JPH06103302B2 - 成人ｔ細胞白血病診断薬 - Google Patents
成人ｔ細胞白血病診断薬Info
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- JPH06103302B2 JPH06103302B2 JP1165551A JP16555189A JPH06103302B2 JP H06103302 B2 JPH06103302 B2 JP H06103302B2 JP 1165551 A JP1165551 A JP 1165551A JP 16555189 A JP16555189 A JP 16555189A JP H06103302 B2 JPH06103302 B2 JP H06103302B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- region
- dna
- diagnostic agent
- regions
- primers
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、成人Ｔ細胞白血病診断薬に関する。
［従来の技術］ 成人Ｔ細胞白血病は、成人のＴリンパ球が白血病細胞と
なって皮下、リンパ節、抹消血に異常増殖する白血病で
あり、レトロウイルスの一種であるHTLV-1又はATLVと呼
ばれるウイルスにより引き起こされる。この白血病に感
染している患者の染色体DNA中にはHTLV-1/ATLVがプロウ
イルス化して存在しているので、染色体中のHTLV-1/ATL
Vプロウイルスの存在を調べることによってこの白血病
に感染しているか否かを診断することができる。
なって皮下、リンパ節、抹消血に異常増殖する白血病で
あり、レトロウイルスの一種であるHTLV-1又はATLVと呼
ばれるウイルスにより引き起こされる。この白血病に感
染している患者の染色体DNA中にはHTLV-1/ATLVがプロウ
イルス化して存在しているので、染色体中のHTLV-1/ATL
Vプロウイルスの存在を調べることによってこの白血病
に感染しているか否かを診断することができる。
従来、HTLV-1/ATLVのプロウイルスの検出は、サザンブ
ロット法、ノーザンブロット法又はドットブロット法等
により行なっていた。しかしながら、これらの方法は、
その感度が必ずしも満足することができない。
ロット法、ノーザンブロット法又はドットブロット法等
により行なっていた。しかしながら、これらの方法は、
その感度が必ずしも満足することができない。
一方、最近、１コピーのDNA領域をも検出することがで
きる遺伝子増幅法が開発された（R.K.Saikiら、Scienc
e,230.1350（1985））。遺伝子増幅法では、検出すべき
核酸領域の両端部にそれぞれハイブリダイズする２種類
のプライマーとDNA又はRNAポリメラーゼを用いて、相補
鎖合成と変性のサイクルを数十回繰返して、検出すべき
領域を数十万倍に増幅させる。従って、極めて微量の試
料中の核酸領域をも検出することができ、試料中、１コ
ピー核酸領域をも検出することが可能である。
きる遺伝子増幅法が開発された（R.K.Saikiら、Scienc
e,230.1350（1985））。遺伝子増幅法では、検出すべき
核酸領域の両端部にそれぞれハイブリダイズする２種類
のプライマーとDNA又はRNAポリメラーゼを用いて、相補
鎖合成と変性のサイクルを数十回繰返して、検出すべき
領域を数十万倍に増幅させる。従って、極めて微量の試
料中の核酸領域をも検出することができ、試料中、１コ
ピー核酸領域をも検出することが可能である。
遺伝子増幅法を利用したHTLV-1/ATLVプロウイルスの検
出方法も提案されており、Journal of Clinical Labora
tory Analysis 2:194-198（1988）に記載されている。
ウイルスが染色体DNA中に組み込まれる際に、欠失や転
位等の種々の修飾を受ける場合があり、プロウイルスを
正確に検出するためには、プロウイルスを特徴づける複
数の領域を検出することが望ましい。しかしながら、遺
伝子増幅法を利用した上記従来の検出方法では、１回の
操作で１つの領域を検出することしかできない。従っ
て、HTLV-1/ATLVプロウイルスの複数の領域を検出する
場合には、各領域についてそれぞれ検出操作（遺伝子増
幅法による増幅及びプローブとのハイブリダイゼーショ
ン）を行なわなければならず、時間と労力がかかるもの
であった。
出方法も提案されており、Journal of Clinical Labora
tory Analysis 2:194-198（1988）に記載されている。
ウイルスが染色体DNA中に組み込まれる際に、欠失や転
位等の種々の修飾を受ける場合があり、プロウイルスを
正確に検出するためには、プロウイルスを特徴づける複
数の領域を検出することが望ましい。しかしながら、遺
伝子増幅法を利用した上記従来の検出方法では、１回の
操作で１つの領域を検出することしかできない。従っ
て、HTLV-1/ATLVプロウイルスの複数の領域を検出する
場合には、各領域についてそれぞれ検出操作（遺伝子増
幅法による増幅及びプローブとのハイブリダイゼーショ
ン）を行なわなければならず、時間と労力がかかるもの
であった。
［発明が解決しようとする課題］ 従って、本発明の目的は、HTLV-1/ATLVプロウイルスの
複数の領域を一度に感度良く検出することができる、成
人Ｔ細胞白血病診断薬を提供することである。
複数の領域を一度に感度良く検出することができる、成
人Ｔ細胞白血病診断薬を提供することである。
本発明者らは、鋭意研究の結果、遺伝子増幅法により増
幅する、検出すべきHTLV-1/ATLVプロウイルスのDNA領域
の大きさをそれぞれ異ならしめ、遺伝子増幅法と電気泳
動とを組み合わせることによって複数のHTLV-1/ATLVプ
ロウイルスDNA領域を同時に簡便に感度良く検出するこ
とができることを見出し本発明を完成した。
幅する、検出すべきHTLV-1/ATLVプロウイルスのDNA領域
の大きさをそれぞれ異ならしめ、遺伝子増幅法と電気泳
動とを組み合わせることによって複数のHTLV-1/ATLVプ
ロウイルスDNA領域を同時に簡便に感度良く検出するこ
とができることを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は、HTLV-1/ATLVのプロウイルスを特
徴づける領域のうち、それぞれ大きさの異なる少なくと
も２つの領域を遺伝子増幅法により増幅するための、少
なくとも４種類のオリゴDNAプライマーを含む成人Ｔ細
胞白血病診断薬を提供する。
徴づける領域のうち、それぞれ大きさの異なる少なくと
も２つの領域を遺伝子増幅法により増幅するための、少
なくとも４種類のオリゴDNAプライマーを含む成人Ｔ細
胞白血病診断薬を提供する。
さらにまた、本発明は、上記オリゴDNAプライマーに、
増幅されたそれぞれの領域を検出するための標識DNAプ
ローブをさらに包含する成人Ｔ細胞白血病診断薬を提供
する。
増幅されたそれぞれの領域を検出するための標識DNAプ
ローブをさらに包含する成人Ｔ細胞白血病診断薬を提供
する。
［発明の効果］ 本発明により、HTLV-1/ATLVのプロウイルスの複数のDNA
領域を同時に感度良く検出することができ、それによっ
て、成人Ｔ細胞白血病を感度良く診断することができる
成人Ｔ細胞白血病診断薬が提供された。本発明の診断薬
を用いることにより、従来よりも簡便に成人Ｔ細胞白血
病を診断することが可能になった。
領域を同時に感度良く検出することができ、それによっ
て、成人Ｔ細胞白血病を感度良く診断することができる
成人Ｔ細胞白血病診断薬が提供された。本発明の診断薬
を用いることにより、従来よりも簡便に成人Ｔ細胞白血
病を診断することが可能になった。
［発明の具体的説明］ HTLV-1/ATLVのプロウイルスの塩基配列が図１に示され
ている。HTLV-1/ATLVのプロウイルスを特徴づける領域
としては、gag領域（およそ第800〜2090塩基）、pol領
域（およそ第2500〜5180塩基）、env領域（およそ第518
0〜6640塩基）及びpX-IV領域（およそ第6680〜8360塩
基）並びにそれらの部分を挙げることができるが、これ
に限定されるものではない。
ている。HTLV-1/ATLVのプロウイルスを特徴づける領域
としては、gag領域（およそ第800〜2090塩基）、pol領
域（およそ第2500〜5180塩基）、env領域（およそ第518
0〜6640塩基）及びpX-IV領域（およそ第6680〜8360塩
基）並びにそれらの部分を挙げることができるが、これ
に限定されるものではない。
本発明の成人Ｔ細胞白血病診断薬は、これらのHTLV-1/A
TLVのプロウイルスを特徴づける領域のうち、それぞれ
大きさの異なる少なくとも２つの領域を遺伝子増幅法に
より増幅するための、少なくとも４種類のオリゴDNAプ
ライマーを含む。すなわち、遺伝子増幅法では、１つの
DNA領域を増幅させるのに、二本鎖DNAの各鎖の５′末端
領域にハイブリダイズする一対のプライマーが必要であ
るので、少なくとも２つのDNA領域を検出するためには
少なくとも二対、すなわち少なくとも４種類のプライマ
ーが必要となる。また、遺伝子増幅法により増幅される
DNA領域は、上記一対のプライマーにより挟まれる領域
となるが、本発明において、上記少なくとも二対のプラ
イマーは、各一対のプライマーによって挟まれる領域の
大きさがそれぞれ異なるように選択される。HTLV-1/ATL
Vのプロウイルスの塩基配列は決定されており、それを
特徴づける領域の位置もほぼわかっているので、このよ
うな少なくとも二対のプライマーは容易に任意に選択す
ることができる。
TLVのプロウイルスを特徴づける領域のうち、それぞれ
大きさの異なる少なくとも２つの領域を遺伝子増幅法に
より増幅するための、少なくとも４種類のオリゴDNAプ
ライマーを含む。すなわち、遺伝子増幅法では、１つの
DNA領域を増幅させるのに、二本鎖DNAの各鎖の５′末端
領域にハイブリダイズする一対のプライマーが必要であ
るので、少なくとも２つのDNA領域を検出するためには
少なくとも二対、すなわち少なくとも４種類のプライマ
ーが必要となる。また、遺伝子増幅法により増幅される
DNA領域は、上記一対のプライマーにより挟まれる領域
となるが、本発明において、上記少なくとも二対のプラ
イマーは、各一対のプライマーによって挟まれる領域の
大きさがそれぞれ異なるように選択される。HTLV-1/ATL
Vのプロウイルスの塩基配列は決定されており、それを
特徴づける領域の位置もほぼわかっているので、このよ
うな少なくとも二対のプライマーは容易に任意に選択す
ることができる。
好ましい態様では、gag領域、pol領域、env領域及びpX-
IV領域とそれぞれ少なくとも部分的に重複する、それぞ
れ大きさの異なる４つの領域を遺伝子増幅法により増幅
するための、８種類のオリゴDNAプライマーが含まれ
る。このようなプライマーの例として、以下のものを挙
げることができる。
IV領域とそれぞれ少なくとも部分的に重複する、それぞ
れ大きさの異なる４つの領域を遺伝子増幅法により増幅
するための、８種類のオリゴDNAプライマーが含まれ
る。このようなプライマーの例として、以下のものを挙
げることができる。
1375 5′CCTCCAAGACCTCCTGCAGT3′1394 1532 5′GTTGTTGTGGATTGTTGGCT3′1513 2631 5′AGGCCTTGCAACACTTGGTC3′2650 2750 5′GGATGAATCGCCAGGTTCCA3′2731 5731 5′ATACCGAACCCAGCCAACTG3′5750 5923 5′TATAGGACGTGCCAAGTGGA3′5904 7871 5′CAATGTTCCCTACAAGCGAA3′7890及び 8090 5′AATCATAGGCGTGCCATCGG3′8071 なお、塩基配列の左右に示した４桁の数字は、プライマ
ーがハイブリダイズするHTLV-1/ATLVのDNA塩基の位置を
示す。
ーがハイブリダイズするHTLV-1/ATLVのDNA塩基の位置を
示す。
本発明の診断薬は、上記した少なくとも４種類のオリゴ
DNAプライマーを例えばTris/EDTAのような適当な緩衝液
中に含む。全てのプライマーが単一の溶液中に含まれて
いることが簡便であり好ましいが、各プライマーが別々
の溶液中に含まれていてもよい。もっとも、その場合で
も後述のように、使用時には同時に用いられる。
DNAプライマーを例えばTris/EDTAのような適当な緩衝液
中に含む。全てのプライマーが単一の溶液中に含まれて
いることが簡便であり好ましいが、各プライマーが別々
の溶液中に含まれていてもよい。もっとも、その場合で
も後述のように、使用時には同時に用いられる。
なお、上記オリゴDNAプライマーは、化学合成により容
易に調製することができる。
易に調製することができる。
本発明の好ましい態様では、遺伝子増幅法により増幅さ
れたそれぞれの領域を検出するための標識DNAプロー
ブ、すなわち、増幅された領域の少なくとも一部とそれ
ぞれ特異的にハイブリダイズする標識DNAプローブをさ
らに包含する。これらの標識DNAプローブはこの分野に
おいて周知であり、ダイレクトクローニング又は化学合
成により容易に調製することができる。診断薬がこれら
の標識DNAプローブを含む場合であっても、後述する使
用方法から明らかなように、上記プライマーを含む溶液
とは別の溶液中に含まれる。各プローブは同一の溶液中
に含まれることが簡便であり好ましいが別々の溶液中に
含まれていてもよい。
れたそれぞれの領域を検出するための標識DNAプロー
ブ、すなわち、増幅された領域の少なくとも一部とそれ
ぞれ特異的にハイブリダイズする標識DNAプローブをさ
らに包含する。これらの標識DNAプローブはこの分野に
おいて周知であり、ダイレクトクローニング又は化学合
成により容易に調製することができる。診断薬がこれら
の標識DNAプローブを含む場合であっても、後述する使
用方法から明らかなように、上記プライマーを含む溶液
とは別の溶液中に含まれる。各プローブは同一の溶液中
に含まれることが簡便であり好ましいが別々の溶液中に
含まれていてもよい。
オリゴDNAプライマーが、先に塩基配列を示した８種類
のプライマーである場合の好ましいプローブの例とし
て、下記塩基配列を有するものを挙げることができる。
のプライマーである場合の好ましいプローブの例とし
て、下記塩基配列を有するものを挙げることができる。
1460 5′GAAACCCGAGGTATTACAGGTTATAACCC3′1488 2651 5′CGGAAGGCCCTGGAGGCAGGCCATATCGAA3′2680 5796 5′ATCCTCGAGCCCTCTATACCATGGAAATCA3′5825 7931 5′CCTAATAATTCTACCCGAAGACTGTTTGCC3′7960 なお、各塩基配列の両端に示された４桁の数字は、プロ
ーブがハイブリダイズするHTLV-1/ATLVのDNA塩基の位置
を示す。
ーブがハイブリダイズするHTLV-1/ATLVのDNA塩基の位置
を示す。
次に、本発明の診断薬の使用方法を説明する。
先ず、患者から採取した検体、例えばリンパ球から常法
によりDNAを抽出する。
によりDNAを抽出する。
次いで、本発明の診断薬中に含まれるプライマーを用い
て遺伝子増幅法によりDNA領域の増幅を行なう。遺伝子
増幅法自体は上記文献に記載されているように公知であ
る。即ち、二本鎖DNAを変性して一体鎖にし、プライマ
ーをハイブリダイズさせ、DNAポリメラーゼを用いて、
各プライマーを起点として相補鎖を合成して二本鎖に
し、さらにこれを変性して上記プライマーとハイブリダ
イズさせ、DNAポリメラーゼを用いて相補鎖を合成する
というサイクルを繰り返す。サイクルをｎ回繰り返すと
理論上、そのDNA領域は2n倍に増幅される。サイクルの
繰り返し数は特に限定されないが、通常20回ないし40回
程度が適当である。
て遺伝子増幅法によりDNA領域の増幅を行なう。遺伝子
増幅法自体は上記文献に記載されているように公知であ
る。即ち、二本鎖DNAを変性して一体鎖にし、プライマ
ーをハイブリダイズさせ、DNAポリメラーゼを用いて、
各プライマーを起点として相補鎖を合成して二本鎖に
し、さらにこれを変性して上記プライマーとハイブリダ
イズさせ、DNAポリメラーゼを用いて相補鎖を合成する
というサイクルを繰り返す。サイクルをｎ回繰り返すと
理論上、そのDNA領域は2n倍に増幅される。サイクルの
繰り返し数は特に限定されないが、通常20回ないし40回
程度が適当である。
次に、試料を電気泳動にかけ、増幅された各DNA領域を
分離する。電気泳動によるDNA分子の分離はこの分野に
おいて周知であり、サザンブロット法やノーザンブロッ
ト法において行なわれている方法をそのまま適用するこ
とができる。ゲルとしては通常アガロース又はポリアク
リルアミドゲルが用いられる。本発明の診断薬を用いて
遺伝子増幅を行なった場合、増幅される領域の大きさは
それぞれ異なっている（プライマーをそうなるように選
択している）。従って、この電気泳動工程において、増
幅された各領域はその大きさに従って分離される。
分離する。電気泳動によるDNA分子の分離はこの分野に
おいて周知であり、サザンブロット法やノーザンブロッ
ト法において行なわれている方法をそのまま適用するこ
とができる。ゲルとしては通常アガロース又はポリアク
リルアミドゲルが用いられる。本発明の診断薬を用いて
遺伝子増幅を行なった場合、増幅される領域の大きさは
それぞれ異なっている（プライマーをそうなるように選
択している）。従って、この電気泳動工程において、増
幅された各領域はその大きさに従って分離される。
次に、分離されたDNA断片を検出する。これは例えば、
電気泳動による分離パターンを維持したまま、分離され
たDNA分子を基体上に転写、固定し、転写、固定された
核酸断片を検出することにより行なうことができる。こ
れらの工程自体はこの分野において周知であり、サザン
ブロット法やノーザンブロット法において行なわれてい
る方法をそのまま適用することができる。すなわち、こ
こで用いられる基体としてはナイロンフィルターやニト
ロセルロースフィルターを好ましく用いることができ
る。DNA分子の固定は、例えば、常法により、フィルタ
ーを熱乾燥又は紫外線照射することにより行なうことが
できる。転写、固定されたDNA分子の検出は例えば、増
幅されたそれぞれの領域の少なくとも一部と特異的にハ
イブリダイズする上記標識プローブをそれぞれ作用さ
せ、それらの標識プローブが基体上のDNA分子と特異的
に結合するかを調べることにより、検出すべきDNA領域
が試料中に存在したか否かを知ることができる。検出す
べき領域は、それぞれの大きさに応じて分離されたパタ
ーンを維持したまま基体上に固定されているので、どの
試料中にどの領域が存在し、どの領域が欠損していたか
を一目瞭然に知ることができ、極めて好都合である。あ
るいは、ゲル電気泳動後、分離されたDNA断片を基体上
に転写、固定することなく、ゲルを熱乾燥させ、上記と
同様に標識プローブを用いて、分離パターンを維持した
ままDNA断片を検出することができる。
電気泳動による分離パターンを維持したまま、分離され
たDNA分子を基体上に転写、固定し、転写、固定された
核酸断片を検出することにより行なうことができる。こ
れらの工程自体はこの分野において周知であり、サザン
ブロット法やノーザンブロット法において行なわれてい
る方法をそのまま適用することができる。すなわち、こ
こで用いられる基体としてはナイロンフィルターやニト
ロセルロースフィルターを好ましく用いることができ
る。DNA分子の固定は、例えば、常法により、フィルタ
ーを熱乾燥又は紫外線照射することにより行なうことが
できる。転写、固定されたDNA分子の検出は例えば、増
幅されたそれぞれの領域の少なくとも一部と特異的にハ
イブリダイズする上記標識プローブをそれぞれ作用さ
せ、それらの標識プローブが基体上のDNA分子と特異的
に結合するかを調べることにより、検出すべきDNA領域
が試料中に存在したか否かを知ることができる。検出す
べき領域は、それぞれの大きさに応じて分離されたパタ
ーンを維持したまま基体上に固定されているので、どの
試料中にどの領域が存在し、どの領域が欠損していたか
を一目瞭然に知ることができ、極めて好都合である。あ
るいは、ゲル電気泳動後、分離されたDNA断片を基体上
に転写、固定することなく、ゲルを熱乾燥させ、上記と
同様に標識プローブを用いて、分離パターンを維持した
ままDNA断片を検出することができる。
上記方法により、HTLV-I/ATLVのプロウイルスを特徴づ
ける領域が１つでも存在した場合には、成人Ｔ細胞白血
病に感染していると考えられる。
ける領域が１つでも存在した場合には、成人Ｔ細胞白血
病に感染していると考えられる。
以下、実施例により、本発明をより具体的に説明する
が、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
が、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例］ （１）試料の調製 健常人及びATL患者からの末梢血５〜10mlから比重液を
用いてリンパ球を分離し、常法によりリンパ球中のDNA
を抽出した。
用いてリンパ球を分離し、常法によりリンパ球中のDNA
を抽出した。
（２）プライマー及び増幅領域 ATLVのgag領域（およそ第800〜2090塩基）、pol領域
（および第2500〜5180塩基）、env領域（および第5180
〜6640塩基）及びpX領域（およそ第6680〜8360塩基）を
検出するための、これら領域とそれぞれ重複する領域の
第１鎖及び第２鎖の５′末端領域とそれぞれ特異的にハ
イブリダイズする、下記表に示す塩基配列を示すプライ
マーを化学合成した。表中、各プライマーの塩基配列の
両側の数字は、各プライマーがハイブリダイズするATLV
ゲノムの塩基の位置を示す。従って、例えばgag領域を
検出するための領域としては第1375塩基から1632塩基が
規定され、この領域が増幅される。増幅される各領域の
大きさは、gag領域が158bp、pol領域が120bp、env領域
が193bp、pX領域が220bpであり、増幅される各領域の大
きさは異なっていた。
（および第2500〜5180塩基）、env領域（および第5180
〜6640塩基）及びpX領域（およそ第6680〜8360塩基）を
検出するための、これら領域とそれぞれ重複する領域の
第１鎖及び第２鎖の５′末端領域とそれぞれ特異的にハ
イブリダイズする、下記表に示す塩基配列を示すプライ
マーを化学合成した。表中、各プライマーの塩基配列の
両側の数字は、各プライマーがハイブリダイズするATLV
ゲノムの塩基の位置を示す。従って、例えばgag領域を
検出するための領域としては第1375塩基から1632塩基が
規定され、この領域が増幅される。増幅される各領域の
大きさは、gag領域が158bp、pol領域が120bp、env領域
が193bp、pX領域が220bpであり、増幅される各領域の大
きさは異なっていた。
（３）遺伝子増幅法 （ｉ）試料の調製 （１）で調製したDNA試料の一部を採り、トリス−EDTA
（TE）緩衝液に最終濃度0.1μg/μｌに溶かした。その5
0μｌを95℃で５分間加加し、混存が予想されるDNA分解
酵素を変性させた。一度攪拌後、600rpm、30秒間遠心
し、以下の操作に用いた。
（TE）緩衝液に最終濃度0.1μg/μｌに溶かした。その5
0μｌを95℃で５分間加加し、混存が予想されるDNA分解
酵素を変性させた。一度攪拌後、600rpm、30秒間遠心
し、以下の操作に用いた。
（ii）反応試薬混合物の調製 反応試薬混合物を、試験管１本当り以下の容量で、試料
数に合わせて反応混合物を作製した。
数に合わせて反応混合物を作製した。
10 x Tris/KCl/MgCl2緩衝液 10.00μｌ dNTP混合物（4 NTP） 8.00μｌ gag領域プライマー１（0.5μg/μｌ） 0.25μｌ gag領域プライマー２（0.5μg/μｌ） 0.25μｌ pol領域プライマー１（0.5μg/μｌ） 0.25μｌ pol領域プライマー２（0.5μg/μｌ） 0.25μｌ env領域プライマー１（0.5μg/μｌ） 0.25μｌ env領域プライマー２（0.5μg/μｌ） 0.25μｌ pX領域プライマー１（0.5μg/μｌ） 0.25μｌ pX領域プライマー２（0.5μg/μｌ） 0.25μｌ Taqポリメラーゼ（5U/μｌ） 0.50μｌ 合計 20.50μｌ （iii）遺伝子増幅 蒸留水74.50μｌ、上記反応試薬混合物20.50μｌ及び上
記DNA試料5.00μｌを混合し、6000rpmで30秒間遠心して
ペレットを沈殿させた。２滴の鉱油を加えた後、6000rp
mで30秒間遠心して気泡を除いた。遠心管を市販の自動
温度コントローラーにセットし、遺伝子増幅を開始し
た。温度サイクルは、１）94℃、２分間、２）60℃、３
分間、３）72℃、３分間であった。終了後、試料を４℃
で保存した。
記DNA試料5.00μｌを混合し、6000rpmで30秒間遠心して
ペレットを沈殿させた。２滴の鉱油を加えた後、6000rp
mで30秒間遠心して気泡を除いた。遠心管を市販の自動
温度コントローラーにセットし、遺伝子増幅を開始し
た。温度サイクルは、１）94℃、２分間、２）60℃、３
分間、３）72℃、３分間であった。終了後、試料を４℃
で保存した。
（４）電気泳動 １％ウルトラビュアアガロース（BRL社製）、２％Nusiv
e GTGアガロース（FMCバイオプロダクツ社製）及び0.3
μg/mlのエチジウムブロマイドを1xTE緩衝液に加熱して
溶解し、アガロースゲルを作製した。（３）で得られた
増幅終了後の試料に6xローディング緩衝液を加え、その
10μｌをゲルの各ウェルに入れ、電気泳動を行なった
（50mA、２〜３時間）。マーカーを含む緩衝液を同じ条
件で電気泳動にかけた。
e GTGアガロース（FMCバイオプロダクツ社製）及び0.3
μg/mlのエチジウムブロマイドを1xTE緩衝液に加熱して
溶解し、アガロースゲルを作製した。（３）で得られた
増幅終了後の試料に6xローディング緩衝液を加え、その
10μｌをゲルの各ウェルに入れ、電気泳動を行なった
（50mA、２〜３時間）。マーカーを含む緩衝液を同じ条
件で電気泳動にかけた。
（５）サザンブロッティングによるDNAの転写常法に従
い、（４）で電気泳動分離されたDNAをナイロンフィル
ターに転写した。
い、（４）で電気泳動分離されたDNAをナイロンフィル
ターに転写した。
（６）オリゴDNAプローブの５′末端標識 上記表に示した塩基配列を有する、各領域を検出するた
めのオリゴDNAプローブ（表中、プローブの塩基配列の
左右の数字は、そのプローブがハイブリダイズするATLV
ゲノムの位置を示す）の５′末端を32Pで標識した。標
識は、下記組成の反応混合物を37℃で１時間インキュベ
ートすることにより行なった。
めのオリゴDNAプローブ（表中、プローブの塩基配列の
左右の数字は、そのプローブがハイブリダイズするATLV
ゲノムの位置を示す）の５′末端を32Pで標識した。標
識は、下記組成の反応混合物を37℃で１時間インキュベ
ートすることにより行なった。
混合オリゴDNAプローブ（0.5μg/μｌ） 0.6μｌ 滅菌蒸留水 5.4μｌ 緩衝液Ｃ（ベーリンガーキット） 2.0μｌ （ベーリンガー−マンハイム社製） T4ポリヌクレオチドキナーゼ 2.0μｌ （ベーリンガー−マンハイム社製）γ−32P−ATP（〜30
0Ci/mmol） 10.0μｌ 合計 20.0μｌ 反応後、Quic Spinカラム（G25セファデックスカラム）
（ベーリンガー−マンハイム社製）で分離した（遠心30
00rpm、２分間）。
0Ci/mmol） 10.0μｌ 合計 20.0μｌ 反応後、Quic Spinカラム（G25セファデックスカラム）
（ベーリンガー−マンハイム社製）で分離した（遠心30
00rpm、２分間）。
（７）DNAバンドの検出 （ｉ）プレハイブリダイゼーション 5 x SSPE、5 x デンハルツ溶液及び0.5％SDSから成る溶
液20mlで10 x 20cm2フィルターを処理し、56℃で２時間
インキュベートした。
液20mlで10 x 20cm2フィルターを処理し、56℃で２時間
インキュベートした。
（ii）ハイブリダイゼーション （ｉ）のプレハイブリダイゼーション後の液と32P−プ
ローブ（2 x 106dpm/ml、４〜5ml/10 x 20cm2フィルタ
ー）を混合し、56℃で２時間インキュベートした。
ローブ（2 x 106dpm/ml、４〜5ml/10 x 20cm2フィルタ
ー）を混合し、56℃で２時間インキュベートした。
（iii）洗浄 以下の洗浄を行なった。
１）2 x SSPE/0.1％SDS、室温、10分間 ２）同上 ３）5 x SSPE/0.1％SDSで55℃、10分間 （iv）現像 常法により、１〜２日間オートラジオグラフィーを行な
った。
った。
（８）結果 結果を図２に示す。図２中、レーン１は健常人、レーン
２ないしレーン11がATL患者からの末梢血リンパ球DNAに
ついての結果を示す。レーン12はマーカー（φx 174のH
ae III消化物、断片サイズは1357bp、1078bp、872bp、6
03bp、310bp、281bp、271bp、234bp、194bp、118bp及び
72bp）の泳動パターンを示す。図２からわかるように、
レーン１においてはATLVの発現は全く認められず、レー
ン２のATL患者はATLVの全領域を発現、レーン３の患者
はgag領域のみを発現、レーン４の患者はpol領域のみを
発現、レーン５の患者はenv領域のみを発現、レーン６
の患者はpX領域のみを発現、レーン７の患者はgag領域
とpol領域のみを発現、レーン８の患者はgag領域とenv
領域のみを発現、レーン９の患者はgag領域とpX領域の
みを発現、レーン10の患者はpol領域とenv領域のみを発
現、レーン11の患者はgag領域、pol領域及びenv領域を
発現していることがわかる。
２ないしレーン11がATL患者からの末梢血リンパ球DNAに
ついての結果を示す。レーン12はマーカー（φx 174のH
ae III消化物、断片サイズは1357bp、1078bp、872bp、6
03bp、310bp、281bp、271bp、234bp、194bp、118bp及び
72bp）の泳動パターンを示す。図２からわかるように、
レーン１においてはATLVの発現は全く認められず、レー
ン２のATL患者はATLVの全領域を発現、レーン３の患者
はgag領域のみを発現、レーン４の患者はpol領域のみを
発現、レーン５の患者はenv領域のみを発現、レーン６
の患者はpX領域のみを発現、レーン７の患者はgag領域
とpol領域のみを発現、レーン８の患者はgag領域とenv
領域のみを発現、レーン９の患者はgag領域とpX領域の
みを発現、レーン10の患者はpol領域とenv領域のみを発
現、レーン11の患者はgag領域、pol領域及びenv領域を
発現していることがわかる。
上記実施例から明らかなように、本発明の診断薬を用い
ると、HTLV-I/ATLVのプロウイルスを特徴づける複数の
領域を感度良く同時に簡便に検出することができること
がわかる。
ると、HTLV-I/ATLVのプロウイルスを特徴づける複数の
領域を感度良く同時に簡便に検出することができること
がわかる。
図１はHTLV-I/ATLVのプロウイルスのDNA塩基配列を示す
図、 図２は、本発明の方法を適用して、ATLVのプロウイルス
の検出を行なった結果得られたオートラジオグラフィー
を示す図である。
図、 図２は、本発明の方法を適用して、ATLVのプロウイルス
の検出を行なった結果得られたオートラジオグラフィー
を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平２−149596（ＪＰ，Ａ) Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，Ｖｏｌ．100，Ｎｏ．15 ９ｔｈ Ａ ｐｒｉｌ（1984）ｐ．131，Ｎｏ．115747 Ｚ
Claims (6)
- 【請求項１】HTLV-1/ATLVのプロウイルスを特徴づける
領域のうち、それぞれ大きさの異なる少なくとも２つの
領域を遺伝子増幅法により増幅するための、少なくとも
４種類のオリゴDNAプライマーを含む成人Ｔ細胞白血病
診断薬。 - 【請求項２】前記領域は、gag領域、pol領域、env領域
及びpX領域並びにそれらの部分から成る群より選ばれる
請求項１記載の診断薬。 - 【請求項３】前記オリゴDNAプライマーは、gag領域、en
v領域、pol領域及びpX領域とそれぞれ少なくとも部分的
に重複する、それぞれ大きさの異なる４つの領域を遺伝
子増幅法により増幅するための、８種類のオリゴDNAプ
ライマーである請求項２記載の診断薬。 - 【請求項４】前記８種類のプライマーは、 ５′CCTCCAAGACCTCCTGCAGT3′ ５′GTTGTTGTGGATTGTTGGCT3′ ５′AGGCCTTGCAACACTTGGTC3′ ５′GGATGAATCGCCAGGTTCCA3′ ５′ATACCGAACCCAGCCAACTG3′ ５′TATAGGACGTGCCAAGTGGA3′ ５′CAATGTTCCCTACAAGCGAA3′及び ５′AATCATAGGCGTGCCATCGG3′ である請求項３記載の診断薬。
- 【請求項５】増幅されたそれぞれの領域を検出するため
の標識DNAプロープをさらに包含する請求項１ないし４
のいずれか１項記載の診断薬。 - 【請求項６】下記塩基配列を有する４種類のDNAプロー
プをさらに包含する請求項４記載の診断薬。 ５′GAAACCCGAGGTATTACAGGTTATAACCC3′ ５′CGGAAGGCCCTGGAGGCAGGCCATATCGAA3′ ５′ATCCTCGAGCCCTCTATACCATGGAAATCA3′ ５′CCTAATAATTCTACCCGAAGACTGTTTGCC3′
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1165551A JPH06103302B2 (ja) | 1989-06-28 | 1989-06-28 | 成人ｔ細胞白血病診断薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1165551A JPH06103302B2 (ja) | 1989-06-28 | 1989-06-28 | 成人ｔ細胞白血病診断薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0329853A JPH0329853A (ja) | 1991-02-07 |
| JPH06103302B2 true JPH06103302B2 (ja) | 1994-12-14 |
Family
ID=15814521
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1165551A Expired - Lifetime JPH06103302B2 (ja) | 1989-06-28 | 1989-06-28 | 成人ｔ細胞白血病診断薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06103302B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4874853A (en) * | 1988-04-18 | 1989-10-17 | City Of Hope | Synthetic oligonucleotides useful in diagnosis of chronic myelogenous leukemia |
-
1989
- 1989-06-28 JP JP1165551A patent/JPH06103302B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＣｈｅｍｉｃａｌＡｂｓｔｒａｃｔｓ，Ｖｏｌ．１００，Ｎｏ．１５９ｔｈＡｐｒｉｌ（１９８４）ｐ．１３１，Ｎｏ．１１５７４７Ｚ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0329853A (ja) | 1991-02-07 |
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