JPH06100595A - Ｉｌ−８受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】ＩＬ−８受容体の遺伝情報を与えるｃＤＮＡ
と、このｃＤＮＡから発現される組換えタンパク。 【効果】組換え受容体、受容体の断片及び同種物は、Ｉ
Ｌ−８とＩＬ−８受容体との間の相互作用に拮抗する能
力について候補化合物をスクリーニングする方法におい
て用いられる。拮抗薬は炎症を軽減する治療薬として用
いられる。ＩＬ−８受容体又は抗体断片もしくは同種物
に特異性を示す抗体、並びに、治療薬としてのその使用
も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、米国ナショナル・イン
スティトゥート・オブ・ヘルス(National Institute of
Health)によって付与された番号＃R01AR39602、＃AG00
115及び＃K04AR01810をもって米国政府の支援の下にな
されたものである。

【０００２】本発明は、炎症を軽減させることに関す
る。

【０００３】

【従来の技術】通常の状態の下では、（例えばＴリンパ
球、Ｂリンパ球、マクロファージ及び好中球による）宿
主の防衛機構の秩序立った進行によって、良好に制御さ
れた免疫反応及び炎症反応が生起し、それによって宿主
を有害な抗原に対して保護する。しかし宿主の防衛に関
与する機構のうちのいずれかの機構の調節機能の不備に
よって、宿主の組織が破壊され、臨床学的に明確な疾病
をひき起すことがある。１つのそうした機能の不備は、
細胞学的反応と組織学的反応との複合されたセットから
成る病理学的プロセスとしての炎症である。これらの反
応は、物理的、化学的又は生物学的な因子によって生じ
た損傷又は異常な刺激に応答して、冒された血管又は近
傍の組織に生ずる。炎症による疾患の例としては、過敏
症(anaphylaxis)、全身性の壊死性脈管炎、全身性のエ
リテマトーデス、血清病症候群、乾癬及び慢性関節リウ
マチ、並びに、心筋梗塞もしくはショックのような虚血
に続く期間の間に生ずる再潅流の障害などがある。炎症
は同種移植拒絶においても或る役割を果すことがある。

【０００４】好中球は、炎症の過程において或る役割を
果す血液の細胞成分である。（例えば病原体によって宿
主が感染した後に）活性化された好中球は、細胞毒性を
示して炎症性応答を増幅させる物質を生成する。強い炎
症の間に好中球のタンパク分解酵素及び酸素を含まない
ラジカルが放出されると、軟骨のムコ多糖類が消化さ
れ、滑膜組織が酸化され、広汎な肺の損傷を生ずること
がある。また炎症の個所の走化性因子によって好中球の
凝集と内皮への付着とを生じ、例えば肺脈管の白血球の
停止又は心肺機能の不備がそれにより惹起される(Jandl
e、 「Blood」、Little、Brown ＆ Co.、ボストン、
１９８７年）。

【０００５】インターロイキン−８（ＩＬ−８）は、イ
ンターロイキン−１及び他の刺激性シトキンによって活
性化された時にいろいろの細胞の型によって産生される
７２アミノ酸ペプチドである（Westwick等、「Immunolo
gy Today」、１０；１４６、１９８８）。ＩＬ−８は、
好中球活性化ペプチド−１（ＮＡＰ−１）、好中球活性
化因子（ＮＡＦ）及び単球誘導中性球走化性因子（ＭＤ
ＮＣＦ）として以前から知られている。ＩＬ−８のアミ
ノ酸配列は定められている（Lindley等、Proc.Nat'l. A
cad. Sci. USA ８５：９１９９、１９８８）。ＩＬ−８
は好中球の走化性及び顆粒のくずれを助長する（Djeu
等、J. Immunol. １４４；２２０５、１９９０）。ＩＬ
−８は、試験管内の好中球の有効な走化性誘引物質（ケ
モアトラクタント）であり、生体中の強い炎症効果を生
起させうることが確かめられている（Colditz等、Am.
J. Pathol. １３４：７５５、１９８９）。またＩＬ−
８は、乾癬又はリウマチ性関節炎などの自然の炎症状態
において、大量に存在することが確かめられている。Ｉ
Ｌ−８は、好中球によって仲介される炎症プロセスの中
心的要因と考えられる。そのためＩＬ−８作用の禁止剤
又は拮抗薬は有用な抗炎症剤として期待される。

【０００６】好中球に対するＩＬ−８の作用は、特定の
受容体によって仲介される（Grob等、J. Biol. Chem.
２６５：８３１１、１９９０）。この糖タンパク質は、
分子量が５８、０００ダルトンと推定され、顆粒球の細
胞特に好中球に限定されている。従来において十分に特
性が定められ又はクローニングされることのなかったこ
の受容体は、ＩＬ−８の阻止剤及び拮抗薬の開発におい
て特に有用なものとして期待される。

【０００７】

【発明の概要】本発明は、一般に、好ましくは図１に示
したアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む
組換えＩＬ−８受容体ポリペプチドを特徴とする。本発
明は、更に、ＩＬ−８受容体の断片又は同種物であり、
ＩＬ−８と結合可能な領域を含む、実質的に単離された
ポリペプチドも特徴とする。

【０００８】本発明の色々の好ましい実施態様におい
て、受容体は、哺乳動物、好ましくはヒト又は兎から誘
導される。

【０００９】本発明は、更に、ＩＬ−８受容体の膜通過
領域又はＩＬ−８細胞外領域の全部又はそのＩＬ−８結
合部分を含むポリペプチドを提供する。好ましくはポリ
ペプチドは、組換え(recombinant)ポリペプチドであ
る。

【００１０】「ＩＬ−８受容体ポリペプチド」とは、Ｉ
Ｌ−８と特異的に結合してＩＬ−８によって仲介される
一連の適切な生物学的事象をシグナルする細胞表面タン
パク質の全部又は一部を意味する。「ポリペプチド」と
は、鎖長又は翻訳後の修正（例えばグリコシル化）と係
わりなしに任意のアミノ酸の配列を意味する。「実質的
に単離されたポリペプチド」とは、ポリペプチドに自然
に結合している他のタンパク質、炭水化物及び脂質を実
質的に含まないポリペプチドを意味する。「実質的に同
一の」アミノ酸配列とは、例えば１つのアミノ酸を同じ
類の他のアミノ酸で代替すること（例えばバリンをグリ
シンに代替し、アルギニンをリジンに代替するなど）に
よるコンサーヴァティブ(conservative)なアミノ酸の代
替、あるいは、受容体の生物学的活性を破壊しないアミ
ノ酸配列中の位置においてその１以上のアミノ酸の非コ
ンサーヴァティブ(non-conservative)な代替、削除又は
挿入のみによって相違するアミノ酸配列を意味する。こ
れらの同等の受容体は、そうした受容体を自然に生成さ
せるか又は後述する方法又はその均等方法を使用して前
記受容体の自然の生成を誘発することのできる任意の動
物の組織又は細胞からの抽出、化学的合成、ＤＮＡ組換
え技術の標準的な手法（例えば前記のような受容体の遺
伝情報を与えるｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの単離）によ
って、それぞれ単離することができる。「から誘導され
た」とは、当該有機体のゲノムによって遺伝情報がコー
ドされて当該組織の細胞のサブセットの表面に存在する
ことを意味する。

【００１１】本発明は、その１つの関連した視点におい
て、前述した受容体（又はその断片もしくは同種物）の
遺伝情報をコードする精製されたＤＮＡを提供する。好
ましくは、精製されたＤＮＡは、ｃＤＮＡ、兎のＩＬ−
８受容体の遺伝情報を与えるｃＤＮＡ、ヒトのＩＬ−８
受容体の遺伝情報を与えるｃＤＮＡ、であり、Ｆ３Ｒプ
ラスミドに含まれ、また４Ａｂプラスミドに含まれる。

【００１２】「精製されたＤＮＡ」とは、ＩＬ−８受容
体（又は適切な受容体もしくは同種物）の遺伝情報をコ
ードするが、本発明のＤＮＡを誘導した組織の自然に存
在するゲノムにおいてＩＬ−８受容体の遺伝情報をコー
ドする遺伝子のフランク(flank)を形成する遺伝子を含
まないＤＮＡ分子を意味する。

【００１３】本発明は、更に別の関連した視点として、
前記の精製されたＤＮＡを有するベクターであって、Ｄ
ＮＡによって遺伝情報がコードされたタンパク質を、当
該ベクターを有する細胞中において発現させることを指
令することができるベクター、並びに、これらのベクタ
ーを有する細胞、好ましくは真該細胞例えば哺乳動物の
細胞（例えば骨髄細胞）を提供する。

【００１４】本発明による発現ベクター又はベクターを
有する細胞は、前記の組換えＩＬ−８受容体ポリペプチ
ド及びポリペプチドを製造するための本発明による製造
方法において使用することができる。本発明による製造
方法は、当該細胞中において発現されるように位置され
た、ＩＬ−８受容体又はその断片もしくは同種物の遺伝
情報を与えるＤＮＡによって形質転換された細胞を用意
し、該ＤＮＡを発現させる条件の下に、該形質転換され
た細胞を培養し、該組換えＩＬ−８受容体ポリペプチド
を単離することから成る。「形質転換された細胞」と
は、ＩＬ−８受容体（又はその断片もしくは同種物）に
遺伝情報をコードするＤＮＡ分子が遺伝子工学的に導入
された（又はその祖先に導入された）細胞を意味する。
このＤＮＡ分子が「発現のために配置される」とは、Ｄ
ＮＡ配列の転写及び翻訳を指示する（即ち、ＩＬ−８受
容体蛋白質又はその断片もしくは同種物の産生を容易に
する）ＤＮＡ配列に隣接してＤＮＡ分子が配置されるこ
とを意味する。

【００１５】本発明は、その更に別の視点において、Ｉ
Ｌ−８受容体（又はその断片もしくは同種物）に優先的
に結合する精製された抗体も提供する。「精製された抗
体」とは、それに天然に含まれる他のタンパク質、炭水
化物及び脂質が医療上の投与と可能とする程度に十分に
除去された抗体を意味する。この抗体は、ＩＬ−８受容
体（又はその断片もしくは同種物）に「優先的に結合」
される（即ち、抗原的に関係のない他の分子を実質的に
認識してこれと結合されることはない）。

【００１６】好ましくは、抗体は、それに結合されるタ
ンパク質の生体中の生物学的活性を中和させる。

【００１７】「生物学的活性」とは、ＩＬ−８と結合し
て生物学的な一連の適切な事象をシグナルするＩＬ−８
受容体の能力を意味する。又「中和する」とは、（例え
ば、ＩＬ−８受容体の生物学的活性を）部分的にか又は
完全に阻止することを意味する。

【００１８】さらに別の視点においては、前述したポリ
ペプチド又は抗体は、医療用の組成物の活性成分として
用いられる。これらの医療用の組成物において、活性成
分は、生理学的に容認可能な担体と共に調製し、又は、
細胞膜中に係留させる。この医療用の組成物は、炎症を
軽減ないし減少させる方法において使用することができ
る。

【００１９】本発明は更に、ＩＬ−８とＩＬ−８受容体
との間の相互作用に拮抗する能力について候補成分（な
いし化合物）をスクリーニングする方法も提供する。こ
の方法は、ａ）組換えＩＬ−８受容体（又はＩＬ−８と
結合する断片もしくは同種物）を含む第１成分及びＩＬ
−８を含む第２成分と、候補拮抗成分（ないし化合物）
とを混合し、ｂ）該第１成分と第２成分とが結合するか
否かを定め、ｃ）該第２成分との該第１成分の結合に干
渉して、ＩＬ−８により仲介される細胞間Ｃａ⁺⁺の放出
を減少させる候補化合物を、拮抗成分（ないし化合物）
として特定することから成る。「拮抗薬とは、或る特別
の活性、この場合には、ＩＬ−８受容体との相互作用、
或いはこの相互作用に起因する一連の生物学的事象（即
ち細胞間Ｃａ⁺⁺の放出）をトリガーするＩＬ−８の能
力、を阻止するモレキュールを意味する。

【００２０】本発明のタンパク質は、好中球の活性化及
び炎症反応を招来する事象に関与する。従って、これら
のタンパク質は、炎症の治療のために、又は別に、炎症
の治療薬を開発する上に有用である。本発明によるタン
パク質及び／又は方法を用いて処理することの可能な特
別の疾患には、乾癬、慢性関節リウマチ、脈管炎、再潅
流の障害、又は、好中球によって媒介される炎症疾患が
含まれる。好ましい治療薬には、インターロイキン：受
容体間相互作用に干渉することによってＩＬ−８又はＩ
Ｌ−８受容体の機能をブロックする拮抗薬、例えば、ペ
プチド断片、抗体又は薬剤がある。

【００２１】受容体成分がこのように組換え技術によっ
て製造され、候補拮抗薬が試験管内(in vitro)において
スクリーニングされるので、本発明により、有用な治療
薬の特定のための簡単ですみやかなアプローチが提供さ
れる。このアプローチは、従来は、次のような理由のた
め困難であった。（１）ＩＬ−８と好中球の表面上のそ
の内因性受容体との相互作用のため、タンパク分解酵素
の放出又は酸素を含まないラジカルの放出のような一連
の事象がトリガーされ、その結果として、受容体を支持
する好中球の細胞が破壊される。（２）好中球の表面に
関連受容体が存在するため、ＩＬ−８受容体の単離（ｃ
ＤＮＡとして）によって、好中球から遠隔の細胞型（例
えばＪ５５８もしくはＳＰ２骨髄細胞又はＣＯＳ細胞）
においての発現が許容され、ＩＬ−８受容体がその通常
の細胞毒のシグナル経路から実効的に遮断され、関連す
る細胞を死なせないＩＬ−８：受容体間の相互作用の検
定のためのシステムを提供する。

【００２２】このようにして特定された後は、組換え及
び分子生物学的手法を用いて、ペプチド又は抗体を主成
分とする治療薬を大量に廉価に製造できる。

【００２３】次に本発明の好ましい実施例について一層
詳細に説明する。

【００２４】

【実施例】本発明によるポリペプチド 本発明によるポリペプチドは、ヒトのＩＬ−８受容体の
全部、並びに、兎のＩＬ−８受容体の全部（図１参照）
である。これらのポリペプチドは、例えばＩＬ−８：受
容体間の相互作用を中断させる拮抗薬をスクリーニング
するために、使用される（下記参照）。本発明によるポ
リペプチドは、ＩＬ−８と相互作用しうるヒトＩＬ−８
受容体又は兎ＩＬ−８受容体の同種又は断片も含む。こ
れらの同種物又は断片も、ＩＬ−８受容体の拮抗薬につ
いてスクリーニングするために使用しうる。その他に、
ＩＬ−８と結合し、好ましくは脂質の小胞中に可溶（も
しくは不溶でこの小胞中において調製される）受容体の
断片又は同種物のサブセットも、炎症性の疾病を軽減さ
せるための拮抗薬として使用しうる（後記参照）。受容
体の同種物又は断片の効力は、ＩＬ−８と相互作用する
能力に依存する。この相互作用は、多くの標準的な試験
管中の結合法及びＩＬ−８受容体の機能検定（例えば後
記参照）によって容易に検定できる。

【００２５】特定の有用な受容体の同種物には、例えば
１つのアミノ酸を同じ類の他のアミノ酸で代替すること
（例えばバリンをグリシンで代替し、アルギニンをリジ
ンに代替するなど）によるコンサーヴァティブ(conserv
ative)なアミノ酸の代替、或いは、受容体の生物学的活
性を破壊しないアミノ酸配列中の位置においての１以上
のアミノ酸のノン・コンサーヴァティブ(non-conservat
ive)な代替、削除又は挿入のみによって相違するアミノ
酸配列を含む、全長の、又は部分的な（後記参照）受容
体タンパク質が含まれる。

【００２６】特定の有用な受容体の断片には、ＩＬ−８
と相互作用可能なＩＬ−８受容体の任意の部分が含まれ
る。これらの部分には膜通過セグメント１−７及び細胞
外と推定される受容体の部分が含まれる。これらの断片
は、（前記のように）拮抗薬として有用と思われ、更
に、（例えば後述するように、受容体とＩＬ−８との相
互作用に干渉することによって）生体中でＩＬ−８受容
体の活性を中和する抗体を産生するための免疫源として
も有用である。細胞外の区域(regions)は、同種の構造
の関連タンパク質（例えばＧ−タンパク結合受容体のス
ーパーファミリーの他のメンバー）との比較によって特
定できる。有用な区域は、ファミリーの十分に特徴が定
められたメンバーの細胞外ドメインとの相同性を示す区
域である。別法として、チョウ−ファスマン法（Ｃｈｏ
ｕ及びＦａｓｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．４７：２５１、１９７８）による疎水度／親水度の
計算を用いて、第１のアミノ酸配列から、第２のタンパ
ク質構造、従って細胞外ドメイン区域を半実験的に推定
できる。親水性のドメイン、特に、疎水性の範囲（Ｓｔ
ｒｅｃｈ）（例えば膜通過領域）によって挟まれたドメ
インは、細胞外ドメインの有力な候補である。又細胞外
ドメインは、標準的な酵素消化分析（例えば、トリプト
ン消化分析）を用いて実験的に特定できる。

【００２７】候補断片（例えば、膜通過セグメント２−
７又は任意の細胞外断片の全部又は一部）は、本明細書
中に記載した検定（例えば前述した検定）によって、Ｉ
Ｌ−８との相互作用について試験される。また、これら
の断片は、ＩＬ−８とその内因性受容体との間の相互作
用に拮抗する能力について、前述した検定を用いて試験
される。（前述したもののような）有用な受容体の断片
の同種物を作成し、（本明細書中において説明される検
定によって）スクリーニング成分又は拮抗薬としての効
き目について試験してもよい。これらの同種物も本発明
において有用と考えられる。

【００２８】次に本発明に用いられる２つのＩＬ−８受
容体の遺伝情報を定めるｃＤＮＡのクローニング及び特
定の決定について説明する。以下に示す例は、単に例示
のためのもので、本発明をそれに限定するものではな
い。

【００２９】兎ＩＬ−８受容体のクローニング及び特性
の決定 兎ＩＬ−８受容体の遺伝子を次のようにして単離した。

【００３０】兎の腹腔の好中球を、ジグモンド及びトラ
ンキロ法（Zigmond and Tranquillo…、１９８６）によ
って、兎から単離し、ポリＡ⁺ＲＮＡ源として用いた。
ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡに転写し、ｃＤＮＡ断片をλ
ｇｔ１１のＥｃｏＲＩ部位に挿入して兎の好中球ｃＤＮ
Ａライブラリを作成した。（これは全てマニアテイス(M
aniatis)等の方法、「Molecular Cloning、Cold Spring
Harbor Press、ColdSpring Harbor、ニューヨーク（１
９８２） によった。）２５０，０００個の組換えプラ
ーク（ｐｌａｇｕｅｓ）を、次の配列 ３’ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ＧＡＣ ＧＡＣ ＴＣＧ
ＧＡＣ ＣＧＧ ＡＣＩ ＣＧＩ ＣＴＧ ＧＡＩ
ＴＡＧ ＴＡＣ ５’ のアンチセンスオリゴヌクレオチドにハイブリッド形成
されるものについてスクリーニングした。

【００３１】このプローブは、Ｇ−タンパク結合性受容
体の第２膜通過領域から誘導された配列に基づいて定め
た（例えばHontig等、１９８９参照）。

【００３２】このプローブには、［³²Ｐ］ＡＴＰ（Du P
ont-New England Nuclear、ボストン、ＭＡ）及びＴ４
キナーゼ（New England Biolabs、Beverly 、ＭＡ）に
よって、前出のマニアテイス等の方法にしたがって５’
末端標識を付した。ハイブリッド形成条件は、６ｘＳＳ
ＰＥ、１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、１
ｘデンハート液、１００μｇ／ｍｌポリＡ、及び４０μ
ｇ／ｍｌ変性コウシ胸腺ＤＮＡ、４２℃、１２時間であ
った。２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて５０℃でフ
ィルタを洗浄した。第３スクリーニングの後、６個のプ
ラークを単離した。これらのうち１つのプラーク（Ｆ３
Ｒと命名）のインサートは、２．５ｋｂの大きさであっ
た。このインサートの配列は、サンジャー(Sanger)等、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
４：５４６９、１９８３の方法にしたがって、配列２．
０（Ｕ．Ｓ．Biochemical Corp.、クリーブランド、Ｏ
Ｈ）を用いて行なった。３５４アミノ酸タンパク質（Ｍ
ｒ＝４０，５２８）のオープン・リーディング・フレー
ム・コーディングが展開された。核酸の配列及び推定さ
れたアミノ酸配列は、図１に示されている。Ｎ結合グリ
コシル化の推定部位は、配列中に下線により示されてい
る。

【００３３】Ｆ３Ｒクローンから推定されるこのタンパ
ク質のいくつかの構造的な特徴は、このタンパク質がＧ
−タンパク結合受容体のファミリーに属することを表わ
している。第１に、推定されたタンパク質の配列のハイ
ドロパシーのプロットは、７個の推定的な膜通過セグメ
ントの存在を指示している。第２に、Ｆ３Ｒの１次構造
は、他のＧ−タンパク結合受容体との高度の類似性を示
している。特に物質Ｋ受容体及び物質Ｐ受容体のような
ペプチドと結合するＧ−タンパク結合受容体との最も高
度の相同性が見られる（Masu等、Ｎａｔｕｒｅ ３２
９：８３６、１９８７；Ｈｅｒｓｈｅｙ 及びＫｒａｕ
ｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７；９５８、１９９０）。
第３に、Ｆ３Ｒは、Ｇ−タンパクに結合した受容体に帰
着されるいくつかの構造的な特徴を備えている。例え
ば、Ｆ３Ｒは、シグナル配列のないＮ末端に２個の推定
的なＮ−結合グリコシル化部位を有すると共に、全ての
Ｇ−タンパク結合受容体において保存される位置８０
（即ち膜通過セグメント〓）に、アスパラギン酸塩を、
また推定された膜通過セグメント〓付近に標準的なＡｓ
ｐ−Ａｒｇ−Ｔｙｒトリペプチドを有している。物質Ｋ
受容体及び物質Ｐ受容体と同様に、Ｆ３Ｒは、アドレナ
リン性、ムスカリン性、ドーパミン性で且つセロトニン
性の受容体においてアミンのイオンの結合に不可欠と思
われる推定的な膜通過セグメント〓にＡｓｐ−１１３を
備えていない（Dixon等、Cold Spring Harbor Ｓｙｍ
ｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５３：４８７、１９８
８）。またＦ３Ｒは、他のＧ−タンパク結合受容体と同
様に、タンパク質キナーゼの潜在的な基質であるいくつ
かの基本的位置のセリン及びスレオニン残基を示す（Be
novic等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
４：４０５，１９８８）。

【００３４】Ｆ３Ｒ遺伝子の発現を更に特徴付けるため
に、兎の好中球ＲＮＡのノザンブロット（Northern Blo
t)解析においてハイブリット形成プローブとして、Ｆ３
ＲｃＤＮＡを使用した。ＲＮＡを塩化セシウム匂配遠心
分離によって、好中球及び他の組織から単離し、１％ア
ガロース ホルムアルデヒド ゲルを経て電気泳動さ
せ、前記マニアテイス等の方法にしたがって、ジーンス
クリーン（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ）膜（デュポン−ニ
ューイングランドニュークレア社）に移した。ファーマ
シア（Pharmacia）社（Piscataway、ＮＪ）のランダム
プライム法によって［³²Ｐ］のｄＣＴＰにて標識した
Ｆ３ＲのＢａｍＨＩ／ＥＣｏＲＩ断片（塩基数６５２；
兎ＩＬ−８コーデイグ連鎖のヌクレオチド−２７から６
２５まで）をプローブとして用いた。ハイブリッド形成
溶液は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＰＥ、５ｘデン
ハート液、０．１％ピロリン酸ナトリウム、１ｍｇ／ｍ
ｌヘパリン、１００μｇ／ｍｌポリＡ、１％ＳＤＳ及び
２００μｇ／ｍｌ変性コウシ胸腺ＤＮＡを含有してい
た。ブロットを４２℃で１６時間ハイブリッド形成処理
した後、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳにて６５℃
で洗浄した。

【００３５】Ｆ３Ｒプローブは、２．６キロベースの好
中球ＲＮＡ分子に特異的にハイブリッド形成された。こ
れによりＦ３Ｒが好中球において発現されたことを確認
されると共に、Ｆ３Ｒクローンがほぼ全長であることが
示された。Ｆ３Ｒクローンは、兎の子宮平滑筋、骨格
筋、肺、肝臓又は脳から単離されたＲＮＡにハイブリッ
ド形成されなかった。またＦ３Ｒクローンは、繊維芽細
胞、上皮細胞及び内皮細胞からポリＡ⁺ＲＮＡにハイブ
リッド形成されなかった。前骨髄球ＨＬ−６０細胞は、
非常に低いレベルのＦ３ＲｍＲＮＡを示した。区別され
たＨＬ−６０細胞は、このＲＮＡより２０倍高いレベル
を発現した。

【００３６】Ｆ３ＲｍＲＮＡは、Promega Corp.社（マ
ジソン、ＷＩ）の方法によって、兎の網状赤血球の溶解
質に試験管内で翻訳された。ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；標準的な手法に
よる；Ausubel等、Current Protocols in Molecular Bi
ology, Green Publishing Associates ニューヨーク、
１９８７年）によって定めた相対分子量３０，０００−
３２，０００ダルトンのタンパク質を合成した。Ｍｒの
計算値４０，５２８とその見かけ値約３１，０００との
差は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの可溶性蛋白質基準に比べて大
きな可動度を膜タンパクがしばしば示すためと思われる
（Bonitz等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１１９
２７、１９８０；Rizzolo等、［Biochemistry」１５：
３４３３、１９７９）。

【００３７】ヒトＩＬ−８受容体遺伝子のクローニング Clontech社（Palo Alto、ＣＡ）から入手したヒト末梢
血白血球λｇｔ１１cＤＮＡライブラリ（５’ストレッ
チ）を、（ヌクレオチド−２７から６２５を含む）６５
２塩基対ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片によって、兎Ｆ３
Ｒクローンのコーデイング区域からスクリーニングし
た。このプローブには前記のようにランダムプライミン
グによって［³²Ｐ］ｄＣＴＰの標識を付した。５０％ホ
ルムアミド、２００μｇ／ｍｌ変性コウシ胸腺ＤＮＡ、
５ｘＳＳＰＥ、１％ＳＤＳ、５ｘデンハート液及び０．
１％ピロリン酸ナトリウムを含有する溶液で、フィルタ
ーをハイブリッド形成し、４２℃で１６時間培養した。
３回のスクリーニングの後、兎ＩＬ−８プローブにハイ
ブリッド形成されたいくつかのヒトのクローンを単離し
た。このうち１つのクローン（４Ａｂと命名）のインサ
ートは、長さが４．０キロベースであり、Ｓｅｑｕｅｎ
ａｓｅ２．０（Ｕ．Ｓ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒ
ｐ．）を用いて、サンジャー等の方法（前記参照）にし
たがって両方のストランドにおいて塩基配列を決定し
た。

【００３８】別法として、クローン４Ａｂの配列に基づ
いたプライマー配列を用いてＰＣＲクローニングによっ
てヒトＩＬ−８遺伝子を単離する。これらのプライマー
の配列は次のとおりである。

【００３９】 ５’ＧＡＡＴＡＴＧＧＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＡＴＧＣＡＧ ３’ ５’ＡＡＴＧＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＧＡＧＧ ３’

【００４０】プライマーは、例えばアプライド・バイオ
システムズ・ＤＮＡシンセサイザー（Applied Biosyste
ms DNA Synthesizer）（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃ
Ａ）を用いて、標準的なシアノエチル・ホスホラミダイ
ト化学を用いることによって合成する。

【００４１】ヒト好中球は、標準的な手法によって単離
し、前記のようにポリＡ⁺ＲＮＡ源として使用する。や
はり前記のようにして、cＤＮＡを合成し、任意の標準
的なクローニングベクター例えばλｇｔ１１にcＤＮＡ
断片を挿入することによって、好中球cＤＮＡライブラ
リを形成する。別法として、クロンテック（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈ）社（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から、ヒト末
梢血白血球λｇｔ１１cＤＮＡライブラリ（５’ストレ
ッチ）を購入してもよい。

【００４２】ヒト好中球又はヒト末梢リンパ球cＤＮＡ
約１００ｎｇを、各々の合成プライマー１μｇと結合さ
せ、メーカー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａ
ｌｋ、ＣＴ）の指示にしたがってポリメラーゼ連鎖反応
を行う。結果ＰＣＲ生成物を電気泳動によって単離し、
例えばベクターＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、、Ｌ
ａＪｏｌｌａ、ＣＡ）中にクローニングし、大腸菌ＸＬ
−１ ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）において増
幅させる。

【００４３】ポリペプチド発現 本発明によるポリペプチドは、適宜の発現ベヒクル中に
おいて、ＩＬ−８受容体の遺伝情報を与えるｃＤＮＡ断
片（例えば前記cＤＮＡ）の全部又は一部と共に、適宜
の宿主細胞を形質転換し、受容体を発現させることによ
って製造することができる。

【００４４】分子生物学に熟達した人には容易に理解さ
れるように、組換え受容体タンパクを供与するために、
非常に多くの種類のどの発現システムも使用することが
できる。使用される厳密な宿主細胞は、本発明にとって
不可欠ではないが、ＣＯＳ−７、ＳＰ−２、ＮＩＨ ３
Ｔ３及びチャイニーズハムスター卵巣細胞などの宿主細
胞が好ましい。これらの細胞は、広汎な供給源、例え
ば、アメリカン・タイプ・カルチユア・コレクション
（American Type Culture Collection）、Ｒｏｃｋｌａ
ｎｄ、ＭＤから入手できる。トランスフエクションの方
法及び発現ビヒクルの選択は、選定される宿主系に依存
する。哺乳動物の細胞のトランスフエクションの方法
は、一例として、オーシユベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）等、
［Current Protocols in Molecular Biology、John Wil
ey & Sons, ニューヨーク、１９８９）に記載されてい
る。発現ビヒクルは、例えば［Cloning Vectors、 A Lab
oratoryManual」（Ｐ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓ等、１９８
５、増補版１９８７）に示されたものから選択できる。

【００４５】特に好ましい発現系は、ｐＭＡＭｎｅｏ発
現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ、ＣＡ）によってトランスフエクト（形質転換）され
たマウス３Ｔ３繊維芽細胞の宿主細胞である。ｐＭＡＭ
ｎｅｏは、デキサメタソン誘導ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモ
ーターに結合されたＲＳＶ−ＬＴＲエンハンサー、哺乳
動物系においての複製を許容するＳＶ４０複製源、選択
可能なネオマイシン遺伝子、ＳＶ４０スプライシング及
びポリアデニル化部位を供与する。ヒト又は兎のＩＬ−
８受容体又は適宜の受容体断片もしくはその同種物（前
記）の遺伝情報をあたえるＤＮＡは、発現を可能とする
べき方向性において、ｐＭＡＭｎｅｏベクターに挿入さ
れよう。組換え受容体タンパクは、後に説明するように
して単離されよう。ｐＭＡＮｎｅｏ発現ビヒクルと共に
使用可能な他の好ましい宿主細胞には、ＣＯＳ細胞及び
ＣＨＯ細胞（それぞれＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１６５０
及びＣＣＬ６１）がある。

【００４６】他の特に好ましい発現系は、ＩＬ−８の遺
伝情報を与えるＤＮＡが受容体タンパクの発現を許容す
る方向性において挿入されているＳＶＬベクター（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社）によって（前記のように）一時的に
トランスフエクトされたＣＯＳ宿主細胞（ＡＴＣＣ受託
番号ＣＲＬ１６５０）である。

【００４７】別法として、ヒト又は兎ＩＬ−８受容体
（又は受容体の断片又は同種物）は、安定的にトランス
フエクトされた哺乳動物の細胞系によって産生される。

【００４８】哺乳動物の細胞の安定したトランスフエク
ションに適した多くのベクターが供与されている（例え
ばＰｏｕｗｅｌｓ等の前掲の文献参照）。これらの細胞
系を構成する方法も、例えばＡｕｓｕｂｅｌ等の前揚の
文献によって知ることができる。一例として、受容体
（又は受容体の断片又は類似物）の遺伝情報を与えるｃ
ＤＮＡを、ジヒドロ葉酸リダクタント（dihydrofolate
reductant）（ＤＨＦＲ）遺伝子を含有した発現ベクタ
ー中にクローニングする。プラスミドを、従って、ＩＬ
−８受容体の遺伝情報を与える遺伝子を宿主細胞の染色
体に合体させるのは、（Ａｕｓｕｂｅｌ等の前掲の文献
に記載されているように）細胞の培養基に０．０１−３
００μＭのメトトレキセートを含有させることによって
選定される。この優生選定は、多くの細胞の型において
達成される。組換えタンパクの発現は、トランスフエク
ト（形質変換）される細胞のＤＨＦＲによって仲介され
る増幅によって増大しうる。遺伝子の増幅を含む細胞系
の選定方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ等の前掲の文献に記載さ
れている。これらの方法は、一般に、徐々に増大するレ
ベルのメトトレキセートを含有する媒体内において長時
間培養することを含む。この目的に普通に使用されるＤ
ＨＦＲ含有発現ベクターには、ｐＣＶＳＥＩＩ−ＤＨＲ
Ｆ及びｐＡｄＤ２６ＳＶ（Ａ）（前掲のＡｕｓｕｂｅｌ
等の文献参照）がある。前述した各々の宿主細胞並びに
好ましくはＤＨＦＲ欠陥ＣＨＯ細胞系（例えばＣＨＯ
ＤＨＦＲ細胞、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ９０９６）は、
安定的にトランスフエクト（形質転換）される細胞系又
はＤＨＦＲによって仲介される遺伝子増幅のＤＨＦＲ選
択のために好ましい宿主細胞である。

【００４９】特に好ましい安定な発現系は、ｐＳＶ２−
ｇｐｔによって安定にトランスフエクトされた骨髄細胞
系Ｊ５５８（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ６）又はＳＰ２
（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５８１）である。ｐＳＶ２
−ｇｐｔは、ＳＶ４０の初期プロモーター及び選択可能
なｇｐｔマーカーを供給する（即ち大腸菌キサンチン−
グアニンフォスホリボシルトランスフエラーゼ）。

【００５０】（例えば本明細書中に記載された適宜の発
現系によって産生した）組換え受容体の発現は、組換え
細胞抽出物の免疫沈降分析又はウエスターンブロット
（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）法のような免疫学的方法
によっても、（例えばＡｕｓｕｂｅｌ等の前掲の文献に
記載された方法を用いた）無傷の組換え細胞の免疫蛍光
法によっても検定できる。組換え受容体タンパクは、そ
の受容体に向けられた抗体を用いて検出する。この抗体
の１つは、適宜のＩＬ−８受容体エピトープ（ｅｐｉｔ
ｏｐｅ）を含有するペプチド又は無傷の（ｉｎｔａｃ
ｔ）受容体を免疫源として使用して他のＩＬ−８受容体
の抗体を作製するいろいろの方法と共に、以下に説明さ
れる。ＩＬ−８受容体の断片又は同種物の発現を検出す
るために、好ましくは、この断片又は同種物に含まれる
エピトープを免疫源として用いて、抗体を作製する。

【００５１】組換えＩＬ−８受容体タンパク（又はその
断片もしくは同種物）が発現されたら、例えばイムノア
フイニテイクロマトグラフイを用いて単離する。一例と
して、ＩＬ−８又は抗−ＩＬ−８受容体抗体（例えば前
記のＩＬ−８受容体抗体）をカラムに付着させたものを
無傷の受容体又は受容体の断片もしくは同種物を単離す
るために使用することができる。アフイニテイクロマト
グラフイの前に受容体係留細胞の溶解及び分別を標準的
な方法（例えば前掲のＡｕｓｕｂｅｌ等の文献参照）に
よって行なうことができる。一度単離された組換えタン
パク質は、所望ならば、効率の高い液体クロマトグラフ
イ（例えば、Fisher、 Laboratory Techniques In Bioch
emistry And Molecular Biology、 Work and Burdon、 El
sevier、１９８０参照）によって更に精製してもよい。

【００５２】本発明の受容体、特に受容体の短い断片
は、（例えば、「Solid Phase Peptide Synthesis 第２
版、１９８４、The Pierce Chemical Co. Ｒｏｃｋｆｏ
ｒｄ、ＩＬに記載された方法を用いた）化学合成によっ
ても作製できる。

【００５３】ＩＬ−８受容体の結合及び機能の検定 本発明において有用な受容体の断片又は同種物は、ＩＬ
−８と相互作用する断片又は同種物である。この相互作
用は、試験管内の結合検定（下記参照）によって検出で
きる。受容体成分は、機能的にも、即ち、ＩＬ−８と結
合してＣａ⁺⁺を可動化する能力についても検定される
（下記参照）。これらの検定には、結合の検出を可能と
するように形態を定めたＩＬ−８及び組換えＩＬ−８受
容体（又は適切な断片もしくは同種物）が成分として含
まれる。

【００５４】ＩＬ−８は、ゲンザイム（Ｇｅｎｚｙｍ
ｅ）社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から入手できる。

【００５５】好ましくは、ＩＬ−８受容体成分は、本来
は実質的に受容体を示さない細胞によって、例えば受容
体成分の遺伝情報を含む核酸を適切な発現系において含
有するように、前記細胞を遺伝子工学的に処理すること
によって作製する。適切な細胞の例としては、例えば骨
髄細胞Ｊ５５８又はＳＰ２等の、組換え受容体の作製に
ついて前述した細胞である。

【００５６】好ましくは、ＩＬ−８受容体成分を発現す
る細胞を固体の基体（例えば試験管、マイクロタイター
ウエル又はカラム）に、当該技術では周知の手段（例え
ばＡｕｓｕｂｅｌ等の前掲の文献参照）によって固定さ
せ、標識されたＩＬ−８（例えば¹²⁵Ｉ−標識ＩＬ−
８）を供与することによって、検定を行なう。受容体成
分に（従って固体の基体に）関連して、検定標識によっ
て結合を検査する。

【００５７】検定フォーマットは、特異性の結合を検出
するための多くの適切なフォーマットのいずれでもよ
く、例えばラジオイムノアツセイフォーマット（例えば
前掲のＡｕｓｕｂｅｌ等の文献参照）でもよい。好まし
くは、ＩＬ−８受容体発現ベクター（前記参照）で一時
的又は安定的にトランスフエクトした細胞を固体の基体
（例えばマイクロタイタープレートのウエル）に固定さ
せ、例えば放射性標識もしくは検定可能な酵素（例えば
アルカリ性ホスホターゼ又はワサビダイコン（ｈｏｒｓ
ｅｒａｄｉｓｈ）由来ペルオキシダーゼ）によって検出
可能に標識されたＩＬ−８と反応させる。

【００５８】典型的な実験において、ＣＯＳ細胞を可変
量のＦ３Ｒ−ｐＳＶＬクローン（前記参照）によって一
時的にトランスフエクト（形質転換）した。標準的な手
法によって膜を回収し、試験管内の結合検定（前記参
照）に使用した。¹²⁵Ｉ−標識ＩＬ−８を膜に結合さ
せ、特異性の活性について検定した。標識しないＩＬ−
８の存在下に行なった結合検定との比較によって特異性
の結合を定めた。表１に結果を示す。

【表１】

【００５９】別法として、ＩＬ−８は、固体の基体（例
えばマイクロタイタープレート）に、前掲のＡｕｓｕｂ
ｅｌ等の文献による、ＥＬＩＳＡ検定のために抗原を付
着させる方法と同様の方法によって付着させ、標識され
た（例えば前掲のＡｕｓｕｂｅｌ等の文献に示されたよ
うに３Ｈ−チミジンで標識された）ＩＬ−８受容体−発
現細胞の能力を、固定されたＩＬ−８への受容体の特異
性の結合を検出するために使用することができる。

【００６０】特別の例によれば、ＩＬ−８受容体（又は
受容体の断片もしくは同種物）を発現するベクターを、
ＤＥＡＥデキストラン−クロロキン法（前掲のＡｕｓｕ
ｂｅｌ等の文献参照）によって、骨髄細胞（例えばＪ５
５８又はＳＰ２細胞）にトランスフエクト（形質転換）
する。受容体タンパクの発現は、検出可能に標識された
ＩＬ−８の細胞への結合を付与する。ＩＬ−８は、トラ
ンスフエクトされていない宿主細胞又は親ベクターのみ
を有する細胞には際立って結合されることはなく、これ
らの細胞は、結合検定のための対照用として用いられ
る。ＩＬ−８受容体発現骨髄細胞（約７５０，０００細
胞／ディッシュ）を、１２〜１８時間ポスト・トランス
フエクションして１０ｃｍ径の組織培養ディッシュに接
種する。４８時間後に０．５ｎＭ放射性ヨウ素で標識し
たＩＬ−８（２００Ｃｉ／ｍモル）を３個のディッシュ
に培養し、（例えば細胞を回収し、細胞に組合された検
出可能な標識の量を検出することによって）受容体を保
持する細胞への結合を検定する。標識ＩＬ−８に特異的
に結合する細胞は、対照細胞に比べて大きな結合レベル
（即ち検出可能な標識の量）を示す細胞である。

【００６１】別法としては、（後述のように作製され
る）ＩＬ−８受容体の遺伝情報を含むＲＮＡを標準法に
よってアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖ
ｉｓ）卵胞子に注入する。ＲＮＡを生体中において卵胞
子に翻訳し、ＩＬ−８受容体タンパクを細胞膜に挿入す
る。（「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａ
ｎｓｌａｔｉｏｎ」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、オクスフォー
ド、１９８６に記載のＣｏｌｍａｎ法による）スクロー
ス匂配遠心分離によって、卵胞子膜を、ＩＬ−８の結合
を試験するために作製し、¹²⁵Ｉ標識ＩＬ−８を添加
し、膜調製物を、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）ＧＦ／
Ｃフィルターを用いて（「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」
２７：５３７１、１９８８、Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎの方
法によって）真空ロ過する。

【００６２】ＩＬ−８依存のカルシウムの可動化を媒介
する能力について組換え受容体を機能的に検定すること
もできる。（前述したように）ＩＬ−８発現ベクターに
よってトランスフエクトした細胞、好ましくは骨髄細胞
に、ＦＵＲＡ−２又はＩＮＤＯ−１を標準法によって負
荷する。前述した蛍光分光分析（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃ
ｚ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３４４０、１
９８５）に従って、ＩＬ−８によって誘導されたカルシ
ウムの可動化を測定する。

【００６３】ＩＬ−８受容体拮抗薬に関するスクリーニ
ング 前述したように、本発明の１つの視点は、ＩＬ−８とＩ
Ｌ−８受容体との間の相互作用に拮抗することによって
この相互作用によって仲介される一連の事象を防止し又
は軽減する成分（ないし化合物）のスクリーニングであ
る。スクリーニングの要素は、結合の検出を可能とする
ように形態を定めたＩＬ−８及び組換えＩＬ−８受容体
（又は前述した適切な受容体断片もしくは同種物）であ
る。前述したように、ＩＬ−８は、ゲンザイム（Ｇｅｎ
ｚｙｍｅ）社から入手でき、兎又はヒトの全長の受容体
（又はＩＬ−８結合断片もしくは同種物）は、前述した
ようにして調製できる。

【００６４】ＩＬ−８のその受容体への結合は、前述し
た方法のいずれかに従って検定できる。好ましくは、組
換えＩＬ−８受容体（又は適切なＩＬ−８受容体断片も
しくは同種物）を発現する細胞は、固体の基体（例えば
マイクロタイタープレートのウエル又はカラム）上に固
定させ、検出可能に標識された前記のＩＬ−８と反応さ
せる。受容体成分（従って固体の基体）と組合せた検出
標識によって固定を検定する。受容体を保持する細胞へ
の標識されたＩＬ−８の結合は、拮抗薬の検定の測定の
ための対照用である。拮抗薬の検定には、適切な量の候
補拮抗薬と共にＩＬ−８受容体を保持する細胞を培養す
ることが含まれる。この混合物に標識されたＩＬ−８の
等量を添加する。本発明において有用な拮抗薬は、固定
された受容体発現細胞との標識ＩＬ−８の結合に特異的
に干渉する。

【００６５】次にＩＬ−８機能に干渉する能力、即ち、
通常受容体によって仲介されるシグナルの変換を生起さ
せずに標識ＩＬ−８の結合に特異的に干渉する能力につ
いて、拮抗薬の試験を行なう。機能検定を用いてこの試
験を行なうために、ＩＬ−８受容体を含有する、安定的
にトランスフエクトされた細胞系を、本明細書中に記載
したように作製し、リポーター化合物例えばカルシウム
結合剤ＦＵＲＡ−２を標準的な手法によって細胞質に負
荷させることができる。ＩＬ−８又は他の作用薬（アゴ
ニスト）によって非対応ＩＬ−８受容体を刺激すると、
細胞間カルシウムが放出されると共に、カルシウム−Ｆ
ＵＲＡ２複合体に蛍光を生ずる。これは作用薬の活性を
測定する便利な手段を提供する。ＩＬ−８と共に潜在的
な拮抗薬を含めることによって、スクリーニングがなさ
れ、蛍光を生ぜずに（即ち細胞間Ｃａ⁺⁺の可動化を生ぜ
ずに）ＩＬ−８の結合を有効に阻害するものとして、真
正の受容体拮抗薬が特定される。この拮抗薬は、炎症性
疾患に体する有用な治療薬として期待される。

【００６６】適切な候補拮抗薬には、ＩＬ−８受容体断
片、特に、前記のように、膜通過セグメント２−７を含
めて、又はこれに隣接して、ＩＬ−８結合部位、或いは
受容体の細胞外ドメインを有する断片がある。これらの
断片は、好ましくは、５個以上のアミノ酸を有する。そ
の他の候補化合物には、ＩＬ−８の同種物、他のペプチ
ド、非ペプチド化合物並びに抗−ＩＬ−８受容体抗体で
あって、受容体の解析から作成又は誘導されるものが含
まれる。

【００６７】抗ＩＬ−８受容体抗体 ヒト又は兎ＩＬ−８受容体（又は免疫原断片もしくは同
種物）は、本発明において有用な抗体を培養するために
使用することができる。 前述したように、抗体を産生
する上に好ましい受容体の断片は、細胞外であることが
推定されるか又は実験的に示される断片である。

【００６８】ＩＬ−８受容体ペプチドに向けられた抗体
は次のように製造される。推定的な細胞外ループに対応
するペプチド（アミノ酸９４−１１３、１８６−２０２
及び２６８−２８５）は、標準的な手法によってペプチ
ド合成剤を用いて製造される。これらのペプチドは、ｍ
−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエス
テル（m-maleimide benzoic acid N-hydroxysuccinimid
e ester）によってＫＬＨに結合される。ＫＬＨ−ペプ
チドをフロイント（Ｆｒｅｕｎｄ）のアジュバントと混
合し、ギニア豚又は兎に注射する。ペプチド抗原のアフ
ィニティクロマトグラフィによって抗体を精製する。こ
の方法を用いて抗体を培養し、アミノ酸９４−１１３を
含むペプチドを得る。

【００６９】作成した抗体を、ウエスターンブロット
（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）法又は免疫沈降分析（前
掲のＡｕｓｕｂｅｌ等によって示された方法）によっ
て、ＩＬ−８受容体の特異性認識について試験する。Ｉ
Ｌ−８受容体を特異的に認識する抗体は、有用な拮抗薬
として期待される候補化合物である。これらの候補化合
物は、ＩＬ−８とＩＬ−８受容体との相互作用に特異的
に干渉する能力について（前述したように）更に試験さ
れる。ＩＬ−８／ＩＬ−８受容体の結合又はＩＬ−８受
容体の機能に拮抗する抗体は、本発明において拮抗薬と
して有用と考えられる。

【００７０】治療 炎症性疾患の処置のための特に適切な治療薬は、生理的
食塩水のような適宜の緩衝液中において調製した前述の
可溶性の拮抗性受容体断片である。膜界面における受容
体の構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を模擬すること
が特に望まれる場合には、十分な数の隣接膜通過残基を
断片に含めることができる。この場合には、適切な脂質
フラクションに断片を組合せることができる（例えば断
片を脂質小胞中に存在させたり、細胞膜を中断させて得
た断片に固着させたりしてもよい）。別法として、前記
のようにして得た抗−ＩＬ−８受容体抗体を治療薬とし
て使用することができる。抗体も、薬理学的に容認可能
な緩衝液（例えば生理的食塩水）中において投与するこ
とができる。適切ならば抗体の調製物に適宜のアジユバ
ントと組合せることができる。

【００７１】治療用調製物は、処法にしたがって投与す
る。普通は、この調製物は、ＩＬ−８との結合との適切
な拮抗を与える用量において静脈内投与する。別法とし
て、経口的、径鼻的又は局所的に、例えば液又はスプレ
ーとして治療薬を投与することが適切である。この場合
の用量は前述と同様である。疾病の徴候の軽減に必要な
回数治療を反復して行なう。炎症の治療のためだけでな
く、その予防のためにも、拮抗薬を投与することができ
る。拮抗薬は、前述したように投与する。

【００７２】ＩＬ−８受容体は、炎症に関係のある好中
球の活性化に関与するので、好中球が主役を演ずる種々
の炎症性の疾患、例えば乾癬、慢性関節リウマチ及び他
の慢性の疾患又は急性の炎症性疾患例えば再灌流障害の
治療又は予防のために使用しうる。

【００７３】本発明による方法は、種々の哺乳動物例え
ばヒト、ペット又は家畜において、炎症性の応答を軽減
するために使用しうる。ヒト以外の哺乳動物を処置する
場合には、ＩＬ−８受容体、受容体断片、同種物又は抗
体は、その種に特異性のものを使用することが好まし
い。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、兎ＩＬ−８受容体の核酸の配列及び推
定されるアミノ酸配列を示す配列図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｐ 8310−2Ｊ 33/566 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】組換えＩＬ−８受容体ポリペプチド。
2. 【請求項２】図１に示したアミノ酸配列と実質的に同一
   のアミノ酸配列を含む請求項１記載の組換えＩＬ−８受
   容体ポリペプチド。
3. 【請求項３】ＩＬ−８と結合しうるドメインを含むＩＬ
   −８受容体の断片又は同種物である実質的に単離された
   ポリペプチド。
4. 【請求項４】該受容体が哺乳動物から誘導された請求項
   １又は３記載のポリペプチド。
5. 【請求項５】前記哺乳動物がヒトである請求項４記載の
   ポリペプチド。
6. 【請求項６】前記哺乳動物が兎である請求項４記載のポ
   リペプチド。
7. 【請求項７】ＩＬ−８受容体の膜通過領域又はＩＬ−８
   細胞外領域の全部又はＩＬ−８結合部分を含むポリペプ
   チド。
8. 【請求項８】組換えポリペプチドであることを特徴とす
   る請求項７記載のポリペプチド。
9. 【請求項９】請求項１、３又は７のポリペプチドの遺伝
   情報をコードする精製ＤＮＡ。
10. 【請求項１０】前記ＤＮＡがｃＤＮＡである請求項９記
    載の精製ＤＮＡ。
11. 【請求項１１】前記ｃＤＮＡが兎のＩＬ−８受容体の遺
    伝情報をコードする請求項１０記載の精製ＤＮＡ。
12. 【請求項１２】前記ｃＤＮＡがヒトのＩＬ−８受容体の
    遺伝情報をコードする請求項１０記載の精製ＤＮＡ。
13. 【請求項１３】前記ｃＤＮＡがＦ３Ｒプラスミド中に含
    まれる請求項１１記載の精製ＤＮＡ。
14. 【請求項１４】前記ｃＤＮＡが４Ａｂプラスミド中に含
    まれる請求項１２記載の精製ＤＮＡ。
15. 【請求項１５】請求項９記載のＤＮＡを有するベクター
    であって、前記ＤＮＡによって遺伝情報がコードされる
    タンパクの、当該ベクターを有する細胞中においての発
    現を指示することができるベクター。
16. 【請求項１６】請求項１５のベクターを有する細胞。
17. 【請求項１７】真核細胞である請求項１６記載の細胞。
18. 【請求項１８】哺乳動物の細胞である請求項１７記載の
    細胞。
19. 【請求項１９】骨髄細胞である請求項１８記載の細胞。
20. 【請求項２０】組換えＩＬ−８受容体ポリペプチド又は
    その断片もしくは同種物を製造する方法において、 当該細胞中において発現されるように位置されＩＬ−８
    受容体又はその断片もしくは同種物の遺伝情報をコード
    するＤＮＡによって形質転換された細胞を用意し、 該ＤＮＡを発現させる条件のもとに、該形質転換された
    細胞を培養し、 該組換えＩＬ−８受容体ポリペプチドを単離することか
    ら成る製造方法。
21. 【請求項２１】請求項１〜３のいずれか一に記載のポリ
    ペプチドに優先的に結合する精製された抗体。
22. 【請求項２２】請求項１〜３のいずれか一に記載のポリ
    ペプチドの生体中の生物学的活性を中和させる請求項２
    １記載の抗体。
23. 【請求項２３】請求項１、３又は７のいずれか一に記載
    のポリペプチドあるいは請求項２１又は２２記載の抗体
    を活性成分として含み、該活性成分は、生理学的に容認
    可能な担体中において調製される医療用組成物。
24. 【請求項２４】前記活性成分が細胞膜中に係留された請
    求項１、３又は７のいずれか一に記載のポリペプチドで
    ある請求項２３記載の医療用組成物。
25. 【請求項２５】ＩＬ−８とＩＬ−８受容体との間の相互
    作用に拮抗する有効量において、請求項２３又は２４記
    載の医療用組成物を哺乳動物に投与することから成る哺
    乳動物の炎症の減少方法。
26. 【請求項２６】ＩＬ−８とＩＬ−８受容体との間の相互
    作用に拮抗する能力について候補成分をスクリーニング
    する方法において、 ａ）請求項１の組換えＩＬ−８受容体ポリペプチド又は
    請求項３のＩＬ−８受容体の断片もしくは同種物を含む
    第１成分及びＩＬ−８を含む第２成分を、候補拮抗化合
    物と混合し、 ｂ）該第１成分と第２成分とが結合するか否かを定め、 ｃ）該第２成分との該第１成分の結合に干渉して、ＩＬ
    −８により仲介される細胞間Ｃａ⁺⁺の放出を減少させる
    候補拮抗成分を拮抗成分として特定することから成るス
    クリーニング方法。