JPH05509333A - 創傷治癒及び修復の修復段階を促進し、かつ感染した創傷及び糖尿病哺乳類の創傷の治癒を促進するためのｉｌ−４の用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 創傷治癒及び修復の修復段階を促進し、かつ感染した創傷及び糖尿病哺乳類の創 傷の治癒を促進するためのＩＬ−４の用途発明の背景 インターロイキン−４［本明細書中では以後ｒＩＬ−４４とするが、Ｂ細胞刺ｆ ｆｉ因子１　（ＢＳＦ−１）　としても知られている］は、Ｍ、　Ｅｌｏｖａｒ ｄ　ｅｔ　ａｌ、により、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｗｅｄ、　（１９８２）、　Ｖｏｌ 、　１５５．　Ｉ）ｐ、　９１４−２３において初めて、ＩＬ−２とは区別され るＴ細胞由来の増殖因子として記載されている。この因子は、正常なマウス８９ ２８球類の長期組織培養を可能にし、かつ、活性化されたＢリンノく球と相互作 用して４か月もの長期間その増殖を維持する。混合したＢリンパ球移植体は培養 を開始するために利用されてきたが、未成熟な表現型を有するＢリンノく球は、 組織培養中においてはＩＬ−４により特異的に促進させられることが明らかにな った。例として、Ｃ，Ｐｅ５ｃｈｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ 、　（１９８９）、　Ｖｏｌ、　１４２．１５５８−１５６８を参照せよ。更に 、Ｇ、　Ｔｒｅｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　ＩａｌＩｌｕｎｏｌ、　（１９８ ８）　Ｖｏｌ、　１４０．１１０１−１１O ６は、ＩＬ−４が、休止期のマウスニリン３球のＬｙｔ−２＋亜集団からの細胞 障害性Ｔ細胞の発生を刺激化することを開示している。

マウスＩＬ−４遺伝子がクローン化され、ＣＯ３−７細胞中で発現させられた［ Ｔ、　０ｔｓｕｋａ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１ ９８７）、　ｖｏｌ、　１５．３３３−３３４を参照せよn。

クローン化した因子は、Ｔ細胞培養上清から精製した因子について観察された、 組織培養における活性を全て有していた。ヒトＩＬ−４遺伝子のクローニング及 び発現は、Ｎ、　Ａｒａｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９ ８９）、　Ｖｏｌ、　１４２．２７４−２８２、及び、Ｔ。

Ｙｏｋｏｔａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　（１９８６）、　Ｖｏｌ、　８３．５８４４−５８４８■L載 されており、ＣＯ３−７中に産生される因子は、組織培養中において研究された 天然の分子に類似した活性を有していた。ＩＬ−４をヒトとマウスの細胞系の両 方において研究した場合には、以下に示すように、追加的なインビトロ活性がこ の分子により生じた。１）ＩＬ−４は、Ｂリンノく球皿集団が増殖へと誘導され る際に生じる過程であるＩｇＥ合成の誘導及び調節における重要な役割を担って ＬＸた［Ｐｅｎｅ、　Ｊ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　（１９８ｇ）、　Ｖｏｌ、　８５．６８８０−６８８４を参照■ よ］。１ｆ）ＩＬ−４は、組織培養における正常ヒＩ−Ｂリンパ球上に、低親和 性のＦｃｅレセプター（ＣＤ２３）を誘導した［：Ｔ、　ＤｅＦｒａｎｃｅ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ。

（１９８７）、　Ｖｏｌ。１６５．１４５９−１４５７ヲ参ｆｆ１ｆヨｌ　、　 Ｕ　Ｉ　Ｌ　−４ハ、他ノリンフォカイン類、インターフェロン−γとは特に著 しく相互作用し［Ｒ，Ｌ、　Ｃｏｆｆｌｌ１ａｎ　ｅｔａｌ、、　Ｉ＋ｕ＋ｕｎ ｏｌ、　Ｒｅｓ、　（１９８８）、　Ｖｏｌ、　１０２．５−２７、及び、Ｓ、 　Ｒｏｍａｇｎａｎｉ　ｅｔ　ａｌA　（上 述）を参照せよ］、更に、Ｔ細胞類とも相互作用して［Ｒ，Ｌ、　Ｃｏｆｆｍａ ｎ　ｅｔ　ａｌ。

（上述）　、Ｓ、　Ｒｏｇｍａｇｎａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、（上述）、及び、Ｍ、 　Ｄ、　ｆｉｄｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　（１９８７）、　Ｖ ｏｌ、　３２６．７９５−９８、を参照せよ］、Ｂ細胞増殖及び改変を引き起こ した。更に、ｔｖ）ＩＬ−４は、休止期のＢ細胞上のＭＨＣクラス■抗原の発現 を増大させた（ＲＮｏｅｌｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、　ＰＮＡＳ　８１．６１４９− ６１５３．１９８４）。

Ｔ、　Ｒ，Ｍｏｓｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、は、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　（１ ９８７）　Ｖｏｌ、　１３８．１８１３（８１６において、アミノ酸配列１−９ ０及び１２９−１４９において５０％が相同であるヒトとマウスのＩＬ−４は種 特異的であることを開示した。

創傷治癒及び修復の段階は、３つの重複する段階（これらは、創傷の原因となる 損傷もしくは外科切開の後に起こる）を含むとみなすことができる。段階■は、 Ａ）血液凝固、及び、Ｂ）炎症反応段階を含み、段階■は、肉芽組織形成及び創 傷収縮を含み、更に、段階■は、「創傷治癒及び修復の修復段階」と呼ばれ、マ トリックス形成と改造、及び、コラーゲン蓄積を含み、この段階では、肉芽組織 の細胞外マトリックスが形成されて、創傷に対する抗張力が与えられる。Ｒ，Ｓ 。

Ｃｏｔｒａｎ、　Ｖ、　Ｋｕｍａｒ　ａｎｄ　Ｓ、　Ｌ、　Ｒｏｂｂｉｎｓ、　 Ｗ、　Ｂ、　５ａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏ、　４ｔｈ　Ｅｄ　１X８９による Ｒｏｂｂｉｎｓ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　Ｄｉｓｅａｓｅ、 　Ｉｍｐ　７１−８６の「治癒及び修復」と題する節、及び、Ｒ１＾、Ｆ、　Ｃ １ａｒｋによる「創傷治癒の概説及び総体的考察」と題する第１章、　ｌ）ｐ　 ３−３３、を参照せよ。

Ｊ、　Ｂａｎｃｈｅｒａｕ　ｅｔ　ａｌ、、Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓ、　 Ｖｏｌ、　６．　Ｎｏ、１：　０１３５（１９８７）に記載■ れているように、ＩＬ−４は広い領域の免疫細胞刺激を有する。Ｃ１１ｎｉｃａ ｌ　ＩＩＩｌｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　 ４９：　２９２−２９８　（１９８８）において、Ｍｏｎｒｏｅ及び共同研究者 らは、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｈ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔ ｈｏｌｏｇｈ　４９：　２９２−２９８（１９８ｇ）にお■ て、マウスＩＬ−４は、初代の及び不滅化させたマウスの皮膚線維芽細胞のいず れにおいてもＤＮＡ合成を冗進することができるという証拠を提供した。Ｔｈｏ ｒｎｔｏｎ、　Ｓ、　Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ　４７：３１２−３２０　（１９９０）は、ヒトの肺及び滑液の繊維 芽細胞に対する細胞増殖亢進活性について、一群のサイトカイン類をテストンた 。検査したサイトカイン類の内、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）及 び血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のみが顕著に細胞増殖を刺激化した。しかし ながら、これらのインビトロにおける実験に関連して、Ｔｈｏｒｎｔｏｎｅｔ　 ａｔ、は、インターロイキン類、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、及 び、ＩＬ−６は不活性である旨を開示している。

１９８９年７月２８日に出願された、共同譲渡されている米国特許出願第３８６ ゜９３７号（１９９０年７月２６日に出願された国際特許出願Ｎｏ　ＰＣＴ／Ｕ Ｓ９０１０４０９３）は、（１）ＩＬ−４を哺乳類に投与することにより好中球 の数を増大させ、感染に対する宿主耐性を増大させるか、あるいは、非常に初期 の段階で感染を治療することができ、更に（２）ＩＬ−４は、局所的に投与して 、創傷部位における好中球及び単球の活性化及び線維芽細胞増殖を刺激すること により、開口している切り傷もしくは火傷等の創傷を治癒するために有効である 旨を開示している。

発明の要約 我々は、驚くべきことに、ＩＬ−４が、ヒト皮膚線維芽細胞株におけるＤＮＡ合 成を刺激化しうることを発見した。我々は、更に、ＰＤＧＦ及び表皮成長因子（ ＥＧＦ）等の既知の増殖因子類とは異なり、ＩＬ−４は、インビトロにおいては 細胞数の顕著な増加を刺激化しないことも発見した。従って、本発明は、創傷治 癒及び修復の修復段階の促進を必要とする哺乳類においてこのような段階を促進 させる方法を提供し、この方法は、このような促進に有効な量のＩＬ−４を、創 傷治癒及び修復の修復段階中に投与することを含む。

本発明は更に、哺乳類、特にヒトの感染した創傷の治癒及び修復を促進させる方 法をも提供し、この方法は、治療に有効な量のＩＬ−４を感染した創傷に対して 投与することを含む。

本発明は更に、真性糖尿病に苦しむ哺乳類の創傷の治癒及び修復を促進させる方 法をも提供し、この方法は、治療に有効な量のＩＬ−４を、真性糖尿病を有する 哺乳類の創傷に対して投与することを含む。

図１は、本発明に従ってＩＬ−４と共にインキュベートしたヒト皮膚線維芽細胞 中におけるＤＮＡ合成の用量依存的増大についての、グラフによる説明である。

図２は、本発明に従ってＩＬ−４と共にインキュベートしたヒト皮膚線維芽細胞 におけるコラーゲン合成の用量依存的増大を示す、グラフによる説明である。

図３は、本発明により、ＩＬ−４がＰＤＧＦに対するヒト皮膚線維芽細胞の走化 性を冗進させたことを示す、グラフによる説明である。

図４は、本発明により、ＰＤＧＦ及びザイモサンに対するヒト皮膚線維芽細胞の ＩＬ−１刺激化遊走における減少を引き起こすＩＬ−４の能力を示す結果の、グ ラフによる説明である。

図５は、ヒト皮膚線維芽細胞組繊細胞ＣＣＤ　１９ｓｋ、　ＣＣＤ　２７ｓｋ、 及びヒト肺の組繊細胞ＣＣＤ　３４１ｕの増殖におけるＩＬ−４の効果の、グラ フによる説明である。

図５ｂは、ヒト皮肩線維芽細胞及び肺細胞の増殖におけるＰＤＧＦの効果の、グ ラフによる説明である。

図５Ｃは、本発明により、ヒト皮膚（肺ではない）繊維芽細胞の増殖のＰＤＧＦ による刺激化を、ｒｈｌＬ−４が用量依存的に促進することについての、グラフ による説明である。

図６ａは、ヒト皮膚線維芽細胞及び肺組織細胞の増殖におけるＥＧＦの効果の、 グラフによる説明である。

図６ｂは、本発明により、ヒト皮膚（肺ではない）繊維芽細胞のＥＧＦによる刺 激化を、ＩＬ−４が用量依存的に促進することについての、グラフによる説明で ある。

図７は、感染した及び感染していない創傷を示す急性創傷治癒モデルにおける創 傷閉鎖を促進させることに対するＩＬ−４の効果の、グラフによる説明である。

図８は、創傷形成後７日目における、糖尿病でない動物及び糖尿病の動物の創傷 の破壊強度を増大させることについてのＩＬ−４の有効性を証明する、グラフに よる説明である。

図９は、創傷形成後１４日目における、糖尿病でない動物及び糖尿病の動物の創 傷の破壊強度を増大させることについてのＩＬ−４の有効性を証明する、グラフ による説明である。

発明の詳細な説明 古典的には、創傷治癒は４つの段階に分けられている。しかしながら、これらの 段階は連続的に起こる傾向にあり、実際の生理学的事項は重複することがある。

これらの段階は創傷形成時から開始し、以下に示すようになる。

段階　時間 炎症／即時　Ｏから１時間 炎症／創面切除／初期　１から２４時間修復／中間期　１から７日 成熟／後期　７日を上回るＢ数 修復期の特徴は、脈管形成、繊維芽細胞の局在化、及び、創傷収縮である。繊維 芽細胞はフィブリン束に沿って創傷滲出物内へと遊走しく即ち、最初の２４時間 の間に癲皮が定着する）、新生血管構造間で凝集し始める。これらの繊維芽細胞 は、早くも２日目から、プロテオグリカン及び可溶性コラーゲンの分泌を開始す る。これらの物質はマトリックスを形成する。創傷の抗張力の増加はコラーゲン 産生に相関する。開口した創傷及び著しい組織損傷を伴う創傷は、血管床を形成 して創傷中の修復細胞が必要とする酸素及び滋養物を供給する必要がある。内皮 細胞の増殖により毛細血管芽が生じ（脈管形成）、それが伸長して肉芽組織床を 形成し、更に、最終的には、上皮細胞に覆われて創傷を閉鎖する。創傷端の内方 向への遊走（収縮）は、収縮特性を有する一連の繊維芽細胞が創傷中に生じた際 に開始する。

我々は、ＩＬ−４が、コラーゲン産生の２倍を上回る増大を誘導することを発見 した。創傷治癒及び修復の修復期においては、新たに合成されたコラーゲンは細 胞外マトリックス中に取り込まれ、それにより、新しい細胞の成長及び増殖の強 力な足場もしくは支持体、及び、創傷の抗張力の増大がもたらされる。我々は更 に、ＩＬ−４が修復期の創傷治癒及び修復の間に、創傷治癒及び修復の選択的な 促進及び調節を提供することをも発見した。本発明に従うＩＬ−４の投与が創傷 治癒及び修復を冗進するばかりでなく、ＩＬ−４は、化学誘引剤であるＰＤＧＦ への過剰な皮膚線維芽細胞の走化性により生じる搬痕組織形成及び／又は繊維形 成を最小限にし、かつ、ＩＬ−１により誘導される皮膚線維芽細胞組繊細胞の増 殖及び化学誘引剤ＰＤＧＦへの走化性を制止させるように調節することにより、 創傷部位の炎症を低減させる。本発明に従う、修復期中の、創傷部位もしくはそ の近傍におけるＩＬ−４の投与は、ＩＬ−４に適合性である哺乳類で、その免疫 反応が創傷治癒及び修復に効果を有するほど強力もしくは迅速でないものにとっ て有効である。ヒトであることが好ましいこのような哺乳類には、癌治療の放射 線化学療法もしくは器官移植のために免疫反応が低下している免疫緩和宿主、遺 伝的免疫不全の宿主、高齢者、創傷治癒及び修復不全の寝たきりの人、及び糖尿 病患者等がある。

本明細書中において使用する用語「創傷」は、外科手術、外傷、火傷による潰瘍 、もしくは床ずれにより生じる開口した創傷もしくは切り傷を含むが、これらに 限定されるものではない。用語「創傷治癒及び修復の修復期の促進」は、（１） 創傷治癒及び／叉は修復の修復期中に、創傷部位に存在するＰＤＧＦ等の化学誘 引剤への、ヒト皮膚線維芽細胞組繊細胞の走化性を調節及び／叉は促進し、（２ ）創傷治癒及び修復の修復期中に、創傷部位に対して遊走している及び／叉は創 傷部位に存在するヒト皮膚線維芽細胞組繊細胞中のコラーゲン合成を調節及び／ 叉は促進し、（３）修復期中に、創傷部位に存在するＰＤＧＦ等の化学誘引剤へ の皮膚線維芽細胞組繊細胞の遊走のＩＬ−１による誘導により生じる炎症反応を 阻害もしくは制動し、即ち、制止させるように調節し、更に、（４）創傷治癒及 び修復の修復期中に、創傷部位に存在するヒト皮膚（肺ではない）線維芽細胞組 繊細胞の増殖の、化学誘引剤ＰＤＧＦ及び特にＥＧＦによる刺激化を、調節的方 法で促進することを含む。

我々は、Ｉｔ−４の存在下において増殖させたヒト皮膚線維芽細胞が、改変した ポイデンチェンバーアッセイにおいて化学誘引剤ＰＤＧＦへの走化性の促進化を 示すことを発見した。この走化性の促進化は、修復期前及び修復期中の、創傷部 位内への線維芽細胞の漸増において、重要なシグナルを提供するものと思われる 。我々は、ＩＬ−４が、ＰＤＧＦへのヒト皮膚線維芽細胞の遊走を刺激化するＩ Ｌ−１の能力を制動し、即ち、制止させるように調節し、それにより、廠痕形成 及び繊維形成を最低限にすることを発見した。従って、我々は、創傷部位もしく はその近傍での、ＩＬ−４の投与、好ましくはＩＬ−４の局所投与が、以下に従 って、創傷治癒及び修復の修復期中の創傷治癒及び修復を亢進させることを発見 した：　（１）皮膚線維芽細胞増殖を刺激化し、（２）コラーゲン合成を誘導し 、（３）ＩＬ−１により誘導されるＰＤＧＦ及び他の化学誘引剤へのヒト皮膚線 維芽細胞の走化性を阻害し、更に、（４）創傷治癒及び修復の修復期中に、創傷 部位に存在するヒト皮膚線維芽細胞組繊細胞の増殖の、化学誘引剤ＰＤＧＦ及び ＥＧＦによる刺激化を調節的方法において促進する。

我々は更に、予期せぬことに、ＩＬ−４が、感染性創傷及び真性糖尿病に苦しむ 哺乳類の創傷の治癒を劇的に促進することを発見した。

ＩＬ−４は種特異的蛋白質である。本発明に従って治療すべき哺乳類に適合性を 示す任意の適切なＩＬ−４を、本発明において利用することができる。ＩＬ−４ に対して相補的なりＮＡ類（ｃＤＮＡ類）が、近年、数々の研究室により、クロ ーン化されかつ配列決定されている［例えば、Ｙｏｋｏｔａ　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳ＾、（１９８６）Ｖｏｌ、８３：　５８９４−５８９ ８　（ヒト）　；　Ｌｅｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　（１９８６）　Ｍｏ１．８３：　 ２０６Ｌ−２０６５（マウス）　；　Ｎ０ｍ１１　ｅｔ　ａ戟A　。

Ｎａｔｕｒｅ　（１９８６）　Ｖｏｌ、、　３１９＋　６４０−６４６　（マウ ス）：及び、Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ。

Ｂｏｓｔｏｎ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　（ヒト及びマウス）コ。更に、 非組換えＩＬ−４が、様々す培養上清から精製されている［例えば、Ｇｒａｂｓ ｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌｌ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、。

（１９８５）　Ｖｏｌ、　１６３：　１４０５−０１３　（マウス）：及び、０ ｈａｒａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

（１９８５）　Ｖｏｌ、　１３５：　２５１８−２５２３　（７ウスＢＳＦ−１ ）］　、ＤＮＡ及びアミノ酸配列、及び本発明における用途のための適切なＩＬ −４物質の取得方法の教示について、上述の論文全ての開示を本明細書の一部と してここに引用する。

好ましくは、治療すべき哺乳類はヒトであり、かつ、本発明において使用される ＩＬ−４はヒトのＩＬ−４であり、更に、大腸菌内で発現されそこから単離され た（１９８７年７月２９日に出願された米国特許出願第０７９．６６６号、及び 、１９８８年７月１２日に出願された米国特許出願第１９４．７９９号）　、Ｙ ｏｋｏｔａ　ｅｔ　ａｌ。。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８６）、　Ｖ ｏｌ、　８３：５８９４−５８９８、及び、１９８７年５月２１に公開されたＰ ＣＴ特許出願Ｎｏ、　８７１０２９９０において記載されている配列ＥＧＦもし くはＰＤＧＦと共に投与することにより、ヒト皮膚線維芽細胞組繊細１１１Ｈの 調節的刺激化を促進する。ガンマ−インターフェロンは、線維芽細胞における細 胞内粘着性分子（ＩＣＡＭ−Ｉ）の発現を増大させることが示されており、一方 、ＩＬ−１はコラーゲンの産生を刺激化することが示されている［Ｄ、　Ｎ、　 ５ａｕｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　（１ ９９０）、　ＶｏＬ　９（４）、　４６５−４７３を参照せよ］B これらの成長因子類と組み合わせた場合、ＩＬ−４はそれらの活性を増加及び／ 叉は調節するように作用しうる。コラーゲン合成及びＧＡＧ合成の調節は、顔面 領域における皮膚創傷の修復において頻繁に生じる問題である搬痕形成を制限す ることを助長しつる。更に、所定の期間にわたるｆＬ−４の塗布は、修復下の創 傷領域内への線維芽細胞類及び他の細胞種の漸増を促進することができる。ＩＬ −４は叉、因子レセプターの発現を亢進するように、あるいは、抑制するように 調節することのいずれかにより、他の因子類、特にＩＬ−１に対する線維芽細胞 の反応性を調節するように作用することもできる。

本明細書中において使用する用語「〜と組み合わせて」もしくは「〜と共に」は 、ＩＬ−４を、他のサイトカイン類の投与の前、それと同時に、あるいはそのす ぐ後に投与しうることを意味する。

方法 ヒト皮膚線維芽細胞細胞株 ＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴ ＣＣ）から入手したヒト皮膚線維芽細胞細胞株（ＣＣＤ　２７ｓｋ　ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ−１４７５．　ＣＣＤ　１９ｓｋ　ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１４７１．及び、 ＣＣＤ　３４１ｕＡＴＣＣ＄ＬＣＲＬ　１４９１）を、ＡＴＣＣにより推奨され ているように、１０％のウシ胎児血清を補充したダルベコ改変培地（ＤＭＥＭ） 　、あるいは、改変イーグル培地（ＭＥＭ）中で継代した。典型的には、線維芽 細胞細胞株培養物を２０継代にいたるまで使用するが、この場合１継代は２から ３の細胞倍加率に等しい。ＣＣＤ　２７ｓｋは、明らかに正常な個体から皮膚生 検により取得した正常（対照）ヒト胎児線維芽細胞である。

リンフ才力イン類及び成長因子類 ＣＨＯ由来の組換えヒトインターロイキン−４（ｒｈＩＬ−４）は、Ｓｃｈｅｒ ｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ　Ｕｎｉｏｎ社、　ＮＪ、から入手した（比活性は、５Ｘ １０Ｔｕ／ｍｌ）　。ヒトＰＤＧＦ　（ＢＢホモダイマー）は、Ｇｅｎｚｙｍｅ 　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、　Ｂｏｓｔｏｎ、　１１＾、から購入した。表皮 成長因子（ＥＧＦ）及び血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、Ｃａ１ｌａｂｏｒ ａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｃｈ社、　Ｎｅｗ　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　Ｍ＾、から購入 した。

抗体類 組換えヒトＩＬ−４（２５Ｄ２）に対するモノクローナル抗体類は、確立された 方法により、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ社、　Ｂｌｏ ｏｍｆｉｅｌｄ、　Ｎ、　Ｊ、　、において調製したが、これは、Ｇｅｎｚｙｍ ｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社からも入手することができる。抗−ＩＬ−５（Ｔ ＲＦＫ）モノクローナル抗体類は、Ｓｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ社。

Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ、から供給された。

本発明に従い、ヒト線維芽細胞を、ＩＬ−４の存在下で増殖させる。実験の形式 に依存して、以下に示す項目のうちの１つもしくは複数を測定する。（１）ＤＮ Ａ合成、（２）コラーゲン合成、（３）ＰＤＧＦ及び他の化学誘引剤類への走化 性、（４）ＩＬ−１により刺激化される走化性の阻害、及び、（５）ヒト皮膚線 維芽細胞組繊細胞類のＰＤＧＦ／ＥＧＦによる刺激化の促進。

実施例１ ヒト皮膚線維芽細胞（Ｃ（Ｄ　２７ｓｋ）におけるＤＮＡ合成に関連した（３Ｈ ）−チミジン取り込みの測定は、Ｍｏｎｒｏｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１１ｎｉｃ ａｌ　Ｉｍａ＋ｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏ１ｏｇｙ４９ ：２９２−２９８　（１９８８）、及び、Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、　Ｓ、　Ｃ，、ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ@Ｂｉ ｏｌｏｇｙ　４７：３１２−３２０　（１９９（１）の方法を使用して行った。

２０、０００個のヒト線維芽細胞（ＣＣＤ　２７ｓｋ）を２４穴の培養皿内に撒 いた。３７℃において一晩インキュベーシ町ンした後、非粘着性細胞を除去し、 細胞層を無血清培地で２度洗浄した。その後、細胞培養物を、０．１％、１％、 もしくは、２％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む培地中で４８時間維持した。次 に、ヒト組換えインターロイキン−４（ｒｈｌＬ−４）（０，１から１００単位 ／穴）を添加し、更に７２時間インキュベーションを継続した。Ｎｅｗ　Ｅｎｇ ｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ社より入手した１μＣ１の（３Ｈ）−チミジンの取り 込みを、Ｍｏｎｒｏｅ　ｅｔ　ａｌ、　（上述）の確立された方法により測定し た。

線維芽細胞培養物は１−２％のＦＣＳを含む培地内では飢餓状態にならないこと もあるが、対照実験では一貫してアッセイ培地は１０％のＦＣＳ及びｒｈＩＬ− ４を含んでいた。

本実験の結果を図１にグラフで示す。ヒト皮膚線維芽細胞におけるＤＮＡ合成を 刺激化するＩＬ−４の能力を、（３Ｈ）−チミジンの取り込みにより測定した。

ＩＬ−４によるＤＮＡ合成の誘導は、アッセイ培地中のウシ胎児血清の濃度に依 存する。このような用量依存的な結果は、ＥＧＦ及びＴＧＦ−β等の他の一般的 な成長因子類に共通である。従って、我々は、ｈＩＬ−４が、臨床モデルにおい てヒト皮膚線維芽細胞内のＤＮＡ合成を刺激化することを予測している。

他の細胞増殖実験を、ｒｈ　Ｉ　Ｌ　−４（２５Ｄ２）に対するモノクローナル 抗体類を添加した以外は上述の方法に厳密に項似する方法に従って行った。ＤＮ Ａ合成は観察されなかった。また、池の細胞増殖実験においては、抗ＩＬ−５（ ＴＲＦＫ）モノクローナル抗体類を添加したこと以外は上述の方法に従ったが、 ＩＬ−４によるＤＮＡ合成の制動は観察されなかった。

実施例２ コラーゲン合成の測定は、Ｍｏｎｒｏｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　 Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ　（１９８ｇ ）、　Ｖｏｌ　４９．２２９−２９８（７）方法に従ッテ行イ、ＣＣＤ　２７ｓ ｋｌ：　ト皮膚Ｈｍ芽細胞を２４穴のプレート（Ｐｒｉｍａｒｉａ社）に撒き、 実施例１について記載したように、０．１から５００単位／ｍＬのＣＨＯ由来Ｉ Ｌ−４と共にインキュベートした。細胞単層を１０μＣｉの（３Ｈ）−プロリン （Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｃｏｒｐ。

社）でパルスした。プレートを氷上に置き、細胞を掻き取って２００μＬの０２ Ｎ　ＮａＯＨ内に入れ、ポリプロピレン製試験管に移した。２ｍＬの５０％トリ クロロ酢酸（ＴＣＡ、）１５％タンニン酸を添加し、水上で１時間インキュベー ションを継続した。この試験管を、４０００ｇで、４℃で３０分間遠心し、ベレ ットを、以前に使用したものと同様のＴＣＡ／タンニン酸溶液で３回、次にアセ トンで３回洗浄した。ペレットを、Ｑ、５Ｎ　ＮａＯＨ１０，５Ｎ　酢酸緩衝液 に再懸濁させた。アリコートを、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂ ｉｏｃｈｅＩＩｌｉｃａｌｓ社、釦ｄｉａｎａｐｏ１ｉｓ、　ＩＮ、から入手し たコラゲナーゼを含む、もしくは、含まないこの緩衝液中で、４°Ｃで９０分間 インキュベートした。５００μＬのＴＣＡ／タンニン酸、及び、１００μＬの１ ｍｇ／ｍＬ　ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加して、この試験管を４°Ｃで ３０分間インキュベートした。次に、試験管を４０００ｇで３０分間遠心した。

上清をシンチレーション計測機で計測した。コラーゲン合成のパーセントは、以 下に示すように決定した。

％コラーゲン合成　＝ 図２にグラフで示した本実験のデータは、ＣＨＯ由来のＩＬ−４を添加したヒト 皮膚線維芽細胞（ＣＣＤ　２７ｓｋ）のインキュベーションの結果、タイプＩ及 び／叉はタイプ■のコラーゲン合成が２＠を上回って増大することを証明する。

実施例３ Ａｄｅｌｍａｎ−Ｇｒｉｌｌ、　Ｂ、　Ｃ，、ａｎｄ　Ｃｕ１ｌｙ、　Ｚ、Ｊ、 、　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　１４３：１７２−１V７ （１９９０）、及び、５ｅｎｉｏｒ、　Ｒ，Ｍ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃ １１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　７０：６１４−６１８　（１９W２） の方法を用いて、以下に示すように改変して、以下に示す走化性実験を行った。

Ａ、ＣＣＤ　２５ｓｋヒト皮膚線維芽細胞の遊走に影響を与えるｒｈｌＬ−４の 能力を、改変型ボイデン走化性チャンバーアッセイを使用して測定した。各穴は 、８μＭの孔を有するポリカーボネート膜からなる２重フィルター（Ｎｕｃｌｅ ｏｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ１社、　Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、　ＣＡ）によって上部と 下部に分割されている。このフィルターを、Ｖｉｔｒｏｇｅｎ　（Ｃｏｌｌａｇ ｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｏ、　ＣＡ）の溶液中に 、室温で４時間浸し、蒸留水で洗浄し、その後、空気乾爆させることにより表面 加工した。

下部を、２４０μＬのＰＤＧＦ含有対照培地で満たし、膜を被せ、更に、３５０ μＬの細胞懸濁液を添加した（１．５−３Ｘ１０’）。線維芽細胞の懸濁液は、 様々な濃度のｒｈＩＬ４　（０，１−１００μ／　ｍ　Ｌ　）と共にアッセイの 前に予め３日間インキュベートした集密単層細胞をトリプシン処理することによ り調製した。組み立てた改変型ポイデン走化性装置を、給温化しているインキュ ベーター内に、３７°Ｃで４時間放置し、その後、膜を除去し、９５％のエタノ ールで固定化し、裏返し、ヘモトキンリンで染色した。細胞遁走は、高出力顕微 鏡下において（Ｘ４００）、下部膜の細胞核を計数して決定した。通常、膜１枚 当たり３−４ケ所の視野を計測した。細胞遁走は、３点決定した視野光たりの細 胞数の平均として表した。

Ｂ、　ＰＤＧＦ及びザイモサンへのヒト皮膚線維芽細胞の走化性についてのＩＬ 　−４の効果を、４ｕｇのＰＤＧＦ及びザイモサンの存在下において実施例３Ａ の方法を使用して決定した。

図３において示した実験においては、ｒ　ｈ、　Ｉ　Ｌ　−４の存在下において 増殖したヒト皮膚線維芽細胞（ＣＣＤ　２７ｓｋ）について、血小板由来成長因 子（ＰＤＧＦ　：　４ナノグラム）へ遊走する能力を試験した。この結果は、Ｉ Ｌ−４により誘導されるＰＤＧＦへの遊走の濃度依存的増大を示している。それ とは対照的に、ザイモサンで活性化させたヒト血清への走化性は減少している。

我々は、様々な化学誘引剤類への走化性を調節するＩＬ−４のこの新しい活性が 、修復段階における創傷の治療及び修復の臨床療法に有効であることを期待して いる。

実施例４ ＩＬ−１で処理したＣＣＤ　２７ｓｋヒト皮膚線維芽細胞のＰＤＧＦへの走化性 についでのＩＬ−４の効果を、実施例３の方法に従い、以下に示すように改変し て測定した。

ヒト皮膚線維芽細胞（ＣＣ０２７ｓｋ）をｒ　ｈ　Ｉ　Ｌ　−１（Ｇｅｎｚｙｍ ｅ社）（１０もしくは１００単位／　ｍ　Ｌ　）で２４時間予め処理し、その後 、ｒｈＩＬ−４の非存在下及び存在下で増殖させた。ＩＬ−４に対するＩＬ−１ の比率は、以下に示す範囲にわたり変化させた。１１０．１／１０．１／１００ ．１０１０．１０／１０、及び、１０／１０帆その後、この方法で処理した細胞 について、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ　：　４ｕｇ）への遊走能力を試験し た。図４にグラフで示した結果は、ＩＬ−４により生じるＰＤＧＦへの遁走の濃 度依存的減少を証明している。

図４の結果に表されるように、ＩＬ−１により誘導される走化性の調節における ＩＬ−４のこの新しい活性は、修復期の創傷治癒及び修復の臨床療法、並びに、 ＩＬ−１により誘導される炎症の治療において有効であると思われる。

実施例５ ヒト皮膚線維芽細胞組繊細胞の増殖の、ＰＤＧＦによる刺激化を促進するｒｈＩ Ｌ−４の可能性を、Ｒ，Ｍａｒｇｉｓ　ｅｔ　ａｌ、＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９８９）、　Ｖｏ１１８１、、２０９−２１１の 方法に従って決定した。

Ａ　ヒト皮膚線維芽細胞、ＣＣＤ　１９ｓｋ、　ＣＣＤ　２７ｓｋ、及び、ＣＣ Ｄ　３４１ｕ　（穴当たり、３．０００から５．０００細胞）を、９６穴プレー ト（Ｐｒｉｍａｒｉａ−Ｆａｌｃｏｎ社）内に撒いた。ｒｈＩＬ−４の一連の２ 倍希釈液（１０００，５００，２５０，１２５，６２，５，３１，２５，１５６ ，７８，３，９）を、１０％ＦＣ３を補充したＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍに添加した。７２ 時間の培養後、用いた培地を除去し、以下に示す分光高度測定アッセイを使用し て細胞数を決定した。培地を除去した後、細胞層を、リン酸緩衝化生理食塩水（ ＰＢＳ）（ｐＨ７，２）で洗浄した。この細胞を、ＰＢＳ中４０％フォルマリン で固定した。細胞を、ｌｌａｒｇｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　（上述）の方法に従って 、１０％酢酸及び４０％メタノール中の０．　２％クマシー（ＢｉｏＲａｄ社） の溶液で染色した（穴当たり５０μｌ）。６０分後、染色液を除去した。次に、 各穴を蒸留水で洗浄し、５０％メタノール中（５０μｌ）のＯ，ＩＮ　ＮａＯＨ を添加して染料を溶出させた。Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｓ社、　Ｃｈａｎｔｉ ｌｌｙ　Ｖａ、から入手可能なＴｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ　ＭＣ上 で、各穴の吸光度を５９５ｎｍにおいて読み取った。

細胞数決定についての本アッセイの精度は、予め、血球系計数により測定した既 知の細胞数と、５９５ｎｍにおける吸光度との比較により評価した。ヒト線維芽 細胞の刺激化に対するＩＬ−４の効果の結果を、図５にグラフで示す。

Ｂ　ヒトの皮膚及び肺の線維芽細胞組繊細胞の増殖についてのＰＤＧＦの効果を 、ＰＤＧＦを一連の２倍希釈法（２，１，０，５，０，２５，０，１２５、領　 ０６２５．０．０３１３．０．０１５６、領　００７８ナノグラム／穴）により 各穴に添加したことを除いては、実施例５ａの方法に従って決定した。ＰＤＧＦ によるヒト皮膚組繊細胞の用量依存的刺激化を、図５ｂにグラフで示す。

Ｃ１ヒトの、肺以外の皮膚組繊細胞の刺激化におけるＩＬ−４による用量依存的 促進化を、ＩＬ−４およびＰＤＧＦを各穴に添加したことを除いては、実施例５ Ａの方法に従って決定した。

ヒト皮膚線維芽細胞組繊細胞株の増殖の、ＰＤＧＦによる刺激化に対するＩＬ− ４の用量依存的促進化を、図５０にグラフで示す。

実施例６ ヒト皮膚線維芽細胞組繊細胞の刺激化に対する、ｒｈＩＬ−４の用量依存的促進 効果を、ＰＤＧＦの代わりにＥＧＦを使用したことを除いては、実施例５Ａの方 法に従って決定した。

ヒト線維芽細胞皮膚組繊細胞の増殖に対するＥＧＦの用量依存的効果を図６ａ中 に示し、ヒト皮膚（肺ではない）の線維芽細胞組繊細胞増殖のＥＧＦによる刺激 化に対する、ｒｈＩＬ−４による用量依存的促進効果を図６ｂに示す。図６ｂの 結果から、創傷部位もしくはその近傍におけるＩＬ−４の投与は、創傷部位もし くはその近傍において既に存在するもしくは放出されたＥＧＦによるヒト皮膚線 維芽細胞の刺激化の促進により、創傷治癒及び修復を促進することが予測される 。ヒトの肺組織細胞の増殖における刺激化は観察されなかった。

実施例７ ＩＬ−４を用いた創傷治癒のインビトロにおける促進化体重２５０−３００グラ ムのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ種のオスのラット７２匹を、３５ｍｇ／ｋｇ のベントバルビッールを腹腔内注射することにより麻酔した。４つの１．５ｃｍ ”の穴を有するように設計された銅の鋳型を各うｙｈの背中の湾曲部にあてがっ た。この鋳型を使用して、各ラットの正中線上に、４ケ所の、筋肉層を含む最大 肥厚切除傷を作成した。

このラットを８つの群に分けた。最初の４つの群の創傷は感染させず、後の４つ の群には意図的に、５Ｘ１０’の大腸菌を混入させた。

対照群１は１０匹のラットを含んでいた。各ラットの創傷に、−日一回５日間、 ０．１ｍｌの食塩水賦形剤を注射した。

群２は１０匹のラットを含んでいた。各ラットの創傷に、−日一回５日間、創傷 の平方センチメートル面積当たり０．　１μｇのマウスＩＬ−４を注射した。

群３は１０匹のラットを含んでいた。各ラットの創傷に、−日一回５日間、創傷 の平方センナメートル面積当たり１．０ｕｇのマウスＩＬ−４を注射した。

群４は９匹のラットを含んでいた。各ラットの創傷に、−日一回５日間、創傷の 平方センナメートル面積当たり１００ｕｇのマウスＩＬ−４を注射した。

群５の感染対照群は９匹のラットを含んでいた。各ラットの創傷に５Ｘ１０’の 大腸菌を混入させ、かつ、０，１ｍｌの食塩水賦形剤を５日間毎日創傷内に注射 した。

群６は、感染させた創傷を有する８匹のラットを含んでいた。各ラットの創傷に ５Ｘ１０５の大腸菌を混入させた。各ラットの創傷に、−日一回５日間、創傷の 平方センナメートル面積当たり０．１μｇのマウスＩＬ−４を注射した。

群７は、感染させた創傷を有する７匹のラットを含んでいた。各ラットの創傷に ５Ｘ１０’の大腸菌を混入させた。各ラットの創傷に、−日一回５日間、創傷の 平方センナメートル面積当たり１．０ｕｇのマウスＩＬ−４を注射した。

群８は、感染させた創傷を有する９匹のラットを含んでいた。各ラットの創傷に ５Ｘ１０Ｓの大腸菌を混入させた。各ラットの創傷に、−日一回５日間、創傷の 平方センチメートル面積当たり１０．０ｕｇのマウスＩＬ−４を注射した。

この「混入させた」創傷には、新鮮な１８時間のブイヨン培養物から取得した５ Ｘ１０５の大腸菌ＡＴＣＣ＃２５９２２を接種した。これにより、急性の混入化 創傷を作成した。手術後、ラットをケージに戻し、食料と水とを随意に与えた。

ＩＬ−４もしくは賦形剤を創傷端に注射した。創傷が完全に閉鎖したとき、超過 用量のベントバルビッールを腹腔内注射することによりラットを屠殺した。各ラ ットの各創傷から生じた廠痕部分を、筋肉層を含む背面組織の８ｍｍの細長い切 片の一部分として切除した。切片は、殿痕部分に対して垂直に採取した。その後 、中心に搬痕を有するこれらの切片を、ｌＮ５ＴＩ？ＯＮ圧力機を使用して、５ ｋｇの負荷圧力と１分光たり１０ｍｍのクロスヘッドスピードで破砕した。得ら れた創傷の破壊強度を、搬痕粉砕に必要なピーク負荷として定義し、キログラム で表す。

結果を、図１、及び、以下の表１及び２に示す。

表１　非感染群 ラット数　処　置　平均値（ｋｇ）　標準偏差１０　対照　１．１０９　０．０ ４４ １０　ＩＬ−４（０，ｂｚｇ／ａｍ２）　０．９０３　０．０４４１０　ＩＬ− ４（１，０ｕｇ／ｃｍ２）　０．９４４　０．０６６９　１Ｌ−４（１０，０ｕ ｇ／ｃｍ２）　０．９８１　０．０２３対照と比較して、ｐ＜Ｑ、０５であった 。

表２　大腸菌感染群 ラット数　処　置　平均値（ｋｇ）　！準偏差９　感染（ＩＮＦ）対照　０．９ ３１　０．０４３Ｓ　ＩＮＦ＋ＩＬ−４（０，１μｇ／ａｍ”）　０．９５５　 ０．０４４７　ＩＮＦ＋ＩＬ−４（１，０μｇ／ｃｍ”）　１．１１１　０．０ ６３９　ＩＮ’Ｆ＋ＩＬ−４（１０，０μｇ／ａｍ２）　０．９９４　０．０５ １感染対照と比較して、ｐ＜０．００５であった。

図７は、感染させた急性の創傷治癒モデルｌこおける、創傷閉鎖の促進に対する ＩＬ−４治療の有効性を立証している。全ての時点において、ＩＬ−４は、感染 対照と比較して、開口したままの創傷の割合を低下させることができた。実際に 、ＩＬ−４治療は、処置されていない非感染性創傷に通常観察される比率での感 染性創傷の治癒を可能にした。表２のデータは、ＩＬ−４が、感染させた最大肥 厚切除創傷治癒の破壊強度を増大させることを示している。

実施例８ 本実験の主題は、糖尿病ラットにおける創傷治癒を誘導するＩＬ−４の能力の、 インビボにおける研究を提示することである。

４５ｍｇ／ｋｇのストレプトシトキシンを筋内向注射することにより、３２匹の ラットに真性糖尿病を誘導した。これらのラットを個別の代謝ケージで飼育し、 ラットの尿を、標準的な尿検査用細片技術により毎日テストして、糖尿とケトン 尿とを決定した。３日間連続して糖尿病が確認された後、動物をネンブタール全 身麻酔法を使用して麻酔した。上述の実施例７に記載した無菌技術を使用して、 最大肥厚の皮膚及び筋肉層にわたる５ｃｍの創傷を各ラットの背中に作成した。

その後、ラットを４つの群、即ち、０，１μｇのＩＬ−４を創傷端内に注射した 群、１．０μｇのＩＬ−４を創傷端内に注射した群、１０．０μｇのＩＬ−４を 創傷端内に注射した群、及び、食塩水賦形剤を創傷端内に注射した群に分けた。

損失を回避するために、動物が麻酔から覚醒し、興奮し始めたときにＩＬ−４を 注射した。その後、創傷を、５−０ナイロンの２本の単純縫合糸で閉鎖した。動 物を麻酔から回復させ、それぞれのケージに戻した。半数のラットを７日目に屠 殺し、残りの半数を創傷形成後１４日目に屠殺して、創傷の破壊強度によってコ ラーゲン成熟の初期及び後期変異を調べた。

各創傷の破壌強度を決定するために、皮膚及び皮下組織の１平方センチメートル の細片を創傷に対して垂直に採取した。破壊強度は、ｒＮｓＴＲＯＮ　Ｔｅｎｓ ｉｏｍｅｔｅｒ　４２０５を用い、５ｋｇの負荷及び１０ｍｍ／分のクロスへソ ドスピードで決定した。

破壊強度の増大は、創傷内のコラーゲンの沈着及び成熟に良く相関することが示 されている。この結果を図８及び９に示す。

図８及び９は、創傷形成後それぞれ７日及び１４日目における、非糖尿病及び糖 尿病ラットの創傷の破壊強度の増大に対するＩＬ−４の有効性を証明している。

左側の対照用グラフに見られるように、糖尿病の動物は治癒不全を示し、その結 果創傷の破壊強度が低くなる。ＩＬ−４による治療は、糖尿病の動物における破 壊強度を、非感染性の最高肥厚切除創傷治癒の破壊強度近くにまで増大させる。

ＩＬ４（単位／穴） 図１ １Ｌ４（単位／ｍ１） 自１°Ｖｏ　−〉１０’／ａ　ＦＣＳ ロ２６１０−〉１０％ＦＣ５ 図２ ＩＬ４（単位） 口ＰＤＧＦ　（４ｎｇ） ロザイモサン １１０　１／１０　１／ｊｏｏ　４０１０　１０／１０　ｆｏ／１００ＩＬＬ　 （単位）予備処理／ＩＬ４（単位）図４ ０　３．９　７，８　１５．６　３１．２５　６２．５　ｊ２５　２５０　５０ ０　１０００日ＣＣＤ３４ 図５ａ 図５ｂ ！Ｌ４　（単位／穴）／ＰＤＧＦ　（ｎ　ｇ／穴）ＥＧＦ　（ｎｇ／穴） ｒＬ４（単位／穴）／　ＥＧＦ　（ｎｇ／穴）図６ｂ 開口創傷のパーセントｉ（Ｘ１００） 図８ ７日後の創傷強度 図９ 請求の範囲 １．　創傷治癒及び修復の修復期の促進の必要とする哺乳類における創傷治癒及 び修復の修復期を促進させる方法であって、このような目的に有効な量のインタ ーロイキン−４（ＩＬ−４）を該修復期中に投与することを含む方法。

２、　真性糖尿病に苦しむ哺乳類の創傷の治癒及び修復を促進させる方法であっ て、このような目的に有効な量のＩＬ−４をその哺乳類の創傷に投与することを 含む方法。

３、　哺乳類の感染性創傷の治癒及び修復を促進させる方法であって、このよう な目的に有効な量のＩＬ−４をその哺乳類の感染性創傷に投与することを含む方 法。

国際調査報告 １酎１−−−＾−紬−−陶　ＰＣＴ ｌ、　０ＪｊＳｆｆｌＣＡｎＤＮ　ＯＦ　Ｓｌ；ＩＪＥｃＴ　ＭＡ　ｒ１裏１１ １−噌蝙−−−禦−リー―ａｐｐｌｙ、　−輪画ａｌｌ”Ｉｎｔ、Ｃ１，Ｓ　＾ ６１に　３７１０２　Ｃ０７に　ｌ５１００Ｉｎｔ、Ｃ１，Ｓ　＾６１　Ｋ　Ｃ ０７Ｋ１ｗ＋ｍｔｍｍｌｋａ＋Ｍｋｍｍ１１−ローーーーーー１ｍ＋ｂａ１コー ー−一ト膠Ｓｉ−−−デ嘴−−喝輪画”ＣＡ１吋−１Ｃｍｍｅ　ｄ　−ロー−、 ”　ｗｈｈ　ｌ−一＋１ｘ　吟−輪重−ｗｍ　ｄ　＋ｋｅ−−替り輪画一”　− ｌ。ｍ　Ｃｌ−Ｈ・f す、＾、９１１４４５０　（ＳＣＨＥＲＩＮＧＣＯＲＰＯＲＡＴＴＯＮ）　６− ９３０ｃｔｏｂｅｒ　１９９１．　ｓ＠ＩＩｐａｇ＠３；　ｓｅｅ　ｐａｇｅ　 ７．０ｎｅｓ２０−２８　” εＰ、＾、０４１０７５０　（ＳＣ）ＩＥＲＩＮＧ　ＣＯＲρ０ＲＡＴＩＯＮ） 　６−９ｉｎ　、’１ｎＡＩ＋ａｒｖ　ｎｑ＋　＜ｍｅ　ｆＩａａｅ　’）−’ ＮＩＩ＊　４’ｌ　−Ｄａａｅ　３゜ＰＭｍ　ＰＣＴＲ詰ｎ＋Ｏｌ期中−室蘭ｌ 　１噛猷＋２ｎ・ＰＩ４１２ｍ　鵠中国際調査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．創傷治癒及び修復の修復期の促進の必要とする哺乳類における創傷治癒及び 修復の修復期を促進させる方法であって、このような目的に有効な量のインター ロイキン−４（ＩＬ−４）を該修復期中に投与することを含む方法。
2. ２．ＩＬ−４を創傷部位もしくはその近傍に局所的に投与する、請求項１の方法 。
3. ３．真性糖尿病に苦しむ哺乳類の創傷の治癒及び修復を促進させる方法であって 、このような目的に有効な量のＩＬ−４をその哺乳類の創傷に投与することを含 む方法。
4. ４．哺乳類の感染性創傷の治癒及び修復を促進させる方法であって、このような 目的に有効な量のＩＬ−４をその哺乳類の感染性創傷に投与することを含む方法 。
5. ５．免疫緩和している哺乳類の創傷の治癒及び修復を促進させる方法であって、 このような目的に有効な量のＩＬ−４をその哺乳類の創傷に投与することを含む 方法。
6. ６．真性糖尿病に苦しむ哺乳類の創傷を治療するための薬剤学的組成物の製造に おけるＩＬ−４の用途。
7. ７．哺乳類の感染性創傷を治療するための薬剤学的組成物の製造におけるＩＬ− ４の用途。
8. ８．創傷治癒の修復期中に哺乳類の創傷を治療するための薬剤学的組成物の製造 におけるＩＬ−４の用途。
9. ９．免疫緩和させた哺乳類の創傷を治療するための薬剤学的組成物の製造におけ るＩＬ−４の用途。