JPH05509393A - 全性腺刺激性アルファーペプチド鎖検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 全性腺刺激性アルファーペプチド鎖検定法本発明は哺乳動物体液中のホルモンを 定ＩＬ（または）検出する検定法、とりわけ排卵前期の濾胞の破裂と排卵時の卵 子の放出を起こす黄体形成ホルモンの変動を定量しそして（または）検出する検 定法に関する。更に詳しく言えば、本発明は尿中の全性腺刺激性アルファーペプ チド鎖含量を黄体形成ホルモン含量の鋭敏な指標として用いる方法に関する。更 に一層詳しく言えば、本発明はヒトの受精期、即ち生存可能な精子と生存可能な 卵子とが女性の生殖器官中に同時に存在しつる期間、を決定するためヒト尿中の 成分を試験するのに適した免疫検定法に関する。

先行技術の背景 哺乳動物体液、例えば血清または尿、の中の構成成分の存在および（または）濃 度を決定することは、幾つかの理由のため臨床的にも（または）診断上にも望ま しい。

ある場合には、哺乳動物のホルモン活性および（または）代謝か、体液中のホル モンまたは代謝物の濃度の変動を年代順に他の出来事と関連づけられる状況をつ くり出す。とりわけヒト尿中の黄体形成ホルモン（ＬＨ）の濃度の変動を用いて 月経周期の受精期を確かめることができる。妊娠することの難かしさを経験して いる夫婦にとっては、性交または人工授精の最適の期間を確認する必要がある。

ヒトの月経周期は女性の腺や器官からのホルモンの周期的放出により支配される 。このような放出は予知することができ、また卵子が卵巣から放出され子宮の内 側か妊娠のために準備される排卵と特に関係づけられる。結局、放出されたホル モンおよび（または）その代謝物か尿中へ出て行くことになる。この特別な生物 学的現象はｒＧｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｃ　Ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａ ｄｅｎｏｈｙｐｏｐｈｙｓｉｓ」と題したＫｅｖｉｎ　Ｊ、　Ｃａｔｔ　および Ｊｏｈｎ　Ｇ、　Ｐｉｅｒｃｅの発表論文に詳細に記載されていて、Ｙｅｎ、　 Ｓ、　Ｓ、　Ｃ，およびＪａｆｆｅｅ、　Ｒ，Ｂ、、　ＲＥＰＲＯＤＵＣＴ［Ｖ Ｅ　ＥＮＤＯＣＲ［Ｎ０ＬＯＧＹ、　２版、Ｗ。

Ｂ、　５ａｕｎｄｅｒｓ、フィラデルフィア（１９７８）の論文の３章（７５〜 １１４頁）として呂ている。正常な月経周期中に女性の血清中のＬＨ濃度が変動 して排卵前期の濾胞の過程は排卵として知られる。ＬＨの変動は血液に変動か起 きた後約８から２４時間で女性の尿に検出される。

従って、ヒトの尿中のＬＨの変動は受精期が前進しつつあるか、または起ころう としていることの指標として用いられ、受精期を検知するための幾つかの商業的 検定法はヒト尿中のＬＨａ度の測定に基づいている。

ゴナドトロピン、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピ ン（ｈＣＧ）、および甲状腺刺激ホルモン（Ｔ　Ｓ　Ｈ）はすへて上記のＣａｔ ｔ等の論文に記載のよく知られたホルモンである。これらのホルモンはすへて共 有結合でなく結ばれた２本のペプチドｊＪＩ（アルファー鎖とベーター鎖）から 形成されて完全なホルモンを与えている。これらの鎖は別々に存在することがで きるか、生物学的に活性なホルモンを生ずるにはこれらか一緒に結合しなければ ならない。ＬＨ，ＦＳＨ。

ｈＣＧおよびＴＳＨのアルファー鎖は本質的に同一であるか、ベーター鎖はすべ て異なる。

この分野で公知の通り、完全な（ホロ）ホルモンおよび遊離のアルファーおよび ベーター鎖は私有、公有および（または）配座エピトープに対し抗体の種々なコ ンビネーションを用いて区別し、別々に検定できる。この点に関して公有エピト ープは鎖が遊離か結合しているかに関係なく利用できるものであり、私有エピト ープは遊離鎖に対してだけ利用することができ、そして配座エピトープは単独鎖 に対してはいずれも利用できず完全なホルモンに対してのみ利用できるものであ る。上記のように商業的受精期検定法は完全なホルモンを検定することによりＬ Ｈの変動を決定するよう以前に構成されたことがある。

ＬＨ検定法は潜在的に完全または遊離のＬＨヘーター鎖いずれかを指向するもの であろうことも認識されて来た。しかし、受精期検定を全アルファー鎖に基かし める程排卵前期全アルファー鎖含量と尿中の完全なＬＨの変動との間に十分な相 関があるという示唆は先行技術になかった。まして全アルファー鎖がＬＨと同時 に変動するだけでなく、検定をずっと鋭敏かつ正確にする程はるかに大きいレベ ルまで変動するという示唆が先行技術になかったことは尚更のことである。

発明の要約 本発明によれば、正常な周期をもつ婦人の尿においては、尿中の性腺刺激性アル ファーペプチド鎖の全含量か全ＬＨベーター鎖または完全なＬＨホルモン含量よ りも相当に大きいということが発見された。またアルファー鎖、ベーター鎖およ びホロホルモンの濃度はすべて周期中間で共同作用的に増加することも発見され た。このようにして、本発明によりホロホルモンの排卵前期の変動か全アルファ ー鎖の同期の強められた変動を伴うことが観察された。このことはホロホルモン に基づく、あるいは遊離または全ベーター鎖に基づく他の検定法と比較して高い Ｓ／Ｎ比をもつ検定法の構成を容易にするものである。周期中間の変動時におけ る性腺刺激アルファー鎖のモル当量濃度はホロホルモンまたはベーター鎖のモル 当量濃度よりおよそ５倍から１０倍大きいことを測定が示した。

上記の観察された現象を利用するため、本発明は一つの検定手順を提供する。こ の方法は哺乳動物から体液試料を得、前記試料を分析して性腺刺激性アルファー ベブチド鎖をそれか遊離形であろうと完全なホルモンの一部であろうと顧慮する ことなく定量または検出する工程を含む。本発明のもう一つの面によれば、黄体 形成ホルモンの排卵前期変動を定量する検定手順が提供される。本手順は被検者 から体液の多数の試料を得、前記試料の全性腺刺激性アルファーペプチド鎖含量 を比較する工程を含む。本発明の尚一層群しい面は、ヒト被検者における排卵の 開始を予知するための検定手順を提供するものであって、この手順は多数の連続 した期間の各々について被検者から尿試料を得、前記試料の各々を分析すること によりその全性腺刺激性アルファーペプチド鎖含量を定量し、そして前記の全性 腺刺激性アルファーペプチド鎖含量の変動を排卵の前兆として観察することから なる。

本発明の更に特別な面は、免疫学的手順を用いて試料を分析する検定手順を提供 するものである。この免疫学的手順は抗体の各々がアルファー鎖車のそれぞれの 異なる結合部位に特異的に結合しつる二つの異なる抗体を用いたサンドイッチ形 成の工程を含む。

本発明の特に適当な一形式を示すと、その検定手順はサンドイッチＥＬＩＳＡ法 を含む。本発明の特に好ましい形式においては、試料を連続した数日で得、朝一 番の尿試料からなる。

図面の簡単な記載 第１図は完全ＬＨの中間周期の排卵前期の変動と７回繰返しの連続日の全アルフ ァー鎖とを比較したチャートである。

第２図は全アルファー鎖含量を分光光度法による吸光度値と関係づける標準曲線 である。

第３図は本質的に全月経周期の間の尿の全アルファー含量を示す。

発明の詳細な記載 上記の通り、本発明は正常周期の婦人の月経周期の同に二つの予想外の現象か起 こるという発見に基づくものである。第一に排卵をひき起こす系における完全Ｌ Ｈの習慣的中間周期変動が系の性腺刺激性アルファーペプチド鎖の全濃度におけ る同時の変動を伴なうことが発見された。更にまたアルファー鎖の変動がホロホ ルモンの変動と比べて著しく強められることも発見された。

これらの現象はある種のＬＨ抗体のエピトープ特異性を決定するためにドツト　 プロット分析を行なうことにより発見された。調査した抗体はＨＫＩ　２Ｇ９、 ＬＨ２５２Ｂ１０、ｌＮＮ−１３２、ｌＮＮ−７２、ＬＨ２６−２０９、ＷＳＰ −２０５およびＷＳＰ−２Ｂ６であった。ＩＮＮ抗体は１．Ｄ、Ｃ，（Ａ−６０ ８０インスプルツク／ＴＧＬＳ、スツルンシュタイヒ１０、オーストリア）から 市販され、またＷＳＰ抗体はＷｅｓｔｅｒｎＳｔａｔｅｓ　Ｐｌａｓｍａ　（３ ８８７Ａｌｔａ　Ｖｉｓｔａ　Ｄｒｉｖｅ、）オールプルツク、力、リホルニア ）から市販されている。他の抗体はＨｙｇｅｉａ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｉｎｃ 、において社内で入手できる。

ＬＨ抗原（遊離ベーター鎖、遊離アルファー鎖および完全ホロホルモン、５ｃｒ ｉｐｐｓから得られる）を、０．２　Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）中５μｇ／ ｌｎｌの濃度で自然濾過により９６−ウェル装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈ ｍｏｎｄ、カリホルニア）を経てニトロセルロースに結合させた。次にニトロセ ルロースを０．２Ｍ炭酸塩（ｐＨ９，０）　中２％ＢＳＡの溶液にさらして残存 結合部位を封鎖した。モノクローンＬＨ抗体を２５ａｇ／ｍｌ　（１００ａ　Ｉ ／ウェル）の濃度で膜を通して自然濾過した。ウェルを０．１％Ｔｗｅｅｎ　２ ０を含む０，２Ｍ炭酸塩３００μｍを用いて真空濾過法により３回洗浄すること により未結合抗体を除去した。封Ｍ１１１衝液中１：１２（１０に希釈したアル カリ性ホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、セントルイス、ミズー リ州）で標識した抗マウスＩｇＧ（１００μｍ／ウェル）を自然濾過し、次に上 記の洗浄緩衝液および真空濾過法を用いて３回洗浄した。蒸留水で最後に洗浄す ることにより残留Ｔｗｅｅｎを除いた。装置から膜を取り出し、Ｖｅｒｏｎａｌ −Ａｃｅｔａｔｅ緩衝液（ｐＨ９，６）中ニトロ　ブルーテトラゾリウム０．０ １％、ＣａＣ１２０，００４Ｍ。

およびインドキシルホスフェート０．５ｍｇ／ｍｌからなる基質に暴露した。

得られた結果は殆とバックグランドを有しない直接的なもので、ＨＫＩ　２０９ 抗体はＬＨベーター鎖鏡上公有エピトープに対して特異的であり、ＬＨ２５２Ｂ ｌＯ抗体はＬＨベーター鎖鏡上公有エピトープに対して特異的であり、ｒＮＮ− １３２抗体はアルファー鎖車の公有エピトープに対して特異的であり、ｌＮＮ− ７２抗体はアルファー鎖車の私有エピトープに対して特異的であり、ＬＨ２６− ２０９抗体はベーター鏡上の私有エピトープに対して特異的であり、ＷＳＰ−２ ０５抗体はアルファー鎖車の公有エピトープに対して特異的であり、そしてＷＳ Ｐ−２８６抗体はホロホルモン上の配座エピトープに対して特異的であることが 決定された。

このようにこれら抗体の対を用いて特異的な被検試料に対するサンドイッチＥＬ ＩＳＡ検定法を開発した。例えば、ＷＳＰ−２８６（ホロホルモン）およびｗｓ ｐ−２６５（アルファー）を用いて完全ホルモンを検定でき、ｌＮＮ−１３２（ アルファー）とＷＳＰ−２Ｃ；５　（アルファー）を用いて全アルファー鎖を検 定でき、またＬＨ２５２ＢｌＯ（ベーター）とＨＫｌ　２Ｇ９（ベーター）を用 いて全ベーター鎖を検定できるであろう。

上記の抗体対と９６−ウェルｒｍｍｕｌｏｎプレートを用いることにより免疫検 定を実施した。ＷＳＰ−２８６、ｌＮＮ−１３２およびＬＨ２５２Ｂ１０抗体を それぞれの捕獲抗体として使用し、多対の他の抗体はセイヨウワサビ　ペルオキ シダーゼ（ＨＲＰ）で標識した。捕獲抗体を種々な濃度で０．０５Ｍ　ＰＢＳ　 （ｐＨ７，３５）中に分散させた。ＷＳＰ　２Ｂ６抗体の濃度は１０Ｍｇ／ｍｌ であり、ｌＮＮ−１３２抗体の濃度は５μｇ／ｍｌであり、またＬＨ２５２Ｂｌ Ｏ抗体の濃度はｌμｇ／ｍｌとした。これら分散液の各々を多数ウェル中に被覆 し（１００μＩ）、室温で一晩インキユベーションした。

封鎖のため、これら被覆液をデカンテーションし、Ｂ　Ｓ　Ａ、　２％とショ糖 ２０％を含む０．　１　Ｍ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ８，０）でウェルを満し、少なく とも３０分インキュベーションした。使用に先立ち封鎖溶液をデカンテーション し、プレートを水道水ですすいだ。長期貯蔵に対しては、封鎖溶液をデカンテー ションし、プレートをペーパータオル上で数回たたいて残留液を除去し、次に真 空デシケータ−中に入れた。

牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１％、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−８０００ ）１％、およびＴｗｅｅｎ２００．１％を含むＯ，ＩＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，０ ）中にＨＲＰ標識ＷＳＰ−２０５抗体をｌμｇ／ｍｌの濃度で分散し、ＨＲＰ標 識したＨＫＩ　２Ｃ；９はｏ、ｓμｇ／ｍｉの濃度で分散した。尿試料は０．　 ＩＭ　Ｔｒｉｓ、１％　ＢＳＡで１＝２以上に希釈した。

希釈した試料５０μＩとＨＲＰ標識抗体分散液５０μＪを用いて検定を行なった 。室温で１時間インキュヘーンヨンを進め、次にプレートをデカンテーションし 、６から８回洗浄した。ＴＢＳ基質溶液ｌＯＯμｍを用いて色を出させた。色の 強さを分光光度社用ブレー１・て吸光度６３０において測定し、第２図に示した ものと同様の標準曲線を用いて評価した。７人の異なる解答者に対する結果を下 記の表１に述べ、第１図に要約した。表Ｉのデータはパイカモル濃度により示し である。表■および第１図から全アルファー鎖含量は完全ＬＨの変動と同時に変 動することおよび全アルファー鎖変動は他の成分の変動よりはるかに大きいこと が分かる。

表　Ｉ 変動の比較 解答者＃４４６ 解答者＃４４８ 解答者＃４４９ ＋６　０　４５　３５０　１０７ 解答者＃４５０ 解答者＃４５１ ＋７　１６２　１１６　１０５５　１９８解答者＃４５３ 周期日　ＬＨ全　全　遊離 ＋５　０　１９９　５３５　− 解答者＃４５４ 上記の結果は受精期検定法が全アルファー鎖に対する検定に基礎をおくことを確 信させかつ強く証明するものである。このような検定法を下記の例１に記述する 。

例１ 全アルファー鎖検定 緩衝剤 ］、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む０．１ＭＴｒｉｓ、　ｐＨ８，０゜ この緩衝液はアルファー鎖探準液の調製にまた尿試料の希釈剤として使われる。

２．　ＢＳＡ　１％１分子量８０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１％ 、およびＴｗｅｅｎ　２００．１％を含む０．　１Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０ ゜この緩衝液は複合体の希釈剤として使われる。

抗体 ■、　抗アルファー、ｌＮＮ−１３２と称する。この抗体は捕獲抗体として使わ れる。

２、　抗−アルファ−１ＷＳＰ−２０５と称する。この抗体は最初のものと異な るエピトープ部位に対抗するもので、第一の抗体、アルファー鎖および第二抗体 からなるアルファー鎖の存在下でサンドイッチをつくる。この系は遊離アルファ ー鎖およびベーター鎖に結合したアルファー鎖の両方を測定する。この第二の抗 −アルファー抗体を酵素せいようわさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識する ことにより、基質あるいはＨＲＰの存在下で変色する色原体を添加して視覚的に 検出を成し遂げられるようにする。

プレート Ｉｍｍｕｌｏ口＋＋９６ウエル　ポリスチレンプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　） を捕獲抗体の被覆に使用する。捕獲抗体を０．０５Ｍ　リン酸塩緩衝食塩水（Ｐ ＢＳ）でＩＯμｇ／ｍｌの濃度に希釈する。ウェル当り１００μｍを加え、−晩 インキユベーションする。ウェルをデカンテーションし、次にＢＳＡ　２％およ びショ糖２０％を含む０、　１　Ｍ　Ｔｔｉｓ　（ｐＨ８，０）の溶液で満して プラスチックウェル上の残存結合部位を封鎖する。封鎖用溶液を最小限３０分間 インキュベージコンし、この時間後プレートをデカンテーションし、水道水です すぐ。ここでプレートはすぐ使用できる準備が整う。

標準液 全アルファー検定に対して精製アルファー鎖または精製完全ＬＨのいずれも使用 できる。両者共５ｃｒｉｐｐｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、サンジエゴ、カリホ ルニア州から購入する。用いた濃度はモル濃度で表わし、２５０ｐＭから１５． ５９Ｍにわたる。これら標準を検定に用いると標準曲線をつくり出すことができ 、そしてこの曲線から未知試料を内挿できる。

テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質ＴＭＢ基質は二つの溶液を用いて調製す る。第一のＴＭＢ溶液はテトラメチルベンジジン４．７５ｇをメタノール３．８ １に加えることにより調製する。この溶液は光から保護しなければならない。第 二の溶液はスズ酸塩を含む基質緩衝液であり、クエン酸５．３．５ｇ、二塩基性 リン酸ナトリウム７５−２７ｇ、スズ酸ナトリウム０．３１ｇ、３０％過酸化水 素５．２ｍｌおよびチメロサール０．２６ｇを十分量の純水中で混合して全量を ５．２ｊ７とすることにより調製される。最終ｐＨは４．９から５．１とすべき である。この溶液は決して金属と接触させてはならない。使用に際しては、ＴＭ Ｂ溶液３部を基質緩衝液７部と混合する。

検定の形式 標準液または希釈未知床５０μｍをウェルへ重複して加える。ＨＲＰに結合させ た希釈　抗−アルファ−５０μｌを各試験ウェルに加える。インキュベーション は室温で１時間行なう。次にウェルをデカンテーションし、水道水で洗浄して未 結合の標識抗体を除去する。次に色原体基質１００μｍを加える。ＨＲＰ存在下 で透明な基質溶液は青色に変るであろう。結合したＨＲＰ標識抗体の量は標準液 または未知試料いずれかに存在するアルファー鎖の濃度に比例するので、発生し た色はアルファー濃度に直接比例する。着色溶液の濃度は分光光度法プレート読 取器により吸光度６３０において検出される。吸光度値（表［Ｈの平均に基づい て標準曲線を引き（第２図）、その標準曲線から内挿し、そしてそのｐＭを希釈 ファクター倍することにより未知試料の全アルファー鎖含量を定量する（表［［ ［）。

表　１１ ０、　０　０．　０３７ ．０１５　．０２６ １５．５　．０７１ ．０５６　．０６４ ３１．０　．１１０ ．１０８　．１０９ ６２、　５　、　２０６ ．２０６　．２０６ １２５、　０　、　４０７ ．４４８　．４２７ １８８、　０　、　６９４ ．６１９　．６５６ ２５０、　０　、　９６４ ．９５２　．９５８ 表　ＩＩ＋ 上記のデータをグラフ形式でプロットする（第３図）。

この図で１１日目に受精期を示す全アルファー鎖変動力（実在することが分かる 。

浄書（内容に変更なし） 要　約　書 ヒト被検者における排卵開始を予知する検定手順。尿試料を連続した数日にわた って得、全性腺刺激性アルファーペプチド鎖含量を検定する。アルファー鎖含量 の変動は排卵および受精期の開始を示す。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許ｄ＆組８４船８）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．検定手順において、哺乳動物から体液試料を得、前記試料を分析して性腺刺 激性アルファーペプチド鎖をそれが遊離形であるか完全なホルモンの一部である かに関係なく定量あるいは検出する工程。
2. ２．黄体形成ホルモンの排卵前期の変動を定量する検定手順において、被検者か ら体液の幾つかの試料を得、前記試料中の全性腺刺激性アルファーペプチド鎖含 量を比較する工程。
3. ３．ヒト被検者の排卵の始りを予知するための検定手順において、被検者から多 数の連続期間の各々について尿試料を得、前記尿試料の各々を分析してその全性 腺刺激性アルファーペプチド鎖含量を定量し、前記全性腺刺激性アルファーペプ チド鎖含量の変動を排卵の前兆として観察することからなる上記検定手順。
4. ４．免疫学的手順を用いて試料を分析する、請求項３記載の検定手順。
5. ５．免疫学的手順は、抗体の各々がアルファー鎖上のそれぞれの異なる結合部位 へ特異的に結合できる２種の異なる抗体を用いてサンドイッチを形づくる工程を 含む、請求項４記載の検定手順。
6. ６．免疫学的手順はサンドイッチＥＬＩＳＡ法からなる、請求項５記載の検定手 順。
7. ７．連続期間は数日であり、尿試料は朝一番の尿試料である、請求項３記載の検 定手順。
8. ８．連続期間は数日であり、尿試料は朝一番の尿試料である、請求項６記載の検 定手順。