １５ １５．８（８−２３） ＨＡＬ−８ ２２ １５．０（１０−２２） ４ ６ １６．３（１１−２５） １５ ０ ＨＡＬ−２４ ２２ ０ ４ ６ ０ １５ ４．３（３−７） ＨＡＬ−３３ ２２ ５．１（２−８） ４ ６ ５．８（３−８） a ：記載した種々の世代時間に２×１０5 個の細胞をヌ
ードマウスの尾静脈に注射した。注射５６日後にマウス
を殺し、肺表面の転移性小節の数を解剖顕微鏡でカウン
トした。
【００９４】b ：６マウスの平均（範囲は括弧内に表示） Ｂ．細胞表面炭水化物エピトープの発現 種々の炭水化物エピトープの細胞表面発現は、Ｌｅ
x （ＭＡｂ ＳＨ１）、シアロシル−Ｌｅx （ＭＡｂ
ＳＨ４）、シアロシル−二量体Ｌｅx （ＭＡｂ ＦＨ
６）、Ｔ（ＭＡｂ ＨＨ８）、Ｔｎ（ＭＡｂ １Ｅ３）
及びシアロシル−Ｔｎ（ＭＡｂ ＴＫＨ２）に対する種
々のモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）を使用して、サイ
トフルオロメトリー(cytofluorometry) で分析した。使
用した全ての抗体は、イムノグロブリン１０μｇ／ｍｌ
に調整されたそれぞれのハイブリドーマの培養上清であ
った。以下に、シアロシル−Ｌｅx （構造式１）、シア
ロシル−二量体−ＬＥx （構造式２）、二量体−Ｌｅx
（構造式３）、トリフコシル−Ｌｅy （構造式４）、Ｌ
ｅb （構造式５）、Ｈ（構造式６）、ＳＡ−Ｌｅa （構
造式７）、ＳＡ−Ｔｎ（構造式８）、ジシアロシル−Ｌ
ｅa （構造式９）、モノシアロシル−Ｌｅa ＩＩ（構造
式１０）、ＧＭ３（構造式１１）、ＳＰＧ（構造式１
２）及びＬｅa （構造式１３）の構造式を示す。
【００９５】
【化２】
【００９６】
【化３】
【００９７】０．２５％トリプシンを含む２ｍＭ ＥＤ
ＴＡ溶液を用いて細胞を培養容器から分離し、各ＭＡｂ
処理のために１×１０5 個の細胞を調製した。細胞をＭ
Ａｂとともに１時間４℃にてインキュベートした後ＲＰ
ＭＩ １６４０で２回洗浄した。ＰＢＳで５０倍に希釈
したヤギ抗−マウスＩｇＧ又はＩｇＭ−ＦＩＴＣ（ベー
リンガー−マンハイム、インディアナポリス(Boehringe
r-Mannheim, Indianapolis) 、ＩＮ）を添加し、３０分
間４℃にてインキュベートした。最後に、細胞を３回洗
浄してＰＢＳに再懸濁させて、エピックス プロファイ
ル フローサイトメトリー(EPICS PROFILE flow cytome
try)（エピックス、ハイアレア(Epics,Hialeah)、Ｆ
Ｌ）に供した。これらの実験は、３つの異なる世代で繰
り返し実施した。
【００９８】サブ細胞株ＨＡＬ−８、−２４及び−３３
上の６つの炭水化物エピトープ（それぞれのＭＡｂｓで
定義される）の発現パターンは、シアロシル−二量体−
Ｌｅx の場合を除いて、ほぼ同一のプロファイルを示し
た（該３つのサブ細胞株の蛋白プロファイルがほぼ同一
であったのと同様に）。特に、ＨＡＬ−８、−２４及び
−３３がシアロシル−Ｌｅx 及びシアロシル−Ｔｎ構造
を顕著に且つ同等に発現することが明らかになった。各
３つのラインはＬｅx 及びＴｎを低量しか発現せず、Ｔ
は発現しなかった。これに対してシアロシル−二量体−
Ｌｅx の発現は、ＨＡＬ−８では高く、ＨＡＬ−３３で
は中程度、そしてＨＡＬ−２４では低かった。
【００９９】 Ｃ．細胞のシアリダーゼ処理による転移阻害 ２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳを用いて細胞を分離して
洗浄し、９倍量のＰＢＳに再懸濁させた。細胞懸濁液１
ｍｌを、０．２Ｕ／ｍｌのクロストリジウム・パーフリ
ンジェンス(Clostridium perfringens) シアリダーゼ
（タイプＸ、シグマ ケミカル カンパニー、セント
ルイーズ(type X, Sigma Chemical Co., St. Louis) 、
ＭＯ）とともに５分間３７℃にてインキュベートした。
インキュベート後細胞を３回洗浄してＲＰＭＩ １６４
０に再懸濁させ、ＭＰ及びシアロシル−二量体−Ｌｅx
の発現を調べた。ＨＡＬ−８及び−３３のＭＰは細胞の
シアリダーゼ処理で完全に阻害された。その結果を、以
下の表２に示す。シアロシル−二量体−Ｌｅx の発現
は、血液−骨転移に重要な役割を持っていることが明ら
かである。
【０１００】 表２ ＨＡＬ−８及び−３３クローンの転移ポテンシャルに対する シ アリダーゼ処理効果 a 処理 ク ローン ＃５６日後の肺小節 b 対照（ＰＢＳ） ＨＡＬ−８ １６．３（９−２４） ＨＡ Ｌ−３３ ４．６（３−７） シアリダーゼ ＨＡＬ−８ ０ ＨＡ Ｌ−３３ ０ a ：２×１０5 個の細胞をヌードマウスの尾静脈に注射
した。注射５６日後にマウスを殺し、肺表面の転移性小
節の数を解剖顕微鏡でカウントした。
【０１０１】b ：６マウスの平均（範囲は括弧内に表示）実施例４ ＧＭＰ−１４０のレクチンドメインに結合可
能な炭水化物エピトープの同定 Ａ．血小板の調製 血小板は、オレゴン赤十字(Oregon Red Cross)（ポート
ランド(Portland)、ＯＲ）から得た“血小板に富んだ血
漿(platelet-rich plasma)”から単離し、混在している
赤血球は８０×ｇで１０分間遠心分離することにより取
り除いた。血小板を３００×ｇで１０分間遠心分離し、
０．３５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む２２ｍ
Ｍクエン酸バッファーを含有するタイロードバッファー
(Tyrode's buffer) （ｐＨ ６．５）中に懸濁した。ト
ロンビン添加後（最終濃度１Ｕ／ｍｌ）、血小板懸濁液
（１×１０8 ／ｍｌ）をインキュベートした（ｐＨ
７．２、３７℃、５分間）。その後、該混合物を攪拌す
ることなしに３７℃にて１０分間インキュベートした。
トロンビンにより活性化された血小板を同容量の２％ホ
ルムアルデヒドを含むリン酸バッファー生理食塩水（Ｐ
ＢＳ）を用いてｐＨ７．２で固定化し、１％ＢＳＡを含
むＰＢＳで２回洗浄した。活性化された血小板は、３７
℃にて３０分間インキュベートした後５０μｌの蛍光標
識したヤギ抗−マウスＩｇ（ターゴ、バーリンゲーム(T
ago, Burlingame)、ＣＡ）と反応させると、２．５μｇ
／ｍｌ抗−ＧＭＰ−１４０ ＭＡｂ ＡＣ１．２（アイ
ソタイプ ＩｇＧ1 ；ベックトン−ディッキンソン、サ
ン ノゼ(isotype IgG1 ; Beckton-Dickinson, San Jos
e)、ＣＡ）との強い反応性を示した（しかし、活性化さ
れていない血小板は強い反応性を示さなかった）。活性
化された血小板と活性化されていない血小板のＭＡｂ
ＡＣ１．２との反応性を示すフローサイトメトリックプ
ロファイルを、図１５、１６、１７及び１８に示す。図
１５は活性化されていない血小板のＭＩｇＧとの反応性
を、図１６はトロンビンにより活性化された血小板のＭ
ＩｇＧとの反応性を、図１７は活性化されていない血小
板の抗−ＧＭＰ−１４０との反応性を、そして図１８は
トロンビンにより活性化された血小板の抗−ＧＭＰ−１
４０との反応性を示している。
【０１０２】活性化された及び活性化されていない血小
板をｐＨ７．２においてＣａ2+−フリーＰＢＳ中パラホ
ルムアルデヒドで固定化し、１％ＢＳＡとともにＣａ2+
を含むＰＢＳで２回洗浄した。１％ＢＳＡ及び０．１％
アジ化合物とともにＣａ2+を含むＰＢＳ中に再懸濁し、
血小板の数を〜１×１０9 ／ｍｌに調整した。該細胞懸
濁液を４℃にて保存し、２４時間以内に結合アッセイに
供した。
【０１０３】Ｂ．ＧＳＬｓでコートされた蛍光ポリスチ
レンビーズ(Fluoroscent PolystyreneBeads) の調製 蛍光ポリスチレンラテックスビーズは、モレキュラー
プローブ、インコーポレイテッド、ユージーン(Molecul
ar Probe, Inc., Eugene) 、ＯＲから得た。該ビーズは
表面に硫酸基を有する黄−緑蛍光ビーズで、直径は〜
０．５μｍである（正確には０．４８６μｍ）。３０μ
ｌエタノール中の１×１０9 個のビーズを１０μｇのＧ
ＳＬ溶液を含む２００μｌのＣ＝Ｍ（クロロホルム：メ
タノール２：１）中に添加して十分攪拌し、Ｎ2 ガスで
乾燥させた。該残査を２００μｌのエタノール中に再懸
濁し短時間超音波処理した後、Ｎ2 ガスで乾燥させた。
乾燥した残渣を３％ＢＳＡ及び０．１％アジ化合物とと
もにＣａ2+を含む２ｍｌのＰＢＳ中に懸濁して１０分間
超音波処理を行い、表面をＢＳＡでブロックするために
３７℃で６０分間静置した。該懸濁液を３０００×ｇで
１０分間遠心分離を行い、ビーズペレットを１％ＢＳＡ
及びアジ化合物とともにＣａ2+を含むＰＢＳで２回洗浄
し、最後に該媒体５００μｌ中に懸濁して４℃にて保存
した。
【０１０４】Ｃ．結合アッセイ パラホルムアルデヒドで固定化された（活性化された又
は活性化されていない）、〜２×１０7 個の血小板を含
む２０μｌの血小板懸濁液を、蛍光ＧＳＬでコートされ
たビーズ（〜２×１０7 個のビーズを含む）１０μｌと
混合して十分攪拌し、２０μｌの固定化血小板懸濁液
（〜２×１０7 個の細胞）を１０μｌの蛍光ＧＳＬでコ
ートされたビーズ（〜２×１０7 個のビーズ）と混合
し、３７℃にて３０分間静置した。該血小板懸濁液をＣ
ａ2+を含む２００μｌのＰＢＳと混合し、フローサイト
メトリーで分析した（エピックス プロファイル、コー
ルターサイトメトリー、ハイアレア(EPICS Profile, Co
ulter Cytometry, Hialeah)、ＦＬ）。
【０１０５】Ｄ．フローサイトメトリックプロファイル
からのデータ分析 血小板単独及びビーズ単独のフローサイトメトリック分
析はゲーティングセット(gating set)のために実施し、
フリービーズ(free beads)より発せられるシグナルを除
外することによって、血小板から発せられるシグナルを
最も多く包含させた。結合指標(the binding index)
（ＢＩ）は、蛍光ＧＳＬでコートされたビーズとともに
インキュベートした血小板の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を
計算し、それを蛍光ＧＳＬでコートされていない（対
照）ビーズとともにインキュベートした血小板のＭＦＩ
で割った値である。種々のＧＳＬｓに対するＢＩ値を下
記の表３及び図１９に示す。図１９において、斜線の棒
線は活性化されていない血小板を示し、白抜きの棒線は
活性化された血小板を示している。ＳＡ−Ｌｅx 、ＳＡ
−Ｌｅa 、ＳＰＧ、ＧＭ３及びＬｅx の活性化／非活性
化血小板の結合指標（ＢＩ）の比を、“Ａ／ＮＡ比”表
示の下に示した。
【０１０６】 表３ ＧＳＬでコートされた硫酸含有ポリスチレンビーズへの トロンビン −活性化血小板の結合指標 a ＧＳＬ 活性化された 活性化／非活性化 血小板 の比 ＧＭ３ １．０±０．１ ０．７±０．５ ＳＡ−Ｌｅx ４．２±１．０ ４．２±０．５ ＳＡ−Ｌｅa ８．１±１．０ ６．１±０．２ ＳＰＧ ０．８±０．２ ０．７±０．２ Ｌｅ x １．１±０．３ １．０±０．３ a ：表示した値は、４つの異なる実験の平均値である。
【０１０７】Ｅ．ＭＡｂｓによる、血小板の蛍光ＧＳＬ
でコートされたビーズへの結合阻害 １．抗−ＧＭＰ−１４０。血小板を抗−ＧＭＰ−１４０
ＭＡｂ ＩＯＰ６２（イムノテック、マルセーユ、フ
ランス(Immunotech, Marseille, France) ）とともに３
７℃にて３０分間インキュベートし、前述のＧＳＬでコ
ートされたビーズを用いて結合アッセイを実施した。非
特異的マウスＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）を対照結合アッ
セイに使用した。
【０１０８】２．抗−ＳＡ−Ｌｅa 及び抗−ＳＡ−Ｌｅ
x ＭＡｂｓ。１０μｌのＳＡ−Ｌｅa でコートされたビ
ーズ（２×１０7 ）を２０μｌの抗−ＳＡ−Ｌｅa ＭＡ
ｂＣＡ１９−９（２０μｇ／ｍｌ）（マウス Ｉｇ
Ｇ1 ；シグネット ラボラトリーズ、デーデム(Signet
Laboratories, Dedham) 、ＭＡ）とともに室温にて６０
分間インキュベートして、血小板結合アッセイに供し
た。抗−ＳＡ−Ｌｅx ＭＡｂ ＳＮＨ４及び非特異的マ
ウスＩｇＧを対照として使用した。
【０１０９】その結果を図２０に示す。図２０の横軸は
阻害率を示し、第１カラムは抗−ＧＭＰ−１４０ ＭＡ
ｂ ＩＯＰ６２、第２カラムは抗−ＳＡ−Ｌｅa ＭＡｂ
ＣＡ１９−９、第３カラムは抗−ＳＡ−Ｌｅx ＭＡｂ
ＳＮＨ４、第４カラムは正常マウスＩｇＧをそれぞれ
示している。
【０１１０】Ｆ．結果 図１５、１６、１７及び１８に示したような抗−ＣＤ６
２ ＭＡｂとの高い反応性から明らかなように、活性化
された血小板は、高いＧＭＰ−１４０の発現を示した。
ＧＭＰ−１４０を発現する活性化された血小板はＳＡ−
Ｌｅx でコートされた蛍光ビーズと強い結合を示した
（図１９及び表３参照）。血小板のＳＡ−Ｌｅx でコー
トされたビーズとの結合も観察されたが、ＳＡ−Ｌｅa
との結合に比べると程度ははるかに少なかった（図１９
及び表３参照）。他のＧＳＬｓでコートされたビーズと
の結合は見受けられなかった。さらには、血小板のＳＡ
−Ｌｅa でコートされたビーズへの結合は抗−ＧＭＰ−
１４０ ＭＡｂ及び抗−ＳＡ−Ｌｅa ＭＡｂにより阻
害されたが、抗−ＳＡ−Ｌｅx ＭＡｂでは阻害されな
かった（図２０参照）。
【０１１１】実施例５ ダイナミックフローシステム中
における、ヒト結腸カルチノーマＣｏｌｏ ２０５細胞の
インターロイキン−１−活性化ヒト臍静脈内皮細胞への
接着に対する、種々 のモノクローナル抗体の効果 接着は、図２１、図２２、図２３及び図２４に示したダ
イナミックフローの実験システムを使用して評価した。
０．４から４．８ dynes／ｃｍ2 の種々のずれ応力(she
ar stress)での３分間における結合細胞数は、ビデオテ
ープの記録を種々の視野から観察してカウントした。粘
性係数は１．０Ｐ、チャンネルの半分の高さは５．７×
１０-3ｃｍ、チャンネル幅は１．３ｃｍであった。
【０１１２】該システムを使用して、種々の腫瘍に結合
する炭水化物抗原に対する種々のヒト腫瘍及びモノクロ
ーナル抗体の研究を行った。一実験の結果、すなわちヒ
ト結腸カルチノーマＣｏｌｏ２０５細胞の活性化された
ヒト内皮細胞への接着結果を図２５に示す。図２５中、
横軸は壁のずれ応力（ dynes／ｃｍ2 ）、縦軸は細胞接
着（×１０-2／視野）を示す。
【０１１３】図２５中の符号は、下記の通りである：○
は無関係なマウスＩｇＧプラスＩｇＭ（対照）の混合
物、▲はモノシアロシル−Ｌｅa Ｉに対するモノクロー
ナル抗体ＣＡ１９−９、△はシアロシル−Ｌｅx に対す
るモノクローナル抗体ＳＮＨ４、●はモノシアロシル−
Ｌｅa ＩＩ及びジシアロシル−Ｌｅa に対するモノクロ
ーナル抗体ＦＨ７、■は無関係なマウスＩｇＧプラスＩ
ｇＭおよび活性化されていない内皮細胞の混合物をそれ
ぞれ示している。
【０１１４】上記結果は、Ｃｏｌｏ２０５細胞の活性化
された内皮細胞への接着が、抗体ＦＨ７によって、特に
高い壁のずれ応力（５〜１０ dynes／ｃｍ2 ）において
最も強く阻害されていることを示すものである。これと
は対照的に、抗体ＣＡ１９−９は阻害効果を全く示さな
かった。これらの知見は、腫瘍細胞の内皮細胞への接着
がモノシアロシル−Ｌｅa ＩＩ又はジシアロシル−Ｌｅ
a とインターロイキン−１−活性化セレクチン(selecti
n)との相互作用を介して進行し得ることを示唆するもの
である。
【０１１５】以上本発明の特定の実施態様を開示した
が、本発明の意図及び範囲を逸脱しない限りにおいては
種々の変更が成されても良いことは、いうまでもない。
【図面の簡単な説明】
【図１】腫瘍において定義された腫瘍関連炭化水素抗原
（ＴＡＣＡ）が発現したものとしないものとの癌患者の
生存率を示す図である。具体的には、モノクローナル抗
体ＭＩＡ−１５−５で評価された、肺扁平上皮細胞ガン
中におけるＨ／Ｌｅy ／Ｌｅb 抗原の発現を示す。●は
ＭＩＡ−１５−５陰性（ｎ＝２９）、○はＭＩＡ−１５
−５陽性（ｎ＝３８）を指す。縦軸は生存率（％）、横
軸は生存年数を示す。
【図２】腫瘍において定義された腫瘍関連炭化水素抗原
（ＴＡＣＡ）が発現したものとしないものとの癌患者の
生存率を示す図である。具体的には、結腸ガン中におけ
るシアロシル−Ｌｅx 発現を示す。
【図３】腫瘍において定義された腫瘍関連炭化水素抗原
（ＴＡＣＡ）が発現したものとしないものとの癌患者の
生存率を示す図である。具体的には、結腸ガン中におけ
るシアロシル−Ｔｎ発現を示す。縦軸は累積生存比(cum
ulative proportion surviving) 、横軸は生存年数を示
す。
【図４】腫瘍において定義された腫瘍関連炭化水素抗原
（ＴＡＣＡ）が発現したものとしないものとの癌患者の
生存率を示す図である。具体的には、卵巣ガン患者の血
清中のシアロシル−Ｔｎレベルを示す。縦軸は無進行率
（％）(Percent Progression-free)、横軸は試験月数を
示す。
【図５】肺におけるＢＬ６細胞付着によるコロニーの数
及び大きさに及ぼすメチルβ−Ｄ−ラクトシド又はフェ
ニルβ−Ｄ−チオラクトシドの効果を示したものであ
る。ＢＬ６を、対照培地、０．１Ｍメチルβ−Ｄ−ラク
トシド（“Ｍｅ−β−ラクトシド”）又は０．１Ｍフェ
ニルβ−Ｄ−チオラクトシド（“ｐｈｅ−β−Ｓ−ラク
トシド”）とプレインキュベートし、２×１０4 個の細
胞をＣ５７／ＢＬマウスに静脈注射した後、２１日後に
肺のコロニー数をカウントして、図中の各カラムの表示
のように直径（＞１ｍｍと＜１ｍｍ）に基づいてコロニ
ーを分類したものである。１個の肺に発現したコロニー
の数をカウントし、実験回数（“ｎ”）を括弧内に表示
した。
【図６】あらかじめメチルβ−Ｄ−ラクトシドを投与す
ることによる、肺におけるＢＬ６細胞付着によるコロニ
ーの数及び大きさに及ぼす効果を示したものである。メ
チルβ−Ｄ−ラクトシド（用量１ｍｌ）をＣ５７／ＢＬ
マウスの腹腔内に注射し、１０分後にＢ１６メラノーマ
細胞を静脈注射した。１９日後に肺のコロニー数及び大
きさを測定した。グループＡはメチルβ−Ｄ−ラクトシ
ドを投与していない対照群を示し、グループＢ及びＣは
それぞれ０．２５Ｍ及び０．５Ｍのメチルβ−Ｄ−ラク
トシドを注射した群を示す。各グループにおいて、第１
カラムはコロニーの合計数、第２カラムは直径＞１ｍｍ
のコロニー数、第３カラムは直径＜１ｍｍのコロニー数
をそれぞれ示し、実験回数は“ｎ”で表示した。
【図７】ＬａｃＣｅｒ上へのメラノーマ細胞の接着がＧ
Ｍ３−ＬａｃＣｅｒ相互作用に基づくことを示す図であ
り、メラノーマ細胞のＬａｃＣｅｒでコートされた固形
層上への接着順序を示す。●はＢＬ６、△はＦ１０、▲
はＦ１、○はＷａ４をそれぞれ表す。
【図８】ＬａｃＣｅｒ上へのメラノーマ細胞の接着がＧ
Ｍ３−ＬａｃＣｅｒ相互作用に基づくことを示す図であ
り、メラノーマ細胞のＬａｃＣｅｒ／フィブロネクチン
（ＦＮ）でコートされた固形層上への接着順序を示す。
●はＢＬ６、△はＦ１０、▲はＦ１、○はＷａ４をそれ
ぞれ表す。
【図９】ＬａｃＣｅｒ上へのメラノーマ細胞の接着がＧ
Ｍ３−ＬａｃＣｅｒ相互作用に基づくことを示す図であ
り、インテグリン−依存性の接着を示す。●はＢＬ６、
△はＦ１０、▲はＦ１をそれぞれ表す。
【図１０】メラノーマ細胞（ＢＬ６）のＬａｃＣｅｒ上
への接着が、ＬａｃＣｅｒ及びＧＭ３により阻害される
ことを示したグラフである。▽はリポソーム単独、○は
ＧＭ３、▲はＧｇ３、●はＭｅβ−Ｌａｃ、△はＬａｃ
Ｃｅｒをそれぞれ表す。
【図１１】メラノーマ細胞（ＢＬ６）の内皮細胞（Ｈｕ
ＶＥＣ）上への接着がＬａｃＣｅｒ及びＧＭ３により阻
害されることを示したグラフである。▽はリポソーム単
独、●はＧＭ３、▲はＧｇ３、○はＭｅβ−Ｌａｃ、△
はＬａｃＣｅｒをそれぞれ表す。
【図１２】腫瘍細胞を静脈内に注射後、以下のＡ〜Ｆの
いずれかを腹腔内に注射した時の、メチルβ−Ｄ−ラク
トシドの転移阻害効果を示したものである。ＡはＰＢＳ
対照、Ｂは０．２５Ｍのメチルβ−Ｄ−ラクトシド、Ｃ
は０．５Ｍのメチルβ−Ｄ−ラクトシド、Ｄは０．５Ｍ
のラクトース、Ｅは０．２５ＭのＮ−アセチルラクトサ
ミン、Ｆは０．５Ｍのメチル−β−ガラクトシドをそれ
ぞれ腹腔内に注射したときの効果を示したものである。
【図１３】Ｈ−Ｌｅy 及びＨ−Ｈの相互作用を図示した
もので、Ｈ1 −リポソームと種々の糖脂質との結合を示
している。▲はＨ1 、○はＬｅy 、▼はシアリルパラグ
ロボシド（ＰＧ）、△はＬｅx 、●はパラグロボシド
（ＰＧ）を表す。
【図１４】Ｈ−Ｌｅy 及びＨ−Ｈの相互作用を図示した
もので、Ｌｅy −リポソームと種々の糖脂質との結合を
示している。▲はＨ1 、●はパラグロボシド（ＰＧ）、
○はＬｅy を指す。
【図１５】活性化されていない血小板のＭＡｂ ＡＣ
１．２との反応性を示すフローサイトメトリックプロフ
ァイルであり、活性化されていない血小板のＭＩｇＧと
の反応性を示す。
【図１６】活性化された血小板のＭＡｂ ＡＣ１．２と
の反応性を示すフローサイトメトリックプロファイルで
あり、トロンビンにより活性化された血小板のＭＩｇＧ
との反応性を示すものである。
【図１７】活性化されていない血小板のＭＡｂ ＡＣ
１．２との反応性を示すフローサイトメトリックプロフ
ァイルであり、活性化されていない血小板の抗−ＧＭＰ
−１４０との反応性を示すものである。
【図１８】活性化された血小板のＭＡｂ ＡＣ１．２と
の反応性を示すフローサイトメトリックプロファイルで
あり、トロンビンにより活性化された血小板の抗−ＧＭ
Ｐ−１４０との反応性を示している。
【図１９】種々のＧＳＬｓでコートされた蛍光ビーズと
血小板との結合指標を図示したものであり、斜線の棒線
は活性化されていない血小板、白抜きの棒線は活性化さ
れた血小板を示している。“Ａ／ＮＡ比”表示の下に、
ＳＡ−Ｌｅx 、ＳＡ−Ｌｅa 、ＳＰＧ、ＧＭ３及びＬｅ
x の活性化／非活性化血小板の結合指標の比を示す。
【図２０】活性化された血小板のシアロシル−Ｌｅa で
コートされたビーズへの結合に対する、種々のモノクロ
ーナル抗体の効果を示したもので、横軸は阻害率を表
し、第１カラムは抗−ＧＭＰ−１４０ ＭＡｂ ＩＯＰ
６２、第２カラムは抗−ＳＡ−Ｌｅa モノクローナル抗
体 ＣＡ１９−９、第３カラムは抗−ＳＡ−Ｌｅx モノ
クローナル抗体 ＳＮＨ４、第４カラムは正常マウスＩ
ｇＧをそれぞれ示している。
【図２１】フローシステム中細胞の流動的接着を示す実
験システムで、ラミナーフローチャンバーの構造を示
す。
【図２２】フローシステム中細胞の流動的接着を示す実
験システムで、細胞又は接着した分子（９）が固定され
たカバーガラス（３）でフローチャンバー本体（１６）
が堅く固定されたラミナーチャンバーの横断面図を示
す。
【図２３】フローシステム中細胞の流動的接着を示す実
験システムで、記録システムを全て集めたものである。
【図２４】フローシステム中細胞の流動的接着を示す実
験システムで、細胞層又は接着分子の上を懸濁液中の腫
瘍細胞が流れる様子を図示したものである。
【図２５】ダイナミックフローシステム中における、ヒ
ト結腸カルチノーマＣｏｌｏ２０５細胞のインターロイ
キン−１−活性化ヒト臍静脈内皮細胞への接着に対する
種々のモノクローナル抗体の効果を図示したものであ
り、○は無関係なマウスＩｇＧプラスＩｇＭの混合物
（対照）、▲はモノシアロシル−Ｌｅa Ｉに対するモノ
クローナル抗体ＣＡ１９−９、△はシアロシル−Ｌｅx
に対するモノクローナル抗体ＳＮＨ４、●はモノシアロ
シル−Ｌｅa ＩＩ及びジシアロシル−Ｌｅa に対するモ
ノクローナル抗体ＦＨ７、■は無関係なマウスＩｇＧプ
ラスＩｇＭおよび活性化されていない内皮細胞の混合物
をそれぞれ示している。
【符号の説明】
１ フローチャンバー ２ 圧力ポンプ ３ カバーガラス ４ 透明プラスティック表面 ５ ガスケット ６ インレットスロット ７ アウトレットスロット ８ インレットマニホルド ９ 細胞 １０ 倒立顕微鏡 １１ ビデオレコーダー １２ ビデオカメラ １３ ディジタル画像処理装置 １４ 腫瘍細胞懸濁液 １５ 回転又は停止腫瘍細胞 １６ チャンバー本体 １７ 水浴 １８ 細管 １９ アウトレットマニホルド ２１ バキューム
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 45/05 8415−4Ｃ Ｃ０８Ｂ 37/00 Ｚ 7329−4Ｃ (72)発明者 センイチロウ ハコモリ アメリカ合衆国 98119 ワシントン シ アトル スィート 305 エリオット ア ベニュ ウエスト 201 ザ バイオメン ブレン インスティテュート内 (72)発明者 カズコ ハンダ アメリカ合衆国 98119 ワシントン シ アトル スィート 305 エリオット ア ベニュ ウエスト 201 ザ バイオメン ブレン インスティテュート内 (72)発明者 タツシ トヨクニ アメリカ合衆国 98119 ワシントン シ アトル スィート 305 エリオット ア ベニュ ウエスト 201 ザ バイオメン ブレン インスティテュート内 (72)発明者 エドワード ヌデルマン アメリカ合衆国 98119 ワシントン シ アトル スィート 305 エリオット ア ベニュ ウエスト 201 ザ バイオメン ブレン インスティテュート内

Claims (51)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシ
    ル−Ｌｅa ＩＩ、ジシアロシル−Ｌｅa 及びシアロシル
    −Ｌｅx の類縁体(mimetics)からなる群から選ばれた少
    なくとも１種の薬剤を生物学的製剤(biological prepar
    ation)とインキュベートし、該薬剤が該製剤の転移ポテ
    ンシャルを阻害することからなる生物学的製剤の範囲内
    で腫瘍細胞の転移ポテンシャル(metastasis potential)
    を阻害する方法。
  2. 【請求項２】前記薬剤がモノシアロシル−Ｌｅa Ｉの類
    縁体である請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記薬剤がモノシアロシル−Ｌｅa ＩＩの
    類縁体である請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記薬剤がジシアロシル−Ｌｅa の類縁体
    である請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記薬剤がシアロシル−Ｌｅx の類縁体で
    ある請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記薬剤がポリ（エチレングリコール）と
    結合している請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 【請求項７】モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシ
    ル−Ｌｅa ＩＩ、ジシアロシル−Ｌｅy 及びシアロシル
    −Ｌｅx の類縁体からなる群から選ばれた少なくとも１
    種の薬剤の有効量を温血動物に投与し、該薬剤が温血動
    物の転移ポテンシャルを阻害することからなる温血動物
    における腫瘍細胞の転移ポテンシャルを阻害する方法。
  8. 【請求項８】前記薬剤がモノシアロシル−Ｌｅa Ｉの類
    縁体である請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記薬剤がモノシアロシル−Ｌｅa ＩＩの
    類縁体である請求項７に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記薬剤がジシアロシル−Ｌｅa の類縁
    体である請求項７に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記薬剤がシアロシル−Ｌｅx の類縁体
    である請求項７に記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記薬剤がポリ（エチレングリコール）
    と結合している請求項８〜１２のいずれかに記載の方
    法。
  13. 【請求項１３】ポリ（エチレングリコール）と結合し
    た、モノシアロシル−Ｌｅa Ｉの類縁体、モノシアロシ
    ル−Ｌｅa ＩＩの類縁体、 ジシアロシル−Ｌｅy の類
    縁体及びシアロシル−Ｌｅx の類縁体からなる群から選
    ばれた類縁体からなる複合体。
  14. 【請求項１４】前記類縁体がモノシアロシル−Ｌｅa Ｉ
    の類縁体である請求項１３に記載の複合体。
  15. 【請求項１５】前記類縁体がモノシアロシル−Ｌｅa Ｉ
    Ｉの類縁体である請求項１３に記載の複合体。
  16. 【請求項１６】前記類縁体がジシアロシル−Ｌｅy の類
    縁体である請求項１３に記載の複合体。
  17. 【請求項１７】前記類縁体がシアロシル−Ｌｅx の類縁
    体である請求項１３に記載の複合体。
  18. 【請求項１８】モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロ
    シル−Ｌｅa ＩＩ、ジシアロシル−Ｌｅa 及びシアロシ
    ル−Ｌｅx の類縁体からなる群から選ばれた少なくとも
    １種の薬剤と生物学的製剤をインキュベートし、該薬剤
    が細胞の凝集または接着を阻害することからなる生物学
    的製剤の範囲内でＧＭＰ−１４０−媒介またはＥＬＡＭ
    −１−媒介の細胞凝集または接着を阻害する方法。
  19. 【請求項１９】細胞凝集または接着が、（ａ）細胞の血
    小板への接着、（ｂ）細胞の血小板を経由した細胞への
    接着、（ｃ）細胞の血小板を経由した内皮細胞への接着
    または（ｄ）細胞のＧＭＰ−１４０またはＥＬＡＭ−１
    を経由した直接的な内皮細胞への接着に起因する請求項
    １８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】細胞凝集または接着が、ＧＭＰ−１４０
    により媒介されたものである請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】細胞凝集または接着が、ＥＬＡＭ−１に
    より媒介されたものである請求項１９に記載の方法。
  22. 【請求項２２】前記薬剤がモノシアロシル−Ｌｅa Ｉの
    類縁体である請求項１８に記載の方法。
  23. 【請求項２３】前記薬剤がモノシアロシル−Ｌｅa ＩＩ
    の類縁体である請求項１８に記載の方法。
  24. 【請求項２４】前記薬剤がジシアロシル−Ｌｅa の類縁
    体である請求項１８に記載の方法。
  25. 【請求項２５】前記薬剤がシアロシル−Ｌｅx の類縁体
    である請求項１８に記載の方法。
  26. 【請求項２６】前記薬剤がポリ（エチレングリコール）
    と結合している請求項２２〜２５のいずれかに記載の方
    法。
  27. 【請求項２７】モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロ
    シル−Ｌｅa ＩＩ、ジシアロシル−Ｌｅa 及びシアロシ
    ル−Ｌｅx の類縁体からなる群から選ばれた少なくとも
    １種の薬剤の有効量を温血動物に投与し、該薬剤が温血
    動物の腫瘍細胞部位での転移ポテンシャルを低減させる
    ことからなる腫瘍細胞部位でＧＭＰ−１４０−媒介また
    はＥＬＡＭ−１−媒介の細胞凝集または接着を阻害し、
    それにより温血動物の該部位での転移ポテンシャルを低
    減させる方法。
  28. 【請求項２８】細胞凝集または接着が、（ａ）腫瘍細胞
    の血小板への接着、（ｂ）腫瘍細胞の血小板を経由した
    腫瘍細胞への接着、（ｃ）腫瘍細胞の血小板を経由した
    内皮細胞への接着または（ｄ）腫瘍細胞のＧＭＰ−１４
    ０またはＥＬＡＭ−１を介した直接的な内皮細胞への接
    着に起因する請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】細胞凝集または接着が、ＧＭＰ−１４０
    により媒介されたものである請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】細胞凝集または接着が、ＥＬＡＭ−１に
    より媒介されたものである請求項２８に記載の方法。
  31. 【請求項３１】前記薬剤がモノシアロシル−Ｌｅa Ｉの
    類縁体である請求項２７に記載の方法。
  32. 【請求項３２】前記薬剤がモノシアロシル−Ｌｅa ＩＩ
    の類縁体である請求項２７に記載の方法。
  33. 【請求項３３】前記薬剤がジシアロシル−Ｌｅa の類縁
    体である請求項２７に記載の方法。
  34. 【請求項３４】前記薬剤がシアロシル−Ｌｅx の類縁体
    である請求項２７に記載の方法。
  35. 【請求項３５】前記薬剤がポリ（エチレングリコール）
    と結合している請求項３１〜３４のいずれかに記載の方
    法。
  36. 【請求項３６】モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロ
    シル−Ｌｅa ＩＩ、ジシアロシル−Ｌｅa またはシアロ
    シル−Ｌｅx の類縁体からなる群から選ばれた少なくと
    も１種の薬剤の有効量を温血動物に投与し、該薬剤が温
    血動物の炎症部位での炎症ポテンシャルを低減させるこ
    とからなる炎症部位でのＧＭＰ−１４０で媒介された細
    胞凝集または接着を阻害し、それにより温血動物の該部
    位での炎症ポテンシャルを減少させる方法。
  37. 【請求項３７】細胞凝集または接着が、（ａ）細胞の血
    小板への接着、（ｂ）細胞の血小板を経由した細胞への
    接着、（ｃ）細胞の血小板を経由した内皮細胞への接着
    および（ｄ）細胞のＧＭＰ−１４０を介した直接的な内
    皮細胞への接着に起因する請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】前記薬剤がモノシアロシル−Ｌｅa Ｉの
    類縁体である請求項３６に記載の方法。
  39. 【請求項３９】前記薬剤がモノシアロシル−Ｌｅa ＩＩ
    の類縁体である請求項３６に記載の方法。
  40. 【請求項４０】前記薬剤がジシアロシル−Ｌｅa の類縁
    体である請求項３６に記載の方法。
  41. 【請求項４１】前記薬剤がシアロシル−Ｌｅx の類縁体
    である請求項３６に記載の方法。
  42. 【請求項４２】前記薬剤がポリ（エチレングリコール）
    と結合している請求項３８〜４１のいずれかに記載の方
    法。
  43. 【請求項４３】モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロ
    シル−Ｌｅa ＩＩ、ジシアロシル−Ｌｅa 及びシアロシ
    ル−Ｌｅx の類縁体(mimetics)からなる群から選ばれた
    少なくとも１種の薬剤を有効成分とする生物学的製剤の
    範囲内で腫瘍細胞の転移ポテンシャル阻害剤、またはモ
    ノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ
    Ｉ、ジシアロシル−Ｌｅy およびシアロシル−Ｌｅx の
    類縁体からなる群から選ばれた少なくとも１種の薬剤を
    有効成分とする温血動物の腫瘍細胞の転移ポテンシャル
    阻害剤、またはモノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロ
    シル−Ｌｅa ＩＩ、ジシアロシル−Ｌｅa およびシアロ
    シル−Ｌｅx の類縁体からなる群から選ばれた少なくと
    も１種の薬剤を有効成分とする生物学的製剤の範囲内で
    ＧＭＰ−１４０−媒介またはＥＬＡＭ−１−媒介の細胞
    凝集または接着阻害剤、またはモノシアロシル−Ｌｅa
    Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa ＩＩ、ジシアロシル−Ｌｅ
    a およびシアロシル−Ｌｅx の類縁体からなる群から選
    ばれた少なくとも１種の薬剤を有効成分とする温血動物
    の腫瘍細胞部位での転移ポテンシャル低減剤、またはモ
    ノシアロシル−Ｌｅa Ｉ、モノシアロシル−Ｌｅa Ｉ
    Ｉ、ジシアロシル−Ｌｅa またはシアロシル−Ｌｅx の
    類縁体からなる群から選ばれた少なくとも１種の薬剤を
    有効成分とするの温血動物の炎症ポテンシャル低減剤。
  44. 【請求項４４】細胞凝集または接着が、（ａ）腫瘍細胞
    の血小板への接着、（ｂ）腫瘍細胞の血小板を経由した
    腫瘍細胞への接着、（ｃ）腫瘍細胞の血小板を経由した
    内皮細胞への接着または（ｄ）腫瘍細胞のＧＭＰ−１４
    ０またはＥＬＡＭ−１を介した直接的な内皮細胞への接
    着に起因する請求項４３に記載の薬剤。
  45. 【請求項４５】細胞凝集または接着が、ＧＭＰ−１４０
    により媒介されたものである請求項４３に記載の薬剤。
  46. 【請求項４６】細胞凝集または接着が、ＥＬＡＭ−１に
    より媒介されたものである請求項４３に記載の方法。
  47. 【請求項４７】前記薬剤がモノシアロシル−Ｌｅa Ｉの
    類縁体である請求項４３に記載の方法。
  48. 【請求項４８】前記薬剤がモノシアロシル−Ｌｅa ＩＩ
    の類縁体である請求項４３に記載の方法。
  49. 【請求項４９】前記薬剤がジシアロシル−Ｌｅa の類縁
    体である請求項４３に記載の方法。
  50. 【請求項５０】前記薬剤がシアロシル−Ｌｅx の類縁体
    である請求項４３に記載の方法。
  51. 【請求項５１】前記薬剤がポリ（エチレングリコール）
    と結合している請求項４７〜５０のいずれかに記載の方
    法。
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