JPH05507205A

JPH05507205A - Ｈｉｖ−１の分子クローンとその使用法

Info

Publication number: JPH05507205A
Application number: JP91518591A
Authority: JP
Inventors: ライツ，マービン　エス．，ジュニア; フランチーニ，ジェノベファ; マークハム，フィリップ　ディ．; ガロ，ロバート　シー．; ローリ，フランコ　シー．; ポポビック，ミクラス; ガーンター，スザンヌ
Original assignee: アメリカ合衆国
Priority date: 1990-10-17
Filing date: 1991-10-17
Publication date: 1993-10-21
Anticipated expiration: 2013-06-18
Also published as: JP2767078B2; EP0554389B2; DE69129034T2; US5869313A; CA2093427A1; US5420030A; WO1992006990A1; ES2115622T3; ES2115622T5; US5576000A; CA2093427C; DK0554389T3; DE69129034D1; AU8936391A; DE69129034T3; EP0554389B1; AU649502B2; DK0554389T4; ATE163676T1; EP0554389A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＨＩＶ−１の分子クローンとその使用法発明の背景ＨＩＶ−１は後天性免疫不全症候群（エイズンの病因成分であると同定されている〔（バレーシヌーシッ他、５ｃｆｅｎｃｅ　２２０，８６８−８７１，１９８８：ボブビック他＋　５ｃｉｅｎｃｅ　２２４，４９７−５００．１９８４；ガロー他、５ｃｉｅｎｃｅ　２２４，５ＤＯ−５０Ｌ　１９８４）、）感染した患者は、通常接触後数カ月以内に抗体を形成しくサルンガドハラン他、５ｃｆｅｎｃｅ　２２４，５０６−５０８．１９８４）、これは免疫学的な基盤に立つ試験法の開発を可能にした。そしてその試験法は感染した患者からの血液資料の殆どを同定できる。これは診断において大いに便利であり、そして血液銀行からの試料を最大限に安全にするのに重要である。

ＨＩ　Ｖ　−１の重要な一面はその遺伝的多様性である（バーン他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｅａｄ、Ｓｅ　ｔ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、８２．４８１８−４８１７．．１９８５）。

これは特に外層膜の糖タンパク質の遺伝子において明白である（スターシッチ他、Ｃｅ１ｌ　４５，６８７−６４８．１９８６；アリシン他、Ｃｅ１ｌ　４６．６８−７４．１９８８；ガーゴ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６４゜５８１−５８６．１９８８）。外層膜の糖タンパク質はウィルス粒子と感染した細胞の表面上に存在するので、免疫系の第一次の攻撃目標の強力な一つであり、それは中和抗体と細胞障害性Ｔ細胞の標的を含む。この多様性は患者からの抗体により認識されるＨ　Ｉ　Ｖ−１のいろいろの株からの抗原のアビリティにおける相違、韮びに罹病した危険のある個体集団中に存在するウィルス株の混合物に対して防御になるであろう免疫応答を抽出するためにウィルスのいろいろの株からのタンパク質のアビリティにおける相違も誘導するかも知れない。

若干数のいろいろの系統のＨＩＶ−１の生理的に活性な完全な分子クローンが得られ、配列決定された。しかし、これらのクローンは、米国の比較的不完全型のＨＩＶ−１単離体であるウィルス遺伝型を表しているように見える。更に、非構造的ウィルスタンパク質の翻訳読み取り枠の幾つかが完全ではない。更にこれらのクローンから誘導されたウィルスは、マクロファージ中で生長しない。多くのＨＩＶ−１野生単離物と対照的に、マクロファージに効率的に感染しないために、これらのクローンはチンパンジー中でよく複製しない。この後者の能力は、動物系における候補ワクチンを試験するのに重要である。更に、マクロファージに感染する能力は引き出された免疫応答の可能な防御効能を評価するのに重要である。とういのは、マクロファージへの感染性の中和は、今までよ（研究されているＴ細胞の中和とは異なるだろうからである。

中和抗体（ロバートーグロフ他、Ｎａｔｕｒｅ　３１６．７２−７４．１９８５．ワイス他、Ｎａｔｕｒｅ８１６，６９−７２．１９８５）は、細胞障害性Ｔ細胞応答を持つものとして、感染した患者で示された（ウォーカー他、Ｎａｔｕｒｅ　８２８，８４５−８４８．１９８８）。これらは防御的であるようには見えないが、もしそれらが感染前に存在するならば、それらは特に関連するウィルスによる感染を防止したであるように見える。これは、［短尾サル（ｍａｃａｑｕｅ）Ｊが、不活性化したシミアン免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）を使用する免疫化により、同類の生ウィルスの感染から保護され得るということの発見により支持される（マーフィーコープ他、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６．１２９１３−１２９７゜１９８９）。チンパンジーも、ある種のウィルスに対する中和抗体の事前投与により同種の生ウィルスによる感染に対して受動的に保護された（エミニ他ｒ　Ｊ　、　Ｖ　ｉ　ｒｏｌ、６４．８６７４−３６７８．１９８９）。

しかし、検討された少なくとも数種の中和抗体がｖ３領域（スターシッチ他、Ｃｅ１ｌ　４５，６８７−６４８．１９８６）と呼ばれるエンベロープ（マツシタ他。

Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６２．２１０７−２１１４．１９８８；ラッシェ他ｒ　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｆ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、８５．８１９８−８２０２．１９８８．スキナー他、ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ、Ｈｕｍ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　４，１８７−１９７．１９８８）上のいろいろな領域の認識に依存しているということは問題がある。

ウィルスのいろいろの突然変異性の問題に対する少なくとも部分的解決法は、基本型のＨＩＶ−１株を同定することであり、この基本型はＤＮＡ配列データによりまたは血清学的反応により罹病した危険のある個人集団に存在する株に最も類似しているからである。混合ワクチンカクテル中にそのような基本型の株を限定数人れることは、所与の個人集団中に殆ど元々存在するウィルスに対して防御的である免疫応答を引き出すことになるであろう。そのような混合物は、感染個人中の抗体の診断における最大に可能な感度も提供するに違いない。

ある地域の高度に代表的な単離物の構成成分は、診断試験とワクチンにおける最大に可能な感度を提供する。

組換えＤＮＡ技術による分子クローンからのウィルスタンパク質の生産は、そのようなタンパク質を提供するための好ましいそして最も安全な手段である。基本型ＨＩＶ−１株の分子クローンは、そのような組換えタンパク質を生成できる材料として役立てることができる。組換えＤＮＡの使用は、生ウィルスの存在の如何なる可能性をも回避し、遺伝的に変換したウィルス遺伝子生産物の機会を提供する。生理学的に活性のあるクローンの使用は、遺伝子生産物が機能的であり、従ってそれらの潜在的可能性を最大にすることを保証する。

感染性のクローンは、換言すれば、受容細胞中へのトランスフェクションの後完全なウィルスを生産できるそれらは、幾つかの理由で望ましい。

一つの理由は、遺伝子産物が当然機能的であり；このことがｉｎ　ｖｉｖｏで何が起きているかについてその能力を最大にする。二番目の理由は、遺伝子的に変異した完全なウィルスを得るのが容易であるということである。その結果、多様性の生理学的結果を容易に検定できるということである。例えば、抗体により中和されるウィルスのアビリティへのエンベロープ遺伝子における変化の影響を容易にアドレスできるからである。この技術を使用して、エンベロープ遺伝子におけ゛る一点変異が中和抗体に対する耐性を付与することを示した（ライツ他。

Ｃｅ１ｌ　５４，５７−６８．１９８８）。Ｅ番目の理由は、クローナルウィルス集団が、候補ワクチン、特に同じ分子的にクローンしたウィルスの構成分を含有するそれらを服薬した動物におけるウィルスに挑戦するための最大に可能な定義を提供するからである。

発明の概要本発明の一つの目的は、アメリカ合衆国に発生する典型的な単離ＨＩＶ−１を表すだろう抗ＨＩＶ−１ワクチンのためのワクチン成分を提供することである。

本発明の別の目的は、ＨＩＶ−１の検出のための診断試験法を提供することである。

本発明のいろいろな目的と利点は、図面と下記の本発明の説明から明瞭になるであろう。

図面の簡単な説明図１は、３ＭＮ−ＰＨ１クローンの構造と制限地図を示している。

図２は、ＭＮ−ＰＨ１エンベロープクローンの制限地図を示している。

図８は、１ＭＮ−３ＴＩクローンの制限地図と構造を示している。

図４は、λＢＡ−Ｌクローンの構造を示している。

図５は、クローンＢＡ−Ｌ　１の制限地図を示している。

発明の詳細な説明本発明ハ、ＨＩＶ−１ウィルス株、ＭＮ−８ＴＩとＢＡ−Ｌに関するものであって、この株は、依然に知られていた株より米国内でより典型的なＨＩＶ−１株である。

局部的単離物は、ワクチン用と血液銀行試料のような生理学的試料中のウィルスの検出用により良い材料を提供する。

本発明は、ＭＮ−３ＴＩまたはＢＡ−Ｌのｅｎｖタンパク質をコードしているＤＮＡ断片（図５と８中に示したＤＮＡ配列はそのような２例である。）に、および上述の断片に相補的であるヌクレオチド配列に、並びにこれらのクローンに含まれる他の遺伝子とヌクレオチド配列に関する。本発明は、ＭＮ−ＳＴ１ｅｎｖタンパク質またはＢＡ−Ｌｅｎｖタンパク質の独特な部分をコードしているＤＮＡ断片にも関すｉ〔「独特な部分ｊは少な（とも５個（または６個）のアミノ酸または該当する少な（とも１５個（または１８個のヌクレオチド）を含む。

本発明は更にＨＩＶ−１ウイルス株ＭＮ−３ＴＩとＢＡ−Ｌそれら自身にも関する。本発明のＨＩＶ−１ウイルスは生理学的に活性がありそして既知の方法を使用する当業者により容易に単離できる。

本発明の上述のＤＮＡ断片は、組換え的に生産されるウィルスタンパク質の生成のための宿主細胞の形質転換において次に使用するＤＮＡ構成中に組み込むことができる。本発明のＤＮＡ構成は、ｅｎＶタンパク質をコードしているＤＮＡ断片とＭＮ−３ＴＩ　（またはＢＡ−Ｌ）のフランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）領域またはそれらの部分とベクターからなる。その構成は更に、ｅｎＶタンパク質をコードしている第二のＤＮＡ断片とｅｎＶタンパク質をコードしている第一のＤＮＡ断片にｅｎＶ遺伝子を作動するようにリンクしているｒｅｖ二応答領域の両方をコードしていてよい。ｒｅｖタンパク質は、真核細胞におけるｅｎｖタンパク質の効果的な発現を容易にする。本発明において使用するための適肖なベクターは、ｐＳＰ７２．　λＥＭＢＬ８とＳＰ６５ｇｐｔに限定されない。

本発明が関連する宿主細胞は、上述のＤＮＡ構成により安定に形質転換される。

その細胞は、形質転換する構成中にコードしたウィルスタンパク質が発現されるような条件下で形質転換される。

宿主細胞は、（細菌のような）原核、（酵母を含むカビのような）低級真核または（哺乳動物のような）高級真核であってよい。宿主細胞は、構造中にコードしであるウィルスタンパク質の発現を可能にする方法で細胞を培養することにより組換え的に形成したＭＮ−３ＴＩ（またはＢＡ−Ｌ）タンパク質を生成するのに使用できる。組換え的に生成したタンパク質は、標準のタンパク質分離プロトコールを使用して宿主細胞から容易に単離ＨＩＶ−１株、ＭＮ−３ＴＩとＢ　Ａ　 −Ｌ　Ｇ！比較的典型的であるアメリカ合衆国の遺伝型であるので、非感染性のＭＮ−ＳＴＩまたはＢＡ−Ｌタンパク質（例えばｅｎＶタンパク質）、ペプチドまたはＭＮ−８ＴＩまたは３人−Ｌタンパク質の独特な部分（例えば、ｅｎｖタンパク質の独特な部分）、そして全体の不活性化したＭＮ−ＳＴＩまたはＢＡ− Ｌすらも、中和能力のある抗体または感染した細胞を殺滅することのできるＴ細胞を生成するために、霊長目の動物のような哺乳動物における免疫源として使用できる。

タンパク質は、ウィルスから単離できるかまたはクローンしたエンベロープ遺伝子から組換え的に製造できる。

従って本発明のウィルスとウィルスタンパク質は、ワクチンまたはその構成分のいずれとしても、またはＨＩＶ−１で既に感染した個人の免疫学的治療における薬剤としても価値がある。

ワクチンについては通常であるように、ＭＮ−ＳＴＩまたはＢＡ−Ｌの非感染性の抗原部分、例えば、ｅｎｖタンパク質を医薬的に許容できる担体中にいれて哺乳動物に投与できる。本発明は、ＭＮ−３ＴＩまたはＢＡ−Ｌのいずれかの非感染性の部分からなるワクチンとＭＮ−ＳＴＩとＢＡ−Ｌの両方の非感染性抗原部分からなるワクチンに関する。本発明のワクチンは、免疫応答を促進することで既知の免疫学的補助剤の有効量を含有できる。

ウィルスタンパク質またはポリペプチドは、抗原タンパク質に対する免疫応答を誘導し、かくしてＨＩＶ−１感染に対して防御するのに充分な量でワクチン中に存在する。防御的抗体は、約２ないし８週間間隔の２−３回の連続的投薬により、通常量も良く誘導される。この連続投与は、患者中の循環する抗体濃度が低下する場合は繰り返してよい。

感染性のＨＩ　Ｖ−１（ＭＮ）クローン、ＭＮ−３ＴＩから誘導されるウィルスも、候補ＨＩＶ〜１ワクチンを投与したチンパンジーにおけるまたは候補ワクチンを投与した個人からのヒト抗血清でのｆｆ１ｎ　ｖｉｔｒｏにおける再現性挑戦実験のためにも使用できる。候補ワクチンは、チンパンジーのような試験動物に、本発明の感染性のＭＮ−ＳＴＩウィルスの前にまたはと同時投与できる。ワクチンの効果は、試験哺乳動物中のＨＩＶ−１感染の存在または不存在を検出することにより決定できる。

並列比較試験は、更に、第二列の組の試験哺乳動物にウィルスだけを投与して試験哺乳動物の２組中に発生した感染数を比較することにより、実施できる。

別の方法としては候補ワクチンは、患者にワクチンを投与し次いで患者からの血液細胞に感染するＭＮ−３Ｔ１のアビリティを試験することにより評価できる。

本発明は生理学的試料中のＨＩＶ−１ウイルスの検出にも関係する。ＨＩ　Ｖ− １ウイルスの検出のためには、ウィルス、ウィルスゲノム中にコードしたタンパク質、またはＨＩＶ−１に対する抗体の存在が、測定される。

当業者が認識できるように、いろいろの型の試験を検出のために使用できる。そのような試験法は、ＥＬＩＺＡとＲＩＡを含むがそれだけに限定はされない。

本発明の一つの生物検定では、ｅｎｖタンパク質の全体または独特な部分を表面に塗布し、生理学的試料と接触させる。タンパク質と血清中のそれらの特異的抗体の間で形成されて得られた複合体の存在は、当技術で通常使用される既知のいずれかの技術、例えば、蛍光抗体分光法または比色定量法により検出できる。

下記の限定を意図しない実施例により、本発明を更に詳細に説明する。

完全なＨＩ　Ｖ−１（ＭＮ）ゲノムを表す並べ替えた環状の組み込んでないウィルスＤＮＡを、ＨＩＶ−１（ＭＮ）を生産するＨ９細胞の全ＤＮＡからのλｇｔＷＥＳ。

λＢＤＮＡのＥｃｏＲ１部位中に、標準的技術によりりローンした〔サムプルツク他、ｔ９８９．ｒ分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、　コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ・プレス発行にューヨーク、コールド・スプリング・ハーイ（−在）〕。このクローンを１ＭＮ−ＰＨ１と命名する、そしてその構造と制限地図を図１に示す。クローンをＭ１３ｍｐ１８とＭｌ　８ｍｐ　１９にサブクローンし、そして図２に示した全クローンのＤＮＡ配列は、塩基配列決定法（ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉ。

ｎ　ｍｅｔｈｄ）（サンガー他＊　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｆ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７４．５４６８−５４６７、　１９７７）により得られた。エンベロープタンパク質のアミノ酸配列（表１を参照）はＤＮＡ配列から推定した。クローンした組み込んでないウィルスＤＮＡの制限地図（図１を参照）は、λＰＨＩのＤＮＡ配列からも得られ、エンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子を市販のプラスミドｐＳＰ７２　（プロメガ・バイオロジカル・リサーチ・プロダクト（ライシコンシン州、マジスン）製）中にサブクローンするために、ウィルスタンパク質の推定したアミノ酸配列と一緒に使用した。このプラスミド（ｐＭＮ−ＰＨＩ　ｅｎｖ）は、エンベロープタンパク質のコーディング領域に加えて、ｒｅｖタンパク質のコーディング領域（ファインバーブ他、Ｃｅ１ｌ　４６．８０７−８１７．１９８６）およびｒｅｖ一応答領域を含ｃｑｕｉｒ、Ｉｍｍｕｎｅ、Ｄｅｆｉｃ、５ｙｎｄｒ。

１．４４１−４５２．１９８８）；というのは両者とも真核細胞中のエンベロープタンパク質の能率的な発現に必要であるからである。

か（して、このプラスミドはエンベロープタンパク質の生産に要求される全ての要素を含み、次いで適当な発現ベクターと受容細胞中への導入の全てが分子生物学者に既知の標準の技術により行われる。

ＭＮ−３ＴＩクローン感染性の分子クローン、λＭＮ−３Ｔ１？ｔ、ＨＩＶ−１（ＭＮ）で感染し、短時間（１ケ月）培地中に維持した末梢血液リンパ球からの精製したＤＮＡからの組み込まれたプロウィルスをクローニングすることにより得られる。組み込まれたプロウィルスＤＮＡを、１５−２０キロ塩基（ｋｂ）のＤＮＡ断片の収率が最高になる条件で部分的に切断する。これをλＥＭＢＬ８のＭＡの相補的ＢａｍＨ１部位に、図３に示すようにして、クローニングした。図８は、クローンλＭＮ −３ＴＩの制限地図も示している。表［１に示した、全クローンのＤＮＡ配列は、塩基配列決定法（ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｄ）（サンガー他、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７４．５４６８−５４８７．１９７７）により得られた。

アミノ酸配列は、ＤＮＡ配列から予測した（表ｔｒを参照）。このクローンは標準法により受容細胞中ヘトランスフェクションできる。トランスフェクシヨンの後、クローンしたプロウィルスＤＮＡを生理的に活性のウィルス粒子に発現し、これはウィルスストック源として利用できる。

プロウィルスＤＮＡ　（その制限地図を図２に示しである。）を、ＥａｍＨＩによる切断によりλフアージベクターから外し、プラスミドＳＰθ５ｇｐｔ（ファインバーブ他、Ｃｅ１ｌ　４６，８０７−８１７．ｔ９８８）中に挿入する。このプラスミドｐＭＮ−３ＴＩは、ＳＶ４０複製起点を含む。従って、付着複製起点と相互作用するＳＶ４　Ｑ遺伝子生産物を生産するＣ０８−１細胞（グルラマン、Ｙ、Ｃｅ１ｌ　２８，１７５−１８２゜１９８１）中へのトランスフェクションは、複製能力のある感染性ウィルスの大量の同時的生産を伴う瞬時的な多数のプラスミド複製をもたらす（ファインバーブ他。

Ｃｅ１ｌ　４６，８０７−８１７．１９８６）、これは遺伝子的に同質のウィルスの便利な生産源並びに標準法を使用する所望の変異を導入する方法を提供する。

エンベロープ遺伝子をλフアージクローンから切出し、１ＭＮ−ＰＨ１について上述したのと同じにしてプラスミド中にクローンした。

このクローン（ｐＭＮ−３ＴＩ　ｅｎｖ）は、それが生理学的に活性のクローンしたプロウィルスから誘導されている以外は、上述のλｐＭＮ−ＰＨ１ｅｎｖと同様である。ｐＭＮ−ＰＨ１ｅｎｖと同様にして、ｐＭＮ−３Ｔｌｅｎｖは周知技術によりＨＩ　Ｖ　−１（ＭＮ）　ノｚンベローブタンパク質を生産するために、適当なベクターと宿主中に配置できる。

ＢＡ−ＬクローンＨＩＶ−１（ＢＡ−Ｌ）ゲノムを表す組み込んでないウィルスＤＮＡのＨｆｎｄｌｌｌ断片を、ＨＩＶ−１（ＢＡ−Ｌ）で感染し、ＨＩＶ−１（ＢＡ−Ｌ）を生産する末梢血液マクロファージの全ＤＮＡからのλファージＣｈａｒｏｎ２８ＤＮＡ中へ、標準技術によりクローンした。陽性のクローンは、ＨＩＶ−１エンベロープのｆｉＮ線標識したプローブを使用するハイブリッド形成により選択した。λＢＡ−Ｌｌと命名したこのクローンは、エンベロープタンパク質のための全遺伝子を含有していることが見出された。その構造を図４に示す。挿入物をプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒ　ｉｐｔ、ＳｔｒａｔａｇｅこのクローンをｐＢＡ− Ｌｌと命名する。

表ＩＩＩに示したエンベロープタンパク質のアミノ酸配列を、ＤＮＡ配列から推定した。制限地図は、適当な発現ベクター中へのｅｎｖ遺伝子のクローニングのための適当な制限酵素を決定するために、ＢＡ−Ｌｌ　（図５に示した）のＤＮＡ配列からも′得た。

０．４ＫｂのＥｃｏ　Ｒ１−Ｈ１ｎｄｌＩＩ断片と２゜８ＫｂのＨｉｎｄｌｌｌ −Ｘｂａｌ断片は一緒にクローンすると全ｅｎｖ遺伝子を構成する。このプラスミドは、エンベロープタンパク質のためのコーディング領域に加えて、ｒｅｖタンパク質とｒｅｖ応答領域を含むｅｎｖタンパク質の部分とをコードしている領域を含む。両者とも真核細胞中のエンベロープタンパク質の能率的な発現に必要である（ファインバーブ他、Ｃｅ１ｌ　４８゜８０７−８１７．１９８６．ディトン他、Ｊ、Ａｃｑｕｉｒ、Ｉｍｍｕｎｅ、Ｄｅｆｃ、５ｙｎｄｒ、１，４４１ −４５２．１９８８）。　かくして、このプラスミドはエンベロープタンパク質の生産に要求される全てのＨＩＶ−１遺伝子的要素を含み、次いで適当な発現ベクターと受容細胞中への導入の全てが分子生物学者に既知の標準の技術により行われる。

寄託に関する記述 λＭＮ−ＳＴＩクローンとＢＡ−Ｌプラスミドクローンは、ブダペスト条約により、１９９０年９月１３日にアメリカ合衆国、メリーランド２０８５２．ロツクヴイレ、１２３０１　バークローン　ドライブ在のＡＴＴＣに寄託された。２ＭＮ−３ＴＩクローンはＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ４０８８９を付与されそしてＢＡ−ＬプラスミドクローンはＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ４０８９０を与えられた。

＊＊＊＊＊上述の刊行物は、ここに引用により包含される。上述の発明は、明瞭にするのと理解のために詳細に記述されたが、当業者はこの開示を読めば、本発明の真の範囲から早離することなしに、形式と詳細におけるいろいろの変形ができることを理解するであろう。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．受容細胞中へのトランスフェクションの後、ＡＴＣＣ４０８８９の同定特性を有するヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）ウイルス株ＭＮ−ＳＴ１の活性培養物を産出できる分子クローンの実質的に純粋な製剤。
２．ＡＴＣＣ４０８９０の同定特性を有する（ＨＩＶ−１）ウィルス株ＢＡ−Ｌのエンベロープとｒｅｖをコードしている配列を含むＤＮＡの実質的に純粋な製剤。
３．ＭＮ−ＳＴ１のエンベロープ（ｅｎｖ）タンパク質をコードしているＤＮＡ断片。
４．表ＩＩＩに記載の配列を持つ請求項８記載のＤＮＡ断片。
５．ＢＡ−Ｌのｅｎｖタンパク質をコードしているＤＮＡ断片。
６．表ＩＩＩに記載の配列を持つ請求項５記載のＤＮＡ配列。
７．精製したＭＮ−ＳＴｌｅｎｖタンパク質。
８．表ＩＩに記載した配列を持つ請求項７記載のタンパク質。
９．精製したＢＡ−Ｌタンパク質。
１０．表ＩＩＩに示した配列を持つ請求項９記載のタンパク質。
１１．ｉ）請求項３記載のＤＮＡ断片；およびｉｉ）ベクターからなるＤＮＡ構造。
１２．更に、ｒｅｖタンパク質をコードしているＤＮＡ断片とｒｅｖ−応答領域からなる請求項１１記載のＤＮＡ構造。
１３．ｉ）請求項５記載のＤＮＡ断片；およびｉｉ）ベクターからなるＤＮＡ構造。
１４．更に、ｒｅｖタンパク質をコードしているＤＮＡ断片とｒｅｖ−応答領域からなる請求項１３記載のＤＮＡ構造。
１５．組換え的に生産されるＭＮ−ＳＴｌｅｎｖタンパク質。
１６．組換え的に生産されるＢＡ−Ｌｅｎｖタンパク質。
１７．請求項１１または１３に記載の上記組換えＤＮＡ構成でもって、上記組換えＤＮＡ分子中にコードしてあるウイルスタンパク質の発現をさせるように、安定に形質転換してある宿主細胞。
１８．組換えＨＩＶ−１ウイルス株ＭＮ−ＳＴ１タンパク質を製造する方法であって、上記ウイルスタンパク質を発現させて単離するように、請求項１７記載の上記の宿主細胞を培養することからなる方法。
１９．ＨＩＶ−１感染に対する哺乳動物用のワクチンであって、上記感染に対する免疫化を誘導するのに充分な量の請求項１記載の上記ＭＮ−ＳＴ１ウイルス株の非感染性抗原部分、および医薬的に許容できる担体からなるワクチン。
２０．ＨＩＶ−１感染に対する哺乳動物用のワクチンであって、上記感染に対する免疫化を誘導するのに充分な量の請求項２記載の上記ＢＡ−Ｌウイルス株の非感染性抗原部分、および医薬的に許容できる担体からなるワクチン。
２１．更に助剤を含有する請求項１９または請求項２０記載のワクチン。
２２．ＨＩＶ−１感染に対する哺乳動物用のワクチンであって、上記感染に対する免疫化を誘導するのに充分な量のＭＮ−ＳＴ１ウイルス株ｅｎｖタンパク質の少なくとも５個のアミノ酸、および医薬的に許容できる担体からなるワクチン。
２３．ＨＩＶ−１感染に対する哺乳動物用のワクチンであって、上記感染に対する免疫化を誘導するのに充分な量のＢＡ−Ｌウイルス株ｅｎｖタンパク質の少なくとも５個のアミノ酸、および医薬的に許容できる担体からなるワクチン。
２４．上記タンパク質が組換え的に生産されたタンパク質である請求項２２または２３記載のワクチン。
２５．ＨＩＶ−１感染に対する候補ワクチンを試験する方法であって、上記ワクチンと請求項１記載のＭＮ−ＳＴ１ウイルス株を試験哺乳動物に投与し、次いで上記感染の存在または不存在を検出する段階からなる方法。
２６．ＨＩＶ−１活性に影響を与える能力について医薬をスクリーニングする方法であって、請求項１７記載の宿主細胞を、上記ウイルスの上記活性が影響され得るような条件下で上記医薬と接触させることからなる方法。
２７．生理学的試料中のＨＩＶ−１の検出のための生物検定法であって：ｉ）ＭＮ−ＳＴ１またはＢＡ−ＬウイルスからのｅｎＶタンパク質の少なくとも５個のアミノ酸で表面を塗布し；ｉｉ）上記表面を上記試料で接触せしめ；次いでｉｉｉ）上記タンパク質と上記試料中に存在する上記タンパク質に特異的な抗体との間で形成した複合体の存在または不存在を検出する段階からなる方法。