JPH0584859B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、固定化酵素膜を有する酵素電極と共
に用いられる長寿命かつ電位の安定性に優れた
銀・塩化銀参照電極に関する。

（従来の技術） 酵素電極を用いた各種化学物質の計測は、酵素
反応が有する高い選択性と、電気化学分析が有す
る高速性・感度の高さという特徴を合わせ持ち、
近年臨床化学・食品化学等の分野で広く利用され
るようになつてきた。酵素電極による計測法は (1) ポテンシオメトリツク法（電位差検出法） (2) アンペロメトリツク法（定電位における電解
電流を検出する方法） に分類される。いずれの方法においても、作用電
極の電位を、基準電位に対して正確に計測し（ポ
テンシオメトリツク法の場合）、あるいは正確に
保持することが要求される（アンペロメトリツク
法の場合）。このような目的を達成するために高
精度の電界効果トランジスターや演算増幅器を用
いた回路が利用出来るが、正確な測定を行うため
には、基準となる参照電極の電位が安定して得ら
れなければならない。

そして理想的は参照電極は、次に挙げる性質を
有する。

(i) 参照電極表面での電極反応が可逆であつて、
電解液中にある化学種とNernstの平衡電位式
に従つて応答（Nernst応答）すること。

(ii) その電位は時間に対して安定であること。

(iii) 微小電流が流れても、すぐ最初の電位に戻る
（ヒステリシスがない）こと。

(iv) 温度が変化しても一定の温度になれば一定の
電位を示すこと。

このような条件に適合し、かつ酵素電極の小型
化の要求を満たすものとして、従来より銀・塩化
銀参照電極が知られている。銀・塩化銀参照電極
は、例えば銀電極を塩素イオンを含む電解液に浸
漬し、銀電極を正極とし、白金極との間に定電流
発生装置により電流を通して、銀電極表面に銀・
塩化銀薄膜を形成することにより作成される（電
気メツキ法）。この方法は製造が容易である利点
があるが、形成された薄膜の物理的強度に劣り、
長期間使用すると、薄膜が剥離してしまい安定し
た電位が得られない欠点があつた。

また銀・塩化銀・硫化銀の混合物を加圧成型し
た酵素電極用銀電極も知られているが（特開昭62
−43556号）、成型に困難を伴い小型の電極を作成
し難い欠点があつた。

（本発明が解決しようとする問題点） 本発明は物理的強度に優れ、長期間にわたり使
用可能で、電位の安定性に優れ、しかも容易に小
型化出来る銀・塩化銀参照電極を提供することを
目的とする。

（問題を解決するための手段） 本発明は、銀電極表面に塩素イオンを含む電解
液中で塩化銀を電気化学的に形成してなる銀・塩
化銀参照電極の製造方法において、塩化銀を形成
する際に、該電解液のPHよりも低い等電点を有す
る蛋白質を該電解液中に含有させ、電極表面に形
成される銀・塩化銀・蛋白質混合薄膜を架橋剤で
処理することを特徴とする銀・塩化銀参照電極の
製造方法である。

（作用） 本発明では、電気メツキ法により塩化銀を電気
化学的に形成する際に、塩素イオンを含む電解液
のPHよりも低い等電点を有する蛋白質（即ち電解
液中において負の電荷を有する蛋白質）を電解液
中に含有させる。

負の電荷を有する蛋白質は、正極である銀電極
表面に泳動・吸着される。この結果銀・塩化銀・
蛋白質混合薄膜が形成され、該薄膜中の蛋白質を
架橋剤で架橋処理することによつて物理的強度に
優れた薄膜が形成される。こうして得られた銀・
塩化銀参照電極は銀・塩化銀薄膜の強度が高く、
長期間にわたり安定した電位を与えることが出来
る。

以下に銀・塩化銀参照電極の構成につき更に詳
述する。先づ銀線を良く研磨し、酸化層を除去
し、次に塩化物水溶液、もしくは緩衝液に塩化物
を溶解したものに、更に蛋白質を含有させた電解
液を調製して銀線を電解液に浸漬する。緩衝液と
しては各種用いることが出来るが多くの蛋白質の
等電点が弱酸性域に存在するためリン酸緩衝液等
が用いられる。緩衝液の濃度は蛋白質溶液を安定
に保つため0.01〜1M程度、より好ましくは0.05
〜0.5Mに調製する。

塩化物としては、塩酸を用いることも出来る
が、塩化ナトリウム、塩化カリウム等アルカリ金
属の塩化物は蛋白質のゲル化や沈澱を引き起こさ
ないため好ましく用いられる。塩化物の濃度は
0.01〜1M程度である。

本発明では、緩衡液のPHよりも低い等電点を有
する種々の蛋白質が用いられるが、中でも、グロ
ブリン（P16.4〜7.2）、卵白アルブミン（P14.6）、
血清アルブミン（P14.8）、コラーゲン、ゼラチン
等は、得られる架橋蛋白質層強度に優れるので好
ましい。蛋白質濃度は電解液の発泡等を避け、且
つ充分な強度の架橋膜を形成させるために0.1〜
100mg／mlの範囲、より好ましくは0.5〜50mg／ml
に調製する。

次に、白金を対極として、飽和カロメル電極
（以下SCEと略す）に対して、銀電極を正極とし
て電解を行う。

電解を行う電位は対SCE＋0.05V以上を用いる
必要があり、対SCE＋0.2Vまで上げると充分な
量の蛋白質を吸着させることが出来る。電解に要
する時間は短いと充分な膜強度が得られず、長い
と膜厚が厚くなりすぎ、最終的な架橋膜にクラツ
クの形成が起こるため１〜480分間、より好まし
くは５〜60分間である。

次にこうして銀線上に得られた銀・塩化銀・蛋
白質よりなる薄膜を架橋剤で処理する。架橋剤と
しては公知の各種蛋白質の架橋剤が用いられる
が、中でもホルマリン、グルタルアルデヒド、グ
リオキザール等のアルデヒド類が水溶性が高く、
また膜強度の点でも好ましい。架橋処理は、電解
終了後、軽く水洗した電極を0.1〜10％の架橋剤
水溶液に浸漬し、乾燥硬化しても良いし、あるい
は電解液中に予め架橋剤を含有させておいても良
い。ただし後者の場合は電解中に電解液がゲル化
しないように蛋白質及び架橋剤を低濃度にする必
要がある。

また40〜60℃程度の加温を行い、硬化反応を促
進することも出来る。

このようにして作成した銀・塩化銀参照電極は
一定濃度の塩化カリウムを満たしたガラス管等の
中に浸漬し、適当な液絡を介して用いることが出
来る。また、一本の円筒中に参照電極を白金作用
極と共に封入し、表面をアセチルセルロース膜等
の選択透過膜で被覆して酵素電極を構成すること
も出来る。

更に本発明の参照電極の製造方法によれば、
銀・塩化銀薄膜の物理的強度が優れるため緩衝液
の剪断力が掛かるフロー型酵素電極測定装置にお
いて、第１図の様に作用電極（酵素を表面に固定
した白金電極等）と対向もしくは並列に配置し
て、直接緩衝液の流れに銀・塩化銀面が接するよ
うにして用いても長期間安定した測定を行うこと
が出来る。この場合フロー型測定装置に用いる緩
衝液に0.01〜0.5Mの範囲で塩化カリウム等を添
加し、塩素イオンを含有させると、参照電極の電
位が更に安定化し、極めて高精度の測定を行うこ
とが出来る。この方法では、液絡が不要であるた
め酵素電極を納める測定セルの小型化が可能であ
る。

（実施例） 以下に実施例を示し本発明をより具体的に説明
するが、勿論本発明はこれのみに限定されるもの
ではない。

実施例 １ 直径２mmの銀線の末端を1600メツシユのエメリ
ー紙で平面に仕上げ、側面を熱収縮テフロン（登
録商標）で被覆した。この先端部を、10mg／mlの
ウシ血清アルブミン（Sigma社製、フラクシヨン
Ｖ）、及び0.05Mの塩化カリウムを含むPH7.0の
0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液に浸漬し、これを
作用電極とし、１cm角白金電極を対極、SCEを参
照電極とし、室温で30分間、＋0.2Vで電解を行つ
た。電解終了後、銀電極を軽く水洗し、1.0％グ
ルタルアルデヒド水溶液に５分間浸漬した後、40
℃で15分間乾燥して架橋硬化処理を行つた。

このようにして作成した銀・塩化銀電極の薄膜
が直接流れに接するように第１図に示すフロー型
計測装置に装着し、参照電極１とした。

グルコースオキシダーゼをウシ血清アルブミン
と共にグルタルアルデヒドで固定した直径２mmの
白金電極を測定セル２に参照電極と対向するよう
に装着し、作用電極３とした。ポンプ４で0.05M
塩化カリウムを含む、PH7.0の0.1Mリン酸ナトリ
ウム緩衝液を1.0ml／minの流速で流した。尚以
下の計測は恒温槽５（37.0±0.2℃）中で行つた。

先ず印加電圧を変化させて、1mM過酸化水素
水溶液を5μ注入した場合に、明瞭な限界電流
が得られることを確認した（第２図において
0.35V〜0.7Vの間では、ほぼ一定の電流値が得ら
れる）。

次にグルコースを含む試料を注入口６よりマイ
クロシリンジで5μ注入し、２電極ボルタンメ
トリーの形式で、作用電極に対参照電極＋0.45V
の電圧を印加し、過酸化水素電極として測定を行
つた。この状態で20日間グルコースを含む試料の
計測を続け、のべ1500検体を分析した。

20日間の計測の後においても1mM過酸化水素
水溶液を用いて限界電流を再現性良く検知できる
ことを確認した（第２図）。即ちグルコースを含
む試料1500検体測定後においても測定開始時と同
様、対参照電極約0.35〜0.7Vの電圧を掛けると、
一定の電流値が得られることを示している。この
ため安定した測定が可能である（図中○印は使用
開始時の値を表し、×印は1500検体測定後の値を
表す）。更に銀・塩化銀参照電極を取りはずし、
目視で参照電極表面の薄膜に剥離等の異常が起き
ていないことを確認した。

比較例 １ 実施例１において電解液中にウシ血清アルブミ
ンを含有させず、硬化処理を行わなかつた以外は
同様にして参照電極を得た。即ち銀線を、0.05M
塩化カリウムのみを含むPH7.0の0.1Mリン酸ナト
リウム緩衝液中で同様に電解処理し、電解終了後
軽く水洗して得た参照電極を第１図に示すフロー
型計測装置に装着し、同様の測定を行つた。第３
図にその結果を示す。明らかに、1500検体を測定
したため限界電流検出位置が不明瞭となつた。
1500検体測定後において、測定開始時と異なり電
流値は電位の変化と共に変化し、安定した測定が
出来ないことを示している。（図中○印は使用開
始時の値を表し、×印は1500検体測定後の値を表
す。）また参照電極の流れの上流側ケ所に薄膜の
剥離が認められた。

（効果） 本発明は、物理的強度に優れ、長寿命かつ安定
性の高い銀・塩化銀参照電極の製造方法であり、
また容易に小型化出来る優れた酵素電極用参照電
極が提供できた。

【図面の簡単な説明】

第１図はフロー型計測装置を例示したものであ
る。第２図は実施例１における、1mM過酸化水
素に対する電流−電圧曲線を示したものである
（図中○印は測定開始時の値を表し、×印は1500検
体測定後の値を表す）。第３図は比較例１におけ
る、1mM過酸化水素に対する電流−電圧曲線を
示したものである（図中○印は測定開始時の値を
表し、×印は1500検体測定後の値を表す）。 １……銀・塩化銀参照電極、２……測定セル、
３……（酵素）作用電極、４……ポンプ、５……
恒温槽、６……注入口。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 銀電極表面に塩素イオンを含む電解液中で塩
   化銀を電気化学的に形成してなる銀・塩化銀参照
   電極の製造方法において、塩化銀を形成する際
   に、該電解液のPHよりも低い等電点を有する蛋白
   質を該電解液中に含有させ、電極表面に形成され
   る銀・塩化銀・蛋白質混合薄膜を架橋剤で処理す
   ることを特徴とする銀・塩化銀参照電極の製造方
   法。