JPH0588424B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は乾式分析に有効な生物活性物質分析素
子に関する。 従来技術 層状（シート状）に構成されたいわゆる乾式分
折要素を用いて、試料液中の生物活性成分を検出
定量する分析システムは既に多数知られている
（米国特許第3050373号等）。それらの分析方法に
おいて一般的に利用されているのは、試料液中に
含まれている分析対象成分（アナライト）との接
触により物理的もしくは化学的な反応を起こす反
応性成分を予め分析要素の中に含有させておき、
分析要素内に導入されたアナライトと前記反応性
成分との反応を分析要素内に設けられた反応層に
おいて進行させ、その反応生成物あるいは未反応
成分などの量を分光的、蛍光的にあるいは放射性
同位元素を用いる方法などによつて測定し、アナ
ライトの定量を行う方法である。 以上のような乾式分析方法は分析操作が比較的
簡便であるため、たとえば、抗原・抗体反応を利
用する免疫学的分析、酵素反応を利用する酵素あ
るいは基質の分析など多くの目的に利用されてい
る。しかしながら、分析要素を用いる方法は一般
的に簡便であるとの利点がある一方、分析の感度
が充分でないとの欠点を有している。 本発明者等は先に生物活性物質との反応に関与
する活性物質を固定化した微粒子状物質を繊維質
素材に分散してなる反応層をもつ分析要素を提案
し（特願昭57−211382）、反応に充分な量の試料
液を保液する機能をこの反応層に賦与することに
よつて上記の欠点を解消した。上記の反応層は通
常分析要素の一部として従つて種々の分析機能層
と共に積層一体化されて分析に供されるのである
が、各層はいわゆる流体接触の状態にあり、その
ような状態での界面における液の移動は不均一と
なりがちである。液の界面移動が不均一であれば
いかに保液機能を高めたとしても分析の定量性が
損なわれるおそれがある。また種々の分析目的に
対応できる機能層と組あわせるためできるだけ薄
層化することも必要である。しかしただ単純に薄
層化だけを達成しても実際の取り扱い（ハンドリ
ング）上極めて不便である。 従来技術においては分析要素を構成する各層は
単に重ね合わせて加圧するか、一体型と称するも
のであつてもバインダーあるいはこれに準ずる物
質を使用して塗布又は加圧により形を整えるので
各層は流体を介して接触している。本発明にいう
一体型とは後述するように従来の流体接触による
ものではなく特殊な界面状態を呈することによる
層形成をいう。 なお繊維質素材を使用した反応層はすでに特開
昭57−196153に開示されているが、そこでは酵素
などの生物活性物質との反応に関与する活性物質
が繊維そのものに直接固定化されている。このよ
うな反応層においては固定化される活性物質量の
コントロールが困難である。 発明の目的 本発明の目的は保液機能を維持しつつ可及的に
薄層化したしかもハンドリングの容易な一体型の
生物活性物質分析素子を提供することにある。 発明の構成 本発明の生物活性物質分析素子（以下、単に分
析素子と呼ぶことがある）は、生物活性物質との
反応に関与する活性物質が固定されている微粒子
状物質と繊維質素材とからなる複合多孔性反応層
及び繊維質素材からなる単一多孔性支持層の少な
くとも二層から構成され、複合多孔性反応層の繊
維質素材と単一多孔性支持層の繊維質素材とが、
それらの層間の界面にて相互に絡み合うことによ
り、両層が結合されていることを特徴とする。 なお、上記の本発明の生物活性物質分析素子の
単一多孔性支持層は、微粒子状物質と繊維質素材
とからなる複合多孔性支持層に替えることもでき
る。 本発明の分析素子は前記の生物活性物質との反
応に関与する活性物質が固定化された微粒子状物
質を含む複合多孔性反応層と単一多孔性支持層と
が少なくとも二層一体化してなる構成をその基本
構造とするものである。本発明の分析素子におい
て二層が相接する界面は両層を構成する繊維質素
材が相互に三次元的に絡み合つたランダム構造を
形成している。その三次元的ランダム構造は化学
的なものではなく単に物理的なものであるが充分
に強固であり、その界面状態を破壊することなく
元の二層に分離することはできない。 本発明の分析素子を構成する一の層は、生物活
性物質との反応に関与する活性物質がその活性を
保持した状態で固定化されている微粒子状物質を
繊維質素材からなる多抗性構造体に分散含有した
構成をもつ複合多孔性層である。活性物質を固定
化した微粒子状物質は繊維質素材の構造体が形成
する空間に略均一に配置されている。 他の一層は最も基本的には繊維質素材のみから
構成されるので、本明細書ではしばしば単一多孔
性支持層と呼ぶ。この単一多孔性支持層には更に
微粒子状物質を分散含有せしめ、これによつて各
種化合物を担持させて複合多孔性支持層としても
よい。このような場合には後述するように分散素
子の分析機能を改善拡大することができる。従つ
て本発明の分析素子では微粒子状物質と繊維質素
材との乾燥重量比が１：20から１：0.3の範囲に
あり、かつ微粒子状物質が１−60ｇ／m²の割合で
含まれることが好ましい。 本発明において利用することができる繊維質素
材としては、それが試料液もしくはアナライトと
実質的に反応しないものであれば特に制限はない
が、一般には、ガラス繊維、石綿などの無機繊
維、木綿、麻、パルプ、絹などの天然有機繊維、
ビスコースレーヨン、銅アンモニアレーヨン、セ
ルロースアセテート、部分ホルマール化ポリビニ
ルアルコール、ポリエチレン、ポリプロピレン、
ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエステル類
（例、ポリエチレンテレフタレート等）などの半
合成繊維、合成繊維が好ましい。この中でもガラ
ス繊維は特に好ましい繊維質素材である。 これらの繊維質素材は約0.1〜5μｍの太さ、約
100〜4000μｍの長さをもつものが本発明の目的
に有利であり、常法により例えば10〜200メツシ
ユ（タイラー規格）程度のフルイを用いて分級す
ることにより所望の繊維質素材を得ることができ
る。 繊維質素材は測定光をカツトできる波長に吸収
帯を有する染料（例えば反応性染料，建染染料な
ど）で直接染色してこれに光しやへい機能を賦与
することができる。 本発明において利用することができる微粒子状
物質としては、それが試料液もしくはアナライト
と実質的に反応しないものであれば特に制限はな
いが、一般的には、アガー、アガロース、セフア
ロース、セフアデツクス、デキストランなどの多
糖類；ポリアクリルアミド、または重合可能なエ
チレン系モノマーの（もしくは共重合により形成
された）ラテツクス；セルロースパウダーなどの
非繊維質微粒子状物質が好ましい。特に、アガ
ー、アガロース、セフアロースのような非繊維質
微粒子状物質は、生物活性物質分析素子の厚さ当
たりの保液量を増大させることができるので好ま
しい。 該微粒子状物質はその短径（幅、あるいは厚
さ）と長径（長さ）との比が１：１から１：20の
範囲にある棒状物質であることが望ましい。その
形状に特別の限定はなく、球状、円錐、角錐、円
柱あるいはそれらの中間的な形状、それらが複合
された形状など任意の形状をとることができる。
これら微粒子状物質は一般的に約10〜200μｍの
平均粒径をもつものが好都合である。 単一多孔性支持層に微粒子状物質を含有させて
複合多孔性支持層とする場合にはこれに繊維質素
材を染色するのに例示したと同様の染料を結合さ
せたり、粒子中に着色顔料（例えばTiO₂，ZnO，
BaSO₄等の白色粉末，アルミニウムなどの白色
又は金属光沢をもつ粉末）を含ませることにより
光しやへい機能を与えることができる。 上記微粒子状物質に固定化される生物活性物質
との反応に関与する活性物質としては免疫反応、
酵素反応、受容体−被受容体結合反応、補体結合
反応、生物学的凝集反応などの生物活性物質との
反応に関与するすべての物質を使用することがで
き、そのいずれを使用するかはアナライトが決ま
れば自ずから決定される性質のものである。 又生物活性物質との反応に関与する活性物質は
上記微粒子状物質に固定化された状態で単一多孔
性支持層に分散されていてもよいしあるいは複合
多孔性支持層及び単一多孔性支持層以外に設けた
独立の補助層に含有させてもよい。このような構
成はアナライトが複数の反応系を経て検知シグナ
ルを生成する場合に特に有用である。例えばグル
コースをアナライトとする場合、第一の複合多孔
性支持層にグルコースオキシダーゼ固定化粒子を
含有させて過酸化水素を生成せしめ、これを補助
層としての第二の複合多孔性支持層あるいは同様
の機能を賦与した単一多孔性支持層に含有させた
粒子に固定化したペルオキシダーゼで発色させる
反応系等である。 以上のような基本的構成をもつ一体型分析素子
は次のような方法によつて容易に製造できる。 (1) (イ) まず生物活性物質との反応に関与する活
性物質を常法により微粒子状物質に固定化す
る。固定化及びこの操作に付随する操作（標
識等）は本発明者らの前記先願あるいは生化
学実験講座、第１巻「タンパク質の化学」、
第２巻「核酸の化学」、第３巻「脂質の化
学」、第４巻「糖質の化学」（日本生化学会
編、東京化学同人、昭和52年刊）、エンザイ
ムイムノアツセイ（宮井潔著、臨床検査、
Vo1・22、No・11、1978年、臨時増刊）、酵
素免疫測定法（石川、他編、医学書院、1978
年刊）などに記載されている。 この段階で固定化された物質の活性量を知
ることができ、必要ならば固定化微粒子状物
質の量を加減することにより所望の活性量に
調製する。 (ロ) 繊維質素材をばらばらにほぐし、必要なら
ふるい分け等でその長さを調整する。 (ハ) (イ)で得られる微粒子状物質と(ロ)で得られる
繊維質素材とを液性分散媒（例えば水、水と
水相溶性有機溶媒との混合物）中に上記の割
合で分散してスラリー（紙料液）を調製す
る。その際分散媒を適宜選択することにより
あるいは水可溶性の溶質（例えばシヨ糖等）
を添加することにより所望の比重及び粘度を
もつたスラリーを得ることができる。これら
分散媒や添加物質の選択は公知の密度勾配法
等に準じて行う。 スラリーの調製に際しては生物活性物質分
析素子の機能を損なわない限り分散剤、粘度
調整剤、防腐剤など一般の抄紙作業に用いら
れる各種の薬剤を任意に添加してもよい。ス
ラリーの調整方法についても特に限定はな
く、例えば、マグネチツクスターラー、攪拌
ばね、ホモゲナイザー、ボールミルのような
通常の混和装置を用いる方法、ビーターのよ
うなスラリーの製造において一般的に用いら
れる方法など各種の任意の方法を利用するこ
とができる。 (2) 一方上記(1)(ロ)と同様にして、繊維質素材をば
らばらにほぐし必要ならその長さを調整する。
得られた繊維質素材をほぐした状態でそのまま
あるいは繊維そのものに所望の分析機能（例え
ば光しやへい機能を付与するため繊維そのもの
を着色する等）を与えた後、(1)(イ)と同様にして
スラリーを作製する。この際上記の分析機能を
繊維そのものに付与する代わりに前記微粒子状
物質にこれを代替させてもよい。後者の場合の
方が着色の効率、種々の機能をもつた広範囲に
わたる物質の担持などにおいてむしろ好都合で
ある。微粒子状物質の使用割合、繊維質素材へ
の分散、スラリー比重や粘度の調整は(1)(ハ)の場
合と同様である。 (3) (1)及び(2)で得られるスラリーが互いに混じり
合わない状態の界面を形成することを確認す
る。両スラリーが混じり合わない状態とするに
は両者に適当な比重差を設けるのが最も一般的
であり、この目的のためには公知の密度勾配法
等を適用することができる。また両者が混じり
合わない状態は比重差だけでなく水溶性ポリマ
ー（いわゆる増粘剤：例えば合成ポリマー、重
合性モノマー、ガム、多糖類など）を添加する
ことによつて両スラリー間に適当な粘度差を与
えることによつても実現することができる。 以上は両者が湿潤状態にある場合の条件であ
るが、一方が乾燥状態であれば自ずから混じり
合わない状態となり必ずしも前記の条件を設定
する必要はない。 (4) 上記のごとく両者が互いに混じり合わないよ
うに調製したスラリー二種を容器に入れ抄紙す
る。具体的には高比重（及び／又は高粘度）の
スラリーが下層を、低比重（及び／又は低粘
度）のスラリーが上層を形成しておりろ過器
（長網、丸網、抄紙用の網、ミリポアフイルタ
ーなど）を通して吸引し分散媒を除く。この抄
紙過程でスラリー中の繊維が両層の界面で相互
に絡みあい三次元的ランダム構造を形成する。 上記抄紙工程は両層が湿潤状態にある場合で
あるが、先に一層のみの抄紙を行いこれを乾燥
したのち、他層を形成するスラリーの上に重置
して抄紙操作を繰り返しても同様の界面をもつ
た層状体が得られる。この操作手順は分析素子
を二層以上に構成する場合には特に好都合であ
る。以上要するに二つの繊維質素材が形成する
界面を抄紙によつて形成する場合、少なくとも
一方の繊維質素材がスラリーとしてランダムに
分散されている状態をとつていれば、相互に三
次元的に絡みあつた構造が界面において実現さ
れるのである。 (5) 次いでこの層状体を一定のクリアランスを有
する部材を用いてその厚さを規定する。例え
ば、該層状体を二枚の平板の間に挟んで一定の
厚さになるまで圧縮する、該層状態を一定のス
リツトを有するローラーの間を通過させる等各
種の方法を利用することができる。その詳細は
本発明者らの前記先願に記載されている。この
ようにして層状体の厚さを、好ましくは100〜
2000μｍの範囲に規定したのち、その厚さを実
質的に変えることなく乾燥を行う。 そのような目的のためには乾燥は比較的低温
で行うのが好ましく、特に凍結乾燥は、上記の
様にして調整された層状体の中に、微粒子状物
質に固定された状態で含まれている生物活性物
質との反応に関与する活性物質をその活性を保
持した状態で乾燥するためにも好ましい方法で
ある。 乾燥は厚さ規定の前に行つてもよい。 以上本発明の分析素子の構造及び製造について
は二層が一体化した分析素子について説明した
が、本発明は二層構成の分析素子に限定されるも
のではなく、更に三層以上の構成をとつてよい。
その構成はアナライトそれぞれに必要な機能によ
りあるいは反応系のメカニズムまた測定系により
決定される。 さらにまた分析素子の機械的強度を補強する目
的で複合多孔性支持層と単一多孔性支持層との間
に網目構造体を挿入することができる。この網目
構造体としてはナイロン、ポリエステルなどのネ
ツト、プランクトン用ネツト、ヴエールなどが好
ましく用いられる。網目構造体はもちろん界面に
おける繊維同志の三次元的絡みあいを妨げない大
きさの網目をもつていなければならない。 本発明においては抄紙工程で微粒子状物質が剥
落するのを防ぐために繊維質素材のみから構成し
た保護層を分析素子の単一多孔性支持層側に設け
てもよい。 本発明の反応層は単独でも分析要素として用い
ることができるが、分析の精度を上げるために
は、複数の層が積層された構成からなる多層分析
要素の形態を利用することが望ましく、本発明者
らの前記先願に記載のように構成して利用するの
が望ましい。 本発明の分析素子を組みこんだ多層分析要素は
実際の分析に際し、例えば以下のように適用され
る。多層分析要素の通常最上層に位置する分析素
子もしくは分析素子の上部に位置する補助層（例
えばろ過層、展開層、試薬層等）にアナライトを
含有する試料液を一定量滴下する。分析素子のな
かで固定化した活性物質に対応する反応が生じア
ナライト量に相当するシグナルが発生する。この
発生シグナルを常法により測定する。 以下実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明
するが本発明はこれに限定されるものではない。 実施例１ ヒト・IgG測定用分析素子の調製 抗ヒト・IgG・ウサギIgG固定化アガロース
の調製 抗ヒト・IgG・ウサギIgG（マイルスラボラトリ
ー製）10mgを0.5M食塩含有の0.1M炭酸水素ナト
リウム緩衝液（PH8.5）20mlに溶解し、あらかじ
め1mMHClで洗浄したCNBr活性化セフアロー
ス4B（フアルマシア・フアイン・ケミカルズ製）
膨潤ゲル100mlと混合する。４℃で攪拌下16時間
反応させる。反応終了後ガラスフイルター上で反
応液をろ別する。次いでゲルを1Mモノエタノー
ルアミン−塩酸液（PH8.5）50mlと混合し、４℃
で攪拌下２〜３時間反応させる。反応終了後、
1M食塩を含む0.1M酢酸緩衝液（PH4.0）と同じ
く1M食塩を含む0.1Mほう酸緩衝液（PH8.0）を
用いて、常法により交互に３回ゲルを洗浄する。
最後に0.1％窒化ソーダ及び0.1M食塩含有の0.1M
グリシン緩衝液（PH8.0）で洗浄した後同じ緩衝
液中で保存する。 ヒト・IgG測定用分析素子の調製 ガラス繊維ろ紙GA−100（東洋ろ紙製）を約２
mm角に裁断しそれを水に懸濁破砕する。次いでタ
イラー規格・標準フルイメツシユNo.32とメツシユ
No.16とを用いてふるいわけ、16メツシユを通過す
るが32メツシユを通過しないガラス繊維分散物を
作成した。 分散物中の固形分重量を知るために、予め分散
物10mlを0.45μｍの孔径を有するミクロフイルタ
ー（富士写真フイルム製）上でろ過し、凍結乾燥
後ミクロフイルターを取り除いてその重量を測定
したところ、固形分重量は7.0mgであつた。 上記分散物150ml（固形分105mg）を取り、これ
に30％グリセリン溶液250mlを加え攪拌混合して、
スラリーＡとした。次に同様にして、上記ガラス
繊維分散物100ml（固形分70mg）、水100ml及び
で調製した抗ヒト・IgG・ウサギIgG固定化セフ
アローズ３ml秤取し、攪拌混合してスラリーＢと
した。 142mm径のミリポアー製フイルターろ過器に、
0.45μｍ孔径のミクロフイルター（富士写真フイ
ルム製）を取り付け、さらに同じくミリポアー製
のアクリルシリンダーをその上に取りつけた装置
に、スラリーＡ及びＢをこの順に静かにそそぎ込
み比重差のある二つの層を形成する。二層が互い
に混じり合わない界面を形成していることを確認
した後、およそ100mmHgの圧力差で減圧ろ過を行
い分析素子を抄紙成型した。 ろ過後平らなステンレス製金網上でミクロフイ
ルターごと凍結させた後凍結乾燥する。乾燥後
250μｍの間げきを有する２枚のステンレス製平
板ではさみつけて成型し、ヒトIgG測定用分析素
子（）を得た。 上記操作において、抗ヒト・IgG・ウサギIgG
固定化セフアローズゲルのかわりに、抗体を固定
していないセフアローズ4B（フアルマシア・フア
イン・ケミカルズ製）を同量加えて調製したスラ
リーＢを用いた他は同じ操作を繰り返して分析素
子（）を作成した。 また、本発明の分析素子（）と比較するため
に、同量の抗ヒト・IgG・ウサギIgGが分析素子
全体に均一に分散している素子を以下のようにし
て調製した。 まず前述のガラス繊維分散物250ml（固形分175
mg）とで調製した抗ヒト・IgG・ウサギIgG固
定化セフアローズゲル３mlとを攪拌混合して得ら
れたスラリーを同じフイルターろ過器でろ過抄紙
し、同様に凍結乾燥し成型して分析素子（）を
得た。 同様にガラス繊維分散物100ml（固形分70mg）、
水100ml及び抗体固定化セフアローズゲル３mlか
らなるスラリーを同じ操作でろ過抄紙し、凍結乾
燥して得られた単一層のものは、ミクロフイルタ
ーを除去するとわずかな外力で破壊され易く、分
析素子としては、取り扱い上不適当であつた。 分析素子の性能評価 で調製した分析素子（），（）及び（）
から13mmφの試料片を10枚ずつ切り抜き、テフロ
ン板の上に並べた。FITC標識ヒト・IgG（カツペ
ル研究所製）を10μｍ／mlの濃度で含有する２％
ヒト血清アルブミン溶液（0.1MNaCl−0.1Mグリ
シン−Na緩衝液 PH9.0）を80μlずつ注下して上
記各試料片に含浸させ30℃で10分間反応させた。
正確に10分経過後減圧状態にあるフイルターろ過
器上のミクロフイルター（0.45μｍ孔径、富士フ
イルム製）の上に、各試料片を移しかえて未反応
FITC・ヒト・IgGを除去した。 次に各試料片を、石英板（２×３cm）上に移
し、上記グリシン緩衝液80μを注下含浸させた
後、日立製作所製、850型分光蛍光光度計を用い
て励起波長492nm、蛍光測定波長525nmで相対蛍
光強度を測定した。各試料につき、平均値（−
と標準偏差（σ）を算出した。 得られた結果を第１表に示す。

【表】 第１表より、同一抗体量においては本発明の分
析素子（）の反応性が優れていることが明らか
である。 実施例２ グルコース測定用分析素子 グルコースオキシダーゼ固定化セフアロース
の調製 実施例１−と同様の操作により、抗ヒト・
IgG・ウサギIgG溶液のかわりにグルコースオキ
シダーゼ（シグマケミカル製）100mgを0.1M重炭
酸ナトリウム緩衝液（0.5M−食塩含有、PH8.5）
10mlに溶解した溶液におきかえて、グルコースオ
キシダーゼ固定化セフアローズゲル（GOD固定
化セフアローズゲル）を調製した。 グルコース測定用分析素子の調製 実施例１−と同様の方法で調製したガラス繊
維分散物（固形分含量10mg／10ml分散液）120ml
（固形分120mg）と粒子サイズが約50〜100μｍの
マイカを主成分とするパールピグメントTP−900
（帝国化工製）200mgとを攪拌混合してスラリーを
作成した。こうして得られたスラリーを実施例１
−で用いたと同じフイルターろ過器でろ過抄紙
した。この際抄紙物の機械強度を増強するため
に、減圧抄紙に先だつてスラリー液面にナイロン
メツシユ（孔径約１mmの六角成型布（東レ）
Toray(株)製）を予めアクリルシリンダー内径120
mmφより小さい径115mmφに裁断しておく）を浮
かせた後で抄紙を行つた。実施例１−と同様に
凍結乾燥してナイロンメツシユ付の反射機能を有
する補助層を得た。 次に上記と同じガラス繊維分散物70ml（固形分
70mg），蒸留水100ml及びで調製したGOD固定
化セフアローズゲル３mlを攪拌混合してスラリー
を調製した。上記と同じフイルターろ過器及びミ
クロフイルター（0.45μｍ孔径）を用い同様の方
法でろ過抄紙した。その際スラリー表面に上記ナ
イロンメツシユ付反射補助層をナイロンメツシユ
をスラリー側にして浮かせて、ろ過抄紙した。こ
れを凍結乾燥後、250μｍのクリアランスを有す
るステンレス平板で圧力成型し、分析素子（）
を得た。 比較のため、COD固定化セフアローズゲルを
セフアローズ4Bゲル（フアルマシア・フアイ
ン・ケミカルズ製）の同量で置き換え、その他は
同一条件で調製した分析素子（）を得た。 グルコース測定用分析素子の使用例（検量線
作成例） 西洋ワサビから調製したペルオキシターゼ（シ
グマケミカルズ製）10000ユニツトとオルトフエ
ニレンジアミン（和光純薬製）５ｇ（メタノール
溶液10ml）及びゼラチン硬化剤0.2ｇを10wt％石
灰処理ゼラチン溶液100mlと混合し、グロー放電
処理した180μｍの厚みを有するPET透明支持体
上に乾燥厚10μｍになるように塗布流延した。こ
れを乾燥して試薬層を調製した。 皮抜きポンチを用いて上記試薬層を13mmφの大
きさに打ち抜いたものと、同じく13mmφに打ち抜
いたで調製した（）及び（）を、ゼラチン
試薬層側と反射補助層とが相接するように積層し
て分析要素を組み立てた。 次にグルコースをそれぞれ０，５，10，20，
50，100，500mg／dlの濃度に含有する0.1Mりん
酸緩衝液（0.9％食塩含有）を調製し、それぞれ
の分析素子（）及び（）を用いて調製した分
析要素に各75μlずつ注下、含浸させ30℃で反応さ
せた。正確に10分経過後、富士写真フイルム製反
射濃度計を使用して青色光を用いて各分析要素試
料についてPET透明支持体側からその光学濃度
を測定した。その結果を第２表に示す。

【表】 第２表より明らかなように本発明の分析素子を
用いると各グルコース濃度に応じて良好な検量線
が得られた。 実施例３ トリプシン測定用分析素子の調製 Ｌ−フエニルアラニル−Ｌ−セリル−Ｌ−ア
ルギニン−４−メチルクマリル−７−アミド固
定化セフアロースの調製 10mgのｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−フエ
ニルアラニル−Ｌ−セリル−Ｌ−アルギニン−４
−メチルクマリル−７−アミド（ｔ−BOC−Phe
−Ser−Arg−MCA：蛋白質研究奨励会製）を10
mlの98％ギ酸に溶解する。この溶液に12N塩酸を
0.5ml添加し攪拌する。室温で１時間反応させた
後、凍結乾燥する。残渣を0.5M食塩含有0.1M重
炭酸緩衝液（PH8.0）10mlに溶解する。この溶液
を予め膨潤水洗しておいた活性化CHセフアロー
ズ4B（フアルマシアフアインケミカルズ製）100
mlと混合し、４℃で攪拌下16時間反応させる。反
応終了後、常法により1Mエタノールアミンで残
存反応性基をつぶす。次いでゲルを0.1M食塩含
有（PH8.0）0.1Mグリシン緩衝液で洗い同じ緩衝
液中に保存する。 トリプシン測定用分析素子の調製 実施例１−と同様の方法で調製したガラス繊
維分散物（固型分10mg／10ml分散液）を120ml
（固型分120mg）取り、これに30％グリセリン溶液
を200ml加えてスラリーＣとした。 また、おなじガラス繊維分散物70ml（固型分70
mg）に蒸留水100mlを加え、更にで調製した
Phe−Ser−Arg−MCA固定化セフアローズゲル
を３ml加えて攪拌混合し、スラリーＤを得た。 実施例１−と同様にして、ミクロフイルター
上に設置したアクリルシリンダーにスラリーＣ
液、蒸留水100ml；スラリーＤ液をこの順に静か
に積層し、100mmHgの減圧下でろ過抄紙した。次
いで凍結乾燥しトリプシン測定用分析素子（）
を調製した。 トリプシン測定用分析素子の使用例 で調製した分析素子から１cm角の試料片を裁
断し石英板上にならべた。Ｌ−１−トシルアミド
−２−フエニルエチルクロロメチルケトン
（TPCK）処理したトリプシン（シグマケミカル
ズ製）を各々0.5，10，20，50，100μｇ／mlの濃
度に含有する0.1M重炭酸緩衝液（PH8.5）を試料
片あたり100μl注下含浸させ30℃で反応させる。
正確に10分経過後、日立製作所製850型分光蛍光
光度計を用いて励起波長360nmで励起し、440nm
の波長で相対蛍光強度を測定した。その結果を第
３表に示す。

【表】 第３表より明らかなように本発明の分析素子を
用いるとトリプシン濃度に対して良好な検量線が
得られる。 実施例４ サイロキシン測定用分析素子の調整 抗T4ウサギIgG固定化セフアローズゲルの
調製 実施例１−と同じ方法により抗T4ウサギ抗
体を固定化したセフアローズゲルを調製した。 光しやへい用着色粒子を含む補助層の調製 実施例１−と同じ方法で調製したガラス繊維
分散物（固形分含量８mg／10ml分散物）を120ml
（固形分96mg）秤取しこれにMikacion.Brill.
Orange GS（日本化薬(株)製）によりオレンジ色に
染色したセフアローズ4Bゲル（フアルマシア・
フアイン・ケミカルズ製）７mlを加え攪拌してス
ラリーを調製した。このスラリーを用い実施例２
−と同じ方法でナイロンメツシユ付の着色補助
層を作成した。 抗体セフアローズ粒子脱落防止層及び着色補
助層付T4測定用分析素子の調製 上記に記載のガラス繊維分散物10ml（固形分
８mg）に20％サツカロース溶液100mlを加え、攪
拌混合してスラリーＥを得た。 次に、同じ分散物90ml（固形分72mg）に0.2M
グリシンナトリウム緩衝液（PH9.0）、100ml及び
で調製したT4抗体固定化セフアローズゲル2.5
mlを加え、攪拌混合してスラリーＦを得た。 実施例１−と同様の方法でミクロフイルター
上に備えたアクリルシリンダー内にスラリーＥ及
びＦをこの順に静かに積層した。その表面に、上
記で調製したナイロンメツシユ付の着色補助層
をナイロンメツシユがスラリー側になるように静
かに浮かせた後、ろ過抄紙し以下同様に凍結乾
燥、圧力成型して脱落防止層、ナイロンメツシユ
及び着色補助層を備えたT4測定用分析素子を得
た。 この反応素子は、FITC標識T4を含有するバイ
ンダー試薬層を有する透明支持体（例えばPFT）
の上に、積層してT4測定用分析要素として使用
できる。 発明の効果 本発明の分析素子は次のような効果を有する。 (1) 高い保液機能をもつているので分析精度が高
く短時間で分析を完了することができる。 (2) 一体型であるから層間における液の移動が均
一になり分折精度を高めるのに貢献する。 (3) 各層の厚さを極めて薄くすることができる。
その結果加えられた一定量の生物活性物質との
反応に関与する物質の実効濃度が相対的に高く
なり、単位時間当たりのシグナル発生量が増加
する。従つて反応時間を短縮することができ感
度も高められる。 (4) 薄層のものが二層以上の一体型に形成されて
いるのでハンドリングが容易である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 生物活性物質との反応に関与する活性物質が
   固定されている微粒子状物質と繊維質素材とから
   なる複合多孔性反応層及び繊維質素材からなる単
   一多孔性支持層の少なくとも二層から構成され、
   複合多孔性反応層の繊維質素材と単一多孔性支持
   層の繊維質素材とが、それらの層間の界面にて相
   互に絡み合うことにより、両層が結合されている
   ことを特徴とする生物活性物質分析素子。 ２ 単一多孔性支持層形成用の繊維質素材を含む
   水性スラリー層の上に、生物活性物質との反応に
   関与する活性物質が固定されている微粒子状物質
   及び繊維質素材を含む複合多孔性反応層形成用水
   性スラリー層を重ねた状態で抄紙操作を行なつて
   得られたものである特許請求の範囲第１項記載の
   生物活性物質分析素子。 ３ 生物活性物質との反応に関与する活性物質が
   固定されている微粒子状物質と繊維質素材とから
   なる複合多孔性反応層及び微粒子状物質と繊維質
   素材とからなる複合多孔性支持層の少なくとも二
   層から構成され、複合多孔性反応層の繊維質素材
   と複合多孔性支持層の繊維質素材とが、それらの
   層間の界面にて相互に絡み合うことにより、両層
   が結合されていることを特徴とする生物活性物質
   分析素子。 ４ 複合多孔性支持層形成用の微粒子状物質及び
   繊維質素材を含む水性スラリー層の上に、生物活
   性物質との反応に関与する活性物質が固定されて
   いる微粒子状物質及び繊維質素材を含む複合多孔
   性反応層形成用水性スラリー層を重ねた状態で抄
   紙操作を行なつて得られたものである特許請求の
   範囲第３項記載の生物活性物質分析素子。