JPH06141894A - ミオシン軽鎖リン酸化酵素の活性測定法 - Google Patents
ミオシン軽鎖リン酸化酵素の活性測定法Info
- Publication number
- JPH06141894A JPH06141894A JP32467692A JP32467692A JPH06141894A JP H06141894 A JPH06141894 A JP H06141894A JP 32467692 A JP32467692 A JP 32467692A JP 32467692 A JP32467692 A JP 32467692A JP H06141894 A JPH06141894 A JP H06141894A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 放射活性物質を用いることなくミオシン軽鎖
リン酸化酵素の活性が測定でき、また、阻害剤のスクリ
ーニングが容易に、しかも、安全で簡便に行うことがで
きる方法を提供する。 【構成】 リン酸化ミオシン軽鎖抗体を用いて、ミオシ
ン軽鎖リン酸化酵素の活性を測定する方法。 【効果】 ミオシン軽鎖リン酸化酵素阻害剤のスクリー
ニングが簡便、迅速になり、従来法における放射活性物
質の取扱いの際の危険性を回避することができる。
リン酸化酵素の活性が測定でき、また、阻害剤のスクリ
ーニングが容易に、しかも、安全で簡便に行うことがで
きる方法を提供する。 【構成】 リン酸化ミオシン軽鎖抗体を用いて、ミオシ
ン軽鎖リン酸化酵素の活性を測定する方法。 【効果】 ミオシン軽鎖リン酸化酵素阻害剤のスクリー
ニングが簡便、迅速になり、従来法における放射活性物
質の取扱いの際の危険性を回避することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、平滑筋から精製された
ミオシン軽鎖リン酸化酵素（以下、ＭＬＣＫという）の
ミオシン軽鎖（以下、ＭＬＣという）を基質にした際の
活性をリン酸化ミオシン軽鎖（以下、ＭＬＣＰという）
を特異的に認識する抗体（以下、ＭＬＣＰ抗体という）
を用いて測定する方法に関するものである。この系にお
いては、抗体の特異性が反応溶液の組成によって左右さ
れることがないので、ＭＬＣＫの阻害剤のスクリーニン
グに用いられる。また、方法が簡便なため、ＭＬＣＫの
活性測定が短時間に可能となる。
ミオシン軽鎖リン酸化酵素（以下、ＭＬＣＫという）の
ミオシン軽鎖（以下、ＭＬＣという）を基質にした際の
活性をリン酸化ミオシン軽鎖（以下、ＭＬＣＰという）
を特異的に認識する抗体（以下、ＭＬＣＰ抗体という）
を用いて測定する方法に関するものである。この系にお
いては、抗体の特異性が反応溶液の組成によって左右さ
れることがないので、ＭＬＣＫの阻害剤のスクリーニン
グに用いられる。また、方法が簡便なため、ＭＬＣＫの
活性測定が短時間に可能となる。
【０００２】
【従来の技術】これまでＭＬＣＫの活性測定には、放射
性同位元素を含む物質、32Ｐ−ＡＴＰの使用が必須であ
った。これは、基質のＭＬＣに取り込まれたリン酸基の
量を放射活性として定量し、ＭＬＣＫの活性とするため
である。しかし、この方法には特別に放射性物質取扱い
の許可を受けた施設が必要であり、放射活性を測定する
機器など特殊な装置が必要である。それ以上に放射性物
質取扱いの際の安全性の問題から、放射性物質の取扱い
にはかなりの緊張を要求される。このような点から、現
在では放射活性物質を用いた実験を避けるような風潮に
なりつつある。したがって、酵素活性測定を放射活性物
質を用いないで測定する系は切望されている。
性同位元素を含む物質、32Ｐ−ＡＴＰの使用が必須であ
った。これは、基質のＭＬＣに取り込まれたリン酸基の
量を放射活性として定量し、ＭＬＣＫの活性とするため
である。しかし、この方法には特別に放射性物質取扱い
の許可を受けた施設が必要であり、放射活性を測定する
機器など特殊な装置が必要である。それ以上に放射性物
質取扱いの際の安全性の問題から、放射性物質の取扱い
にはかなりの緊張を要求される。このような点から、現
在では放射活性物質を用いた実験を避けるような風潮に
なりつつある。したがって、酵素活性測定を放射活性物
質を用いないで測定する系は切望されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、放射活性物
質である32Ｐ−ＡＴＰを用いることなくＭＬＣＫの活性
が測定でき、また、阻害剤のスクリーニングが容易に、
しかも、安全で簡便に行うことができる方法を提供する
ことを目的とするものである。
質である32Ｐ−ＡＴＰを用いることなくＭＬＣＫの活性
が測定でき、また、阻害剤のスクリーニングが容易に、
しかも、安全で簡便に行うことができる方法を提供する
ことを目的とするものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者は、前記の課題
を解決するために鋭意研究を重ね、用いたＭＬＣＰ抗体
の性質を利用することにより、放射性物質を使用しない
ＭＬＣＫの活性測定系を完成することができた。本発明
の課程を以下に詳述する。
を解決するために鋭意研究を重ね、用いたＭＬＣＰ抗体
の性質を利用することにより、放射性物質を使用しない
ＭＬＣＫの活性測定系を完成することができた。本発明
の課程を以下に詳述する。
【０００５】ＭＬＣＰ抗体の作製 ＭＬＣＰ抗体作製には、ＭＬＣのリン酸化部位のセリン
を含む前後１２残基の配列を持った合成ペプチドを抗原
として用いた。まず、ＭＬＣのＮ末端を基準として数
え、１１番目のリジンから２２番目のフェニルアラニン
までの配列にシステインをＣ末端に加えたペプチドを合
成する（ＫＫＲＰＱＲＡＴＳＮＶＦＣ）。この配列の中
には、リン酸化を受けるセリン残基が含まれている。こ
の合成ペプチドをＡＴＰ存在下で、ＭＬＣＫの触媒作用
によりリン酸化を行い、逆相高速液体クロマトグラフを
用いてリン酸化ペプチドを単離精製する。このときの溶
媒条件は、１７％アセトニトリル、０．１％トリフルオ
ロ酢酸を用いた。精製したリン酸化ペプチドを抗原とし
てウサギに免疫するために、ペプチドをしゃみせん貝ヘ
モシアニン（ＫＬＨ）とコンジュゲートする。このとき
のコンジュゲート効率は、１１０〜１４８nmolペプチド
／mg ＫＬＨであった。このコンジュゲート体をウサギ
１羽あたり、１回につき０．２mgをアジュバントと混合
してウサギに免疫した。５回の免疫の後、ＭＬＣＰ抗体
の抗体価が充分に上昇したのを確認し、ＩｇＧ画分とし
て精製し保存した。ＭＬＣＰ抗体の抗原特異性を、ＭＬ
ＣとＭＬＣＰを用いて調べた結果、この抗体は、ＭＬＣ
Ｐを１０００倍以上の特異性で認識することがわかっ
た。（図１参照）。
を含む前後１２残基の配列を持った合成ペプチドを抗原
として用いた。まず、ＭＬＣのＮ末端を基準として数
え、１１番目のリジンから２２番目のフェニルアラニン
までの配列にシステインをＣ末端に加えたペプチドを合
成する（ＫＫＲＰＱＲＡＴＳＮＶＦＣ）。この配列の中
には、リン酸化を受けるセリン残基が含まれている。こ
の合成ペプチドをＡＴＰ存在下で、ＭＬＣＫの触媒作用
によりリン酸化を行い、逆相高速液体クロマトグラフを
用いてリン酸化ペプチドを単離精製する。このときの溶
媒条件は、１７％アセトニトリル、０．１％トリフルオ
ロ酢酸を用いた。精製したリン酸化ペプチドを抗原とし
てウサギに免疫するために、ペプチドをしゃみせん貝ヘ
モシアニン（ＫＬＨ）とコンジュゲートする。このとき
のコンジュゲート効率は、１１０〜１４８nmolペプチド
／mg ＫＬＨであった。このコンジュゲート体をウサギ
１羽あたり、１回につき０．２mgをアジュバントと混合
してウサギに免疫した。５回の免疫の後、ＭＬＣＰ抗体
の抗体価が充分に上昇したのを確認し、ＩｇＧ画分とし
て精製し保存した。ＭＬＣＰ抗体の抗原特異性を、ＭＬ
ＣとＭＬＣＰを用いて調べた結果、この抗体は、ＭＬＣ
Ｐを１０００倍以上の特異性で認識することがわかっ
た。（図１参照）。
【０００６】ＭＬＣＰ抗体を用いたＭＬＣＫの活性測定
系 前記のＭＬＣＰ抗体を用いて測定系を作る。まず、ニワ
トリ砂嚢よりペリーら（バイオケミカル ジャーナル
１９８３年、２１１巻、２６７〜２７２ページ）の方法
にしたがって、分子量２０ＫダルトンのＭＬＣを精製す
る。このＭＬＣを５μｇ／mlに調整し、９６穴イムノプ
レート（ヌンク社製）に一穴あたり１００μｌ分注し、
吸着させる。４℃にて一晩放置後、吸着しなかったＭＬ
ＣをＰＢＳにて洗浄後、トリス緩衝液（ｐＨ７．５）、
ＭＬＣＫ、ＡＴＰおよび阻害剤を含む反応混液を各穴に
入れ、プレートに吸着したＭＬＣをリン酸化する。一定
時間後、２０％リン酸を加えて反応を停止させ、０．２
％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳ（ＴｒＰＢＳ）で
３回洗浄する。洗浄した各穴に、０．０５％ツウィーン
２０を含むＰＢＳ（ＴｗＰＢＳ）で５００倍に希釈した
前項で述べた抗体を一次抗体として１００μｌ／穴で加
え、１時間室温で放置する。ＴｒＰＢＳで３回洗浄後、
二次抗体として、ペルオキダーゼとコンジュゲートした
ヤギの抗ウサギＩｇＧ抗体（カッペル社）をＴｗＰＢＳ
で１０００倍希釈したものを用い、１００μｌ／穴で加
え１時間放置する。ＴｒＰＢＳで３回洗浄後、過酸化水
素、オルトフェニレンジアミンを含む発色液を１００μ
ｌ加え発色、４．５Ｍ硫酸を３０μｌで発色停止、バイ
オラッド社製のマイクロプレートリーダーで発色を定量
する。この発色量は、リン酸化されたＭＬＣ量を反映す
るので、ＭＬＣＫ活性とすることができる。
系 前記のＭＬＣＰ抗体を用いて測定系を作る。まず、ニワ
トリ砂嚢よりペリーら（バイオケミカル ジャーナル
１９８３年、２１１巻、２６７〜２７２ページ）の方法
にしたがって、分子量２０ＫダルトンのＭＬＣを精製す
る。このＭＬＣを５μｇ／mlに調整し、９６穴イムノプ
レート（ヌンク社製）に一穴あたり１００μｌ分注し、
吸着させる。４℃にて一晩放置後、吸着しなかったＭＬ
ＣをＰＢＳにて洗浄後、トリス緩衝液（ｐＨ７．５）、
ＭＬＣＫ、ＡＴＰおよび阻害剤を含む反応混液を各穴に
入れ、プレートに吸着したＭＬＣをリン酸化する。一定
時間後、２０％リン酸を加えて反応を停止させ、０．２
％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳ（ＴｒＰＢＳ）で
３回洗浄する。洗浄した各穴に、０．０５％ツウィーン
２０を含むＰＢＳ（ＴｗＰＢＳ）で５００倍に希釈した
前項で述べた抗体を一次抗体として１００μｌ／穴で加
え、１時間室温で放置する。ＴｒＰＢＳで３回洗浄後、
二次抗体として、ペルオキダーゼとコンジュゲートした
ヤギの抗ウサギＩｇＧ抗体（カッペル社）をＴｗＰＢＳ
で１０００倍希釈したものを用い、１００μｌ／穴で加
え１時間放置する。ＴｒＰＢＳで３回洗浄後、過酸化水
素、オルトフェニレンジアミンを含む発色液を１００μ
ｌ加え発色、４．５Ｍ硫酸を３０μｌで発色停止、バイ
オラッド社製のマイクロプレートリーダーで発色を定量
する。この発色量は、リン酸化されたＭＬＣ量を反映す
るので、ＭＬＣＫ活性とすることができる。
【０００７】
【発明の効果】本発明により、ＭＬＣＫの活性測定、お
よびＭＬＣＫ阻害剤のスクリーニングを安全に、かつ短
時間に測定することができる。
よびＭＬＣＫ阻害剤のスクリーニングを安全に、かつ短
時間に測定することができる。
【０００８】
【実施例】次に、実施例としてリン酸化酵素阻害剤ＡＴ
８７７の阻害定数の測定例を挙げて、本発明をさらに詳
細に説明する。ＡＴ８７７がＭＬＣＫ活性阻害能を持つ
事実は、ヨーロピアン ジャーナルオブ ファーマコロ
ジー、１９９１年、１９５巻、２６７〜２７２ページに
記載されている。
８７７の阻害定数の測定例を挙げて、本発明をさらに詳
細に説明する。ＡＴ８７７がＭＬＣＫ活性阻害能を持つ
事実は、ヨーロピアン ジャーナルオブ ファーマコロ
ジー、１９９１年、１９５巻、２６７〜２７２ページに
記載されている。
【０００９】反応混液は以下のように調製する。２５ｍ
Ｍ トリス緩衝液ｐＨ７．５、３ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１ｍＭ 塩化カルシウム、０．１％ ２−メルカプ
トエタノール、１mg／ml牛血清アルブミン、２０μｇ／
ml カルモジュリン、０．１μｇ／ml ＭＬＣＫを含む
溶液中で、ＡＴＰは２０から１００μＭ、またＡＴ８７
７は１０から３０μＭの濃度で変化させる。各ポイント
の溶液は時間０で、前述したＭＬＣを吸着させた９６穴
プレートに移し反応を開始する。３分後に１００μｌの
２０％ リン酸を加えて反応を停止し、０．２％トライ
トンＸ−１００を含むＰＢＳ（ＴｒＰＢＳ）でプレート
を３回洗浄する。洗浄した各穴に、０．０５％ツウィー
ン２０を含むＰＢＳ（ＴｗＰＢＳ）で５００倍に希釈し
たＭＬＣＰ抗体を一次抗体として１００μｌ／穴で加
え、１時間室温で放置する。ＴｒＰＢＳで３回洗浄後、
二次抗体として、ペルオキダーゼとコンジュゲートした
ヤギの抗ウサギＩｇＧ抗体（カッペル社）をＴｗＰＢＳ
で１０００倍希釈した溶液を用い、１００μｌ／穴で加
え１時間放置する。ＴｒＰＢＳで３回洗浄後、過酸化水
素、オルトフェニレンジアミンを含む発色液を１００μ
ｌ／穴加え発色、４．５Ｍ硫酸を３０μｌ／穴加え発色
停止する。このプレートは、バイオラッド社製のマイク
ロプレートリーダーで発色を定量する。求められた値
は、二重逆数プロット法にてプロットした（図２参
照）。そして、このプロットから阻害定数を求めた。そ
の結果、今回の抗体を用いた系からは、ＡＴ８７７の阻
害定数は３９μＭと求められた。この値は、放射活性物
質、32Ｐ−ＡＴＰを用いて測定した値、３６μＭと良く
一致した（表１参照）。
Ｍ トリス緩衝液ｐＨ７．５、３ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、１ｍＭ 塩化カルシウム、０．１％ ２−メルカプ
トエタノール、１mg／ml牛血清アルブミン、２０μｇ／
ml カルモジュリン、０．１μｇ／ml ＭＬＣＫを含む
溶液中で、ＡＴＰは２０から１００μＭ、またＡＴ８７
７は１０から３０μＭの濃度で変化させる。各ポイント
の溶液は時間０で、前述したＭＬＣを吸着させた９６穴
プレートに移し反応を開始する。３分後に１００μｌの
２０％ リン酸を加えて反応を停止し、０．２％トライ
トンＸ−１００を含むＰＢＳ（ＴｒＰＢＳ）でプレート
を３回洗浄する。洗浄した各穴に、０．０５％ツウィー
ン２０を含むＰＢＳ（ＴｗＰＢＳ）で５００倍に希釈し
たＭＬＣＰ抗体を一次抗体として１００μｌ／穴で加
え、１時間室温で放置する。ＴｒＰＢＳで３回洗浄後、
二次抗体として、ペルオキダーゼとコンジュゲートした
ヤギの抗ウサギＩｇＧ抗体（カッペル社）をＴｗＰＢＳ
で１０００倍希釈した溶液を用い、１００μｌ／穴で加
え１時間放置する。ＴｒＰＢＳで３回洗浄後、過酸化水
素、オルトフェニレンジアミンを含む発色液を１００μ
ｌ／穴加え発色、４．５Ｍ硫酸を３０μｌ／穴加え発色
停止する。このプレートは、バイオラッド社製のマイク
ロプレートリーダーで発色を定量する。求められた値
は、二重逆数プロット法にてプロットした（図２参
照）。そして、このプロットから阻害定数を求めた。そ
の結果、今回の抗体を用いた系からは、ＡＴ８７７の阻
害定数は３９μＭと求められた。この値は、放射活性物
質、32Ｐ−ＡＴＰを用いて測定した値、３６μＭと良く
一致した（表１参照）。
【００１０】
【表１】 リン酸化酵素阻害剤ＡＴ８７７の阻害定数の測定法による比較 ＭＬＣＰ抗体法（μＭ） 32Ｐ−ＡＴＰ法（μＭ） ──────────────────────────────── 阻害定数 ３９ ３６
【図１】リン酸化ミオシン軽鎖抗体の抗原特異性を示す
図表である。
図表である。
【図２】ＡＴ８７７のＭＬＣＫ活性に対する阻害の二重
逆数プロット法でプロットした図表である。
逆数プロット法でプロットした図表である。
Claims (1)
- 【請求項１】 リン酸化ミオシン軽鎖抗体を用い、ミオ
シン軽鎖リン酸化酵素の活性を測定することを特徴とす
るミオシン軽鎖リン酸化酵素の活性測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32467692A JPH06141894A (ja) | 1992-11-11 | 1992-11-11 | ミオシン軽鎖リン酸化酵素の活性測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32467692A JPH06141894A (ja) | 1992-11-11 | 1992-11-11 | ミオシン軽鎖リン酸化酵素の活性測定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06141894A true JPH06141894A (ja) | 1994-05-24 |
Family
ID=18168489
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32467692A Withdrawn JPH06141894A (ja) | 1992-11-11 | 1992-11-11 | ミオシン軽鎖リン酸化酵素の活性測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06141894A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003047591A1 (en) * | 2001-11-30 | 2003-06-12 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Remedies for primary pulmonary hypertension |
| US7893050B2 (en) | 2005-10-26 | 2011-02-22 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Fasudil in combination therapies for the treatment of pulmonary arterial hypertension |
-
1992
- 1992-11-11 JP JP32467692A patent/JPH06141894A/ja not_active Withdrawn
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003047591A1 (en) * | 2001-11-30 | 2003-06-12 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Remedies for primary pulmonary hypertension |
| JPWO2003047591A1 (ja) * | 2001-11-30 | 2005-04-14 | 旭化成ファーマ株式会社 | 肺高血圧症予防治療剤 |
| JP4525964B2 (ja) * | 2001-11-30 | 2010-08-18 | 旭化成ファーマ株式会社 | 肺高血圧症予防治療剤 |
| US7893050B2 (en) | 2005-10-26 | 2011-02-22 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Fasudil in combination therapies for the treatment of pulmonary arterial hypertension |
| US8476259B2 (en) | 2005-10-26 | 2013-07-02 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Fasudil in combination therapies for the treatment of pulmonary arterial hypertension |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20000201 |