JPH05507491A - 免疫原性ペプチド、抗体、及び、ｃｄ４レセプター結合に関するそれらの用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫原性ペプチド、抗体、及び、ＣＤ４レセプター結合に関するそれらの用途 本出願は、１９９０年５月１６日に提出されている米国特許出願整理番号０７１ ５２４，８３２の継続部分である。

本発明は、免疫原性ポリペプチド、そのようなポリペプチドに対する抗体、及び 、ＣＤ４レセプターを有するｇｐ１２０蛋白の結合を予防するためのそれらの用 途に関する。

ヒトノ免疫不全’）イルス（ＨＩ　Ｖ−１、ＨＴＬＶ−１１ｒ。

ＬＡＶもしくはＥ（ＴＬＶ−ｒ　ｒ　Ｉ／ＬＡＶとも引用すｔＬル）ハ、後天性 免疫不全症候群（Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓ）及び関連する疾患の病因学的作用因子である 。ｌ：Ｂａｒｒｅ−３ｉｎｏｕｓｓ　ｔ、ｅｔａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２０ ＋８６８−８７Ｌ（ユ９８３）；Ｇａ１ｌｏ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ（ １９８４）：Ｐｏｐｏｖｉｃ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：４９７ −５００　（１９８４）；Ｓａｒｎｇａｄｈａｒａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｓｃｉｅ ｎｃｅ２２４＋５０６−５０８　（１９８４）　；Ｓｉｅｇａｌ　ｅｔ１４３９ −１４４４　（１９８１）］。この疾患は、長期の無症状期間の後に、免疫系及 び中枢神経系の退化が進展するのが特徴である。ウィルスの研究により、複製が 高度に制限され、かつ、Ｔ−リンパ球のＣＤ４陽性ヘルパー細胞集団の潜在的及 び溶菌的感染が組織培養中で起こる［Ｚａｇｕｒｙ　ｅｔａｌ、、５ｃｉｅｎｃ ｅ　２３１：８５０−８５３（１９８６）］。感染した轡者におけるウィルスの 発現は、感染性ウィルスの力価が疾患過程全体を通して低く保たれるように調節 されているようにも思われる。ＨＩＶ−１の複製及びゲノム体制の分子的研究に より、それが多くの遺伝子をコードしていることが示されている［Ｒａｔｎｅｒ 　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３１３：２７７−２８４　（１９８５）；５ａ ｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２２７：４８ ４−４９２　（１９８５）；Ｍｕｅｓｆｎｇ　ｅｔ　ａｔ、、Ｎａｔｕｒｅ　３ １３４５０−４５７　（１９８５）；Ｖａｉｎ−Ｈｏｂｓｏｎ　ｅｔ伝子の内の ３種類、ｇａｇ、２−色」ユ、及び、ｅｎｖは、全てのレトロウィルスに共通で ある。ゲノムは、追加的な遺伝子をもコードしており、それは、多くのレトロウ ィルスには一般的で［５ｏｄｒｏｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、　、５ｃｉｅｎｃｅ　２ ３ユニ１５４９−１５５３　（１９８６）；Ａｒｙａ　ｅｔ　ａｌ、、１７１− １７３　（１９８５）；５ｏｄｒｏｓｋｉ　ｅｔａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２１ ：４１２−４１７（１９８６）；Ｆｅｉｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　 １旦：８０７−８１７（１９８６）；Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ、Ｗ、Ａ、、２４０（ １９８８）；ＣｏｈｅｎＳＥ、　ｅｔ　ａｌ、、べて引用文献として本明細書中 に取り込んである。］他のレトロウィルス類、特にＩ（Ｉｖ−２、及び、サルの 免疫不全ウィルス類、特に５ＴＶ（以前に５ＴＬＶ−１１１として引用した）か らのヌクレオチド配列は、ｅｎｖを含む構造遺伝子、並びに、二土ユ、ｒｅｖ、 及び、旦工艷コーのような調節配列をも含む［Ｇｕｙａｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、 Ｎａｔｕｒｅ　３２６：６８２−６６９　（１９８７）；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔ ｉｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２８：５４３−５４７（１９８７）、これは 、引用文献として本明細書中に取り込んである］。

）ＴＴＶ−Ｔ、ＨＩＶ−２、及び、ＳＩＶのｅｎｖ遺伝子全ては質膜の糖蛋白質 を作製し、それは切断され、その一部分がｇｐ１２０として引用されるウィルス の外包膜蛋白質サブユニットトナル。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、及ヒ、Ｓ■■ウ ィルスの、細胞との結合及び融合は、このｇｐ１２０ウィルス包膜蛋白質膜蛋白 質サブユニットと標的細胞表面上のＣＤ４レセプターとの間の特異的相互作用に より保持されている［Ｂｅｒｇｅｒ、Ｅ、Ａ、　、ｅｔ　ａｌ、　、ＰＮＡＳ　 ＵＳＡ８５　：　２３５７−２３６１　（１９８８）］。

ＨＩＭ感染を予防もしくは減少するために発案されている−っの方法は、可溶性 ＣＤ４分子の利用である。しかしながら、この方法は、臨床的に成功していると は未だ証明されていない。

標的細胞（７）ＣＤ４領域におけるＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、もしくは、ＳＩＶ のｐｇ蛋白質間の結合を特異的に妨げるための方法が存在するとしたら有用であ る。

ＣＤ４レセプターとのｇｐ１２０の結合の度合いを減少することができる抗体は 有用である。

更に、ＣＤ４分子とｇｐ１２０との間の特異的相互作用の理解は、免疫不全症疾 患を治療するためには重要である。

発明の要約 我々ハ、今回、ＨＩＶ−１、ＨＩ　Ｖ−２、もしくは、ＳＩＶウィルスのｅｎｖ 蛋白質ｇｐ１２０上の結合部位に対して特異性を宵する抗体を作製することに使 用することができる、特異的なエピトープを有する免疫原性ペプチドを発見した 。これらのペプチドを、ｇｐ１２０蛋白質の特定な指定されたエピトープに対し て特異的に結合するという特徴を有する抗体を作製させるために使用することが できる。これらのエピトープは、ＣＤ４レセプターとのｇｐ１２０の結合のため には重要である。

本発明により、哺乳類における、特にヒトにおける免疫不全性疾患を治療もしく は最低限にさせるための方法を開示する。

この方法は、開示されている免疫原性ペプチドを投与するもしくは本明細嘗中に 開示されている、ＨＩ　Ｖ−１、ＨＩＶ−２、もしくは、ＳＩＶの一つに対する 抗体の治療的な量を投与する、：　トｌ：　ヨリ、ＨｒＶ−４、ＨＩＶ−２、も しくは、ＳＩＶのエピトープの内の一つに対する抗体の形成を誘導することを含 む。

図の簡単な説明 図１は、ｇｐ１２０変位体の比較ＣＤ４結合能を示す。図１人は、５ｕＴ）ＴＩ ＩＪンパ球の表面に対して結合及び未結合のｇｐ１２０の量を示す、一連のオー トラジオグラフである。図ＩＢは、特異的なアミノ酸配列における変化に伴う比 較ＣＤ４結合能の減少率のＩ　ｏ　ｇ　Ｉ　Ｑ値を示すグラフである。

図２は、３６８／３７０及び４７０アミノ酸残基付近の、ＨＴＶ−１、ＨＩＶ− ２、及び、ＳＴｖウィルスの配列比較である。

図３は、ｇｐ１２０包膜蛋白質膜蛋白質びＣ４領域により形成される予想構造の 概略である。

図４は、比較ＣＤ４結合能（上部）、及び、ｇｐ１２０認識のためのヒトのモノ クローナル抗体（下部）における、ＨｒＶ−１のｇｐ１２０内でのアミノ酸変化 の効果を示す。

図５は、数種のｇｐ１２０突然変異体のための、ｇｌ）１２０に対するヒトのモ ノクローナル抗体に対する中和耐性を示す。

図６は、ｇｐ１２０包膜蛋白質膜蛋白質域付近に、β−ループにより形成される 予想３次元構造の概略である。

発明の詳細な説明 ヒトの免疫不全症ウィルスのタイプ１（ＨｒＶ−４）、タイプ２　（ＨＩＶ−２ ）　、及び、サルの免疫不全症ウィルス（、Ｓ　ＴＶ）Ｌよ６ＣＤ４　Ｌｆプタ ーノ、ｇｐ１２０（７）外側の質膜糖蛋白質との結合は、ウィルスの侵入及び細 胞変性効果にとって重要である［Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ、Ａ、Ｇ、、　ｅｔＪ、　 、ｅｔ　ａｌ、　、５ｃｉｅｎｃｅ　２３ユニ３８２−３８５　（１９８６）； ＬｉｆｓｏｎＳＪ、Ｄ、　、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２３ニア２５−７ ２９　（１９８６）：５ｏｄｒｏｓｋｉＳＪ、Ｄ、　、ｅｔ　ａｌ、　、Ｎａｔ ｕｒｅａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４４；９４−１０２（１９９０） ）。保存されているｇｐ１２０領域Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４、もしくは、Ｃ５における 挿入もしくは欠失は、ＣＤ４結合に影響を与えることが示されているが［Ｌａ５ ｋｙ、Ｌ。

Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　５０：９７５−９８５（１９８７）；Ｋｏｗａ ｌｓｋｉ、Ｍ、　、ｅｔ　ａｔ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２３７＋１３５１−１３５ ５　（１９８７）；Ｃｏｒｄｏｎｎｉｅｒ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ ４４６８　（１９８９）；Ｌｉｎ５ｋｅｓｙＳＰ、Ｓ、、ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｖｉ ｒｏｌ、　６２：３６９５−３６７２（１９８８）、これらは、引用文献として 本明細嘗中に取り込まれているコ、ｇｐ１２０の立体配座におけるこれらの変化 の効果は調査されていない。１６０カルボキシ末端のｇｐ１２０残基を構成する 蛋白質分解断片がＣＤ４に結合することが報告されており［ＮｙｇｒｅｎＳＡ、 　、ｅｔ　ａｌ、　、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｒ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８５：６５４３−６５４．６ 　（１９８８）コ、更に、Ｃ４もしくはＣ５に対する抗体が、ある覆の環境にお いてはＣＤ４結合を遮断することができることが報告されている［Ｌａ５ｋｙ、 Ｐ、Ｓ、、Ｄｏｗｂｅｎｋｏ、Ｄ、　、ｅｔ　ａ［、、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ。

６３：４７０３−４７１１　（１９８８）；Ｓｕｎ、Ｎ、Ｃ，、ｅｔ　ａｌ、、 Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３＋３５７９−３５８５　（１９８９）；Ａｒｃｉｍａ ｎＳＢ、　、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　ＡＩＤＳ　３：２０６−２１４（１９９０） ］、しがしながら、ＣＤ４結合に決定的な、これらの大領域内の特異的なアミノ 酸は未知である。

我々は、今回、ｇｐ１２０包膜蛋白質膜蛋白質結合能に顕著に影響を与える、ｇ ｐ１２０包膜蛋白質上の特異的部位を発見した。これらの領域は、ｔｈｒ　２５ ７、ａｓｐ　３６８、ｇｌｕ　３７０、及び、ａｓｐ　４５７に関連する（番号 付けは、ＨＶＩ−１のｇｐ１２０配列に基づイテおり、ＨＩＶ−２及びＳｒｖの アミノ酸配列Ｉは）［￥−１に一致する。図２を参照せよ）。これらのアミノ酸 を部位特異的な突然変異誘発により置換した結果、特定の場合において、野生型 蛋白質ものと比較する突然変異体のＣＤ４との結合能の減少が９０％を上回って いた。（図１を参照せよ）。従って、これらの部位の任意のものの遮断により、 ｇｐ１２０蛋白質のＣＤ４との結合能に劇的に影響を与えることができる。ａｓ ｐ　３６８、ｇｌｕ３７０、もしくは、ａｓｐ４５７部位を遮断することが好ま しい。理論に縛られたくはないのであるが、これは、天然のｇｐ１２０糖蛋白質 における水性環境にそれらが露出されることが予想されるためである。

これらのアミノ酸の遮断は、当業者に良く知られている数々の方法の任意のもの により行うことができ、それは、４つのエピトープ、つまり、ｔｈｒ　２５７、 ａｓｐ　３６８、ｇｌｕ３７０、もしくは、ａｓｐ　４５７の内の一つに対して 特異的な抗体のようなものである。例としては、これらの具体的な領域の任意の ものに対して特異的な免疫原性ポリペプチドを取得することである。その後、こ の免疫原性ポリペプチドを、これらの結合性部位（エピトープ）の少なくとも一 つに対して特異的な抗体を作製するのに用いる。一つの好ましい実施態様におい ては、この免疫原性ポリペプチドを、インビボ、つまり以下に論議するようにヒ トにおいて抗体を作製するのに使用する。

又、これらのエピトープの一つを上回るものを含む含むペプチドを使用して巨大 な不連続のエピトープを作成し、これらの部位の一つを上回るものを遮断するよ うな不連続なエピトープに対する抗体を生じさせることができる。本明細書中に 記載されているｇｐ１２０突然変異体のペプチドのようなペプチドを使用するこ とが好ましい。

目下記載中の抗体は、モノクローナルもしくはポリクローナル抗体のいずれかで あることができる。更に、本明細書中に用いられているように、その用語は、イ ムノグロブリン全体、並びに、その抗原結合断片を含む。このような抗体を調製 する目的で、数々の良く知られている技術の任意のものを使用することができる 。例えば、４種類の指定されたエピトープの内の一つを含むペプチド、及び、抗 体結合選択性を使用することができる特徴的なエピトープを定義するのに充分な 量のフランキング残基である。前述したように、一つを上回るこれらの部位を含 むペプチドを利用して、事実上、巨大な不連続なエピトープを作成することがで きる。ある実施態様においては、使用されるペプチドが、天然蛋白質における全 てのＣＤ４結合部位を含まないことが好ましい（我々は、ｇｐ１２０突然変異体 として、天然のｇｐ１２０蛋白質とは異なるアミノ酸を有するペプチドを、本明 細書中において引用する）。このペプチドは化学的に合成することができる。ペ プチドの合成は、当業者に良く知られている（例えば、　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ 、Ｒ，Ｂ、　）Ｂｉｏｃｙｈｅｍｉｓｔｒｙ　３＋１３８５−１３９０（１９６ ０）；米国特許番号４．．８３９．３４４　（これらは、引用文献として本明細 書中に取り込まれている）を参照せよ）。

市販のペプチド合成機を入手することができ、かつ、ペプチドを作製するために 使用することができる。

このポリペプチドは、指定された蛋白質断片のエピトープが何かを定義するのに 充分なアミノ酸残基を含む必要があるが、検出される蛋白質の立体配座とは異な る限定的な立体配座を有するほど大きい必要は無い。しかしながら、ペプチド断 片があまりに短すぎる場合には、その断片は、無関係な他の蛋白質中に見いださ れ、かつ、免役された担体蛋白質中に物理学的に埋もれてしまう。単一の部位に 対する、もしくは、例えば３６８と３７０のように近接しながら間をあけて存在 する複数の部位に対するペプチドが５から１８までのアミノ酸の範囲に及ぶこと が典型的である。特別な部位に有用である正確なサイズは、当業者により、本開 示から、簡単に決定することができる。

その免疫原性を増大させる目的で、ペプチドは、ペプチドのいずれかの端、例え ば、第１、第２、最後、もしくは、最後から２番目の位置において、システィン のようなアミノ酸を含むことができる。ペプチドは、鍵穴カサガイのヘモシアニ ンもしくはランの血清アルブミンのような担体蛋白質に対して、ゲルトアルデヒ ドを用いて［Ｗａｌｔｅｒ、Ｇ、　、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

７７　：　５１９７−５２０１　（１９８０）　、これは、引用文献として本明 細書中に取り込んである］、もしくは、システィン残基を通して［Ｃａｒｌｓｏ ｎ、Ｊ、　、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１７３ニア２３　（１９ ７８）、これは、引用文献として本明細暑中に取り込んである］、複合体形成し ていることができる。このペプチド・担体蛋白質複合体を、その後、宿主動物内 へ挿入して抗体を作製する。好ましい宿主動物はヒトである。

一つの好ましいペプチドは、エピトープとしてａｓｐ３６８とｇｌｕ　３７０と の両方を含む。作製される抗体が、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０に対するものである ことが好ましい。

しかしながら、）（ＴＶ−２もしくはＳＩＶに対する抗体は、本開示に基づき簡 単に作製される。例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、及び、ｓｒｖ中の３６８及 び３７０アミノ酸配列における強い保存の度合いを示している図２を参照せよ。

ＳＩｖ株ＭＮＤにおいては、グルタミン酸は、カルボキシ末端から３７０位まで に２残基が配置されている［Ｔｓｕ　ｊ　ｉｍｏ　ｔｏ、）１．、ｅｔ　ａｌｌ 、Ｎａｔｕｒｅ　３４１：５３９−５４１（１９８９）、これは、引用文献とし て取り込まれている］。

ａｓｐ　４５７位付近にも実質的な配列相同性が存在する。本発明による好まし い免疫原性ペプチドは、両端を挟まれたアミノ酸として、より強く保存されてい るアミノ酸を含む。例えば、位置３６６−３７０、つまり、ＧＧＤＰＥ、からの ａｓｐ３６８もしくはｇｌｕ　３７０についてである。ａ９ｐ３６８もしくはｇ ｌｕ　３７０ペプチドについては、調製することができるペプチドは、ＧＧＤＰ ＥｒＴＴＨ。

ＧＧＤＰＥ　ＩＶＭＨ，５ＳＧＧＤＰＥ　ＩＶＴＨ。

Ｓ　Ｓ　Ｇ　Ｇ　Ｄ　Ｐ　Ｅ　Ｉ　Ｖ　Ｍ　Ｈ、Ｓ　Ｓ　Ｇ　Ｇ　Ｄ　Ｐ　Ｅ　 Ｉ　Ｖ　Ｔ　ＨＳ　Ｆ　Ｎ　Ｃ。

（全てＨＴＶ−１について）、あるいは、ＧＫＧＳＤＰＥＶＡＹＭＷＴＮＣＣＨ ＩＶ−２について）を含む。ＡＳＰ　４５７ペプチドについて調製することので きるペプチドは、Ｃ３５ＮＩＴＧＬＬＬＴＲＤＧＧ。

Ｃ５５ＮｒＴＧＩＬＬＴＲＤＧＧ。

ＣＳ　Ｓ　Ｎ　Ｉ　Ｔ　Ｇ　Ｌ　Ｌ　Ｌ　Ｔ　ＲＤ　Ｇ　Ｇ　Ｎ　Ｓ　Ｎ　（Ｈ Ｅ　Ｖ　１　ニ対シテ）又はｃＮｓＴＶＴｓ　Ｔ　ＦＡＮ　ｒＤＷＱＮＮ　（Ｈ Ｔ　Ｖ−２１，：対しテ）テアル。ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、もシ＜ハ、ＳＴｖ の突然変異体のアミノ酸配列に相当する他のペプチドをも使用することができる 。保存的なアミノ酸変異の結果としてこれらの配列とは異なる配列をも使用する ことができ、これらの例とはいずれかの末端における２、３のアミノ酸が異なっ ているペプチドも同様である。

エピトープはウィルス内における高い可変率の領域に近接しているものの、すぐ 両端を挟んでいるアミノ酸は可変ではない。

用いられるフランキングアミノ酸は、抗体を作製することを希望する特有のエピ トープ、もしくは、その複数、及び、ｇｐ１２０に依存しており、かつ、本開示 に基づき、当業者により簡単に決定することができる。１つか２つの近接しなが ら間隔をおく部位に対するペプチドは、少なくとも約５つのアミノ酸の長さがあ り、かつ、約２０個のアミノ酸の長さを越えないことが好ましい。更に、それが 、少なくとも約８個のアミノ酸の長さであり、かつ、１８個のアミノ酸の長さを 越えないことがより好ましい。このペプチドが、１５個と１８個の間のアミノ酸 の長さであることが、更により好ましい。

数々の特有なエピトープ構成要素から生しる不連続なエピトープに対する抗体を 作製することも好ましい。我々は、数種の抗体が、ＣＤ４結合部位に近接した部 位に対して強固に反応すると思われることを発見した。例えば、多様な範囲のＨ ＩＶ単離物（マーシャル　ボスナー社からのもの）からｇｌ）１２０糖蛋白質を 認識する、ＨＴＶ−１に感染した固体に由来するヒトのモノクローナル抗体であ るＦ２Ｏ３は、アミノ酸２５６−２５７．３６８−３７０．４２１、もしくは、 ４７０−４８４における変異を認識しているようである。従って、４種類の不連 続な領域に存在するＨＩＶ−４のｇｐ１２０残基におけるアミノ酸の変異は、こ の広範囲な中和抗体による認識の一１的な減少という結果をもたらす。上述の残 基における多数の置換を含み、Ｆ１０５認識が減少しており、ｇｐ１２０突然変 異体の全体的な立体配座の変化を明らかに伴わないｇｐ１２０突然変異体を使用 することで、特定の突然変異体は、この抗体による機能の中和を回避した。不連 続なエピトープを形成する２つの構成成分は、２５６−２５７及び３６８−３７ ０であり、これらは、上述のＣＤ４エピトープの結合部位の内の３つを含む。

Ｆ１０５抗体による認識は、これらの残基における異なる置換に対しては、ＣＤ ４結合よりもより感度が高かった。この不連続なエピトープの第３の構成成分は りシン４２１であり、これは、トリプトファン４２７に近接している。トリプト ファン４２７における変異は、ＣＤ４結合能の劇的な減少を引き起こすが、Ｆ１ ０５認識については減少は起こらない。従って、この抗体は、明らかに、ＣＤ４ が行うよりも、第４の保存されたｇｐ１２０領域における、より親水性の断片を 認識している。

ＣＤ４結合に影響を与える第４のＣＤ４エピトープ領域、つまり、アスパラギン 酸４５７は、抗体の認識には影響を及ぼさないように思われるが、ｇｐ１２０残 基の４７０−４８４に存在する不連続エピトープの一部を形成する他の構成要素 を有する天然のｇｐ１２０糖蛋白賀に近接していると考えられる理由が存在する いｇｐ１２Ｑの短い第５の可変領域を対照的に挟み込んでいる両方の親水性領域 は強力なβ−ターンポテンシャルを示し、我々は、これが、天然の糖蛋白質にお けるこれらの領域の並置を結果として引き起こすことができ、そのために、残基 ４７０−４８４がアスパラギン酸４５７付近の領域に近接するものと考えている （図６を参照せよ）。この図においては、ｇｐ１２０の予想される３次元構造を 見た場合、４５７（ＤＧＧＮＳＮＮ、、、）における東１ターンがどの程度、４ ７４−４７８　（ＤＭＲＤ）におけるこのＩＫ２ターンに近いかを示している。

当然、アスパラギン酸４５７における、より破壊的な立体配座的変化の幾つかの ものは（例えば、４５７Ｄ／Ｒ）　、抗体認識に影響を与える一方で、４７０− ４８４頭域における、より破壊的な立体配座的変化の幾つかのものは（例えば、 ４７７　Ｄ／Ｖ、もしくは、４８２／４８３／４８４ＥＬＹ／ＧＲ，Ａ）　、Ｃ Ｄ４結合において僅かな影響を示す。

従って、この不連続なエピトープの大部分を含むｇｐ１２０蛋白質を抗体作製に おいて使用することは有用である。アミノ酸残基において変異が存在し、このよ うな抗体を作製するために希望するエピトープの露出を増大させる、突然変異体 ｇｐ１２０蛋白質を用いることが好ましい。不連続なエピトープの露出を増大さ せる方法の例は：　（１）ｇｐｔ２ｏ分子から可変領域を除去しながらも、全体 的な立体配座を野生型蛋白質のものと近似させて保持すること；　（２）特別な 糖添加部位を除去すること：及び、（３）エピトープの直線成分に近接している ｇｌ）１２０残基において、単一のアミノ酸変異を作成すること、である。本明 細書において用いられているように「近接する」は、ｇｐ１２０の３次元構造に おける近位を意味する。

ｇｐ１２０蛋白質の蛋白類域は既知である。１種類もしくは複数の可変領域部分 を除去することが好ましい。例えば、突然変異体ｇｐ１２０蛋白質（もしくは、 ペプチド）１１９−２０５は、ｖｌ及びｖ２領域を除去させられ、そのために、 例えば、Ｆ１０５抗体により認識される不連続なエピトープ領域に対する露出が 増大する。他の可変領域を除去することもできる。本開示に基づく免疫沈降のよ うな既知の方法により、特別な欠失が希望するエピトープの露出を増大させるか 否かを経験的に簡単に決定することができる。

糖添加部位に関しては、希望するエピトープ、もしくは、希望する不連続なエピ トープのエピトープ構成成分に「近接する」糖添加部位は、除去することが好ま しい。例えば、３５６もしくは２６２における部位である。これらの部位は、当 業者に良く知られている方法により除去することができる。例えば、ある糖添加 部位は配列ＮＸ　（Ｔ、もしくは、Ｓ）を有して０る（このＸは任意のアミノ酸 である）。Ｎもしくは（Ｔ、もしくは、Ｓ）の、異なるアミノ酸への部位特異的 突然変異誘発は、糖添加部位を除去する。例えば、突然変異体ｇｐｔ２ｏ蛋白質 ３５６Ｎ／ｌである。

これらの異なるアミノ酸変異もしくは欠失の一つを上回るものを組み合わせるこ とが好ましい。更に、エピトープの立体配座構造に不利な影響を与えない、この 蛋白質の他の部位を欠失及び／叉は変異させることが可能である（例えば、Ｎ末 端における変異）。

以下に示す部位の内の少なくとも一つにおける変異の結果生じる突然変異体は、 ある好ましい群である＋２６６．３５６．３８１．４２７．４３２．４３５．４ ３８．４９３、及び、以下に示す突然変異体を使用することが好ましい＋１１９ −２０５．２６６　Ａ／Ｅ、３５６　Ｎ／Ｉ、３８１　Ｅ／Ｐ。

４２７　Ｗ／Ｓ、４２７　Ｗ／Ｖ、４３２　Ｋ／Ａ、４３５Ｙ／Ｈ，４３８Ｐ／ Ｒ，４９３Ｐ／に、及び、４９５Ｇ／に０ 上述のペプチドを作製する際に、当業者に良く知られた多様な方法を使用するこ とができる。例えば、天然のｇｐ１２０蛋白質を用いて、更に、部位特異的突然 変異誘発により、ｇｐ１２０突然変異他あいを作成することができる。それに代 わる方法として、あるいは、上述のものとの組み合わせで、Ｈｒｖのｇｐ１２０ 蛋白賀に相当する蛋白質を用い、更に、非必須領域を開裂することができる。そ れに代わる方法として、標準的な蛋白質合成を用いて、不連続なエピトープ領域 を含むべ゛ブチドを合成することができる。

好ましい実施態様においては、免疫原性ペプチドを使用して、ｇｐ１２０上のＣ Ｏ２結合部位の内の少な（とも一つに特異的な抗体を誘導させることができる。

これらのペプチドを、免疫予防もしくは免疫療法のために使用することができる 。例えば、ＨＩＶ−１もしく　ハＨＩ　Ｖ　−２＋７）　ｇ　Ｉ）　１２０１： 相当する結合部位を含むこれらのペプチドの、ＨＩＶに感染していない固体への 投与は、結果的には、その固体のＨＩＶ感染を妨げるもしくは予防する、ｇｐ１ ２０ｅｎｖ蛋白質の、既に記載した結合部位に対する抗体を作製することになる 。感染している固体におるこれらの抗体のインビボにおける作製が、他の細胞の 更なる感染を予防もしくは遅延させるのを補助することができる。一連の抗体を 誘導させる目的で、種々のエピトープに対するペプチドの配合物を用いることが 好ましい。前述したように、このペプチドは、他の部分、例えば、担体蛋白質と 複合体形成することができ、これにより、ペプチドの免疫原性が増大する。

これに代わる実施態様においては、治療を受けるべき固体以外の宿主動物におい て抗体を調製することができる。これらのペプチドから作製される抗体は、指定 されている特定の応用法及び／又はエピトープ付近の蛋白の変異性に応じてポリ クローナルもしくはモノクローナルであることができる。前述したように、これ らの抗体を、当業者には良く知られている技術により調製することができる。例 えば、その蛋白質の希望する断片もしくは化学的に合成したペプチドを、鍵穴カ サガイのヘモシアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）と複合体形成させ、更に、ウサギのような 動物において抗体を作製するのに使用することができる。典型的には、ペプチド −ＫＬＨＩ合体を数回、約２か月の期間にわたって注射して抗体を作製する。抗 体に対して、限定されたｇｐ１２０領域の露出の増大を示す、上述したような突 然変異体ｇｐ１２０糖蛋白質を合成して、動物もしくはヒトに接種することがで きる。その後、抗体を、標準的な技術により血清から回収する。これに代わる方 法として、ハイブリドーマ細胞を形成するための標準的な融合技術を用いること により、そのペプチドに対する抗体を産生ずる細胞において、モノクローナル抗 体を産生させることができる［Ｋｏ　ｈ　Ｉ　ｅ　ｒＳＧ−、ｅ　ｔａｌ、、Ｎ ａｔｕｒｅ　２５６＋４９５（１９７５）、これは引用文献として取り込まれて いるコ。典型的には、これは、抗体産生細胞の、骨髄腫細胞のような不滅の細胞 株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を産生ずることに関連している。他の方法 においては、モノクローナル抗体を、引用文献として本明細書中に取り込まれて いるＨｕｓｅ、ｅｔ　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅある実施例においては、ハイブリド ーマを、免疫原性ペプチドの内の一つを用いて、マウスの免疫化により作製する ことができる。このマウスを、充分量のペプチドを用いて、腹腔内で（ｉ、Ｉ） 、　）免役することができる。その後、すぐに、例えば、Ｈ２Ｏ中のシクロフオ スフォアミドのｉ、ｐ、注射を行うことができる。このシクロフォスフオアミド 治療を、１次注射の後１．２日繰り返す。免疫化の後約２週間で、マウスを充分 量のペプチドで再度注射し、更にその後、更に２週間休ませる。

２次注射の後４日目に、その動物を層殺し、１次融合のためにその膵臓を取り出 す。

ハイブリドーマは、ポリエチレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ）法により、５Ｐ２１ ０骨髄腫細胞を有する免役したマウスからのように、典型的な技術により細胞を 融合することにより作製する。

細胞を免役したマウスから無菌的に除去し、更に、血清を含まない培地（例えば 、ＤＭＥ）で膵臓を一面に広げることにより、膵臓細胞単−な細胞懸濁液を取得 する。膵臓細胞と骨髄腫細胞とを共に、例えば、５対１の、膵臓細胞対骨髄細胞 の比率で混合する。その後、この細胞を遠心し、更に、吸引により上清を除去す る。その後、この細胞を、標準的な技術により、培地中で増殖させる。融合過程 の後に増殖する／％イブリドーマを、その後、細胞抽出物について、ＥＬｒＳＡ アッセイにより、ｇｐ１２０のエピトープに特異的な抗体の分泌についてふるい 分ける。陽性結果を示すハイブリドーマを増やし、更に、限定希釈によりクロー ン化して、その細胞及び結果として生じる抗体が本当にモノクローナルであるか を確認する。希望するｇｐ１２０エピトープの内の一つに対する抗体の産主につ いて陽性結果を示すハイブリドーマコロニーを、例えば１．ミリリットル当たり ５つのハイブリドーマ細胞の濃度に、培地中で希釈する。

一旦コロニーが増殖したら、その上清を再度、ｇｐ１２０エピトープに対する抗 体の存在についてテストする。ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイによりテストした場合に 結果が陽性であれば、そのコロニーを再び、限定希釈によりクローン化する。

ＨＩＶ−４、ＨｒＶ−２、もシくハ、ＳＩｖウィルスのｇｐ１２０エピトープに 対するこのようなペプチドにより生じたペプチド及び抗体の両方を、ウィルスに よる細胞の感染を予防もしくは最低限にするるために使用することができる。そ の細胞がヒトの細胞であることが好ましい。この方法は、そめウィルスを有する ことが疑われる哺乳類からの液体もしくは細胞試料に対するペプチドもしくは抗 体の、治療効果量を投与することを含む。体液試料を使用することが好ましい。

その哺乳類が霊長類であることが好ましく、それがヒトであることが更に好まし い。治療のためにインビボにおいて用いる場合、本発明の抗体を、他の細胞へ侵 入するウィルスの能力を除去もしくは減少させる量で、患者に投与する。この抗 体は、ｇｐ１２０蛋白質の結合部位を遮断するように作用し、更に、それにより 、細胞に侵入しかつ生殖するウィルスの能力を減少させる。このペプチドもしく は突然変異体蛋白質を充分量投与して、ウィルスが細胞内へ侵入する能力を減少 もしくは除去させるのに充分な抗体を作製する。本発明に記載のペプチド及び／ 叉は抗体の両方を混ぜ合わせた反応混合液を使用することもできる。

抗体もしくはペプチドを、数々の方法の内の任意のものにより配給することがで きる。例えば、いずれのものも、非経口注射（筋肉内（ｉ、ｍ、）、腹腔内（ｊ 、ｐ、）、静脈内（ｉ。

Ｖ、）、もしくは、皮下（Ｓ、Ｃ，））、経口もしくは当業者に良くしられてい る投与の他の経路により投与することができる。非経口投与が好ましい。

使用される量は、典型的には、約０．１ｍｇから約Ｌ　Ｏｍｇ／Ｋｇ（体重）の 範囲である。その抗体及びペプチドは、単位用量形態において処方されることが 好ましい。

例えば、経口投与に用いることができる固体用量形態には、カプセル類、錠剤類 、ビル類、粉末類、及び、顆粒類がある。

このような固体用量形態においては、例えば、抗体もしくはペプチドのような活 性成分を、シタ等、乳糖、もしくは、澱粉のような、少なくとも一つの不活性担 体を混合する。このような用量形態は、例えば、ステアリン酸マグネシウムのよ うな潤滑剤のような、不活性希釈剤以外の付加的物質をも含むことができる。更 に、カプセル類、錠剤類、及び、ビル類の場合における用量形態は、緩衝用試薬 を含むこともできる。錠剤類、カプセル類、及び、ビル類は、時間放出被膜加工 を含むこともできる。

非経口投与については、典型的には、薬剤学的に容認される非経口用賦形剤と配 合しである滅菌した水性もしくは非水性溶液、懸濁液、もしくは、乳化液を含む 。非水性溶液もしくは賦形剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリ コール、オリーブ油及びトウモロコシ油のような植物油類、ゼラチン、及び、オ レイン酸エチルのような注射可能な有機エステル類である。これらの用量形態は 、保存用、湿潤化用、乳化用、及び分散用試薬を含むことができる。これらを、 例えば、細菌保持用のフィルターを通しての濾過、組成物中に滅菌した試薬を混 合させること、組成物を放射線照射すること等により、抗体を不活性化させない ように注意するかぎり滅菌することができる。

これらを、使用する前に、滅菌した水の培地もしくはある種の他の滅菌した注射 可能な培地中で製造することができる。これらの賦形剤の更に別の例には、食塩 水、リンゲル溶液、デキストローズ溶液、及び、５％のヒトの血清アルブミンが ある。リポソームを担体として使用することもできる。例えば、緩衝液及び保存 剤のように等偏性及び化学的安定性を元通させる物質のような付加物を使用する こともできる。このような賦形剤における活性成分の好ましい範囲は、約１ｍｇ ／ｍｌから約１０ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｉまでの濃度である。より好ましくは、約３ ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌである。

これらの抗体を担体として使用することができる。このように、これらを希望す る化学的部分をｇｐ１２０上のエピトープに配給するために使用することができ る。例えば、これらを、ｍ胞障害剤、あるいは、例えば、細菌もしくは植物起源 の酵素的に活性な物質を配給するために使用することができる。例えば、これら の部位のうちの一つにおいてｇｐ１２０を開裂し、更に、そのため、結合部位を 除去する酵素を配給することは、特に利点がある。他の実施態様においては、こ れらの抗体を、その部位もしくは近接した部位をキャップする他の分子を配給す るために使用することができる。これは、ウィルス性のｇｐ１２０ウィルスの３ ６８もしくは３７０部位のいずれかに対する抗体を使用と特に有効である。ｇｐ １２０のＣＤ４レセプターに対する結合を妨害する任意の分子を使用することが できる。

当然、以下に論議するようなラベル類の利用により、ＣＤ４レセプターとの結合 を予防もしくは妨害するための抗体能を元通することができる。

これらの結合性エピトープ部位を遮断するために抗体を使用することに加え、こ れらの部位を遮断する他の方法を使用することができる。例えば、３６８−３７ ０及び４５７残基は直線の１２０アミノ酸配列に基づくと非常に距離があるよう に思われるが、我々は、これらは天然分子上では近接しているものと予想してい る。図３を参照せよ。このモデルは、３７８及び４４５におけるｇｐ１２０のシ スティン残基はジスルフィド架橋で結合されているという観察に基づいており、 従って、その２つの領域は（図に）示されるような構造を形成することができる 。更に、３つの全ての残基、つまり、３８８．３７０．及び、４５７残基は親水 性領域内に位置しており、β−ターンを形成するための強いポテンシャルを示す 。この性質及び比較配置により、抗体の他に更にこれらの部位を遮断する化学的 方法を使用できることが示される。従って、この３つの部位を遮断するための、 例えば化学的部分のような物質の有効量を投与する方法を使用することもできる 。前述したように、これらの部位にやはり近接している他の領域が存在し、それ らは同様に影響を受ける。

ｇｐ１２０蛋白質の存在、及び、従って患者内のウィルスの存在を検出するため の免疫アッセイ過程において使用するため、あるいは、ウィルスを有すると指摘 されている患者におけるウィルスの状態を記録するためにこれらの抗体をラベル 化することもできる。更に、上述したように、そのラベル化物が抗体に対して数 種のより大きい立体障害を提供して、ｇｐ１２０のＣｄ４レセプターに対する結 合を予防する抗体能を先進させることができる。疾患の状態を記録するために使 用される場合には、定量的な免疫アッセイ法を使用するべきである。例えば、こ れらの抗体による疾患の治療追跡するためにこれを使用することができる。この 免疫アッセイは、通常の当業者により簡単に測定できる。

ｇｐ１２０のレベル、及び、そのレベルに変化があったかどうかの両方を測定す ることができる。試料採取された物質について得られた基準線レベルに対して結 果を比較することができる。更に、様々な時間に同一の固体から試料を採取して 、継続的なレベルの比較を行うことができる。

本発明に従って、抗体、あるいは、例えば抗体プローブのようなプローブ類の反 応混合液を、検出のために使用することができる。例えば、抗体であるこのプロ ーブを、従来の技術を用いて、レポーターで直接、もしくは、特異的結合対の要 素で間接的にラベル化することができる。

特異的結合対は、免疫もしくは非免疫種であることができる。

免疫性特異的結合対の例は、ハブテン／抗ハブテン系の抗原−抗体系である。こ れらには、フルオレセイン／抗フルオレセイン、ジニトロフェニル／抗ジニトロ フェニル、ビオチン／抗ビオチン、ペプチド／抗ペプチド、及び、その類のもの がある。

非免疫性結合対は、２種類の成分が互いに天然の親和性を共有するが、抗体では ない系を含む。例としての非免疫性対は、ビオチン−ストレプトアビジン、固有 因子−ビタミンＢ１２、葉酸−葉酸塩結合蛋白質、及び、その類のものである。

多様な方法を、特異的結合対の要素で抗体を共有結合的にラベル化するために用 いることができる。方法は、特異的結合対の要素の性質、希望する結合の種類、 及び、多様な複合体形成化学試薬に体する抗体の耐性に基づいて選択する。ビオ チンは、市販品として手に入れることができる活性誘導体類を利用することによ り、抗体に共有結合的にカップルさせることができる。

これらの幾つかのものは、蛋白質上のアミン基に結合するヒドロキシ−スクシン イミド、カルボジイミドカップリングを通して、炭水化物部分、アルデヒド類、 及び、カルボキシル基に結合するビオチンヒドラジド；及び、スルフヒドリル（ 水硫）基に結合するビオチンマレイミド及びヨードアセチルビオチンである。フ ルオレセインは、フルオレセインイソチオシアン酸塩を使用して、蛋白質のアミ ン基にカップルさせることができる。

ジニトロフェニル基は、２．４−ジニトロベンゼン硫酸モジくは２．４−ジニト ロフルオロベンゼンを使用して、蛋白質のアミン基にカップルさせることができ る。複合体形成の他の標準的な方法を、モノクローナル抗体を利用して特異的結 合対の要素に対してカップルさせることができ、それは、ジアルデヒド、カルボ ジイミドカップリング、均質官能基間での架橋結合、及び、不均質二重官能基間 での架橋結合を含む。カルボジイミドカップリングは、市販品として手に入れる ことができる試薬である１−エチル−３−（ジメチル−アミノプロピル）−カル ボジイミド（ＥＤＡＣ）を使用することにより促進される。

二重官能基であるイミドエステル類及び二重官能基であるＮ−ヒドロキシスクシ ンイミドエステル類を含む、均質官能基である架橋形成体類は、市販品として手 に入れることができ、かつ、これらを、ある物質上のアミン基を他の物質上のア ミン基へとカップリングさせるために利用する。不均質二重官能基である架橋結 合体類は、異なる官能基を保持する試薬類である。

最も一般的な、市販品として手に入れることができる、不均質二重官能基である 架橋形成体類は、一つの官能基としてアミン反応性のＮ−ヒドロキシスクシンイ ミドエステルを、更に、策２官能基としてスルフヒドリル反応基を有する。最も 一般的なスルフヒドリル反応基は、マレイミド類、ビラジルジスルフィド類、及 び、活性ハロゲン類である。官能基の一つは、光活性を有するアリルナイトレン であることができ、これは、光照射に際して多様な基と反応する。

検出用にラベル化したプローブ、例えば抗体、検出用にラベル化した抗体、もし くは、検出用にラベル化した特異的結合対の要素を、ラジオ活性を有する同位体 、酵素、フルオレン原性、化学ルミネセント用、もしくは、電子化学的物質であ ることができるレポーターにカップルさせる。２種類の一般的に用いられている ラジオ活性同位体は、　ｆ及び３Ｈである。標準的なラジオ活性同位体ラベル化 法は、　■については、クロラミンＴ１ラクトパーオキシダーゼ、及び、ブルド ン−ハンター法が、３Ｈについては、還元メチル化がある。

本発明における用途に適する酵素には、西洋ワサビのパーオキシダーゼ、アルカ リフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルンフ ェラーゼ、β−ラクタマーゼ、ウレアーゼ、及び、リゾチームがあるが、これら に限定はされない。

酵素のラベル化は、抗体の特異的結合対の要素とのカップリングについて上述し たような、ジアルデヒド、カルボジイミドカップリング、均質官能基である架橋 結合体類、及び、不均質二重官能基である架橋結合体類を使用することにより促 進される。

選択されるラベル化法は、ラベル化されるべき酵素及び物質上で有効な官能基、 及び、その両者の、複合体形成条件に対する耐性に依存する。本発明において使 用されるラベル化法は、引用文献として取り込んである、Ｅｎｇｖａｌｌ　ａｎ ｄＰｅａｒｌｍａｎｎ、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　旦：８７１（１９７ １）、Ａｖｒａｍｅａｓ　ａｎｄＴｅｒｎｙｎｃｋ、ＴｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉＳ ｔｒｙ　８：１１７５　（１９７５）、及び、Ｊａｂｌｏｎｓｋｉ、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４８：１９９　（１９８５）、により記載されているもの を含む、最近利用される任意の従来的方法のうちの一つであることができるが、 これらに限定はされない。

ラベル化は、スペーサーもしくは特異的結合対の他の要素を用いるような間接的 な方法により行うことができる。この例は、ラベル化していないストレプトアビ ジンとビオチニル化した酵素とを、更に、ストレプトアビジンとビオチニル化し た酵素とを、連続しであるいは同時に添加する、ビオチニル化した抗体の検出で ある。そのため、本発明に従い、検出に使用される抗体を、レポータで直接的に 、あるいは、特異的結合対の第１要素で間接的に、検出用にラベル化することが できる。抗体を、特異的結合対の第１要素に対してカップルさせる場合、検出は 、抗体−特異的結合の第１要素複合体を、上述したように、ラベル化したもしく はしていない結合対の第２要素と反応させることにより、行われる。

更に、ラベル化していない検出用抗体は、そのラベル化していない抗体を、ラベ ル化していない抗体に特異的なラベル化した抗体と反応させることにより検出す ることができる。このような抗〜抗体を、先に論議した任意の方法を使用して、 直接的にあるいは間接的にラベル化することができる。例えば、抗−抗体を、先 に論議したストレブトアビンンー西洋ワサビパーオキシダーゼ系と反応させるこ とにより検出されるビオチンに対してカップルさせることができる。

ある好ましい実施態様は、ビオチンを利用している。このビオチニル化された抗 体を、次に、ストレプトアビジン−西洋ワサビパーオキシダーゼ複合隊と反応さ せる。オルトフェニレンジアミン、４−クロロ−ナフトール、もしくは、テトラ メチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して、色素原に関する検出を行うことができ る。本発明を実行するための好ましい免疫アッセイ型は、従来の技術を使用して 支持体の表面上に捕獲用試薬を固定化する、前進的なサンドイッチアッセイであ る。アッセイにおいて使用される好ましい支持体には、ポリエチレン、ポリスチ レン、置換したポリスチレン（例えば、アミン化したあるいはカルボキシル化し たポリスチレン）のような合成ポｒＪマー支持体類；ポリアクリルアミド類、ポ リアミド類；ポリビニル塩化物、等；ガラスピーズ；アガロース；ニトロセルロ ール、等がある。

本発明は、以下に示す実施例により更に詳しく説明される。

これらの実施例は、本発明の理解を補助するために提供され、その制限として解 釈されるべきではない。

実施例 ＣＯ３−１細胞を、Ｃｕ　Ｉ　Ｉ　ｅｎ％Ｂ、Ｒ３、Ｍｅ　ｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５２＋６８４−７０３（１９８７）、のＤＥＡＥ−デキスト ラン法により、野生型もしくは突然変異したＨＸＢ２ｅｎｖ遺伝子のいずれかを 含む、１０ミリグラムのｐｓＶＩＩｒｅｎｖプラスミドでトランスフェクトさせ た。

このｐｓＶＩＩＩｅ二ｌプラスミドに、ｇｐ１６０の質膜前駆体を高レベルで過 渡的に発現させる［Ｈｅ１ｓｅｔｈ　Ｅ、、ｅｔ　ａｌ、　、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ 、　６４：２４１６−２４２０　（１９９０）、これは、引用文献として本明細 書中に取り込まれている］。トランスフェクシＪンの４８時間後、３５　： 細胞を、　Ｓ−ノステインでラベル化した。蛋白質分解的な開裂を受けるｇｐｉ ｓｏ突然変異体については、成熟したｇｐ１２０の外側の質膜糖蛋白質をトラン スフェクトしたＣＯ５−１細胞の上溝中に検出することができ、これは、ｇｐ４ １膜透過性糖蛋白質とのｇｐ１２０の会合が不安定なためである。トランスフェ クトしたＣ０９−１細胞の上滑中に存在するラジオラベル化したｇｐ１２０を使 用して、５ｕｐＴ１リンｌく球の表面上のＣＤ４分子に対する結合能を評定した 。ラベル化した上清を、５Ｘ１０７の５ｕｐＴＬリンパ球と、３７℃で１時間イ ンキュベートした。この５ｕｐＴ１細胞を、リン酸緩衝化した食塩水で一度洗浄 して、１．０ｍｌのＲＩＰＡ溶菌緩衝液中で溶菌し、更に、Ｈｅ１ｓｅｔｈ、Ｅ 、、ｅｔ　ａ！、、Ｊ、−Ｖｉｒｏｌ、　６４、（上述）において記載されてい るように、過剰の１９５０１のＡ、　Ｉ　Ｄ　Ｓ患者の血清を用いる免疫沈降の ために用いた。

沈降物を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析し、更に、以下に記載するよ うに、密度測定によりオートラジオグラムを定量した。ｇｐ１２０もしくは突然 変異体ｇＴ）１２０の結合以前に細胞を０ＫＴ４ａ　（オルト　ダイアグノステ ィック社）で予めインキユベートすることを除く、これらの過程を使用した試験 的研究により、５ｕｐＴｌリンパ球に対するｇｐ１２０の結合は、ＣＤ４分子へ の依存関係を示す０ＫＴ４ａモノクローナル抗体により完全に遮断されることが 証明された。

このｐｓＶＩ　Ｉ　Ｉ　ｅｎｖプラスミドのＫｐｎｌ−ＢａｍＨ１断片を、Ｋｕ ｎｋｅｌ、Ｔ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５４：３６７−３８２（１９８７）、の方法に従い、部位 特異的突然変異誘発のために使用した。突然変異の存在を、幾つかの場合におい ては新種の制限エンドヌクレアーゼ部位の作成により、及び、Ｓａｎｇｅ、Ｆ、 　、ｅ　ｔけるようなりＮＡ配列決定により証明した。突然変異を起こしてｅｎ ｖ断片の各々につき２種類の独立したクローンを調製してＣ４結合アッセイに使 用して、希望する突然変異からの自発側な突然範囲の距離が、観察される表現型 にかなっていないことを確認した。表１における数々の突然変異体は、ＨＩｖ− ４のＨＸＢｃ２株の質膜糖蛋白質のアミノ酸残基を意味し、ここで、１は最初の メチオニンである［Ｍｙｅｒｓ、Ｇ、　、ｅｔａｌ、（編集）、ヒトのレトロウ ィルス及びＡＴＤＳ　Ｃロスアラモス　ナショナル　ラボラトリ−、ニューメキ シコ州〕（１９８８）、これは、引用文献として本明細畜中に取り込まれている ］。

野生型及び突然変異体ｇｐ１２０の結合及び遊離型を、過剰の１９５０１　ＡＩ ＤＳ患者の抗血清を用いるラジオラベル化した蛋白質の免疫沈降により測定し、 その蛋白質を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析し、更に、ｇｐ１２０の バンドを密度型でスキャンした。ＣＤ４結合実験の全ては、ＣＤ４の独活がｇｐ １２０結合について限定されない条件下において行ったため（データー未発表） 、算出された比結合能は、突然変異体：野生型結合定数の真の比率に近似してい る。結合、遊離のｇｐ１２０の比率は、ｇｐ１２０の独活の２０倍を越えて測定 され、かつ、変化しなかった。別の実験においては、ＣＤ４の比結合能は、報告 された価の１０パーセントを上回って変化することがなかった。これらの結果に ついての比結合能は、以下に示す式から算出した。

［ｇｐＬ２０結合］　＊ｇｔ、１ｌｓＸ　［ｇ　ｐ１２０遊駒□１ＨＴＶ−１、 ＨＩＶ−２、ＳＴＭｍａｃ、及び、ｓｒｖａｇｒｎのｇｐ１２０の外側の質膜の 糖蛋白質中では保存されているアミノ酸で、本研究において変化したものを表１ に示す。

表１ Ｅ（ｒＶ−１のｇｌ）１２０突然！異体（７）ＣＤ４Ｍ合能アミノ酸変異８　比 較ＣＤ４結合能５ 野生型　１．００ ３６　Ｖ／Ｌ　１．　４４ ４０　Ｙ／Ｄ　１．２３ ４５　Ｗ／Ｓ　０．　８４ ６９　Ｗ／Ｌ　１．　３６ ７６　Ｐ／Ｙ　１．３６ ７６　Ｐ／Ｎ　１．１６ ８０　Ｎ／ＲＯ，６２ ８８Ｎ／Ｐ　Ｏ，８９ ９１Ｅ／Ｒ１，２１ ９３／９４　ＦＤ／ＴＲＮＰｃ １０２　Ｅ／Ｌ　Ｏ，８２ １０３Ｑ／Ｆ　Ｏ，６２ １０８Ｅ／Ａ　１．５３ １１３　Ｄ／Ａ　１．１６ １１３　Ｄ／ＲＯ，８５ １１７Ｋ／Ｗ　１．０６ １２０／１２１　ＶＫ／ＬＥ　Ｏ，５１１２５Ｌ／Ｇ　１．３１ ２０７　Ｋ／Ｗ　１．０２ ２２７　Ｋ／Ｅ　ＮＰ’ ２５２　Ｒ／Ｗ　２．５ ２５６　Ｓ／Ｙ　Ｏ，３０ ２５６Ｓ／ＲＮＰ ２５７　Ｔ／ＲＯ，１６ ２９８Ｒ／Ｇ　１．００ ３１４　Ｇ／Ｗ　Ｏ，５４ ３６８Ｄ／Ｒ＜０．００４ ３６８　Ｄ／Ｐ　Ｏ，０９ ３６８Ｄ／Ｔ　Ｏ，３３ ３７０Ｅ／Ｒ＜０．００３ ３７０　Ｅ／Ｄ　Ｏ，４５ ３７７Ｎ／Ｋ　Ｏ，６９ ３８０Ｇ／Ｆ　Ｏ，７８ ３８１Ｅ／Ｐ　１．０９ ３８２　Ｆ／Ｌ　２．７ ３８４　Ｙ／Ｅ　Ｏ，２９ ３９１Ｆ／Ｑ　ＮＰｃ ３９５　Ｗ／３　１．　１１ ４２Ｏｒ／Ｒ１，２４ ４２１Ｋ／Ｌ　Ｏ，５５ ４３５Ｙ／Ｈ１，４３ ４３５Ｙ／Ｓ　Ｏ，７７ ４３８Ｐ／Ｒ２，３ ４４７Ｓ／Ｉ　Ｏ，２７ ４５７Ｄ／Ａ　０．０９ ４．７０　Ｐ／Ｌ　Ｏ，５４ ４７４Ｄ／Ａ、　１．０１ ４７５　Ｍ／３　１．０３ ４７６　Ｒ，／Ｄ　Ｏ，７１ ４７７Ｄ／ＲＮＰｃ ４．７７　Ｄ／Ｖ　Ｏ，３９ ４７７Ｄ／Ｓ　Ｏ，５３ ４８２／４８３／４．８４　ＥＬＹ／ＧＲＡ　Ｏ，４４４，８５Ｋ／Ｖ　Ｏ，７ ９ ４８６／４８７　ＹＫ／ＷＰ　ＮＰｃ ３９５　１／Ｆ　１．２８ ４９３　Ｐ／Ｋ　１．７８ ４９５　Ｇ／Ｋ　１．７１ ４９７／４９８／４９９　ＡＰＴ／ＶＬＬ　Ｏ，９８５００１５０１ＫＡ／ＫＧ ＩＰＫＡ　Ｏ，９１ａ／　突然変異の結果、左側のアミノ酸の代わりに右側のア ミノ酸置換を生じ；例えば、２７３　Ｒ／Ｔは、位置２７３におけるアルギニン 残基に代わるイソロイシンの置換を示す。使用されている一文字アミノ酸の略称 は以下に示すとうりである　Ａ、Ａｌａ；Ｃ５Ｃｙｓ；ＤＳＡｓｐ；Ｅ、Ｇｌｕ ；Ｆ。

Ｐｈｅ　；Ｇ、Ｇｌｙ　；Ｍ、Ｍｉ　ｓ　；　Ｉ、ｒｌｅ：に、Ｌｙｓ；ＬＳＬ ｅｕ　：Ｍｓ　Ｍｅｔ　；Ｎ５Ａｓｈ；Ｐ、Ｐｒｏ　；Ｑ。

Ｇｌｎ；Ｒ，Ａｒｇ；Ｓ、Ｓｅｒ　；Ｔ、Ｔｈｒ　；ｖ、Ｖａｌ；Ｗ、Ｔｒｐ； 及び、Ｙ、Ｔｙｒｏ ｂ／　比較ＣＤ４結合能は、以下に示す式を用いて算出した＝［ｇｐ１２０遊蜆 □＋ｕ＋ｍＸ　［ｇ　９１２０結合］、−ｃ／　ｇｐ１２０前駆体のｇｐ１２０ とｇｐ４１糖蛋白賀への不十分なプロセシングが、これらの突然変異体について 観察された。ＣＤ４結合能は測定しなかった。

プロセシング用の指数は、突然変異体ｇｐ１６０の質膜糖蛋白質前駆除の、成熟 したｇｌ）１２０への変換の、野生型糖蛋白質の変換と比較した測定値である。

トランスフェクトしたｃｏｓ−ｉ細胞を、先に記載したように、３５Ｓ−システ ィンで１２時間継続的にラベル化し、更に、細胞抽出物及び上清を、先に記載し たようにＡ　Ｉ　Ｄ　Ｓ　、！！者の血清で免疫沈降させた。ｇｐ１６０及びｇ ｐ１２０糖蛋白質の量は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルのオートラジオグラ ムの密度測定スキャンを行うことにより、以下に示す式に従って算出されるプロ セシング指数を用いて決定した：〔総ｇｐ１２０］　ｗｇｔ＊−［ｇｐ：１６０ １１！１１包膜発現性ＣＯ３−１細胞における突然変異体ｇｐ１２０分子とｇｐ ４１分子の間の会合の、野生型糖蛋白質のものと比較した測定値である、会合指 数を、その後算出した。細胞抽出物及び上清を、先に記載したようにプロセシン グし、更に、以下に示す式に従ってその指数を算出した・［細胞ｇｐ１２０］　 １１１１ｔｌ＃Ｘ　ｌ１１ｇｐ１２０］　＊＊＊結果を以下の表２に示す。

表２ 選択したｇｐ１２０突然変異体の性質 野生型　１．００　１．００　１．００２５６　Ｓ／Ｙ　Ｏ，３００，１７０， １７２５７Ｔ／Ｒ０，１６０，４３１，００２６２Ｎ／Ｔ　Ｏ，２１０，０７０ ，１４３６８Ｄ／Ｐ　０．　０９　０．　９４　０．　９１３６８　Ｄ／Ｔ　Ｏ ，３３０，８８０，９３３６８Ｄ／Ｒ＜０．００４　龜７９　０．９７３７０　 Ｅ／Ｒ＜０．００３　０．６７　０．８５３７０　Ｅ／Ｄ　Ｏ，４５０，９３０ ，９９３８４Ｙ／Ｅ　０．　２９　１．　００　０．　３５４４７　Ｓ／Ｉ　Ｏ ，２７０，０７０，２９４５７Ｄ／Ａ　Ｏ，０９０，８８０，７６４７７Ｄ／Ｖ 　０．３９　０．２０　Ｌ　００４８２．３．４　ＥＬＹ／ＧＲＡ　０．４４　 ０．２３　０ａ／　比較ＣＤ４結合能についての価は、表１から取得した。

ｂ／ ［総ｇｐ１２０コ　□ｔ＋＋ｍＸ　［：ｇ　ｐ１６０］　□。

Ｃ／ ［細胞ｇｐ１２０］＊□□×比清ｇｐ１２０］□。

これらの方法を用いて、我々は、ＣＤ４に結合しかつｇｐ１２０結合部位を定義 することができる、霊長類の免疫不全症ウィルス内で保存されている全てのｇｐ １２０アミノ酸を変異させた。３つのｇｐ１２０残基（Ｃ３領域内のａｓｐ　３ ６８及びｇｌｕ　３７０．及び、Ｃ４領域内のａｓｐ　４５７）における変異の 結果、前駆体のプロセッシング、サブユニ・ノド会合、及び、モノクローナル抗 体の認識は、野生型の糖蛋白質ものと類似してるものの、ＣＤ４結合における９ ０／々−セントを上回る減少を示す糖蛋白質を生じた。これらの３つの酸性残基 はｇｌ）１２０領域内に位置しており、この領域は、親水性特性、β−ターン形 成についての強固な傾向、Ｂ細胞のエピトープのように作用するための予想され るポテンシャル、及び、グリコジル化された高度な可変領域への近接、という特 徴を共有している［ＭｙｅｒｓＳＧ、　、ｅｔ　ａｌ、　、ヒトのレトロウィル ス及びＡＩＤＳ、（上述）；Ｍｏｄｒｏｗ、Ｓ、　、ｅ　を図ＩＡは、結果の数 々の例を示し、これを、突然変異体ｇｐ１２０糖蛋白質のＣＤ４結合能を算出す るのに使用し、表１及び図ＩＢを参照せよ。図ＩＡは、Ｓ　ｕ　ｐ　Ｔ　１　’ Ｊンバ球の表面に対して結合した（Ｂ）ｇｐ１２ｏ、並びに、結合しなかった（ Ｆ）ｇｐ１２０を、野生型及び突然変異体糖蛋白質の両方について示している。

図ＩＢにおいては、特定のアミノ酸残基における最も破壊的な変異について観察 される、比較ＣＤ４結合能の低下の１０　ｇ　ＩＱ値が示されている。白抜きの 棒は、野生型の糖蛋白質のものの４０パーセントを下回るプロセシングもしくは 会合指数を示す突然変異体糖蛋白質を表す。黒塗りの棒は、プロセシング及び会 合指数の両方が野生型の価の少なくとも４０パーセントである突然変異体糖蛋白 質を表す。ＨｒＶ−１の２９１２０分子の直線配列を示し、保存領域を白く、可 変領域を黒くしである。数はアミノ酸残基を示す。Ｓ＝シグナル配列。

９つの例外が存在するものの、全ての突然変異体の質膜糖蛋白質は、Ｃ０８−１ 細胞の上清中に検出される２９１２０分子へとプロセシングされる。導入された アミノ酸変異の大部分が保存的でないとしても、大多数のｇｐ１２Ｑ突然変異体 はＣＤ４結合能を示すが、これは、野生型のものの２倍を越えるほど差があるも のではない。これらの結果により、良好に保存されているｇｐ１２０残基の大多 数が、本来、高い親和性のＣＤ４結合に必須ではないということが示される。

１３の残基における単一のアミノ酸変異の結果、野生型のｇｐ１２０の５０％を 下回るＣＯ２結合能を示す糖蛋白質を生じた。ｇｐ１６０前駆体のプロセシング 、発現性細胞上でのｇｐ４１糖蛋白質とのｇｐ１２０分子の会合、及び、立体配 座依存的ｇｌ）１２０エピトープを認識する２つのモノクローナル抗体の、突然 変異体糖蛋白質を沈殿させる能力についての、誘導した変異の効果を、図２を参 考にしながら、先に記載したように調査した。突然変異体の幾つかのもの（２５ ６Ｓ／Ｙ。

２６２　Ｎ／Ｔ、３８４　Ｙ／Ｅ、４４７　Ｓ／Ｉ、４７７Ｄ／Ｖ、及び、４８ ２／４８３／４８４．　ＥＬＹ／ＧＲＡ）　は、前駆体のプロセシングもしくは 細胞会合のいずれかにおいて６０パーセントを上回る減少を示し、これは、ｇｐ １２０における重要な局所もしくは全体の立体配座変異がこれらのアミノ酸変化 の結果生じたことの可能性を示唆している。両方のモノクローナル抗体による野 生型及び１３全ての突然変異体ｇｐ１２０分子の認識は類似しており、これによ り、ｇｐｉｓｏ前躯体のプロセシング及び細胞会合が色層構造における変化のよ り感受性の高い指標であることが示唆される。

ＣＯ２結合能における最も顕著な減少は、ｔｂ、ｒ２５７、ａｓｐ　３６８、ｇ ｌｕ　３７０、及び、ａｓｐ　４５７を含む変異について観察された。比較ＣＤ ４結合法における９０％を上回る減少は、これらの残基に影響を与える突然変異 の幾つかものによる結果生じた。ｇｐ１６０のプロセシング及びｇｐ１２０の細 胞会合におけるこの変異の効果は、実質的にはより高いＣＯ２結合能を示す他の 突然変異体について観察されるものと比較すると小さいものである（表２、及び 、データー未発表）。スレオニン　２５７のアルギニンへの変換はＣＯ２結合能 を８４％減少させるが、一方で、アラニンもしくはグリシンへのより保存的な変 異の結果、殆ど野生型の結合能を有するｇｐ１２０蛋白質を生じた。これらの結 果により、この残基における完全なアミノ酸範囲は、ＣＤ４結合を劇的に破壊す ることができ、スレオニンの存在は、ＣＤ４結合にとって不可欠ではないことが 示される。

ｇｐＬ２０糖蛋白質の２つの領域にある酸性残基の幾つかの変異の結果、つまり 、ａｓｐ　３６８／ｇｌｕ　３７０及びａｓｐ　４５７、ＣＤ４結合における顕 著な減少が生じた。検出可能なＣＤ４結合の完全な喪失は、残基３６８もしくは ３７０の、陽性に荷電しているアミノ酸への変異に関連していた。結合親和性の 減少は、これらの残基における他の変異について、ｇｌｕ　３７０のアスパラギ ン酸への保存的な変異についてさえも示された。

２つのクラスの中和用抗体を、ＨｒＶ−１感染したヒト（これは、種限定的であ り、広い反応性を示す）に対して誘導する。

種限定的である中和用抗体は、感染したヒトにおいて初期に生じ、更に、ｇｐ１ ２０ポリペプチドの多様な調製物を用いる免疫化により動物において簡単に作製 することができる［ＰｕｔｎｅｙＳｅｔ　ａｌ、　、５ｃｉｅｎｃｅ　２３４＋ １３９２　（１９８６）；Ｍａｔｔｈｅｗｓ、ｅｔ　ａｌ、、Ｇｏｕｄｓｍｉｔ Ｓｅｔ　ａｌ、、Ｖａｃｃｉｎｅ　６：２２９（１９８８）］。Ｎ限定的な抗体 の最も良く性質決定されているものは、ｇｐ１２０のｖ３可変領域に対するもの であり　：Ｐｕｔｎｅｙ、ａｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２３４　、上述；Ｍ ａｔｔｈｅｗｓＳｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３％上述、Ｎａｒａ、ｅ ｔ　ａｌ、　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ｇｏｕｄｓｍｉｔ、ｅｔ　ａｌ、、Ｖａｃｃｉｎｅ　６、上述；Ｒｕ５ｃｈｅ、 ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８５：３１８９（１９８８）　；Ｊａｖ ａｈｅｒｉａｎＳ　ｅｔ　ａｌ、、り形成されるループ内に含まれている［Ｌｅ ｏｎａｒｄ　ｅｔａｌ、、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５：１０３７３ 　（１９９０）］。直線のエピトープ及び外側のエピトープ内における質膜の糖 蛋白質の変化により、これらの抗体による中和からウィルスを回避させることが できるｒＬｏｏｎｅｙ、　ｅｔ　ａｌ、　、５ｃｉｅｎｃｅ　２４１＋３５７（ １９８８）；ＭｃＫｅａｔｉｎｇ、ｅｔ　ａｌ、、の抗体はＣＤ４結合を遮断し ないが、ウィルス侵入及びシンシチウム形成に関連したレセプター結合以前の事 柄、おそらくは、膜融合の成分を明らかに妨害している［５ｋｉｎｎｅｔ。

ヒトのＦ（ＴＶ−１間性の過程における後期に、より広範囲にわたるＨＩＶ−１ の単離物を中和することができる抗体が出現６９　（１９８５）：Ｒｏｂｅｒｔ −ＧｕｒｏｆｆＳｅｔＲｏｂｅｒｔ−Ｇｕｒｏｆｆ、ｅｔ　ａｌ、、ＡＩＤＳ（ １，９８６）］。これらの広域中和用抗体を動物において誘導するのは困難であ り、かつ、活性感染中に蓄積する多様なＨＩＶ−１単離物に対する付加的な抗− ｖ３０−プの反応性のみが結果として得られるわけではない［Ｐｒｏｆｙ、ｅｔ ａｌ、、Ｊ、　Ｔｍｍｕｎｏｌ、　１±４＋４６４１（１９９０）］。大部分の ＨＴＶ−１感染した固体から発見される、広範囲に反応する一連の抗体は、ｇｐ １２０とＣＤ４と者血清においてのみ観察され、これらの抗体の力価及び／叉は 親和性が低いことを示唆している。これらの抗体は、天然のｇｐ１２０とのみ反 応し、還元されたｇ’　ｐ　１２０とは反応しない血清の固体中に存在し、これ らの抗体の少なくとも幾つかが不連続なｇｐ１２０エピトープを認識しているこ とを示唆している：Ｐｕｔｎｅｙ１　ｅｔ　ａｌ、　、５ｃｉｅｎｃｅ　ん３４ ：１３９２　（１９８６）　；Ｍａｔｔｈｅｗｓ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

上述；ＨａｉｇｗｏｏｄＳｅｔ　ａｌ、、１ｎＶａｃｃｉｎｅｓ　９０：３１３ （コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−プレス社、１９９０）：Ａｒｄ ｍａｎ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　ＡｒＤＳ　３：２０６　（１９９０）　コ　。

このエピトープの不連続性及び叡者血清中に発見された様々な抗体の混合物が、 広範囲中和用抗体により認識されるエビｈ−ブの性質決定を困難にしている。最 近、ｇｐ１２０−ＣＤ４結合を遮断する多様な範囲のＨＩＶ−１単離物に由来す るｇｐ１２０糖蛋白質を認識し、かつ、ウィルス感染を中和する、ＨＩＶ−１感 染した固体に由来するヒトのモノクローナル抗体か同定された。このようなヒト のモノクローナル抗体の一つは、Ｆ２Ｏ３と表示されている［Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｌｅｔ　ａｌ、、ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ、Ｈｕｍ、Ｒｅｔｒｏ、　６：５８７（１９ ９０）；Ｈｏ、ｅｔ　ａｌ、　、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６：４８９（１９９１） ；Ｔｉ１ｌｅｙ、ｅｔ　ａｌ、、　ｉｎ（Ｍ、Ｇｉｒａｒｄ及びり、Ｖａ　＋　 ｅ　ｔ　ｔ　ｅｆｌＡＪＩＬパリ（１９９０）］　。

Ｆ１０５抗体は多様なＨｒＶ−１単履物を認識する。その結果、ＨＩＶ−１株中 で保存されるアミノ酸は、不連続なＦ１０５エピトープの重大な成分を構成する 。Ｆ１０５抗体による認識にとって重要なｇｐ１２０アミノ酸は、先に議論した ように、保存される残基において変化させられる一連のＨｒＶ−１のｇｐ１２０ 突然変異体との、抗体の反応性により同定された。

ＨｒＶ−１のＨＸＢ　ｃ　２株の野生型もしくは突然変異”体の質膜糖蛋白質を 発現するプラスミドでトランスフェクトしたＣＯ３−１際棒からの、ラジオラベ ル化した細胞抽出物は、Ｆ１０５抗体もしくはＨＴＶ−１感染したヒトに由来す る血清混合物のいずれかで沈降化した。混合した患者血清が、大部分が突然変異 体の糖蛋白質におけるアミノ酸変異により影響を受けない複数のｇｐｔ２ｏエピ トープを認識するため、後述の沈降化により、その細胞抽出物中に存在する突然 変異体の色層糖蛋白質の量を査定することができる。野生型の色層糖蛋白質のも のと比較して特定の突然変異体の質膜精蛋白質がＦ１０５抗体により認識される 能力を表すＦ２Ｏ３の認識指数は、表３の説明文中に記載されているように算出 した。

この免疫沈降化実験の結果を、表３及び図４に示す。図４は、比較ＣＤ４結合能 及びＦ１０５認識についての、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０におけるアミノ酸変異の 効果を示す。）ＩＩＶ−４の２９１２０分子の直線配列を図４に示し、保存領域 に薄い影を付け、可変領域に黒い影を付けである。シグナル配列（Ｓ）及び保存 領域（ＣＩ−Ｃ５）の位置を、アミノ酸番号で示しである。アミノ酸の番号付け は、最初のメチオニンに相当する残基１を基準にしである。ｇｐ１２０の直線地 図の上に、特定のアミノ酸における最も破壊的な変化について観察される比較Ｃ Ｄ４結合能の、負のｌｏｇ数をプロットしである（図４の上部）。白抜きの棒は 、野生型の価の４０パーセントを下回るｇｌ）１６０前駆体のプロセシングもし くはｇｐ１２０−ｇｐ４１の会合についての指数を示す突然変異体糖蛋白質を表 す。

ｇｐ１２０の直線地図の下には、特定のアミノ酸における最も破壊的な変異につ いて観察されるＦ１０５抗体の認識指数の負のｌｏｇ数をプロットしである（図 ４の下部）。

Ｆ１０５抗体は、大部分の突然変異体のｇｐ１６０及びｇｐ１２０形態の両方を 、少なくとも野生型の色層糖蛋白質を沈降化させるのと同程度に沈降化させた。

アミノ酸２５６−２５７．３６８−３７０．４２１、もしくは、４７０−４８４ における変異を有する突然変異体糖蛋白質は、Ｆ１０５抗体により沈降化される 能力が著しく減少していることを示す。単一のｇｐ１２０残基における複数のア ミノ酸置換を調べた場合には、先の４つの領域における全ての変異は、結果とし てＦ１０５認識を著しく減少させていた。Ｆ１０５認識の減少を示すｇｐ１２０ 突然変異体の大部分のものの立体配座は、包膜前駆体のプロセシングの速度、ｇ ｐ１２０−ｇｐ４１の会合、ＣＤ４結合、もしくは、機能面での研究により判断 したところ、全体的には変化していなかった。

表３ Ｆ１０５認識指数及び選択されたＨＩＶ−１のｇｐ１２０突然変異体との比較Ｃ Ｄ４結合能１、　００　（１，００） １０２　Ｅ／Ｌ　０．　４５ １１３　Ｄ／Ｒ０，９２ １１７Ｋ、／Ｗ　０．　６０ １１９−２０５ｅ　＞１．５　（１，４）１２０／１２１　ＶＫ／ＬＥ　１．２ １ｄ１２５　Ｌ／Ｇ　Ｏ，６７ ２５２Ｒ，／Ｗ　＞１．５ ２５６　Ｓ／Ｙ　＜０．０２５　（０，３０）２５７　Ｔ／Ｒ０，００７２（０ ，１６）２５７　Ｔ／Ａ　＜０．０７８　（１，１２）２５７　Ｔ／Ｇ　＜０． ０２５　（１，０４）２６２　Ｎ／Ｔ　Ｏ，６０ ２６６Ａ／Ｅ　＞１．　５ ２６７　Ｅ／Ｌ　０．　８０ ２６９　Ｅ／Ｌ　０．　７６ ３５６　Ｎ／Ｔ　＞１．　５ ３６８　Ｄ／Ｅ　＜０．０２４　（０，０９）３ｆ３８　Ｄ／Ｔ　＜０．０１５ 　（０，３３）３６８　Ｄ／Ｐ　＜０．０１５　（０，０９）３６８　Ｄ／Ｒ＜ ０．０１３　（＜０．００４）３６８　Ｄ／Ｎ　領０７９　（０：　０１９）３ ６８　Ｄ／Ｋ　＜０．０２　（＜０．　００５）３７０　Ｅ／Ｄ　＜０．０１７ 　（０，４５）３７０　Ｅ／Ｑ　＜０．０３８　（０，０１８）３７０　Ｅ／Ｒ ＜０．００７５　（＜０．００３）３８０／３８１　ＧＥ／ＹＷ　Ｌ　５ ３８２　Ｆ／Ｌ　０．５４ ３８４　Ｙ／Ｅ　０．１５９ ３８６　Ｎ／Ｑ　１．００ ３９５　Ｗ／３　０．４４ ４．２０　１／Ｒ＞１．５ ４２１　Ｋ／Ｌ　＜０．０２０　（０，５５）４２７　Ｗ、／ｓ　＞Ｌ　５　（ ＜０．００６）４２７　Ｗ／Ｖ　＞１．５　（＜０．０１２）４５６　Ｒ／Ｋ　 ＞１．５ ４５７　Ｄ／Ａ　０．９３　（０，０９）４５７　Ｄ／Ｒ０，４２（０，１５） ４５７　Ｄ／Ｅ　１．５ ４５７　Ｄ／Ｇ　Ｏ，８９ ４６３Ｎ／Ｄ　１．　１ ４６５　Ｓ／Ｌ　＞１．　５ ４７０　Ｐ／Ｇ　Ｏ，１９（領８２） ４７５　Ｍ／Ｓ　＜０．０１３　（１，０３）４７７　Ｄ／Ｖ　Ｏ，１５（０， ３９）４８２／４８２／４８４　ＥＬＹ／ＧＲＡ　０．０１８　（０，４４）４ ８５　Ｋ／Ｖ　＞１．５ ４９１　１／Ｆ　Ｏ，６４ ａ、　Ｆ１０５Ｈ識についてテストした他のｇｐ１２０突然変異体には、４０　 Ｙ／Ｄ、６９　Ｗ／Ｌ、７６　Ｐ／Ｙ１８０　Ｎ／Ｒ，８８Ｎ／Ｐ、１０３　Ｑ ／Ｆ、１０６　Ｅ／Ａ、１１３　Ｄ／Ａ、２０７　Ｋ／Ｗ、２９８　Ｒ／Ｇ。

３０８／３０９／３１０　ＲＩＱ／ＲＰＥＬｒＰＶＱ、３１４Ｇ／Ｗ、３１４　 Ｇ／Ｑ、３０８　Ｇ／Ｆ、３８１　Ｅ／Ｐ。

３８６　Ｎ／Ｒ１３９２Ｎ／Ｒ１３９２Ｎ／Ｅ、４０６Ｎ／Ｇ、４２９　Ｋ／Ｌ 、４３０　Ｖ／Ｓ、４３２　Ｋ／Ａ。

４３３　Ａ／Ｌ、４３５　Ｙ／Ｈ，４３５Ｙ／Ｓ、４３８Ｐ／Ｒ，４５０Ｔ／Ｎ ０．４９３　Ｐ／に、４９５　Ｇ／Ｋ。

４９７／４９８／４９９　ＡＰＴ／ＶＬＬ、及び、５００　１５０１　ＫＡ／Ｋ ＧＩＰＫＡがある。Ｆ１０５抗体ニよルコレらの突然変異体の各々のものの調製 は、野生型糖蛋白質について観察されるのと、少なくとも同様な効果があった。

ｂ、　特定の突然変異体糖蛋白質についてのＦ１０５認識指数は、以下に示す式 に従って算出した：突然変異体（ｇｐＩ６０＋ＨＩ２０）　野生型ｆｇｐ１６０ ＋ｇｐｌＨ）野生型の糖蛋白質の免疫沈降物を、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ルにおいて分析し、質膜糖蛋白質のバンドの比較強度を、オートラシトグラフを 密度計でスキャンすることにより測定した。認識指数についての各個は、少なく とも２回の独立した実験の平均値を表し、実験上の変化量は、典型的には、報告 されている価の１０％を越えるものではない。

Ｃ１突然変異体糖蛋白質の比較ＣＤ４結合能は、引用文献２１から引用した。

ｄ、Ｆ１０５抗体によるこの突然変異体糖蛋白質のｇｐ１２０型の免疫沈降は、 野生型のｇｐ１２０糖蛋白質のものと比較すると減少しているが、その突然変異 体のｇｐ１６０型の沈降は、野生型の糖蛋白質のものよりもやや効率が良かった 。

ｅ、１１９−２０５突然変異体は、ＨＩＶ−１のｇｐ１２０のＶｌ−Ｖ２領域の 完全な欠失を含む。欠失付近の予想アミノ酸配列及び残基数は、・・Ｌｅｕ　（ １１６）−Ｌｙｓ（１１７）−Ｐｒｏ　（１１８）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ　（２０６ ）−Ｌｙｓ　（２０７）−Ｖａ　Ｉ　（２０８）−３ｅ　ｒ　（２０９）　・・ である。

表３は、Ｆ１０５抗体により殆ど認識されないｇｐ１２０突然変異体の幾つかは 、ＣＤ４結合能を保持していることを示しており、池の実験においては、これら の突然変異体の幾つかは、重要な質膜糖蛋白質機能を示した。このこ七は、数種 の突然変異体がＦ１０５抗体による認識を回避することがあることを示唆してい る。我々は、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ ）遺伝子をコードする、ｅｎｖ−欠損Ｈ［Ｖ−１プロウイルスが野生型もしくは 突然変異体の質膜糖蛋白質により、１回の複製の間に補足されるアッセイを利用 した：Ｈｅ１ｓｅｔｈ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　’／１ｒｏｌ。

６４：２４１６　（１９９０）］。突然変異体の質膜糖蛋白質を含み、細菌のＣ ＡＴ遺伝子をコードするｅｎｖ−欠損プロウィルスのゲノム詰め込みを行う組換 えウィルスを、Ｃ０９−１細胞中で作製した。このピリオンを、Ｊｕｒｋａｔリ ンパ球でインキュベートする以前に、高濃度（８０マイクログラム／ｍ１）の精 製したＦ１０５抗体の存在もしくは非存在下で、３７℃で１時間インキュベート した。感染後２日目に、Ｊｕｒｋａｔ細胞を溶菌させ、ＣＡＴ活性を測定した。

図５を参照せよ。抗体の存在下における各突然変異体について観察されるＣＡＴ 活性の、抗体の非存在下において観察されるＣＡＴ活性に比較したパーセント率 が示されている。

野生型の質膜糖蛋白質を含むウィルスを、Ｆ１０５抗体により中和し、同様に、 Ｆ１０５抗体による野生型糖蛋白質と同様に認識される突然変異体質膜糖蛋白質 を含むウィルスもＦ１０５抗体により中和した（図５）。対照的に、２５７　Ｔ ／Ｇ、２５７　Ｔ／Ｒ，３６８Ｄ／Ｎ１３６８　Ｄ／Ｔ。

３７０　Ｅ／Ｑ、４２１　Ｋ／Ｌ、及び、４７５　Ｍ／Ｓ突然変異体の質膜糖蛋 白質を含むウィルスは、野生型の糖蛋白質を含むウィルスと比較して、Ｆ１０５ 抗体による中和に対してより顕著な耐性を示した。先の突然変異体のうちの幾つ かのもの（２５７Ｔ／Ｇ、４７５　ン／Ｓ）　は、ＨｒＶ−１（７）ｇｐ１２０ のｖ３ループを認識する０、５　β−モノクローナル抗体による中和に感受性を 示すままで存続しており口Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉ ｒｏｌ　。

６２　：２１０７　（１９８Ｂ）コ、これは、中和からの回避は抗体特異的であ ることを示している（データー未発表）。野生型と４７５　Ｍ／Ｓの糖蛋白質の Ｆ１０５認識指数の間のＦ１０５認識指数を示す４７０　Ｐ／Ｇ及び４７７　Ｄ ／ｖ突然変異体の糖蛋白質は、Ｆ２Ｏ３の中和に対して中間的なレベルの感受性 を示した。

本明細暑中に報告されている結果により、ＣＤ４結合にとって重要な、数々の不 連続なｇｐ１２０アミノ酸（エピトープ）を同定した。ＣＤ４結合親和性におい て観察された減少が、単に、突然変異体のｇｐ１２０蛋白質における全体的な立 体配座の変化の結果ではありそうもない。我々は、蛋白質分解的な開裂を受け、 かつ、細胞表面に輸送され、正確に折り畳まれた糖蛋白質を確実に選択すること が知られているプロセシングを受け、ｇｐ１６０前駆体蛋白質に由来するｇｌ） １２Ｑ分子を研究した。更に、ＣＤ４結合について顕著に減少しているｇｐ１２ ０突然変異体は、依然として発現性細胞と会合し、それはつまり、ｇｐ４１の外 側の領域及びｇｐ１２０のアミノ及びカルボキン末端の両方に位置している不連 続領域に依存する相互作用である。第３に、ＣＤ４の結合の減少を示すｇｐ１２ ０突然変異体の、立体配座に依存してｇｐ１２０エピトープを認識する２つのモ ノクローナル抗体との反応性は保持されていたものの、この変数は、前駆体のプ ロセシングもしくは細胞会合に比較すると、ｇｐ１２０の構造変化に対しては非 感受性であった。

霊長類の免疫不全症ウィルス内で保存されているｇｐ１２０アミノ酸の、ａ！ｉ ＋）　３６８、ｇｌｕ　３７０、及び、ａｓｐ４５７における変異は、ＣＤ４結 合において最も多大な影響を及ぼす。これらの酸性残基は、ＣＤ４結合能を保持 するとして報告されている蛋白質分解断片内に位置している。霊長類の免疫不全 症ウィルスの配列比較により、残基４５７の側鎖における酸性基よりはむしろカ ルボニル基の存在が保存されている主要点であることが示される。図２は、３６ ８／３７０及び４５７残基付近の、霊長類の免疫不全症ウィルスの配列比較を提 供する（太文字において示されている）。同一のアミノ酸を線で囲み、異なる単 離物についての各位置において見いだされる異なる残基は、括弧内に入れて示し た。高可変率の領域が示されている。Ｆ（ｒＶ−１における高可変率の０４領域 については、この領域における極端な度合いの可変率のために、ＨＸＢ２配列の みを括弧内に示しである。

残基は中程度の可変率を示すのに対して、アミノ酸３６８及び３７０は全てのウ ィルスにおいて不変であり、グルタミン酸が、カルボキシ末端から３７０位まで の２つの残基に現われるＳ　Ｉ　Ｖ、、、が例外である。３６８もしくは３７０ の酸性側鎖のいずれかの、塩基性側鎖への変換は、特にＣＤ４結合能を破壊する 。この結果は、これらの位置における荷電した残基の存在は、ＣＤ４結合に充分 ではなく、酸性の側鎖が、ＣＤ４もしくは他のｇｐ１２０領域のいずれかのもの とのイオン性結合に関与することができることを示唆している。ｇｐ１２０結合 にとって重要であるＣＤ４領域は［Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、Ａ、　、ｅｔａｌ、、Ｃ ｅ１ｌ　５４：６５−７２　ぐ　１９８８）；ＬａｎｄａｕＳＮ、　ｅｔ　ａｌ 、、Ｎａｔｕｒｅ　３３４１５９−１６２　（１９８８）；　Ｊａｍｅｓｏｎ、 Ｂ、　、ｅｔａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０＋１３３５−１３３８（１９８８ ）；Ｃ１ａｙｔｏｎＳＬ、　、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３３５：３６３− ３６６　（１９８８）；Ａｒｔｈｏｓ、Ｊ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　５７： ４６９−４８１　（１９８９）：Ｍｉ　ｚｕｋａｍｔ、Ｔ、　、ｅ　ｔｇ２０− ＣＤ４Ｎ互作用を安定化させるために酸性アミノ酸による中和を必要とする数種 の塩基性残基を含んでいる。

理論に縛られたくはないのであるが、このモデルは、ｇｐ１２０の３７８と４４ ５におけるシスチン残基がジスルフィド結合されているという観察により支持さ れており、これは、これらの２つの傾城が対称的な構造を形成することができる ことを示唆している。

図３は、Ｃ３及びＣ４ｇｐ１２０領域により形成される、予想される対照的構造 を示す。ｃｙｓ　３７８とｃｙｓ　４４５との間の既知のジスルフィド結合は、 実線で囲まれた親水性領域内で起こる。β−ターン［Ｍｏ　ｄ　ｒ　ｏｗ、　Ｓ 、　、ｅ　ｔａｌ、、Ｊ、　Ｖｊｒｏｌ、　８ユ、上述Ｊを形成すると予想され る配列を、図中に折り曲がっているように示しである。高可変領域（Ｖ３及びＶ ５）［Ｍｙｅｒｓ、Ｇ、、ｅｔ　ａｔ、、上述］を、線で囲み、既知の糖蛋白質 の部位を丸と棒で描いた。

記載されている特性は、天然の分子が表面上で露出していることの根拠となって いる。これらの２つの領域の親水性特性及びβ−ターンポテンシャルは、それら が有効なり細胞エピトープであり、更にそのため、免疫予防もしくは免疫両方の ための重要な標的を構成することができることを示唆している。天然のＨＩＶ− １感染の間に、３６ｇ−３７０及び４５７ｇｐ１２０領域の免疫原性は、潜在的 なＮ結合性グリコジル化部位を含む高可変領域に、これらの残基が近接すること により修飾されることができる（図３）。

ＣＤ４に結合すると報告されているｇｌ）１２０の蛋白質分解断片内には含まれ ていない、ｇｐ１２０の残基２５７に影響を及ぼすある突然変異は、ＣＤ４結合 に顕著な影響を及ぼす。

残基４２３−４３８を含むｇｐ１２０の領域に対する抗体はＣＤ４結合を妨害す る。しかしながら、余り保存されないｔｒｌ）　４２７及びａｌａ　４３３残基 におけるーっのアミノ酸変異が、ＣＤ４結合に影響を及ぼすことが報告されてい るのにも係わらず、ｇｐ１２０のこの領域はＣＤ４結合については僅かな影響の みを及ぼす。

４つの不連続量域内に位置するＩ（ＩＶ−４のｇｐ１２０残基におけるアミノ酸 変異の結果、広範囲中和用のヒトのモノクローナル抗体Ｆ１０５による認識が劇 的に減少した。同一残基における複数の置換は、ｇｐ１２０の全体的な立体配座 破壊が明白に存在しない状態においてＦ１０５認識を減少させ、かつ、機能的に 中和を回避する突然変異体が、これらの領域の各々における幾つかの変異により 作製されるということにより、これらの４つの領域が、不連続なエピトープの決 定的な要素を構成していることが示される。このモデルは、性賀決定されている 蛋白質上の、他の不連続なエピトープのものと一致し、これは、典型的には、２ つから５つの連なる成分に由来する１３−２４アミノ酸からなる［Ｃｏｌｍａｎ 、ａｔ　ａｌ、、５ｈｅｒｉｆｆ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４：８０７５（１９８７）：Ｌａｖｅ ｒ、ｅｔ　ａｌ、　、Ｃｅ１ｌ　６に５５３　（１９９０）；Ｂｅｎｔｌｅｙ、 ｅｔ　ａｌ、、Ｐａ１ｄｌａｎ、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　８６：５９３８（１９８９）；Ｐａｔｔｅ ｒｓｏｎ、ｅｔ　ａｌ、、５ｃｔｅｎｃｅ２４９ニア５５（１９９０）コ。

重大な重なり合いが、ＣＤ４結合に係わるｇｐ１２０の領域とＦ１０５認識にと って重要な領域との間に存在し、このことは、Ｆ１０５抗体の、ｇｐ１２０−Ｃ Ｄ４相互作用を遮断する能力に矛盾しない。２５６−２４７及び３６８−３７０ におけるＦ２Ｏ３の不連続エピトープの２つの要素は、ＣＤ４を結合させるため に重要であるとして同定されたｇｐ１２０のアミノ酸に正確に一致した。Ｆ１０ ５抗体による認識は、ＣＤ４結合におけるものよりも、これらの残基における異 なる置換に対してより強い感受性を示した。リンン　４２１におけるＦ１０５不 連続エピトープの第３の要素は、トリプトファン　４２７に近接しており、その 変異の結果、ＣＤ４結合能が劇的に減少するが、Ｆ１０５認識は減少しない。従 って、Ｆ１０５抗体は、明らかに、ＣＤ４よりも、保存されている第４のｇｐ１ ２０領域におけるより親水性の強い断片を認識している。不連続な抗体エピトー プ内に、ＣＤ４結合に重要なこれら３つの不連続領域が含まれているということ は、それらが天然の糖蛋白質に近接していることを示唆している。

ｇｐ１２０の残基４７０−４８４における不連続エピトープの第４の要素は、Ｃ Ｄ４結合にとって重要なアスパラギン酸４５７付近の領域と重なってはいないが 、これら２つの領域は、天然のｇｌ）１２０糖蛋白賀に近接していると考える理 由が存在する。ｇｌ）１２０の短い第５可変領域を対称的に挟み込んでいる両方 の親水性領域が、強いβ−ターンポテンシャルを示し、この結果、天然の糖蛋白 質におけるこれらの領域の並置が生じることがある。この概念を支持しているの は、アスパラギン酸　４５７における、立体配座をよりひどく破壊するある変異 （例えば、４．５７　Ｄ／Ｒ）が、Ｆ１０５認識に影響を与え、一方で、４７０ −４８４領域における、立体配座をよりひどく破壊するある変異（例えば、４７ ７　Ｄ／Ｖ、もしくは、４８２／４８３／４８４　ＥＬＹ／ＧＲＡ）はＣＤ４結 合において僅かな影響を及ぼすという観察である［０１ｓｈｅｖｓｋｙ、ａｔ　 ａｌ、、Ｊ、　Ｖｔｒｏｌ。

６４：５７０１（１９９０）コ。

このデーターは、ＣＤ４結合の妨害は、少なくともあるｇｐ１２０抗体、つまり Ｆ１０５抗体によるウィルス中和の主要機構であることを示唆している。ｇｐ１ ２０構造の成分はＦ２Ｏ３を結合することを必要とし、ＣＤ４は異なるために、 Ｆ１０５エピトープの成分内の変異による中和回避が可能になったのである。Ｈ ＩＶ−１単離物中に観察された、これらの領域の高い度合いで保存されているこ とにより、これらの領域内の変異についての選択的強制力が低いか、これらのイ ンビトロにおける復製アッセイにおいてはモデルとして示されないような変異に ついての拘束が存在するか、あるいは、中和回避についての他の機構が存在する か、のいずれかが示唆される。

中和回避は、可変なｇｐ１２０領域に対する抗体についてＣＬｏｏｎｅｙ、ｅｔ 　ａｌ、　、５ｃｉｅｎｃｅ　２４１、上述；ＭｃＫｅａｔｉｎｇ、ｅｔ　ａｌ 、、ＡｒＤＳ　３．上述；Ｎａｒａｌｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　８４、 上述コ、更に、感染した患゛者血清に就いて［Ｒｅ１ｔｚ、ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ １ｌ　５４：５７（１９８８）］観察されたように、保存されている機能的なｇ ｐ１２０構造を認識する抗体にとってさえ、理論的には可能であるために、ＨＩ Ｖ−１変異は、治療もしくは予防応用において考慮されるべきである。ＨＩＶ− １変異は、これらのエピトープに対するモノクローナル抗体のインビボにおける 用途について、あるいは、インビボにおけるワクチン応用において、問題となる ことが証明されるか否かは、これからの課題である。しかしながら、報告されて いるＣＤ４結合エピトープ領域を認識する抗体は、本明細書において、分岐した ＨｒＶ−１株を中和することが示された。

前述の開示の恩恵にあやかる当業者が、その様々な改変法を作製し、かつ、本発 明の概念から鋭利せずに、本明細書において記載されている具体的な実施態様か らの新発案を作製することができ、更に、本発明が、添付されている特許請求の 範囲及び真意によってのみ制限されるべきであることは明白である。

阻害された／阻害されなしｈＣ７ＬＴ活性（ｘ　１００）要　約　書 ＣＤ４レセプターに対する結合部位を定義するアミノ酸残基を含む免疫原性ペプ チドを開示する。これらのペプチドに対する抗体をも開示する。ＣＤ４に結合す るｇｐ１２０ｅｎｖ蛋白質の能力を減少させる方法をも開示する。これらの抗体 類及びペプチド類を用いる治療及び予防の方法をも開示する。

国際調査報告

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、もしくは、ＳＩＶのｇｐ１２０ｅｎｖ蛋白質上の 結合部位を含むエピトープに対して選択的に結合する抗体であって、当該結合部 位が、ｇｐ１２０ｅｎｖ蛋白質がＣＤ４レセプターに対して結合することを可能 にする、上記抗体。
2. ２．結合部位が、ｔｈｒ　２５７、ａｓｐ　３６８、ｇｌｕ３７０、及び、ａｓ ｐ　４５７からなる群から選択されるアミノ酸を含む、請求項１の抗体。
3. ３．結合部位が、ａｓｐ　３６８、ｇｌｕ　３７０、及び、ａｓｐ　４５７から なる群から選択されるアミノ酸を含む、請求項１の抗体。
4. ４．抗体がモノクローナル抗体である、請求項１の抗体。
5. ５．抗体がポリクローナル抗体である、請求項１の抗体。
6. ６．抗体が遮断用因子に対して複合体形成している、請求項２の抗体。
7. ７．抗体が細胞障害性因子に対して複合体形成している、請求項２の抗体。
8. ８．抗体がキヤッピング部分に対して複合体形成している、請求項２の抗体。
9. ９．抗体が検出可能なラベルでラベル化されている、請求項１の抗体。
10. １０．ＣＤ４レセプターに対する結合部位を含むＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、もし くは、ＳＩＶについてのｇｐ１２０ｅｎｖ蛋白質の、請求項１の抗体を生じるの に充分な部分に相当し、結合部位の両端を挟み込むアミノ酸残基の、抗体が選択 的に結合する結合部位を含むエピトープを定義するのに充分な量を含む、免疫原 性ペプチド。
11. １１．結合部位が、ｔｈｒ　２５７、ａｓｐ　３６８、ｇｌｕ３７０、及び、ａ ｓｐ　４５７からなるｇｐ１２０のアミノ酸の群から選択される、請求項１０の ペプチド。
12. １２．システイン残基が、ペプチドの第１、第２、最後から２番目、もしくは、 最後の位置のいずれかに存在する、請求項１．０のペプチド。
13. １３．システイン残基が、ペプチドの第１もしくは最後から２番目の位置に存在 する、請求項１２のペプチド。
14. １４．ペプチドの長さが、５と約２０のアミノ錯の間である、請求項１１のペプ チド。
15. １５．ペプチドの長さが、８と１５のアミノ酸の間である、請求項１４のペプチ ド。
16. １６．ｇｐ１２０ｅｎｖ蛋白質を含む体液に対して、ｔｈｒ２５７、ａｓｐ　３ ６８、ｇＩｕ３７０、及び、ａｓｐ４５７からなるｇｐ１２０のアミノ酸の群か ら選択される少なくとも一つのアミノ酸に対して選択的に結合する物質の治療的 に有効な量を投与することを含む、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、もしくは、ＳＩＶ のｇｐ１２０ｅｎｖ蛋白質の、ＣＤ４に対して結合する能力を減少させる方法。
17. １７．物質が、ａｓｐ　３６８、及び、ｇｌｕ　３７０に対して選択的に結合す る、請求項１６の方法。
18. １８．物質が抗体である、請求項１６の方法。
19. １９．物質が、ｔｈｒ　２５７、ａｓｐ　３６８、ｇＩｕ３７０、もしくは、ａ ｓｐ　４５７の一つを開製する部分に対して複合体形成する、請求項１６の方法 。
20. ２０．抗体が細胞障害性部分に対して複合体形成する、請求項１８の方法。
21. ２１．請求項１０の免疫原性ペプチドの、抗体を作製するのに充分な免疫学的な 量を、動物に体して投与することを含む、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、もしくは、 ＳＩＶのｇｐ１２０ｅｎｖ蛋白質による動物における細胞の感染を阻害する方法 。
22. ２２．組み合わせたペプチドを使用し、そのペプチドが異なる結合部位に相当す る、請求項２１の方法。
23. ２３．ペプチドが免疫原性部分に対して複合体形成する、請求項２１の方法。
24. ２４．動物がヒトである、請求項２１の方法。
25. ２５．請求項１０の免疫原性ペプチドの、抗体を作製するのに充分な免疫学的な 量を、動物に対して投与することを含む、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、もしくは、 ＳＩＶにより感染した動物を治療する方法。
26. ２６．動物を感染しているＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、もしくは、ＳＩＶのｇｐ１ ２０ｅｎｖ蛋白質上の結合部位を含むエピトープに対して選択的に結合する抗体 を、免疫原性ペプチドに加えて投与する、請求項２５の方法。
27. ２７．動物がヒトである、請求項２５の方法。
28. ２８．請求項１０の免疫原性ペプチドの治療的有効量を含む、薬剤学的組成物。
29. ２９．請求項１の抗体の治療的有効量を含む、薬剤学的組成物。
30. ３０．治療的有効量が、抗体の約１ｍｇと約１０ｍｇとの間の範囲である、請求 項２９の薬剤学的組成物。
31. ３１．ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、もしくは、ＳＩＶのｇｐ１２０ｅｎｖ蛋白質の 、ｇｐ１２０に対して選択的に結合する抗体を作製するエピトープを含むのに充 分な部分に相当するが、そのペプチドが３次元構造においてエピトープに近接す る領域内の少なくとも一つのｇｐ１２０のアミノ酸残基に相当しないことの結果 としてエピトープに対する露出が増大している、及び／叉は、少なくとも一つの ｇｐ１２０可変ループを含まない、免疫原性ペプチド。
32. ３２．ペプチドが、糖添加部位である少なくとも一つのｇｐ１２０アミノ酸残基 に相当しない、請求項３１の免疫原性ペプチド。