JPH06128288A - ポリペプチドおよびそれを含有するウイルス感染治療用医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ポリペプチドおよびそれを含有するウイルス
感染治療用医薬組成物の提供。 【構成】 哺乳動物の肝臓抽出物のアセトン不溶性画分
に由来し、抗ウイルス活性および５,０００〜２０,００
０ダルトンの分子量を有するポリペプチドおよびその合
成ポリペプチド、ならびに前記いずれかのポリペプチド
を有効成分として含有する、ウイルス感染治療用の医薬
学的に許容な組成物であり、特にＨＩＶ感染ならびにＨ
ＨＶ−６感染の治療に用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、哺乳動物のウイルス感
染治療のための方法および組成物に関する。また、皮膚
科学的でないウイルス感染、特にＨＩＶ感染に効果的
な、もともとは哺乳動物の肝臓抽出物由来である特定の
ポリペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術および課題】ここ何十年の間に細菌感染の
治療は急速に進歩したが、ウイルス感染の治療は、それ
に匹敵するほどには進歩していない。事実、今日でも、
有効な抗ウイルス剤はごく僅かである。知られているそ
れらの抗ウイルス剤は、限定もしくは制限された効力し
か有しないか、または毒性である。例えば、アマンチジ
ン（amantidine）はインフルエンザを防ぐことが知られ
ているが、感染前に投与した場合にのみ有効である。ア
シクロバイア（acyclovir）はしばしばヘルペスウイル
ス感染の治療に有効であるが、これに耐性なウイルス系
統が存在するのでその投与ケースを選ぶ。また、アシク
ロバイアは、レトロウイルス並びにある種のヘルペスウ
イルス、例えばサイトメガロウイルス等を含む種々のウ
イルスに対して効力を有しない。その他の抗ウイルス
剤、例えば３'−アジド−３'−デオキシチミジン（ＡＺ
Ｔ）は毒性であり、その活性は相対的な、絶対的でない
ウイルス生活環の選択性に依存している。インターフェ
ロンおよびインターフェロン誘導物質を含み、間接的に
作用する抗ウイルス治療法は、ウイルス感染に対する細
胞性応答性を高め、細胞が感染プロセスに干渉すること
を可能にする。しかし、インターフェロンはその登場時
に期待されたほどの治療効果を挙げていない。インター
フェロン誘導物質が登場したのは最近であり、その効力
はまだ証明されていない。

【０００３】後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および
ＡＩＤＳ関連合併症（ＡＲＣ）は、レトロウイルスの一
種であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−I）により引
き起こされる。ＨＩＶ−Iウイルスは宿主の免疫細胞お
よび神経細胞等に感染する。ＨＩＶ−Iウイルスに感染
した人の多くは、ウイルスにより引き起こされる免疫不
全の結果として、いつかは種々の深刻な日和見感染に対
して異常に感染し易くなる。現在の抗ＨＩＶ−I薬は有
効でないか、あるいは望ましくない副作用を引き起こ
す。これらの薬には、ＡＺＴ、２',３'−ジデオキシシ
チジン(ｄｄＣｙｄ)、インターフェロン(ＩＦＮ)、ミス
対合二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)およびアンフォテリシン
Ｂ(amphotericin B)が含まれる。特に、ＡＩＤＳ治療に
おいて幾らかの効力を示すＡＺＴは高い割合で、患者に
非常に深刻な副作用、例えば骨髄抑圧等を引き起こす。
また、１２〜１８カ月間で症状を和らげるという、ＡＺ
Ｔの有効性も報告されているが、患者は新たな感染に罹
るか毒性の副作用に見舞われる［Chase,“医者も患者も
ＡＺＴがスチーブのＡＩＤＳを治すことを望む（Doctor
sand Patients Hope AZT Will Help Stave Off AID
S)”, Wall Street Journal,April 28, 1988, at 14, c
ol.1.］。

【０００４】哺乳動物の肝臓抽物は、尋常性アクネ［Jo
urnal Invest Dermatology, 2:205〜218 (1939)]、第一
度および第二度の熱傷[Mississippi Valley MedicalJou
rnal, 76:199 (1954)］、日焼け［Clinical Medicine,
3:245 (1956)］、ツタウルシ皮膚炎［Clin. Med., 3:42
5 (1956)］および帯状ヘルペス［SouthernMedical Jou
rnal, 50:1524 (1957)］を含む、感染性および非感染性
皮膚科学的状態（皮膚病および皮膚の傷）の治療に用い
られて来た。活性主体および機構については記述されて
いない。臨床医達が肝臓抽出物を皮膚科学的状態の治療
に用いてきたにも拘わらず、該抽出物は、皮膚治療のた
めにさえ抗ウイルス剤あるいは免疫調節剤と見なされて
いない。哺乳動物の肝臓抽出物は、潜在的にブラジキニ
ン活性を有すると報告されている［Tewksbury 等, Arc
h. Biochem. Biophys. (U.S.), 112, 453 (1965);Tewks
bury, Archives Int'l. de Pharmacodynamie et de The
rapie, 173, 426 (1968); Tewksbury, Dissertation
Abstracts International-Part II, Vol.25/04, p. 22
14 (1964)］。さらに、商品説明書によれば市販の肝臓
抽出物（商品名 KUTAPRESSIN, Kremers-Urban Co., Mi
lwaukee, Wisconsin）は、傷つけられて炎症および浮腫
を有する組織に対してだけその働きを示す。

【０００５】前記抽出物は慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の
治療に有用であることが認められ（米国特許第5,055,29
6号参照）、また、約４,０００ダルトンの分子量を有す
るある精製ペプチドは別のウイルス感染、例えばＨＩＶ
−I感染の治療に有用であることが認められた。このペ
プチドは、ウイルス予防のために３９μg/mlの精製ペプ
チドを必要とする。このように、潜在的に、生理学的に
さらに活性なペプチド画分が、肝臓抽出物“KUTAPRESSI
N (Kremers-Urban Co.)”から分離され得るかどうか確
かめるために、該抽出物を再評価する必要がある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、約５,０００
〜４０,０００ダルトンの間の分子量を有し、アセトン
不溶性肝臓抽出物から得られる実質的に純粋なあるポリ
ペプチドが、水溶性型に調製したときに、ＨＩＶ−Iな
らびにＨＩＶ−IIのウイルス亜類型を含むＡＩＤＳを引
き起こすウイルス（例えばＡＩＤＳウイルス）の複製お
よび病原性の進行を阻害することができるとういう知見
に基づいている。本発明の試験的研究の間、これらの水
溶性ペプチドは、試験管内で細胞未結合ＡＩＤＳウイル
スによる感染からヒトリンパ球を完全にもしくは部分的
に防御できることが実証された。この防御活性は、活性
ペプチドの濃度が約１２.５μg/mlであるときに強く働
いたが、活性ペプチドが５μg/ml程の少量でも認められ
た。さらに、前記活性ポリペプチドは、ＡＩＤＳ感染の
抑制に対してＡＺＴと共同的に機能することができるこ
とが認められた。

【０００７】図１は、試験管内において、ブタ肝臓抽出
物がＨＩＶ−Iウイルスに感染したＭＴ−２リンパ球様
細胞の細胞溶解を減少させる能力を試験した結果を示し
ている。図２は、試験管内において、ＡＺＴ、アンプリ
ゲン（ampligen）、カスタノスパーマイン（castanospe
rmine）および二種類のブタ肝臓抽出物がＨＩＶ−Iウイ
ルスに感染したＭＴ−２リンパ球様細胞の細胞溶解を減
少させる能力を試験した結果を示している。図３は、試
験管内において、活性ペプチドがＨＩＶ−Iウイルスに
感染したＭＴ−２リンパ球様細胞の細胞溶解を減少させ
る能力を試験した結果を示している。図４は、試験管内
において、活性ペプチドがＨＩＶ−Iウイルスに感染し
たＭＴ−２リンパ球様細胞の細胞溶解を減少させる能力
を試験した結果を示している。図５は、試験管内におい
て、活性ペプチドがＨＩＶ−Iウイルスに感染したＭＴ
−２リンパ球様細胞の細胞溶解を減少させる能力を試験
した結果を示している。図６は、試験管内において、活
性ペプチドがＨＩＶ−Iウイルスに感染したＭＴ−２リ
ンパ球様細胞の細胞溶解を減少させる能力を試験した結
果を示している。図７は、ジーンバンクの全てのブタ(p
ig)配列を用いてＨＩＶのコドンの偏りを示している。
図８〜図１１は、活性ポリペプチドの配列決定に用いた
戦略を示している。図１２は、“Ｋｕ１０,２６０”の
ｐＨ勾配を示している。このｐＨ勾配は、試料として同
日あるいはほぼ同日に泳動したｎ＝４のゲルに、表面電
極を用いて測定した。二次元目の電気泳動に用いたスラ
ブゲルを広げて乾燥したところ、最終的なパターンは約
１５.５ｃｍ長であった。試料にＳＤＳを添加する場合
には、ＳＤＳ−ＮＰ４０のミセルがチューブゲルの酸性
側末端に移動してｐＨ勾配を抑制する。この場合には、
最終的な二次元パターンは１４.０〜１４.５ｃｍ長とな
る。得られた二次元電気泳動ゲル上の黒いバンドは、本
発明者らの用いた内部標準である、ｐｌ５.２、分子量
２７,０００のビタミンＤ依存カルシウム結合蛋白質
（ＣａＢＰ）を示す。分子量標準として、ミオシン（２
２０,０００）、フォスフォリラーゼＡ（９４,００
０）、カタラーゼ（６０,０００）、アクチン（４３,０
００）、およびリソザイム（１４,０００）をアガロー
スに添加した。図１３は、ＨＩＶーI ＣＥＭマウス研究
の終了時におけるｐ２４血清濃度を示している。図１４
は、試験管内において投与されたＡＺＴと“ＫＵ１０,
００４”の共同作用を示している。

【０００８】哺乳動物の肝臓抽出物の内、熱に安定で、
アセトン不溶性且つ水溶性の画分がウイルス感染の治療
に有効であると認められた。ここに開示の手法により調
製される肝臓抽出物は、脂肪酸類およびビタミン類、特
に肝臓で天然に生成されるビタミンＢ-１２を含まな
い。さらなる研究により、KUTAPRESSIN (Kremers-Urban
Co.)中にはポリサッカロイドが、プロテオグルカンおよ
び／またはグリコプロテインの形で存在している可能性
が示唆された。後述の皮膚状態の治療においては、前記
と同一の肝臓抽出物を用いた。

【０００９】さらには、本発明は、アセトン不溶性肝臓
抽出物から精製され、抗ウイスル活性を有し、さらに約
５,０００〜４０,０００ダルトンの範囲の分子量により
特徴付けられる、特定のポリペプチドを提供する。本発
明のポリペプチドはまた、特定のアミノ酸配列によって
も同定することができる。特に、前記ポリペプチドは配
列番号１に示すアミノ酸配列を５'末端に有し、且つ配
列番号４または６に示すアミノ酸配列を３'末端に有し
ている。さらに本発明のポリペプチドは、配列番号２に
示すＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列を５'
末端に有し、配列番号３に示したＤＮＡ配列によりコー
ドされるアミノ酸を３'末端に有することで特徴付ける
ことができる。これらのポリペプチドの、抗ウイルス特
性を有する断片もまた、本発明は包含する。さらに、配
列番号８および９に示したアミノ酸配列を有する合成ポ
リペプチドもまた、本発明は意図している。本発明はま
た、本発明の実質的に純粋なポリペプチドを有効成分と
して含む、ウイルス感染の治療のための医薬学的に許容
な組成物を提供する。

【００１０】活性ポリペプチドのＤＮＡ配列は、活性ペ
プチドの組成アミノ酸を決定して、活性ペプチドをコー
ドする遺伝子とハイブリダイゼーションし易いＤＮＡ断
片を調製し、そしてこれらのプローブとハイブリダイゼ
ーションした核酸配列を増幅して確認した［ Mullis の
米国特許第4,683,202号の教示がここに参考として取り
入れられる］。これらのポリペプチドのＨＩＶ複製阻害
活性は、公知の検定法により確認することができるが、
その検定法として以下のものが特に包含される：Montef
ioriらが J. Clin. Micro. Biol. 231〜235 (1968) に
記載した検定法、Graham らが「ＨＩＶ−Iに感染したヒ
ト由来血清における抗融合活性（Anti-Fusion Activity
in Sera from Persons Infected with Human Immunode
ficiency VirusType I）」［J. of Clin. MicroBio. 2
8:2608 (1990)］に記載した検定法（ＭＴ−２細胞を用
いた抗合胞体検定法）、および Montefiori らが「低分
子量ポリサッカロイド硫酸エステル類によるＨＩＶ−I
細胞結合およびＨＩＶ−I誘導性合胞体形成の種々の阻
害（Differential Inhibition of HIV-I Cell Binding
and HIV-I Induced Syncytium Formation by Low Molec
ular Weight Sulphated Polysaccharides）」［J. Ant
i. Microb. Chemotherapy 25:315〜318 (1990)］に記載
した検定法（ＨＩＶ−Iから分離したIIIＢの抗合胞体検
定法および逆転写酵素阻害検定法）。

【００１１】ＭＴ−２細胞検定法により測定された通
り、試験管内における有効阻害量は、溶液１ｍｌ当たり
約５〜５００μｇ以上の範囲である。生体内における有
効量も、同様であろうと考えられる。例えば、生体内に
おける活性ペプチドの望ましい血中濃度は、血清１ｍｌ
当たり約５〜５００μｇ以上である。本発明の活性ポリ
ペプチドによる治療は、特に血清学的タイプがＨＩＶ−
Iであるウイルスを含むＨＩＶに感染した患者に用いら
れるが、ＨＩＶ−II等の他のＨＩＶに感染した患者にも
用いることができる。本治療は、ウイルスに感染してい
るがまだＡＩＤＳの症状がない、外観上は健康な時期に
開始するのがよい。リンパ腺症症候群もしくはＡＩＤＳ
関連合併症(ＡＲＳ)が発現した患者もまた、治療するこ
とができる。さらに、本治療はＡＩＤＳであると診断さ
れた（ＡＩＤＳ症状の発現した）患者にとって価値のあ
るものであると信じる。しかしながら、本治療は、活動
性のＡＩＤＳ症状が進行していない患者になされること
が好ましい。

【００１２】本治療の有効性は公知の手順および観察に
よりモニタリングすることができる。例えば、最近で
は、AMS NEWS, Current Topics, 55:586〜588 1989
に、ＣＤ４を有するＴリンパ細胞の血中濃度を観察する
ことを含む、検査室試験マーカー等の手順および観察が
記述されている。ＡＩＤＳ症状を発現した患者における
最も直接的な徴候は、臨床観察、例えば日和見感染の発
生の減少および延命等に基づいている。別の検査室測定
はＨＩＶの抗原であるｐ２４の試験、またはβ−２−マ
イクログロブリンおよび／またはネオプテリンを含む免
疫系の付加的成分の試験を含む。選択される徴候は、Ｈ
ＩＶ感染の段階に依存する。ＡＩＤＳ症状のない患者の
場合には、血中に検出されるＨＩＶ抗原の量が最も良い
尺度であろう。例えば、コールター社(Coulter Corpora
tion)のコールター免疫部門は、使用可能なＨＩＶ抗原
検定法を用意している。これは、マイクロウエル（micr
owell）ストリップ上にコーティングしたネズミの(抗Ｈ
ＩＶコア抗原)モノクローナル抗体を用いた酵素免疫検
定法である。この検定法は血漿あるいは血清中のＨＩＶ
抗原を検出する。本発明の科学的根拠を、以下の試験的
な例によりさらに説明する。

【００１３】肝臓抽出物の調製 本発明に用いる肝臓抽出物は、哺乳類の肝臓、好ましく
はブタの肝臓から画分を分離することにより調製され
る。原料は、（ボイルした肝臓抽出物が非経口的な使用
に適することが述べられている）Pharmacopeia of the
United States,Vol.15, P.379、(哺乳類の肝臓の熱安定
性画分の水性溶液について述べられている）National F
ormulary, Vol.XII, p.222、もしくは（種々の熱安定性
肝臓分離物について述べられている）National Formula
ry, Vol.XI, p.192〜194 の各々に記載されたと同様の
肝臓分離物であってもよい。原料は、代替的に、生の肝
臓、冷凍肝臓あるいは市販の肝臓分離物であってもよ
い。原料からアセトン不溶性画分を分離する。これは、
原料に過剰のアセトンを添加して混合し、生じたアセト
ン不溶性画分をアセトンから分離することにより達成す
ることができる。アセトンによる処理を反復してもよ
い。前記アセトン不溶性画分をアセトンから分離した後
に、水に溶解させる。アセトンが残っていても、例えば
蒸留により除去することができる。初老期痴呆または老
年痴呆の治療に有効な物質は水溶液中に含まれている。

【００１４】代替的に、そして好ましくは、アセトン抽
出の前に、原料をフェノールと共に水に溶解させる。こ
の溶液を室温でインキュベートした後に濾過して透明に
し、そして該溶液を陽イオン交換樹脂に通す。次に、得
られたイオン交換樹脂処理溶液を蒸発して濃縮した後、
これを水で希釈して遠心分離する。続いて、アセトン不
溶性画分は大過剰のアセトンを添加することにより上澄
み液から分離され、さらに既述のように処理される。ア
セトン不溶性画分を活性炭により処理して有色色素を除
去することにより、さらに純化する。活性炭による処理
は、例えばアセトン不溶性画分を水に溶解させて、アン
モニアで活性化させた炭と接触させて行う。通常は、水
性溶液に医薬学的に許容な防腐剤を添加する。例えば、
フェノールを約０.０５〜１％、好ましくは約０.５％添
加する。本発明に有用な肝臓抽出物は、以下の例に従っ
て調製することが可能である。

【００１５】例１ 肝臓抽出物 National Formulary XI 193頁に記載の肝臓画分Iを水に
溶解して、その濃度を１６重量％とした。これにフェノ
ールを添加し、最終濃度を１％とした。溶液をよく混合
し、そして室温で７日間インキュベートした。次に、こ
れを濾過して透明とした後、水で希釈して水溶液中の固
体成分濃度を８重量％とした。続いて、この水性溶液を
陽イオン交換樹脂（スルホン化ポリスチレン）に３回通
した。イオン交換樹脂処理した溶液を濾過して透明と
し、そして６５〜７０℃の減圧下で蒸留することにより
濃縮して、総固体成分濃度を４０重量％とした。冷水
（５〜１０℃）を撹拌しながら添加し、水と肝臓溶液の
容積比を５：７とした。次に、得られた溶液を、シャー
プレスタイプ遠心機を用いて毎分１ｌの速度で遠心し、
上澄みを収集した。フェノールを添加して最終濃度を
０.５〜１％とした。必要に応じて塩酸または水酸化ナ
トリウムを添加して前記溶液のｐＨを６.０〜７.０に調
整し、濾過により透明とした後、４０℃に加熱した。次
いで、肝臓溶液１ｌ当たり２０〜３０ｌのアセトンを添
加した。アセトン沈殿性物質をそのままにして、アセト
ンをデカンタして除いた。残った懸濁液を室温で一晩イ
ンキュベートした後、水で該懸濁液を１０ｌにまで希釈
し、これを蒸留してアセトンを除去した。次に、フェノ
ールと水を添加して、フェノールの最終濃度を０.５
％、且つ総固体成分の割合を溶液１ｍｌ当たり２５ｍｇ
を越える量とした。この溶液を“ＫＵ１０,０００”と
した。必要に応じて塩酸あるいは水酸化ナトリウムを用
いて“ＫＵ１０,０００”のｐＨを６.０〜７.０に調整
し、水で希釈して総固体成分濃度を溶液１ｍｌ当たり２
５ｍｇ（即ち、２.５重量％固体成分）とした。次に、
この溶液を滅菌濾過して、使用に適したバイアルに入れ
た。この最終溶液を“ＫＵ１０,００１”とした。

【００１６】試験管内試験 例１で調製した“ＫＵ１０,００１”を、Journal of Cl
inical Microbiology,p.231〜235, Feb. 1968 に記載の
マイクロタイター感染検定法システムを用いて試験し
た。簡単には、成育培地［１６％の加熱不活性化牛胎児
血清および１ｍｌ当たり５０μｇのゲンタマイシン（ge
ntamicin）を含有するＲＰＭＩ１６４０]に種々の濃度
で含まれる“ＫＵ１０,００１”を１００μｌ取り、マ
イクロタイタープレートのウエルに添加した。成育培地
１００μｌ中のＭＴ−２細胞を、ウエル当たり３〜４×
１０⁴細胞となるように添加した。このプレートを、二
酸化炭素を５％含む空気条件下、湿度１００％、３６℃
で４時間インキュベートした。次に５〜２５×１０⁴個
の感染性粒子を含むＨＩＶ−Iを各ウエルに５０ｍｌづ
つ添加した。このプレートを、二酸化炭素を５％含む空
気条件下、湿度１００％、３６℃で３〜５日間インキュ
ベートした。前記のＭＴ−２リンパ芽球様細胞系は、ヒ
トＴ細胞リンパ症ウイルスI(ＨＴＬＶ−I)で形質転換さ
れたＴ４⁺Ｔ-リンパ芽球様細胞系である。

【００１７】次に、カルチャー（culter）の生存力およ
び治療の効力を評価するために、各試験カルチャーを１
００μｌ、新たなマイクロタイタープレートのポリーＬ
−リジン被覆ウエルに移植し、これらのウエルそれぞれ
に、成育培地中の０.０１４％フィンターニュートラル
レッド（Finter neutral red）を１００μｌ添加した。
これらのプレートを３６℃で１時間インキュベートし、
そのときに培地を除去し、次に融合細胞をリン酸緩衝食
塩水１５０μｌで２回洗浄した。酸性アルコール（１％
酢酸に５０％エタノールを添加）１００μｌを添加して
融合細胞から染料を抽出し、そして抽出された染料溶液
の波長５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。本検定法
の結果を図１に示した。この結果は、ＭＴ−２細胞のカ
ルチャーにＨＩＶ−Iを添加した４日後には、“ＫＵ１
０,００１”が４２％以上の細胞をＨＩＶ−Iの細胞毒性
効果から防御していたことを示している。これは“ＫＵ
１０,００１”肝臓抽出物の充分な抗ＨＩＶ効果であ
り、他の抗ＨＩＶ薬、例えばＡＺＴ、ｄｄＣｙｄ、ｒＩ
ＦＮ−α、ｒＩＦＮ−β、ｄｓＲＮＡおよびアンフォテ
リシン Ｂ等による効果に匹敵するものであることを示
している。

【００１８】予備試験の結果は、“ＫＵ１０,００１”
の試験管内試験における現在の濃度のフェノールがＭＴ
−２細胞に対する細胞毒性効果を示すこと、およびフェ
ノールは充分な抗ウイルス活性を有しないことを示して
いる。この細胞毒活性が“ＫＵ１０,００１”の抗ウイ
ルス活性を不明瞭にしているのかどうかを評価するため
に、次のものを調製してマイクロタイター感染検定法で
試験した。 １． 例１に記載の方法で調製した“ＫＵ１０,００
１”。 ２． “ＫＵ１０,００４−１”を３倍量の水で希釈し
て調製した“ＫＵ１０,００４−２”。“ＫＵ１０,００
４−１”は、“ＫＵ１０,０００”を等容量のエチルエ
ーテルで二回抽出することでフェノールを除去して調製
した。最終的な水相が“ＫＵ１０,００４−１”であ
り、その固体成分濃度は。溶液１ｍｌ当たり８０ｍｇで
あった。 ３． “ＫＵ１０,００６”は、“ＫＵ１０,０００”を
３.８倍容量のアセトンで沈殿させてフェノールを除去
し、その沈殿物を回収して乾燥させ、そして該沈殿を固
体成分濃度が溶液１ｍｌ当たり５５ｍｇとなるように水
に溶解して調製した。マイクロタイター検定法の結果を
表１に示した。

【００１９】

【表１】

【００２０】これらの結果は、ＭＴ−２試験管内検定法
は、フェノールの除去が肝臓抽出物の抗ウイルス活性を
検出する能力を実質的に改善したことを示している。マ
イクロタイター感染検定法により、“ＫＵ１０,００４
−１”、“ＫＵ１０,００４−２”、ＡＺＴ、アンプリ
ゲンおよびカスタノスパーマインの活性を比較した。ア
ンプリゲン［(rI_n)Xr(C₁₂,U)_n］は、ミス対合した二本
鎖ＲＮＡであり、ヒトインターフェロンを誘発し、且つ
抗ＨＩＶ−I活性を有している［Montefioriand Mitchel
l, Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A., 84(9), 2985〜298
9 (May 1987)］。カスタノスパーマインは以下の処方
（formula）を有する：これは、マメ科の木本、Castano
spermun australe の種子から抽出される。カスタノス
パーマインもまた、抗ＨＩＶ−I活性を有している。先
に名を記した種々の物質を連続的に希釈し、マイクロタ
イター感染検定法により試験した。各物質の（希釈して
いない）原液は次のような濃度であった。

【００２１】

【表２】

【００２２】これらの物質のマイクロタイター感染検定
法による検定結果を図２に示した。図２から明らかな通
り、“ＫＵ１０,００４−１”と“ＫＵ１０,００４−
２”は、ＡＺＴおよびアンプリゲンと比較して充分な細
胞防御活性を与え、且つカスタノスパーマインよりも優
れた細胞防御活性を与えた。

【００２３】肝臓抽出物の投与 本発明において有用なアセトン不溶性肝臓抽出物は、注
射、例えば筋肉注射により投与することが好ましい。し
かし他の投与形態もまた、意図されている。本肝臓抽出
物は、その成分の医薬学的に許容な塩類、例えばアルカ
リ金属塩類の形で用いることができる。医薬学的に許容
なアミド、低級アルキルエステル、保護された誘導体、
その他の誘導体および肝臓抽出物成分の類似物等もま
た、意図されている。すでに示した通り、本肝臓抽出物
は水性溶液として用いられることができるが、その他の
医薬学的担体、例えば食塩水等と共に用いることもでき
る。ともかく、本肝臓抽出物は注射により投与されるこ
とが望ましいので、該抽出物が水を主とする担体に含有
されることは意図されている。好ましい製品は、肝臓抽
出物の固体成分を約２.５重量％含有する水性溶液であ
る。投与量は、患者の状態に応じて変えることができ
る。しかし、一般的には、例１に記載の如く調製した
“ＫＵ１０,００１”を２ｍｌ、一日おきに筋肉内投与
することで、約４週間程で有益な結果を生む。

【００２４】ＨＩＶ−I感染患者における生体内試験 １９８８年８月に、ある３４才の患者がＨＩＶ抗体を有
していることが判明した。その患者は過去に重病を患っ
たことがなく、また、それまで日和見感染を含むいかな
る医学的問題も経験していなかった。１９９０年５月２
９日に、この患者は KUTAPRESSIN (Kremers-Urban Co.)
による治療を開始し、それから毎日、該薬剤を２ｃｃ
筋肉内注射する治療を継続した。Ｔリンパ球機能検査の
結果、患者のリンパ球を、マイトゲン能を有するフィト
ヘマグルチニン（phytohema-glutinin；ＰＨＡ）と共に
標準的な試験官内組織培養試験システムでインキュベー
トしたときに、非常に抑制された応答が表れた。標準的
な試験官内組織培養試験システムにおけるマイトゲン能
を有するフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）は、ＨＩＶ−
I感染（ＡＩＤＳ）による死亡原因となることが最も多
い日和見感染との戦いにおける主体である、生体の細胞
性免疫能を適確に認識する指標である。その結果を下記
の表３に示す。正常な応答は、基底線または生体内の未
刺激細胞（コントロール）の５０倍であると考えられて
いる。６カ月間 KUTAPRESSIN (Kremers-Urban Co.）に
よる治療を受けた後には、患者のＴリンパ球のＰＨＡに
対する応答は、以下の表３に示す如く改善された。

【００２５】

【表３】

【００２６】このデータは、６カ月間の KUTAPRESSIN
(Kremers-Urban Co.）を用いた治療によるリンパ球機能
の充分な改善を示している。これは、ＡＺＴは単独では
フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）応答を阻害するが（Mu
nch-Petersen）、このＡＺＴ投与患者に KUTAPRESSIN
(Kremers-Urban Co.）を投与したときに、[ＡＩＤＳ発
病の危険性の増加を示唆する（Cunningham-Rundles)］
患者の異常に強く抑圧されていた基底線に対するＰＨＡ
応答の倍数性が、正常範囲近くに改善されたことを示し
ている[このことは、KUTAPRESSIN (Kremers-Urban Co.)
治療の抗ＨＩＶ−Ｉ効果により、ＡＩＤＳ発病の危険性
が減少したことを示唆している］。

【００２７】ＨＩＶ−I感染生体内試験 このケースでは、１９８６年に無症候の５０才の白人男
性が通常のＨＩＶ検査を受けたところ、１９８６年１２
月１５日に、Ｔ４細胞の計測数が７８０であることから
ＨＩＶ陽性であることが判明した。Ｔ４細胞の計測数レ
ベルが１８０にまで落ち込んだので、１９８９年９月
に、この患者に１日当たり６カプセルのＡＺＴの投与を
開始したが、その時点で患者には幾らかの疲労感および
後に好酸性毛包炎と診断された軽度の肌荒れが認められ
た。また、患者にペンタミジン（Pentamidene）ＩＰＰ
Ｂを月単位で投与することも開始した。患者は、養護施
設の最高経営責任者としての本人の通常の仕事を続け
た。Ｔ４細胞の計測数が１００であった１９９０年１月
に、KUTAPRESSIN (Kremers-Urban Co.) を月曜日、水曜
日および金曜日毎に２ｃｃづつ筋肉内注射する治療を開
始し、現在まで１年以上この投与量を継続している。１
９９０年１月には、患者の症状は、幾らかの疲労感およ
び皮膚の軽い掻痒の結果生じた好酸性毛包炎による肌荒
れだけであった。１９９１年５月には、患者のＴ４細胞
の計測数は３６に落ち込んだ。患者は、時々感じる軽い
疲労感および皮膚感染に伴う軽度の症状以外には、依然
として症候を呈していない。これは、単に症状として治
療され、患者は養護施設の経営責任者として毎日働き続
けた。１９９１年５月に、患者にＤＤＣを日に３回、
０.７３５ｍｇづつ投与し始めた。このときにＡＺＴの
投与を止めたが、KUTAPRESSIN (Kremers-Urban Co.) を
月曜日、水曜日および金曜日毎に２ｃｃづつ筋肉内注射
する治療は継続した。患者はこのプログラムを継続して
現在に至っている。１９９１年６月には、患者のＴ８細
胞であるサプレッサーＴ細胞の数は１８００と計測さ
れ、Ｔ４細胞数は３６と計測された。患者には１９９１
年５月から、すでに概要を述べた治療を継続したが、１
９９２年７月には以下に示す通りの状態であった；１０
種類のＴ細胞（そのうちの３種類は６３.４％または１,
５９３と記録された）、ヘルパーＴ細胞もしくはＴ４細
胞は０.０３％または８であり、サプレッサーＴ細胞も
しくはＴ８細胞は６３.２％または１,５８８と計測され
た。患者の症状は、幾らかの疲労感、および掻痒と軽度
の毛包炎を特徴とする、多数の皮膚科医もやはり好酸性
毛包炎と診断した、引き続く肌荒れだけであった。患者
は毎日働き続け、一度も入院せず、通常ＡＩＤＳ診断の
手掛かりとなるどんな症状にも苦しめられておらず、も
し患者のＴ細胞計測数が２００を越えていたならば、本
当にＡＩＤＳ患者であるとは診断できないだろう。この
患者には薬剤として、ＤＤＣを日に３回、０.７３５ｍ
ｇづつ投与し、KUTAPRESSIN(Kremers-Urban Co.) を月
曜日、水曜日および金曜日毎に２ｃｃづつ筋肉内に注射
することを継続した。患者に毎日ビタミンを摂取させ、
その肌荒れのためのクリームを使用させた。最近この患
者を検査したところ、非常な健康体であった。KUTAPRES
SIN (Kremers-Urban Co.) による治療を開始してから、
患者のｐ−２４検査の結果はずっと陰性のままである。

【００２８】ヒトヘルペスウイルスー６試験管内試験 ＨＳＢ₂細胞における試験管内試験は、ＨＨＶ−６（Ｇ
Ｓ）感染に関する KUTAPRESSIN (Kremers-Urban Co.)
の効果を示した。ＨＨＶ−６はヒトヘルペスウイルスー
６である。このウイルスが初めて単離されたのはＡＩＤ
Ｓ患者および他のリンパ球増殖性異常患者からであった
［Ablashi,「ヒトＢリンパ球ウイルス（ヒトヘルペスウ
イルス−６)」, J. Virol. Met. 21:29〜48 (1988)］。
ＨＳＢ₂細胞は、１００、３００および５００μｌレベ
ルの KUTAPRESSIN (Kremers-Urban Co.) により２４時
間に亙って、前処理した。KUTAPRESSIN (Kremers-Urban
Co.) は、例１で説明された通りに調製した。細胞を洗
浄し、そして溶液１ｍｌ当たりほぼ１,０００のＴＣＩ
Ｄ₅₀を用いてＨＨＶ−６（ＧＳ単独）に感染させ、好ま
しくないウイルスを除去した後に KUTAPRESSIN (Kremer
s-Urban Co.) を細胞に添加した。これらの細胞に対し
て、生存能力、形態変化（巨大細胞形成）および、ヒト
のポリクローナル抗体とＨＨＶ−６に対する血清（Ｎ９
０１）ならびに２種類のＨＨＶ−６モノクローナル抗体
（Ｄ１２および５ＣＥＡ）を用いたＩＦＡによる抗原表
現を検査した。その結果は、以下のようにまとめられ
る：細胞を薬剤で２４時間処理した。次に薬剤を除去
し、１,０００のＴＣＩＤ₅₀に感染させてＨＨＶ−６を
２時間吸収させた。吸収されなかったウイルスを除去
し、そして細胞に薬剤を含有する培地を与えた。ＨＨＶ
−６抗体を有するヒト血清（Ｎ９０１）を用いて間接免
疫蛍光検査法により細胞を検査して感染を調査した。

【００２９】

【表４】

【００３０】これらの試験のより詳しい結果を表５〜８
に示した。

【００３１】

【表５】

【００３２】

【表６】

【００３３】

【表７】

【００３４】

【表８】

【００３５】これらの結果は、KUTAPRESSIN (Kremers-U
rban Co.) がＨＨＶ−６抗原を減少させる効果を有する
ことを示している。これらの試験のうちで最も効果的な
処理は、KUTAPRESSIN (Kremers-Urban Co.) で前処理
し、次いでウイルスを吸収させた後も KUTAPRESSIN (Kr
emers-Urban Co.) を用いた培養を継続する処理であっ
た。

【００３６】ＣＦＳ患者における KUTAPRESSIN の生体
内試験 ＣＦＳに罹病した１３１人の患者グループを、例１に記
載した通り調製した“ＫＵ１０,００１”を用いて治療
した。本研究に用いた患者は、Ann. Int. Medicine, 1
08:387 (1988) に記載の診察基準を満たしていることか
ら、ＣＦＳであると診断されていた。治療前に、エプス
タイン−バーウイルスの初期抗原（ＥＡ）に対するＩｇ
Ｇ抗体試験を含む種々の実験室的試験を実施した。ＥＡ
に対する抗体の存在は、活性エプスタイン−バー感染の
存在を示す。ＥＡに対する抗体に関する試験結果が陽性
であった（即ち、タイターが１：８０かそれ以上であっ
た）、本研究グループ内の患者の数を、表９に示した。
患者には、２ｍｌの“ＫＵ１０,００１”を一日おきに
筋肉内に注射した。最終的な注射回数は、患者毎に異な
っていた。患者達に、彼らの症状の改善程度を次の中か
ら選ばせた：１）改善せず；２）僅かに改善した；３）
少し改善した；４）かなり改善した；５）非常に改善し
た。これらの評点の結果を表９に示す。表９はまた、各
グループの患者の最終的な注射回数の平均も示してい
る。

【００３７】

【表９】

【００３８】表９に示す通り、ＣＦＳであると診断され
た患者の“ＫＵ１０,００１”による処理は、患者の９
４％において、その症状を少なくとも僅かに改善した。
非常に多くの患者（７１％）は、その症状が「かなり」
もしくは「非常に」改善された。上記の開示は、本発明
者らの信じるものが、人も含めて、ウイルスに感染し
た、もしくはＣＦＳに苦しむ哺乳動物を肝臓抽出物を用
いて治療するための独特且つ新規な方法であることを説
明している。肝臓抽出物の働きは、直接的なウイルス破
壊またはウイルス増殖阻止活性の結果であるかもしれ
ず、免疫応答の転形の結果であるのかもしれない。例１
の肝臓抽出物“ＫＵ１０,００１”は、毒性を有しない
ことを長年示しており、皮膚科学的状態の治療における
臨床例を豊富に有している。これらは、その多くが非常
に深刻な毒性を有する他の抗ウイルス薬剤よりも明らか
に優れた点である。

【００３９】例２ 生理的に活性なポリペプチド 例１により調製した“ＫＵ１０,００１”をバイアル当
たり２０ｍｌづつ、総量１６０ｍｌ入れた８本のバイア
ルに、充分過剰なアセトン“１８００ｍｌ"を添加し、
４時間室温で放置した。ビーカーの底部に沈殿が堆積し
た後、透明なアセトン層をデカンタして移し、残った懸
濁液を３０００ｒｐｍで５分間遠心した。次に、得られ
たペレットを１６０ｍｌの水に溶解し、凍結乾燥させて
乾燥粉末の重量１ｍｇ当たり０.３ｍｇのタンパク質か
らなる乾燥粉末を約４.０ｇ製造した。これらの試料
を、それぞれ“ＫＵ１０,１７２”、“ＫＵ１０,１８
５”、“ＫＵ１０,２１１”、“ＫＵ１０,２４４”およ
び“ＫＵ１０,２７５”とした。１ｇの乾燥粉末をｐＨ
７.５の５０ｍＭリン酸塩緩衝液７ｍｌに溶解して１０
０×２.５ｃｍのカラムに通したが、このカラムには、
３０,０００以上の分子量を、分子の通過速度により分
別するのではなく、除去する分子篩としての使用に適し
たセファデックスＧ５０、もしくは２０,０００以上の
分子量の分子を除去するバイオゲル（BIOGEL）ｐ１０を
詰めた。使用前に、流速毎時３６ｍｌの５０ｍＭリン酸
塩緩衝液でカラムを平衡させた。カラムを５０ｍＭリン
酸塩緩衝液で溶離させた。７ｍｌづつの画分として収集
し、Ａ₂₈₀で読み取った。画分を、Bush, Henry および
Slasarchyk が J. of Antibiotics 37(4), 330 (1984)
で述べた手法を用いて、（フリルアクリロイルフェニル
アラニルグリシルグリシンを基質として使用する）アン
ギオテンシン変換酵素阻害試験した。アンギオテンシン
変換酵素阻害の前に溶離した全ての画分を、下記の表１
０の如くプールした。

【００４０】

【表１０】

【００４１】プールした試料を全て濃縮し、分子量１,
０００未満の分子を切り捨てるセルロース透析管で透析
して、該試料を凍結乾燥した。大きなＧ５０（Pharmaci
a Co.）カラムに“ＫＵ１０,２７５”を通してこれをさ
らに純化し、３,５００以下の分子量の分子を切り捨て
るアミコンフィルター（amicon filter）を用いて脱塩
した。このポリペプチドを凍結乾燥した。分子量は約１
０,０００ダルトン、タンパク質含量は０.７２％である
と測定された。このポリペプチドを“ＫＵ１０,２８
０”とした。

【００４２】試験管内試験 Journal of Clinical Microbiology, p.231〜235, Feb.
1968 に記載のマイクロタイター感染検定システムを用
いて、例２に従って調製したポリペプチドを試験した。
簡単には、成育培地[１６％の加熱不活性化牛胎児血清
および１ｍｌ当たり５０μｇのゲンタマイシンを含有す
るＲＰＭＩ１６４０]に種々の濃度で含まれる“ＫＵ１
０,００１"を１００μｌ取り、マイクロタイタープレー
トのウエルに添加した。成育培地１００μｌ中のＭＴ−
２細胞を、ウエル当たり３〜４×１０⁴細胞となるよう
に添加した。このプレートを、二酸化炭素を５％含み湿
度１００％の空気条件下、３６℃で４時間インキュベー
トした。次に、５〜２５×１０⁴個の感染性粒子を含む
ＨＩＶ−Iウイルスを、各ウエルに５０μｌづつ添加し
た。このプレートを、二酸化炭素を５％含み湿度１００
％の空気条件下、３６℃で３〜５日間インキュベートし
た。前記のＭＴ−２リンパ芽球様細胞系は、ヒトＴ細胞
リンパ症ウイルスI（ＨＴＬＶ−I）で形質転換されたＴ
４⁺Ｔ−リンパ芽球様細胞系である。

【００４３】次に、カルチャーの生存力および治療の効
力を評価するために、各試験カルチャーを１００μｌ、
新たなマイクロタイタープレートのポリーＬ−リジン被
覆ウエルに移植し、これらのウエルそれぞれに、成育培
地中の０.０１４％フィンターニュートラルレッドを１
００μｌ添加した。これらのプレートを３６℃で１時間
インキュベートし、そのときに培地を除去し、次に融合
細胞をリン酸塩緩衝食塩水１５０μｌで２回洗浄した。
酸性アルコール（１％酢酸に５０％エタノールを添加）
１００μｌを添加して融合細胞から染料を抽出し、そし
て抽出された染料溶液の波長５４０ｎｍにおける吸光度
を測定した。本検定の結果を図３〜５に示したが、これ
らは、ＭＴ−２細胞のカルチャーにＨＩＶ−Iを添加し
た後、活性ペプチドは、ほぼ８μg/ml で、ＨＩＶ−Iの
細胞毒性効果から１００％近い細胞を防御したことを示
している。さらに、４μg/ml程度の少量であっても、平
均で５０〜６０％の活性が観察された。これは、３９μ
g/mlの活性ペプチド濃度で５０％の活性が観察された
“ＫＵ１０,００１”肝臓抽出物よりも充分改良された
結果である。

【００４４】例３ 生理的に活性なポリペプチドのさら
なる純化 例２に従って調製した“ＫＵ１０,１７２”を、逆相Ｃ
₁₈ prep カラムで画分に分け、緩衝液Ａ：ｐＨ７.０の
２０ｍＭ酢酸アンモニウム、Ｂ：緩衝液Ａに８０％アセ
トニトリットを添加したもの、２１４ｎｍで設定したグ
ラディエントラン（gradient run）：ゼロから８０％Ｂ
が速度８.４ｍｌ／分で８０分以内、の条件で溶離し
た。画分を、試験管当たり８.４ｍｌづつ収集した。全
ての試験管を分析 Ｃ₁₈ 逆相カラムおよびサイズ分別高
圧液体クロマトグラフィーカラムTsk125 で分析し、回
収時間に基づいて１２の画分としてプールした。“ＫＵ
１０,２０１”から“ＫＵ１０,２０８”までの８画分に
ついて抗ウイルス活性を試験したところ、これらは充分
な細胞防御活性を示した（図６参照）。また、例３に従
って調製した“ＫＵ１０,２０３"および“ＫＵ１０,２
０７"を、逆相Ｃ₁₈ prep カラムを用いてさらに純化
し、緩衝液Ａ:ｐＨ７.０の２０ｍＭ酢酸アンモニウム、
Ｂ：緩衝液Ａに８０％アセトニトリットを添加したも
の、２１４ｎｍで設定したグラディエントラン：ゼロか
ら８０％Ｂが速度８.４ｍｌ/分で８０分以内、の条件で
溶離した。画分を試験管当たり８.４ｍｌづつ収集し
た。全ての試験管を分析Ｃ₁₈逆相カラムおよびサイズ分
別高圧液体クロマトグラフィーカラム Tsk125 で分析
し、回収時間によりプールして“ＫＵ１０,２１４"およ
び“ＫＵ１０,２１５”を製造した。生物検定において
活性であった“ＫＵ１０,２１４”および“ＫＵ１０,２
１５”のために、ラット肝臓由来ｃＤＮＡを単離して、
ポリメラーゼチェイン反応技術を用いてクローニングし
た。増幅すべき所望の配列は、“ＫＵ１０,２１４”お
よび“ＫＵ１０,２１５”画分中のペプチドをコードす
る、ブタ肝臓細胞中の遺伝子配列である。

【００４５】例４ 活性画分ペプチドのアミノ末端アミ
ノ酸の配列決定 高圧液体クロマトグラフィーを取り付けた１２０Ａ型オ
ンラインフェニールイソチオシアネートアナライザーを
備えた、アプライドバイオシステムズ(AppliedBiosyste
ms）社製４７７Ａ型自動ペプチドシークエンサーを用い
たエドマン分離により、“ＫＵ１０,２１４”および
“ＫＵ１０,２１５”のアミノ端末配列のアミノ酸を測
定したところ、それは (Ala または Val または Ile) -
Glu - (His または Pro) - Gly - (Tyr または Met ま
たは Thr) - His - Gly - Pro -His - Gly［配列番号１
０］であった。より詳しくは、“ＫＵ１０,２１４” はアミノ酸配列：(Ala または Val
または Ile) - (Glu または Gln) - (His または Pro
またはArg) - Gly - Thr - His - Xaa - Pro - His - G
ly［配列番号１１］を有し、“ＫＵ１０,２１５” はアミノ酸配列：(Ala または Val
または Ile) - (Glu または Gln) - (His または Pro)
-Gly - (Tyr または Met) - His - Gly - Xaa - His -
Gly - Xaa - Xaa- Gly -Xaa - Gln［配列番号１２］を
有している。 両者の配列は類似しているので、以下の１０ペプチド配
列、即ち配列番号１３の Ala - Glu - His - Gly - Tyr
- His - Gly - Pro - His - Gly 配列をポリメラーゼ
チェイン反応に用いた。

【００４６】ポリメラーゼチェイン反応用プライマーの
調製 5'CATGGICCICATGGI3'（I はイノシンを示す）［配列番
号１４］の配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー
を、生物検定において活性な画分である“ＫＵ１０,２
１４”および“ＫＵ１０,２１５”に共通する５アミノ
酸配列（HGPHG）領域配列に基づいて調製した。このプ
ライマーは、His を除いては、使用コドンにかかわら
ず、上記のアミノ酸に対応する。データバンク６６にお
いて見いだされた全てのブタ遺伝子配列のコドン偏向分
析は、“ＣＡＴ”His コドンが、“ＣＡＣ”His コドン
の約２.５倍の頻度で用いられていることを示した。こ
のこと、および哺乳動物ゲノムのペプチドコーディング
領域におけるＣＧジヌクレオチドの珍しさ [Sambrook,
J., Fritsch, E.F. および Maniatis, T. (1989)、“分
子クローニング：実験の手引（Molecular Cloning: A L
aboratory Manual)",2nd edition, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York] は、5'C
ATGGICCICATGGI3'［配列番号１４］のプライマー配列を
生成する本配列においては、“ＣＡＣ"ではなく“ＣＡ
Ｔ"が His コドンとして使用されていることを示してい
る。このプライマーは、アプライドバイオシステムズ社
製ＤＮＡシンセサイザーを用いた従来技術により調製し
た（図７参照）。

【００４７】ＲＮＡの単離 雌ブタ由来生肝臓組織１.５ｇを、グアニジンチオシア
ネート中で急速にホモジェネートした後にフェノールで
抽出して、総量２.５ｍｇのＲＮＡを単離した［Chomczy
nski, P. および Sacchi, N. (1987） Anal. Biochem 1
62, 156〜159］。イソプロパノールで２回連続して沈殿
させた後、純化したＲＮＡを水に溶解した。次に、この
ＲＮＡをポリ（Ｕ）セファロースクロマトグラフィーに
かけ［Jacobson, A. (1987) Meth. Enzymology 152, 25
4〜261]、これにより総量１ｍｇのＲＮＡから２１μｇ
のポリ（Ａ）+ＲＮＡを得た。

【００４８】ｃＤＮＡの合成およびポリメラーゼチェイ
ン反応中間体の増幅 Gubler および Hoffman [Gene 25, 283 (1983)］の変法
により、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製
した。５μｇのポリ（Ａ）＋ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）−
ＨｉｎｄIIIプライマーおよびＡＭＶ逆転写酵素と共に
用いて一本目の鎖を合成し、そしてＲナーゼＨと大腸菌
ＤＮＡポリメラーゼIを用いて二本目の鎖を変換した。
一本目の鎖の収量が約３０％、二本目の鎖の収量が１０
０％であった。慣用法により、二本鎖ｃＤＮＡをフェノ
ールで抽出して、エタノールを用いて沈殿させた。Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼにより末端部を洗浄し、当業者によ
り記載の条件下で、ｃＤＮＡを UNIAMPアダプター（Clo
ntech Labs Inc. 800-662-CLON)で結合した。結合に引
き続き、当業者により記載の条件下で、Perkin Elmer C
etus GENEAMP システムにおいてシングル UNIAMP プラ
イマー(Clontech)を用たポリメラーゼチェイン反応によ
り、１：１０で希釈したｃＤＮＡ３μｌを増幅した。こ
の反応産物の試料をエチジウムブロライドの存在下にア
ガロースゲル電気泳動して分析した。その結果は、ｃＤ
ＮＡ産物の泳動パターン分布は、増幅していないｃＤＮ
Ａの泳動パターンと近似していることを示した。反応産
物残部をフェノール抽出、およびセファロース（SEPHAR
OSE, Pharmacia Co.）CL-4Bクロマトグラフィーにより
精製した。これらの中間体増幅および精製工程により、
引き続く手順に干渉しうる余分な配列を有しない、充分
な量の純性ｃＤＮＡを製造した。

【００４９】特異性プライマーによるポリメラーゼチェ
イン反応の増幅 増幅したｃＤＮＡをエタノールで沈殿させ、これを遠心
により収集して、２０μｌの水に溶解した。試料１μｌ
を用い、既述の特異性プライマーをオリゴ（ｄＴ）−Ｈ
ｉｎｄIIIプライマーと組み合わせてポリメラーゼチェ
イン反応を増幅させた。ポリメラーゼチェイン反応の条
件は、まず９４℃で１分間、次に７２℃で２分間という
サイクルを２９回、そして鎖延長の最後のサイクルは、
９４℃で１分間、次に７２℃で５分間のサイクル（計３
０サイクル）であった。反応産物の画分を、エチジウム
ブロマイドの存在下にアガロースゲル電気泳動して分析
した。その結果は、２００ｂｐ（塩基対）、４００塩基
対および５００塩基対の範囲内の３種類の主ＤＮＡ種を
示した。プライマーを添加しなかったコントロール反応
では、産物を検出できなかった。このＤＮＡの配列決定
戦略を図８〜図１１に示した。

【００５０】ポリメラーゼチェイン反応産物のクローニ
ング Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼでポリメラーゼチェイン反応産
物の残余を処理して末端部を洗浄し、続いて該反応産物
をフェノール抽出およびエタノール沈殿により精製し
た。標準条件下で該ＤＮＡを ＥｃｏＲＩリンカーと結
合した。次に、ＥｃｏＲIとＨｉｎｄIIIでこれを消化
し、セフォロース（Pharmacia Co.) CL-4Bクロマトグラ
フィーで小分子を除去した。得られたＤＮＡを Ｅｃｏ
ＲI／ＨｉｎｄIII ＥＸＬＯＸベクター腕と結合させ、
試験管内でパッケージングして、常法により大腸菌(E.C
oli)に植え付けた。得られたライブラリは、３×１０⁵
の混合クローン（independent clones）を含んでいた
が、これを３×１０¹⁰pfμ/ml のタイターに増幅させ
た。

【００５１】クローンの多様化 前記ライブラリは、８２ｍｍプレート当たりほぼ１,０
００のプラークに対応する密度で植えられた。プラーク
リフトを調製して、これを常法によりランダムプライマ
ーにより標識したＤＮＡプローブとハイブリダイゼーシ
ョンさせた。既述の特異性プライマーで増幅したＤＮＡ
由来のプローブを用いることにより、殆ど全てのプラー
クが、ハイブリダイゼーション陽性を呈した。このこと
は、前記ライブラリがポリメラーゼチェイン反応産物の
望ましい挿入を含むことを示している。ＤＮＡ配列の決定 ランダムに６つのプラークを選択し、ＤＮＡ配列分析の
ためのプラスミドサブクローンに変換した。制限酵素分
析により、これらの単離物の内の４つにほぼ５００塩基
対の挿入が示された。プラスミドＤＮＡを調製し、Ｔ７
ＤＮＡポリメラーゼ(promega)および鎖−末端ジデオキ
シヌクレオチド［Mierendorf, R.C.および Pfeffer, D.
(1987) Meth. Enzymol. 152, 556-562］を用いて直接
的に配列を決定した。

【００５２】ＤＮＡ配列の決定 配列決定実験により挿入ｃＤＮＡの５'末端部の９６塩
基対ならびに３'末端部の１１０塩基対を決定したとこ
ろ、それらは配列が決定された複数のクローンにおいて
は同一であることが明らかになった。５'末端部の９６
塩基対［配列番号２］は、最初の４つのアミノ酸ＧＰＨ
Ｇがプライマーの最初の４つのアミノ酸ＨＰＧＨＧに対
応する、３２アミノ酸からなるポリペプチド［配列番号
１］をコードしていた。３'末端部の１１０塩基対［配
列番号３］は、３つのリーディングフレーム全てに“Ｔ
ＡＡ"または“ＡＴＧ"終了コドンを有していた。即ち、
該塩基対は３つのポリペプチドをコードしていたが、該
ポリペプチドのＣ末端は（５'ＣＴＡ３'でコードされ
た）Ｌであり、且つ８アミノ酸を有し［配列番号５の］
配列でコードされるポリペプチド［配列番号４］であ
り、および／または２１アミノ酸を有し［配列番号７
の］配列でコードされるポリペプチド［配列番号６］で
あった。従って、これらのポリペプチドは５'末端部の
配列番号１、および配列番号４ならびに６を特徴とす
る。

【００５３】例５ 生理的に活性なポリペプチドの生理
および化学試験 以上のことから、生理学的に活性なポリペプチドは、そ
の生理的特性および化学的特性により特徴付けることが
できる。活性ポリペプチドは、アセトン不溶性かつ水溶
性である。該ポリペプチドは、分子篩クロマトグラフィ
ー試験による測定で、約５,０００〜４０,０００ダルト
ンの分子量を有する。生理学的に活性なペプチドは、図
１２に示したｐＨ勾配を有し、酸性である。

【００５４】ポリペプチドの投与 本発明に有用なポリペプチドは、注射、例えば筋肉内注
射により投与されることが好ましい。しかし、他の投与
形態も意図している。該ポリペプチドは、その成分の医
薬学的に許容な塩、例えばアルカリ金属塩の形態で用い
ることもできる。医薬学的に許容なアミド、低級アルキ
ルエステル、保護された誘導体、その他の誘導体および
ポリペプチド成分の類似物もまた、意図している。しか
し、既に示した如く、該ポリペプチドは水溶液として用
いることができるので、その他の医薬学的担体、例えば
食塩水とも組み合わせて用いることができる。ともか
く、該ポリペプチドは注射により投与することが好まし
いので、水基担体に含有した抽出物も意図している。好
ましい製品は、約２.５重量％のポリペプチドを含有す
るポリペプチド水溶液である。より一般的には、該ポリ
ペプチドの量は、担体１ｍｌ当たり５〜５００μｇの範
囲である。

【００５５】ＨＩＶ−I／ＣＥＭ マウス試験 ＨＩＶ感染細胞を移植したヌードマウスを用いて、“Ｋ
Ｕ１０,２８０"の生体内における、抗ＨＩＶ効力を評価
した［Wetherall の「ＡＩＤＳ２９１による、胸腺欠損
“ヌードマウス”におけるＨＩＶ−I ｐ２４抗原血症発
達の動物モデル（The Development of HIV-I p.24 Anti
genemia in the Athymic “Nude Mouse"Animal Models
in AIDS 291)」, 1990, Elevier Science Publishers
B.V. に記載の教示がここに参考および資料として取り
入れられる］。この試験においては、ＨＩＶ感染ＣＥＭ
細胞を移植した８匹の放射線照射ヌードマウスを用い
て、このモデルシステムにおいて“ＫＵ１０,２８０”
がＨＩＶを効果的に阻害するか否かを測定した。すでに
有効であることが示されていたＡＺＴ薬剤を、コントロ
ールとして用いた［Lie ら、「抗ウイルス剤の評価モデル
としてのＨＩＶ感染細胞移植ヌードマウス（The Nude N
ouse Transplanted With HIV Infected Cellsas a Mode
l for the evaluation of antivirals)」, Amer. Soc.
Microbiol. Abstract Number 230060 (1992) 参照］。

【００５６】試験手法：細胞系およびＨＩＶ培養。ＣＣ
ＲＦ−ＣＥＭまたはＣＥＭは、その性状がかなり明らか
にされており［Foley GE, Lazarus H, Farber S, Uzman
BG, Boone BAおよび McCarthy Re、「急性白血病小児
の末梢血由来ヒトリンパ芽球の連続培養（Continuous c
ulture of human lymphoblasts from peripheral blood
of achild with acute leukemia)」, Cancer 1965;18:
255〜529］、これは腫瘍形成性[Graham BS および Weth
rall NT、「ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるヒト細胞系の
生長（Growth of human cell lines in BALB/c mic
e)」, Cancer Res, 1990;5 0:5943〜5946] 且つＨＩＶ許
容性［Dalgeish aG, Beverly PCL, Clapham PR, Crawfo
rd DH, Greaves MF, および WEiss RA、「ＣＤ４（Ｔ
４）抗原がＡＩＤＳレトロウイルス受容体の本質的構成
要素である（The CD4(T4) antigene is anessential co
mponent of the receptor for the AIDS retroviru
s）」, Nature1984;312:736〜767］な細胞系であり、こ
れをアメリカンタイプカルチャーコレクション [Amerca
n Type Culture Collection, Rockville, MD.(ATCC CCL
119)]より入手し、既述の如く、１５％の加熱不活性化
牛胎児血清と５０μg/mlのゲンタマイシンを含有するＰ
ＲＭＩ１６４０培地中で維持した［Wetherall NT:「胸
腺欠損“ヌードマウス"におけるＨＩＶ−I ｐ２４抗原
血症の発達(The develop-ment of HIV-I p24 antigenem
ia in the athymic “nude mouse"）」, AnimalsModels
in AIDS., Schellekens H および Horzinek MC (ed
s.), Elsevier;Amsterdam, 1990, pp. 291〜302］(これ
らの文献の教示がここに参照として取り入れられる）。
これらの細胞を、３７℃の湿った５％二酸化炭素雰囲気
中で増殖させた。ＨＩＶ−Iの分離株、即ちＨＴＬＶ−I
IIＢ（カタログ番号３９８）を、米国国立保健研究所
（ＮＩＨ）の ＡＩＤＳ試薬の研究および寄託プログラ
ム（ＡＩＤＳ Research and Reference Reagent Progra
m）より入手し、慢性的に感染させたＣＣＲＦ−ＣＥＭ
細胞の培養から収穫した。通常の増殖においては、培養
液に含まれるウイルスを低速遠心機で細胞から分離し
て、口径０.４５μｍのフィルターに通して収穫した。
感染の終末点として細胞親和効果（Cytopathiceffect ;
CPE）を用いて、マイクロカルチャー中のＭＴ−２細胞
上で感染ウイルスを計量した［Scudiero DA, Shoemaker
RH, Paull KD, Monks A, Tierney S,Nofziger TH, Cur
rens MJ, Seniff D, および Boyd MR、「ヒトおよび他種
の腫瘍細胞系を用いた培養における細胞生長および薬剤
感受性に関する可溶性テトラゾリン/ホルマザン検定法
の評価（Evaluation of a soluble tetrazolim/formaza
nassay for cell growth and drug sensitivity in cul
ture using human and other tumor cell lines)」, Can
cer Res., 1988;48;4827〜4833］。５０％組織培養感染
価(ＴＣＩＤ₅₀）を、Reed−Muench の方法［Reed L. J.
and Muench H.、「簡単な５０％終末点評価方法（a sim
ple method of estimatingfiftypercent endpoints)」,
Amer. J. Hygiene, 1938;27:493〜497］により計算し
た。ウイルス異種移植に用いたＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞
を、感染多重度［ＭＯＩ；(接種時感染多重度：input M
OI)］０.１で、ＨＩＶ−Iの貯蔵希釈液を用いて速やか
に感染させ、３７℃で２時間吸収させた。ＨＩＶ−Iの
取り扱いは全て生物学的安全基準３（Biosafety Level
3; BSL-3）の施設内において、BSL-3 のガイドラインを
順守して行った［Centers for Disease Control (CD
C)、「ヒト免疫不全ウイルスのための摘要およびヒト免
疫不全ウイルスによる研究室内感染に関する報告(Agent
summary statement for human immunodeficiency viru
s and reporton laboratory-acquired infection with
human immunodeficiency virus）」,MMWR, 1988;37 (S-
4): 11〜15］。

【００５７】動物、食餌、環境、および細胞／ＨＩＶ移
植 既に述べられている如く［Wetherall NT、「胸腺欠損
“ヌード"マウスにおけるＨＩＶ−Iｐ２４抗原血症の発
達(The development of HIV-I p24 antigenemiainthe a
thymic “nude" mouse), Animal Models in AIDS, Sche
llekens H およびHorzinek MC (eds.), Elsevier; Amst
erdam, 1990, pp. 291〜302. Johnson MD, Davis BW,
および Wetherall NT、「 原位置におけるハイブリダイ
ゼーションおよび免疫−組織化学的研究のためのプロト
オンコジーン表現標準組織産生物（Production of prot
o-oncogene expressing control tisseus for in situh
ybridization and immuno-histochemical studies)」,
J. Environ. Path. Tox.and Onc., 1989;9:171〜19
0］、雑系で胸腺を欠損した、体温２７±１℃の、抗生
物質を適用されていないマウスを、ＨＥＰＡフィルター
で濾過した空気の層流下の特定の病原菌を有しない部屋
にて研究に供した。寝床、ケージ、水およびその他の前
記マウスに直接触れる物は全て、使用前にオートクレー
ブにより滅菌した。動物（マウス）には、自由に餌およ
び水を摂取させた。高濃度の熱感受性栄養素を含有する
ペレット状の餌（Purina autoclavable rodent laborat
ory chow#5010）をマウスに与えた。固い壁および床を
マイクロアイソレーター（micro-isolaters)で覆い、寝
藁を週２回取り換えた。ＣＤＣにより概要が示された B
SL-3 ガイドライン[Centers for Disease Control (CD
C)、「ヒト免疫不全ウイルスのための摘要およびヒト免疫
不全ウイルスによる研究室内感染に関する報告（Agent
summary statement for human immuno-deficiency viru
s and reportonlaboratory-acquired infection with h
uman immunodeficiency virus)」, MMWR,1988;37 (S-4):
11〜15.：Milan G, および D'Souze P、「ＳＣＩＤマ
ウスにおけるＨＩＶ感染：安全に関する考察（HIV infe
ctions in SCID mice: safetyconsiderations)」, ASM
News, 1990;56:639〜642.］を順守した。試験期間中、
ケージ当たりの最大マウス個体数は１０個体であった。

【００５８】ＨＩＶ感染の有無を問わず、ＣＥＭ細胞培
養を収穫して血清を含有しない培地で洗浄し、そして再
び収穫した。血球計算器により細胞数を計測して、血清
を含有しない培地で細胞懸濁液を調整し、これにより接
種を標準化した。０.２ｍｌの培地中に懸濁した細胞
を、２２ゲージのテフロン製小児用アンギオカテーテル
にルエルロック（luer lock）で装着した注射器を用い
て、肩胛骨に挟まれた部位（intrascapular region）に
皮下注射した。このカテーテルを最初に皮下組織に通
し、接種材料の漏れを評価した。全ての操作を無菌的に
行った。試験開始期の月曜日に動物が供給され、これを
２日間かけて新しい環境に慣れさせた。次の水曜日に、
(ミネソタ大学医学部の J. L. Shepherd MarkＩ放射線
照射機で)５００ラドの¹³⁷Ｃｓ放射線を該動物に照射し
た。この照射量によりナチュラルキラー細胞の活性は減
少し、そして通常、被験動物は動けなくなる。木曜日
に、薬剤の投与を開始し、この週の金曜日に、ＣＥＭ細
胞を上述の方法で動物に接種した。その後、マウスを観
察し、試験薬剤を少なくとも週に３回投与した。これら
３回の投与時毎に、動物グループを計量し、接種部位を
そっと触診して肉眼的腫瘍の生じた日付を測るか、ある
いはキャリパーにより腫瘍の大きさを二次元的に測っ
た。長球楕円体のための式、π/６ ＬＷを用いて、腫瘍
の体積を二次元の測定値から計算した［Graham, BS お
よび Wetherall NT、「ＢＡＬＢ/ｃマウスにおけるヒト
細胞系の生長(Growth of human cell lines in BALB/c
mice）」,Cancer Res., 1990;50:5943〜5946.： Skalri
n NT, Chahinian AP, Feuer EJ, Lahman LA, Szrajer L
および Holland JF、「ヌードマウスに異種移植したヒ
ト悪性中皮種における、インターフェロンによるシス−
ジアミンジ−クロロプラチナム（II）およびマイトマイ
シンＣの活性の増加(augmentation of activityof cis-
diamminedi-chloroplatinum (II) and mitomycin C by
interferon inhuman malignant mesothelioma xenograf
ts in nude mice)」, Cancer Res., 1988;48：64〜6
7.］。グループ間の差異の有意性を不対（unpaired）ス
チューデント式Ｔ検定により評価し、信頼値を両側検定
（two tails）により求めた。本試験の終わりに、動物
をメトキシフルラン麻酔にかけた。痛覚反応消失後、心
臓穿刺により動物を出血死させた。この方法で死亡しな
かった動物には、頸部脱臼を用いた。これらの方法は、
米国獣医学会（American Veterinary MedicalAssociati
on）の安楽死の方法群の認定に沿っている。死後、動物
を剖検して、ＣＥＭ細胞試験および間接免疫免疫検定法
を用いたＨＩＶ抗原表徴［MontefioriDC および Mitche
ll WM、「ＨＴＬＶ−IIIと共にＴ細胞系であるＣ３を提
供するＨＴＬＶ−IIの感染は高許容的且つ高細胞溶解性
である(Infection of the HTLV-II bearing T-cell lin
e C3 with HTLV-III is highly permissive and lyti
c)」, Virology 1986;155:726〜731］のために腫瘍組織
を無菌的に摘出した。動物を用いた研究を導入するにあ
たって、本発明者らは、国立研究所実験動物資源局実験
動物の飼育と使用に関する委員会により用意された「実
験動物の飼育および使用の手引（Guide for the Care a
nd Use of Laboratory Animals）」（NIH Publication
No. 86〜23, Revised 1985）を順守した。

【００５９】ｐ２４酵素免疫検定法 ｐ２４酵素免疫検定法(ＥＩＡ)として、コールター社
（Coulter Corporation,Hialeah, F1）から販売の方法
を改変せずに用いたが、該方法は、マイクロウエルスト
リップ上に被覆した、ＨＩＶコア蛋白質に対するマウス
モノクローナル抗体を用いる。本検定法は、培養浮遊
物、血漿および血清中のｐ２４ ｇａｇ蛋白質抗原を検
出する。本検定法においては、マウス血清との非特異的
交差反応は観察されない。

【００６０】製剤の調製および投与 新鮮な“ＫＵ１０,２８０”の投与量を、薬剤投与日毎
に調製した。毎日の注射に用いるアンプルは担当者（sp
onsor）が準備した。各アンプルは、１.２ｍｌの蒸留水
を用いて液体状に戻し、特に断らない限り、毎日の薬剤
投与として０.１ｍｌを注射したが、筋肉内注射は接種
前日から接種後１１日目まで、皮下注射は接種後 １９
日目から３８日目まで実施した。コントロール動物に
は、（プラセボとして）０.１ｍｌの水を注射した。Ａ
ＺＴは、売薬である RETROVIR(商標)１００ｍｇカプセ
ルとして調達した。撹拌プレート上で１時間混合するこ
とにより、各カプセルの内容物を２００ｍｌの蒸留水に
溶解した。カプセル内容物の不活性フィラー成分を、
３,０００rpmで１０分間遠心して除去した。その上澄み
に蒸留水を添加して、最終濃度を０.１２５ mg/ml とし
た。平均消費が４ｍｇ/日/マウスとなるように毎日動物
をモニタリングして、この平均消費を達成した。本法で
は、０.５ｍｇ ＡＺＴ/日/マウス、あるいは２０ｍｇ
ＡＺＴ/ｋｇ/日の薬剤を投与した。使用時には“ＫＵ１
０,２８０”およびＡＺＴを溶解して希釈液として調製
し、ＡＺＴは、毎週新鮮なものを調製して安定性を維持
した。

【００６１】試験計画 本モデルを用いた生体内検定法は、薬剤の１回分の投与
量をＨＩＶ接種の前日に投与するという、予防的方法に
よる“ＫＵ１０,２８０”の試験からなる。被験動物お
よびコントロール動物を、休止期間（washout）も含め
て３９日間の間観察した。本試験計画は、以下のグルー
プの比較からなる。

【００６２】

【表１１】

【００６３】試験および動物の犠牲の終了時に、試験の
締めくくりとして、血清ｐ２４抗原レベルを測定した。結果 表１２および１３は、本試験の全てを概説している。
（明らかに過剰量の）放射線照射の問題のために、１１
日目までに既に病的状態が表れ、これが全処置の休止の
原因となった。全てのマウスが、放射線照射に起因す
る、血小板減少症を含む皮膚の点状出血を様々な程度に
呈したが、ＡＺＴ処理グループにおいて特に顕著であっ
た。全てのグループで死亡例が認められた（１１〜２０
日目、ＡＺＴ処理動物は試験終了前に全例死亡）。試験
開始時の動物数を増加させることにより、死亡が与え
る、負の衝撃を最小化した。“ＫＵ１０,２８０”で処
理した動物において、生存率が等しいか、またはより良
好であったことは、放射線照射からの何らかの防御を示
唆するものとして、記録されるべきである。第１９日目
に、明らかに放射線により障害されたマウスが回復した
ので、処理を再スタートした。最初の腫瘍形成が、（グ
ループ１および３では）１１日目に、（グループ４で
は）１５日目に、あるいは（グループ２および５では）
１８日目に生じ、そしてそれは ３９日目に試験を終了
するまで進行し続けた。薬剤処理を行ったのは全部で３
１日間であった（その内訳は、異種移植前日から１０日
目まで、および１９日目から３９日目までである）。

【００６４】

【表１２】

【００６５】

【表１３】

【００６６】試験終了時に、各グループ別に体重、腫瘍
の大きさ、血清中のｐ２４レベルを測定した。その結果
を表１４〜１６に示す。各グループを比較した有意性
（信頼値）のレベルを表１４〜１６の最も右のコラムに
示す。

【００６７】

【表１４】

【００６８】

【表１５】

【００６９】

【表１６】

【００７０】

【表１７】

【００７１】ＨＩＶ／ＣＥＭマウス研究終了時における
血清中のｐ２４抗原は、６ガンマの放射線を照射し、Ｈ
ＩＶ−I IIIＢに感染したＣＥＭ細胞を移植したヌード
マウスに対し、２８日間にわたって８ｍｇ/日の“ＫＵ
１０,２８０”を皮下的に投与することが、０.５ｍｇ/
ｋｇ/日のＡＺＴを投与するよりも、ウイルスのｐ２４
を大幅に抑制したことを示した（図１３参照）。

【００７２】ウイルス遮断研究 “ＫＵ１０,２８０”の作用機構は、以下の知見から、
ウイルスの細胞侵入を遮断するものである可能性が考え
られる。ＨＩＶ−I IIIＢにおける“ＫＵ１０,２８０”
の結合阻害の概略を試験した。１５.６２５〜５００ｍ
ｇ/ｍｌの濃度で、“ＫＵ１０,２８０”は活性ＨＩＶ−
I IIIＢのＭＴ−２細胞との融合を、全体の５０％以上
阻害した。この有効濃度範囲は、マイクロタイター検定
法を用いて観察される“ＫＵ１０,２８０”の試験管内
における活性とよく一致している。該検定法を、活性Ｈ
ＩＶ−I IIIＢのＭＴ−２細胞との融合をブロックする
ように設計し、自然条件下での融合も検定した。ウイル
ス（２,５００ｐｇ ｐ２４）を“ＫＵ１０,２８０”と
共に、３７℃で３０分間、２５０μｌの成育培地中でイ
ンキュベートした。これにＭＴ−２細胞（成育培地２５
０μｌ中に３.７５×１０⁶個）を添加し、この混合物を
室温で２時間、回転台上でインキュベートした。５ｍｌ
の成育培地で３回洗浄して、未結合ウイルス粒子を除去
した。細胞ペレットを０.５％トリトンＸ−１００（Tri
ton X-100）中で溶解し、アボット免疫検定法によりｐ
２４抗原の量を測定した。ウイルスの濃度上昇に関する
先の試験により、該検定法の全ての測定値とウイルス結
合数との関係は、一次関数で表すことができることが確
認されている。

【００７３】“ＫＵ１０,２８０"は、トリトンＸ−１０
０により活性化されたＨＩＶ−I IIIＢ溶解物における
逆転写を阻害せず、また、慢性的に感染したＨ９細胞を
ＭＴ−２細胞と混合した（デキストラン硫酸エステルを
コントロールとして用いた）際に、合胞体形成をブロッ
クせず、また、未感染(cell-free)ビリオンを直接的に
不活性化することもなかった。注射可能な(フェノール
を除去した) KUTAPRESSIN（Kremers-Urban Co.）（即
ち、“ＫＵ１０,００４”）は、試験管内において、Ａ
ＺＴと共同作用した（図１４参照）。

【００７４】本明細書においては、主として、特別な、
好ましい態様に沿って本発明を説明したが、本発明の主
旨から離れる事なく改変することが可能であることは明
らかである。「特許請求の範囲」は、本発明の全てのバ
リエーション、実施または改作、および一般的には、本
発明の原理に従い、且つ本発明から、理解されるもの、
または当該分野において本発明に付属するもの、あるい
は当業者にとり自明なものとしての、そのような発展を
含むように意図されている。

【００７５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３２ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 配列： Gly Pro His Gly Gln Ser Ile Met Leu Gly Leu Asn Ser Val Phe Tyr 1 5 10 15 Pro Ser Ala Ile Ile Arg Gln Ala Ala Pro Phe Phe Asp Phe Cys Trp 20 25 30

【００７６】配列番号：２ 配列の長さ：９６ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 配列： GGGCCGCATG GGCAAAGTAT TATGCTCGGC CTGAACAGTG TATTTTATCC AAGTGCAATA 60 ATACGTCAAG CTGCAGCTTT TTTTGACTTC TGCTGG 96

【００７７】配列番号：３ 配列の長さ：１１０ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 配列： CTATAAATGT GCATTTATCA GAAGTTGATG TAAACACTAT TCTAGTACTG TTCCTTCATC 60 TAGATTGATC AATTTTAATT AAAATTAAGC ACTAAAAAAA AAAAAAAAAA 110

【００７８】配列番号：４ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド

【００７９】配列番号：５ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 配列： CTATAAATGT GCATTTATCA GAAGT 25

【００８０】配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 配列： Ile Asn Val His Leu Ser Glu Val Asp Val Asn Thr Ile Leu Val Leu 1 5 10 15 Phe Leu His Leu Asp 20

【００８１】配列番号：７ 配列の長さ：６５ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 配列： CTATAAATGT GCATTTATCA GAAGTTGATG TAAACACTAT TCTAGTACTG TTCCTTCATC 60 TAGAT 65

【００８２】配列番号：８ 配列の長さ：５０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 配列： Gly Pro His Gly Gln Ser Ile Met Leu Gly Leu Asn Ser Val Phe Tyr 1 5 10 15 Pro Ser Ala Ile Ile Arg Gln Ala Ala Pro Phe Phe Asp Phe Cys Trp 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Lys Cys Ala Phe Ile 35 40 45 Arg Ser 50

【００８３】配列番号：９ 配列の長さ：６３ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 配列： Gly Pro His Gly Gln Ser Ile Met Leu Gly Leu Asn Ser Val Phe Tyr 1 5 10 15 Pro Ser Ala Ile Ile Arg Gln Ala Ala Pro Phe Phe Asp Phe Cys Trp 20 25 30 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile Asn Val His Leu Ser 35 40 45 Glu Val Asp Val Asn Thr Ile Leu Val Leu Phe Leu His Leu Asp 50 55 60

【００８４】配列番号：１０ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド

【００８５】配列番号：１１ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド

【００８６】配列番号：１２ 配列の長さ：１５ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド 配列： Xaa Xaa Xaa Gly Xaa His Gly Xaa His Gly Xaa Xaa Gly Xaa Gln 1 5 10 15

【００８７】配列番号：１３ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ペプチド

【００８８】配列番号：１４ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：不明 トポロジー：不明 配列の種類：ゲノムＤＮＡ 配列： CATGGICCIC ATGGI 15

【図面の簡単な説明】

【図１】試験管内において、ブタ肝臓抽出物がＨＩＶ−
Iウイルスに感染したＭＴ−２リンパ球様細胞の細胞溶
解を減少させる能力を試験した結果を示す図である。

【図２】試験管内において、ＡＺＴ、アンプリゲン（am
pligen）、カスタノスパーマイン（castanospermine）
および二種類のブタ肝臓抽出物がＨＩＶ−Iウイルスに
感染したＭＴ−２リンパ球様細胞の細胞溶解を減少させ
る能力を試験した結果を示す図である。

【図３】試験管内において、活性ペプチドがＨＩＶ−I
ウイルスに感染したＭＴ−２リンパ球様細胞の細胞溶解
を減少させる能力を試験した結果を示す図である。

【図４】試験管内において、活性ペプチドがＨＩＶ−I
ウイルスに感染したＭＴ−２リンパ球様細胞の細胞溶解
を減少させる能力を試験した結果を示す図である。

【図５】試験管内において、活性ペプチドがＨＩＶ−I
ウイルスに感染したＭＴ−２リンパ球様細胞の細胞溶解
を減少させる能力を試験した結果を示す図である。

【図６】試験管内において、活性ペプチドがＨＩＶ−I
ウイルスに感染したＭＴ−２リンパ球様細胞の細胞溶解
を減少させる能力を試験した結果を示す図である。

【図７】ジーンバンクの全てのブタ配列に用いられるＨ
ＩＶのコドンの偏りを示す図である。

【図８】活性ポリペプチドの配列決定に用いた戦略の一
部を示す図である。

【図９】活性ポリペプチドの配列決定に用いた戦略の一
部を示す図である。

【図１０】活性ポリペプチドの配列決定に用いた戦略の
一部を示す図である。

【図１１】活性ポリペプチドの配列決定に用いた戦略の
一部を示す図である。

【図１２】“Ｋｕ１０,２６０”のｐＨ勾配を示す図で
ある。

【図１３】ＨＩＶーI ＣＥＭマウス研究の終了時におけ
るｐ２４血清濃度を示す図である。

【図１４】試験管内において投与されたＡＺＴと“ＫＵ
１０,００４”の共同作用を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 15/06 8517−4Ｈ // Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 エス・ケン・タナカ アメリカ合衆国、イリノイ州、バッファロ ー・グローブ、カッパーウッド・ドライブ 156 (72)発明者 トーマス・ステインバック アメリカ合衆国、テキサス州、ヒュースト ン、バイユー・シャドウズ、ナンバー ４ (72)発明者 カール・エイチ・ロイヤー アメリカ合衆国、ウィスコンシン州、メコ ン、ノース・フォンテンブロー・コート 10320 (72)発明者 ウィリアム・ジェイ・ハーマン・ジュニア アメリカ合衆国、テキサス州、シーリー、 リバー・リッジ・ロード 103 (72)発明者 アリ・アブデル・サラム・ガウィッシュ アメリカ合衆国、ウィスコンシン州、メコ ン、ノース・ランターン・レイン 11920

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗ウイルス活性および５,０００〜４０,
   ０００ダルトンの分子量を有し、アセトン不溶性肝臓抽
   出物から得られる、実質的に純粋なポリペプチド。
2. 【請求項２】 水溶性担体中にある、請求項１に記載の
   ポリペプチド。
3. 【請求項３】 （ａ）抗ウイルス活性および５,０００
   〜４０,０００ダルトンの分子量を有し、アセトン不溶
   性肝臓抽出物から得られる、実質的に純粋なポリペプチ
   ド、および（ｂ）担体を含有し、その際、該ポリペプチ
   ドの含量が５〜５００μg/ml の範囲である、医薬学的
   に許容な組成物。
4. 【請求項４】 配列番号１に示すアミノ酸配列を５'末
   端に有し、且つ配列番号４に示すアミノ酸配列を３'末
   端に有する、抗ウイルス活性を有する実質的に純粋なポ
   リペプチドまたはその断片。
5. 【請求項５】 配列番号１に示すアミノ酸配列を５'末
   端に有し、且つ配列番号６に示すアミノ酸配列を３'末
   端に有する、抗ウイルス活性を有する実質的に純粋なポ
   リペプチドまたはその断片。
6. 【請求項６】 配列番号２に示すＤＮＡ配列によりコー
   ドされるアミノ酸配列で５'末端が構成され、且つ配列
   番号３に示す塩基対からなるグループから選択されるＤ
   ＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列で３'末端が
   構成される、抗ウイルス活性を有する実質的に純粋なポ
   リペプチドまたはその断片。
7. 【請求項７】 前記３'末端のアミノ酸配列が配列番号
   ５のＤＮＡ配列によりコードされる、請求項６に記載の
   ポリペプチド。
8. 【請求項８】 前記３'末端のアミノ酸配列が配列番号
   ７のＤＮＡ配列によりコードされる、請求項６に記載の
   ポリペプチド。
9. 【請求項９】 請求項１に記載のポリペプチドを有効成
   分として含有する、ＣＦＳを生じないウイルス感染の治
   療のための医薬学的に許容な組成物。
10. 【請求項１０】 前記ウイルス感染がＨＩＶ−Iによる
    ものである、請求項９に記載の組成物。
11. 【請求項１１】 前記ウイルス感染がＨＨＶ−６による
    ものである、請求項９に記載の組成物。
12. 【請求項１２】 請求項４、５、６、７、および８に記
    載のポリペプチドまたはその断片を有効成分として含有
    する、ＣＦＳを生じないウイルス感染の治療のための医
    薬学的に許容な組成物。
13. 【請求項１３】 前記ウイルス感染がＨＩＶ−Iによる
    ものである、請求項１２に記載の組成物。
14. 【請求項１４】 前記ウイルス感染がＨＨＶ−６のよる
    ものである、請求項１２に記載の組成物。
15. 【請求項１５】 配列番号８に示すアミノ酸配列を有す
    る合成ペプチド。
16. 【請求項１６】 配列番号９に示すアミノ酸配列を有す
    る合成ペプチド。
17. 【請求項１７】 ＡＺＴおよび請求項１に記載の組成物
    を有効量含有する、ＡＩＤＳ感染の治療のための医薬学
    的組成物。
18. 【請求項１８】 ＡＺＴおよび請求項４に記載の組成物
    を有効量含有する、ＡＩＤＳ感染の治療のための医薬学
    的組成物。
19. 【請求項１９】 ＡＺＴおよび請求項５に記載の組成物
    を有効量含有する、ＡＩＤＳ感染の治療のための医薬学
    的組成物。
20. 【請求項２０】 ＡＺＴおよび請求項６に記載の組成物
    を有効量含有する、ＡＩＤＳ感染の治療のための医薬学
    的組成物。
21. 【請求項２１】 熱に安定で、アセトン不溶性且つ水溶
    性である肝臓抽出物を有効成分として含有する、ＨＨＶ
    −６感染の治療のための医薬学的に許容な組成物。