JPH06113865A - 組換えアデノウイルスベクターおよび形質転換動 物細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 温度感受性，低温感受性，条件誘導性などの
条件変異性のＳＶ４０初期遺伝子を動物細胞中に効率的
に組み込ませるための組換えアデノウイルスベクターお
よび該ベクターを用いて形質転換した動物細胞および該
細胞の製造法。 【効果】 産業上有用な動物細胞を効率よく不死身化で
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、組換えアデノウイルス
ベクターおよびその導入により形質転換して得られる動
物細胞および該動物細胞の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒトを含む動物の初代培養細胞は、元
来、無限に増殖できるものではなく有限分裂回数（通常
５０−６０ＰＤＬ）を有しているものであるから、これ
ら特異機能を有した細胞を長期にわたり培養し、産業的
に大量に培養する場合、大きな障害となる。従って、動
物細胞を産業上役立てるためには，特異機能を有した状
態のまま細胞分裂回数が著しく増大されたか，理想的に
は事実上無限増殖能が付与（不死化）された形質転換動
物細胞を得る事が必要となる。近年、いくつかの癌遺伝
子が、初代培養細胞にその固有の機能を部分的に保持し
たままで無限増殖能を付与するのに役立つ機能を有して
いることが明らかになった。そこで該癌遺伝子発現ベク
ターＤＮＡを初代培養細胞に導入する試みが多くなされ
ているが、従来のプラスミドＤＮＡを用いる場合，ＤＮ
Ａの細胞への導入効率は通常５−２０％であり，また導
入による不死化効率も通常０．０１％以下の低いレベル
に止まっている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ある機能を
有する動物細胞を大量に、長期間培養する場合および機
能の異なった種種の細胞をできるだけ多く不死化する場
合にみられる問題点を解決しようとするもので、動物細
胞にＳＶ４０初期遺伝子等の癌遺伝子を含むアデノウイ
ルスベクターを導入することにより得られる機能の異な
る、数多くの不死化細胞を培地中で培養し、それら細胞
の特異的機能を利用することに特徴がある。しかも温度
感受性変異株等の条件変異性癌遺伝子を用いることによ
り、非許容条件下にして、癌遺伝子の機能をを失活し、
細胞本来の持つ機能を活用できるところにも特徴があ
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明に於て利用する癌
遺伝子または条件変異性癌遺伝子を組み込んだアデノウ
イルスベクターおよびそのベクターにより形質転換した
細胞は、以下に述べるようにようにして、調製し得る。

【０００６】癌遺伝子を組み込んだ組換えアデノウイル
スベクターの調製：動物細胞を形質転換するのに用いら
れる組換えアデノウイルスベクターはＹ．Ｇｌｕｚｍａ
ｎ等よって作成された△Ｅ１／Ｘ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５
０，６０６−６１４，１９８４）を改変したものであ
る。△Ｅ１／Ｘ はアデノウイルス５型の初期遺伝子で
あるＥ１ＡおよびＥ１Ｂを含むＥ１領域の大部分を欠損
したもので、正確にはアデノウイルス遺伝子の左端から
４５５番目から３３３０番目までの塩基配列を欠失して
いる。この欠失した領域に細胞やウィルス由来の野生ま
たは条件変異性癌遺伝子を含んだＤＮＡ断片を挿入した
組換えアデノウイルスベクターを作成した。それらＤＮ
Ａ断片には導入遺伝子を発現させるための遺伝子上のシ
グナル（プロモーター，ポリ（Ａ）付加シグナル、ＲＮ
Ａスプライシング部位等）を全て含んでいる。

【０００７】動物細胞の形質転換： １） 組換えアデノウイルスベクターによる癌遺伝子の
細胞への導入：細胞の形質転換には、細胞およびウイル
ス由来の癌遺伝子の野生株または条件変異株を組み込ん
だ組換えアデノウイルスベクターを用いる。導入には以
下に述べるいくつかの方法を用いた。１つは通常のウイ
ルス感染によるもので、これには細胞膜上にあるアデノ
ウイルスレセプターが主に関与するが、細胞の食作用も
若干関与すると思われる。この方法だと導入細胞種が限
られる場合が生じるので、他の方法として、ウイルス粒
子をエレクトロポレーション法により細胞内に導入する
方法を用いた。

【０００８】２） 組換えアデノウイルスベクター導入
により不死化した動物細胞の樹立とそのクローニング：
上記の方法で組換えアデノウイルスベクターが導入され
た初代培養動物細胞を増殖培地（１０％ＦＣＳを含む培
地）にて培養し、導入後３−４日目に、ＥＤＴＡ−トリ
プシンを用いて細胞を分散させて、１０ｃｍシャーレに
５ｘ１０^２個の細胞を植え込み、増殖培地で培養する。
４−５日毎に増殖培地を交換し、２−３週間でクローニ
ングするのに充分な大きさになってからコロニーを個別
に培養し、少なくとも６０回以上の継代培養を行なう。
この有限分裂回数をはるかに越えた継代培養期間中に分
裂増殖を続けたコロニーを選別し、常法の希釈法により
更にクローニングを繰り返す。以下、実施例を示して本
発明とその効果を具体的に説明する。

【０００９】

【実施例】

１） 条件変異性癌遺伝子を組み込んだ組換えアデノウ
イルスベクターの調製 アデノウイルス５型のＥ１領域を欠失した△Ｅ１／Ｘの
ＤＮＡを調製するには、アデノウイルスＥ１ＡおよびＥ
１Ｂで形質転換したヒト胎児腎臓細胞由来の２９３細胞
を用いる。２９３細胞はＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を発
現しているので、それら領域を欠損している△Ｅ１／Ｘ
が感染増殖できる。常法に従い、２９３細胞を用いて、
△Ｅ１／Ｘウイルス粒子を量産し、ＣｓＣｌ平衡密度遠
心勾配法により精製する。精製した△Ｅ１／Ｘウイルス
粒子を４Ｍ塩酸グアニジンにて、ウイルス外殻を壊し、
遺伝子ＤＮＡの両５’末端塩基に末端タンパク質が共有
結合している複合体をゲル濾過にて分離する。分離した
複合体を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．５）−
１ｍＭ ＥＤＴＡ−１５０ｍＭ ＮａＣｌから成る緩衝
液にて透析後、ＸｂａＩで切断し、上記のＸｂａＩ切断
後、分離した温度感受性ＳＶ４０初期遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片をＴ４リガーゼにて接合し、２９３細胞にリン酸
カルシウム法によりトランスフェクションし常法により
軟寒天培地に交換した後、１０−１４日後にプラーク分
離を行なう。

【００１０】温度感受性ＳＶ４０初期遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片は東京大学医科学研究所の山口宣夫らによって分
離されたＳＶ４０Ａ１株（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１５、１２
９７−１３０１、１９７５）に由来する。ＳＶ４０Ａ１
ＤＮＡをＥｃｏＲＩで完全切断し、ＰｖｕＩＩで部分切
断し、ＳＶ４０初期遺伝子を含むＤＮＡ断片をｐＢＲ３
２２のＥｃｏＲＩとＰｖｕＩＩとの間に挿入する（図
１，ステツプ １）。次にＢｇｌＩで部分切断し、切断
部位の単鎖ＤＮＡ部分を常法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７、３８９８−３９０２，
１９８０）に従いＳ１ヌクレアーゼで削った後にＴ４リ
ガーゼで接合する。ＳＶ４０複製開始点のＢｇｌ１切断
部分の欠損したものを選別する（図１，ステツプ
２）。この処理によりｌａｒｇｅＴ抗原に依存したＳＶ
４０ＤＮＡ複製能は完全に失われ、細胞染色体内に一旦
組み込まれた組換えアデノウイルスベクターがＳＶ４０
複製開始点からのＤＮＡ複製により染色体外へ切り出さ
れることを防いでいる。次にＥｃｏＲＩとＰｖｕＩＩで
切断後、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントにて両末端を平滑末
端にして、ＸｂａＩリンカーを両末端に接合後，Ｘｂａ
Ｉにより切断し、ＳＶ４０初期遺伝子を含むＤＮＡ断片
をｐＵＣ１９のＸｂａＩ切断部位に挿入する（図１，ス
テップ ３）。こうして得られたプラスミドＤＮＡをＸ
ｂａＩで切断し、アガロースゲル電気泳動にて温度感受
性ＳＶ４０初期遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離し、上記
の△Ｅ１／ＸのＸｂａＩ切断部位に挿入する（図２，ス
テツプ４）。

【００１１】以上の操作により、各々のプラークを形成
した組換えアデノウイルスＤＮＡをサザーン法にて解析
し、目的とする組換えＳＶ４０−アデノウイルスベクタ
ーを選別し（図２，ステップ ５）、再度、プラーク分
離およびウイルスＤＮＡを解析し、組換えＳＶ４０−ア
デノウイルスベクターの純化を完全にした後、こうして
得られたウイルスベクターを常法に従って２９３細胞に
感染させた。アデノウイルス特有の細胞変性効果が殆ど
すべての細胞に出現する感染後５−７日目に、その感染
細胞を含む培養液（ＤＭＥＭ＋２％ＦＣＳ）を３回凍結
融解し、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心後、上清をウィ
ルス原液として用いる。通常、上記の方法により感染価
が２ｘ１０^８ＰＦＵ／ｍｌのウイルス原液が得られる。
こうして得られたウイルスは図２ステツプ ５に見られ
るように挿入方向の違いにより、２つの異なるタイプの
ウイルスベクターが得られるが、感染により発現される
ＳＶ４０初期遺伝子ｍＲＮＡ量には殆ど差がみられなか
ったので、以下タイプ１の組換えＳＶ４０−アデノウイ
ルスベクターを使用する。

【００１２】２） ヒト骨髄支持初代培養細胞への組換
えアデノウイルスベクターの導入：ヒトの骨髄穿刺によ
り１ｍｌの骨髄サンプルを採取し、Ｆｉｃｏｌｌを用い
て常法により骨髄単核細胞（ＭＮＣ）を分離する。５ｘ
１０^６４個のＭＮＣを５ｍｌの増殖培地（α−ＭＥＭ、
１０％ＦＣＳ、１００ｕ／ｍｌ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉ
ｎ，５０ μｇ／ｍｌ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）に
懸濁し、６０ｍｍ シャーレに植え込む。シャーレに付
着した細胞を増殖培地で１−３週間培養し、この付着細
胞をヒト骨髄支持初代培養細胞として用いる。組換えア
デノウイルスベクターの細胞ヘの導入は、従来から用い
られている感染法またはエレクトロポレーション法を採
用して行なった。

【００１３】感染法の場合、ヒト骨髄初代培養細胞がサ
フ゛コンフルエントになった状態で吸引し、血清無添加
α−ＭＥＭ培地で洗浄後、上記１）により調製した組換
えＳＶ４０アデノウイルスベクター原液をｍｕｌｔｉｃ
ｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ｍ．ｏ．ｉ．）＝
２００ＰＦＵ／−ｃｅｌｌで感染し、１．５時間の吸着
時間の後に、洗浄後、１０％ＦＣＳを含む増殖培地に交
換して培養を続ける。細胞がコンフルーエント（通常２
−３日後）になるまで培養する。

【００１４】エレクトロポレーション法の場合、ヒト骨
髄初代培養細胞がサブコンフルーエントになってから、
ＥＤＴＡ−トリプシンを用いて分散し、増殖培地で１回
洗浄し、血清無添加α−ＭＥＭ培地で更に１回洗浄し，
上記１）により調製したウイルスベクター原液で、１−
５ｘ１０^６ ｃｅｌｌ／ｍｌになるように懸濁する。ウ
イルスベクター原液の感染価は２ｘ１０^８ＰＦＵ／ｍｌ
であるので４０−２００ ＰＦＵ／ｃｅｌｌで導入する
ことになる。上記細胞懸濁液を電気パルス用のキュベッ
トの中に入れ、それを氷水の入ったセルーポレーターの
チャンバー内に設置し、電気強度５００Ｖ／ｃｍ、キャ
パシター １，１８０μＦの設定条件でパルスを１回発
生させる。パルス後、１０分間氷水中に静置し、次に、
増殖培地を加えて１０ｃｍシャーレに植え込む。１２時
間後に増殖培地を交換し、接着細胞がコンフルエントに
なるまで培養する。

【００１５】３） 形質転換細胞のクロニーング：上記
２）でウイルス感染またはエレクトロポレーション法に
てウイルスベクターを導入された細胞がコンフルーエン
トになった後、ＥＤＴＡ−トリプシンにて細胞を分散さ
せ、細胞数を算定し、増殖培地を用いて５００個の細胞
を１０ｃｍデイッシュに植え込み、以後５日毎に増殖培
地で全量交換を行なう。培養を開始してから１週間後に
コロニーが出現し、２−３週間を過ぎた時点でクロニー
ングするのに十分の細胞集落になってから約２０個のコ
ロニーを無差別に選択し、個別に培養する。クローニン
グを行なうに際しては、滅菌濾紙（０．５ｘ３ｘ３ｍ
ｍ）と滅菌ピンセットを用意しておき、まず培地を除去
し、ＰＢＳで２回洗浄後、上記ピンセットを用いて濾紙
にＥＤＴＡ−トリプシンをしみ込ませたものをコロニー
の上に注意深くのせる。この場合、コロニーを取り扱う
毎にピンセットをガスバーナーでよく焼いて汚染を避け
る。上記濾紙をコロニーの上にのせてから数分後に、そ
れを増殖培地を１ｍｌづつ入れてある２４穴プレートに
移し、プレートを軽くたたいて細胞を濾紙から離れるよ
うにし、濾紙はそのままウェルの中に沈めておく。５日
後に、増殖培地を全量交換する際に、滅菌ピンセットで
上記濾紙をウェルから除去する。上記細胞を１回目の培
養細胞とし、コンフルエントになった時に常法に従って
４−６倍に希釈し、一部を継代培養し、残りは常法に従
い凍結保存しておく。通常４−６日毎に継代培養を続
け、少なくとも３０回以上行なった。正常初代培養細胞
の継代可能回数（２０−３０回）をはるかに越えて、分
裂増殖をつづけたコロニーを選別し、再び５００個の細
胞を１０ｃｍシャーレに植え込み、クロニーングを行
い、上記２回のクロニーングを経た細胞を不死化かつク
ローン化したヒト骨髄支持細胞として維持ないしは凍結
保存した。

【００１６】４） ウイルスベクター導入による骨髄支
持細胞不死化効率の算定：上記３）のクローニング１回
目で形成したコロニーを約２０個無差別に選定し，３０
回以上継代培養可能なコロニー数を算定した結果を表１
に示す。

【００１７】

【表１】

【００１８】上記表において，「コロニー数／５００細
胞」の値は，ベクターを導入した５００個の細胞を１０
０ｍｍシャーレに植え込み培養した時に出現したコロニ
ー数を数えたものである。「不死化したコロニー数」は
選択したコロニーのうち３０回以上継代して生き残った
コロニー数を数えた。「不死化効率」は植え込んだ５０
０細胞に対して３０代以上継代できたコロニー数を計算
し不死化効率を計算した。なおＣ）の場合の実験３は５
００細胞のかわりに１０^４細胞植え込んだ。

【００１９】不死化効率を比較するのに２０μｇのＳＶ
４０初期遺伝子をｐＵＣ１９に挿入したプラスミドＤＮ
Ａ（図１，ステツプ ３に記載）を常法の燐酸カルシウ
ム法または上記エレクトロポレーションにて導入した。
またコントロールとして、ＳＶ４０初期遺伝子を含まな
いアデノウイルスベクター△Ｅ１／Ｘを感染法またはエ
レクトロポレーション法にて導入した。その結果、組換
えウイルスベクターの場合、格段的に高い効率でヒト骨
髄支持細胞を形質転換し、不死化することが可能であっ
た。ちなみに燐酸カルシウム法およびエレクトロポレー
ション法により組換えプラスミドＤＮＡを導入した場合
の通常の不死化効率は０．００１−０．０５％である。
このことから、組換えウイルスベクターの導入による不
死化効率はＤＮＡ導入する場合に比して１００倍以上も
高いことがわかった。

【００２０】５） 不死化されたヒト骨髄支持細胞の多
種多様性：ヒト骨髄支持組織はいくつかの異なった細胞
種により構成されている。それらはマクロファージ、繊
維芽細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞が主なものである。
今日まで、ＤＮＡ導入によりヒト骨髄支持組織から、い
くつかの細胞株が樹立されているが、それらは全て繊維
芽様細胞である。そこで、ウイルスベクターにより不死
化された細胞株の３つをランダムに選択し、それらの形
態学的所見を図３に示し、細胞化学的所見を表２に示
す。

【００２１】

【表２】

【００２２】ＨＡＳ−３０１細胞株は繊維芽様細胞で、
ＨＡＳ−３０３株はファクターＶＩＩＩ陽性であること
から内皮細胞由来、ＨＡＳ−３０４株はアルカリフォス
ターセ゛陰性であることからマクロファージ由来である
と思われる。これらの結果は、組換えウィルスベクター
を用いて不死化された細胞は、単一細胞種ではなく、多
種多様の細胞種を不死化できることを示すものである。
更に、ＨＡＳ３０３株はＧＭ−ＣＳＦやＩＬ−６を検出
感度以上に産生しているが、ＨＡＳ−３０１、３０４株
ではそれら因子の産生は確認できなかった。

【００２３】６） 組換えウイルスベクターによるヒト
ケラチノサイトの不死化：ヒトケラチノサイト初代培養
細胞を常法により、ヒト皮膚組織から作製する。この場
合、ケラチノサイト培養用のＣａ^＋＋濃度の低い特殊培
地ＫＧＭ−ＬＣを用いる。血清を培地に添加すると分化
誘導が起こり、角化が始まるので血清は添加しない。Ｋ
ＧＭ−ＬＣ培地でケラチノサイトがサブコンフルエント
になった時に、上記２）と同様に、感染およびエレクト
ロポレーション法にて組換えウイルスベクターを細胞内
に導入する。その導入効率を導入後４８時間で調べた結
果を表３に示す。

【００２４】

【表３】

【００２５】上記表において，トランジエント エクス
プレションは導入４８時間後，ＳＶ４０Ｔ抗原陽性細胞
の％を計算した。各実験少なくとも２００細胞調べた。
「血清およびカルシウム抵抗性コロニー数」の測定に際
し導入された細胞（１ｘ１０^５細胞）は，Ｓｈｅｌｅｇ
ｅｌらの方法（１９８８）により，３週間血清および高
濃度カルシウム存在下で培養された。なお表中「ｍ．
ｏ．ｉ．」とはｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ
ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（感染の多重度）のことである。

【００２６】組換えプラスミドに比して組換えウイルス
ベクターの方がはるかに導入効率は良いことがわかっ
た。またウイルスベクター導入の際に，異なるｍ．ｏ．
ｉ．で導入するとｍ．ｏ．ｉ．が５の方が５００よりも
導入効率が良いことから、導入細胞には最適ｍ．ｏ．
ｉ．があることがわかる。

【００２７】さらに、細胞染色体内への組み込み効率の
実験として、血清およびＣａ^＋＋抵抗性コロニーの出現
頻度を調べた。この実験は、正常ケラチノサイトは血清
および１．５ｍＭＣａ^＋＋添加ＤＭＥＭ培地では細胞分
化して増殖しないが癌遺伝子が細胞染色体内に組み込ま
れ癌化したケラチノサイトは増殖し、コロニーを形成す
ることを利用したものである。Ｓｃｈｌｅｇｅｌらの報
告した常法（ＥＭＢＯ，Ｊ．，７，３１８１−３１８
７，１９８８）に従い血清およびＣａ^＋＋抵抗性コロニ
ーの出現頻度を比較した結果を表３に示す。組換えウイ
ルスベクターの方がＤＮＡに比して、血清およびＣａ
^＋＋抵抗性コロニー出現率が高い。３ｘ１０^６細胞の初
代培養ケラチノサイトに上記１）で調製した組換えウイ
ルスベクターと組換えプラスミドＤＮＡを導入して、導
入後、血清無添加のＫＧＭ−ＬＣ培地で継代培養を行な
う。ＤＮＡを導入したケラチノサイトは数代継代培養を
繰り返すと増殖が全く止まった。しかし、組換えウイル
スベクターを導入したケラチノサイトは３０代以上継培
養しても細胞増殖が続き、不死化したものと思われる。

【００２８】これら不死化したケラチノサイトは正常ケ
ラチノサイトと同様の形態学的所見を呈し、培地である
ＫＧＭ−ＬＣに１．５ｍＭＣａ^＋＋を添加することによ
り、図４に示すようにケラチノサイトの分化に特有の細
胞重層化（ｓｔｒａｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）や細胞の偏
平化が起こる。しかし分化程度は正常のケラチノサイト
に比べると若干弱い。

【００２９】以上の結果から、本発明に従って、複製開
始能の欠損したＳＶ４０初期遺伝子の条件変異株を含む
アデノウイルスベクターを感染法またはエレクトロポレ
ーション法により細胞内に導入する手段は、従来のＤＮ
Ａによる導入法に比して、格段的に高い効率でヒト骨髄
支持細胞とヒトケラチノサイトを形質転換し、不死化す
ることを可能にした。

【００３０】ＳＶ４０以外のウイルス由来の癌遺伝子や
Ｃ−ｆｏｓやＣ−ｍｙｃ等の細胞由来の癌遺伝子をアデ
ノウイルスベクターに組み込むことは可能である。

【００３１】

【発明の効果】本発明の新規組換えウイルスベクターに
よる動物細胞の不死化効率は，プラスミドＤＮＡによる
場合に比べて１００倍以上である。また，本発明のベク
ターは，多種多様の動物細胞を不死化することができ
る。従って，本発明は，産業上有用な動物細胞を安価且
つ効率よく提供する上で価値の高い発明である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＳＶ４０−アデノウイルスベクターの構築模式
図のステップ１−３までを示す。

【図２】ＳＶ４０−アデノウイルスベクターの構築模式
図のステップ４−５を示す。

【図３】ＳＶ４０−アデノウイルスベクターにより不死
化された動物細胞の形態を示す図面代用写真である。
（ａ）は，ＨＡＳ−３０１の顕微鏡写真，（ｂ）は，Ｈ
ＡＳ−３０３の顕微鏡写真，（ｃ）はＳ−３０４の顕微
鏡写真である。

【図４】ＳＶ４０−アデノウイルスベクターにより不死
化されたケラチノサイトと，Ｃａ^＋＋により分化誘導さ
れた不死化したケラチノサイトの形態を示す図面代用写
真である。（ａ）および（ｃ）は不死化ケラチノサイト
の形態を示す顕微鏡写真，（ｂ）および（ｄ）はＣａ
^＋＋により分化誘導した不死化ケラチノサイトの形態を
示す顕微鏡写真である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウイルスまたは細胞由来の癌遺伝子およ
   び条件変異性癌遺伝子を動物細胞染色体に効率よく組み
   込むための新規組換えアデノウイルスベクター。
2. 【請求項２】 条件変異性のＳＶ４０初期遺伝子を動物
   細胞染色体に効率よく組み込むための新規組換えアデノ
   ウイルスベクター。
3. 【請求項３】 条件変異性のＳＶ４０初期遺伝子が温度
   感受性のＳＶ４０初期遺伝子である請求項２記載のベク
   ター。
4. 【請求項４】 請求項１または２記載の組換えウイルス
   ベクターを用いて形質転換した動物細胞。
5. 【請求項５】 請求項１または２記載の組換えアデノウ
   イルスベクターを用いて感染法またはエレクトロポレー
   ション法により形質転換細胞を製造する方法。