JPH05506850A - 好中球刺激ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

好中球刺激ペプチド 本発明は、好中球刺激活性を有するペプチドと、これらペプチドの治療薬として の使用に関する。 腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は、最初、特定の移植腫瘍の出血性退宿をり１き起こし 、また、インビトロにおいて、いくつかの形質転換された細胞系統の細胞溶解活 性を有する因子として、バチルス　カルメツチーブニリン（ＢＣＧ）［Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎｌで処理されたマウスの血清から同 定された（カルスウェル、その他［Ｃａｒｓｗｅｌｌｅｔａｌ］、ＰＮＡＳ　７ ２，３６６６−３６７０．ヘルソン、その他ｒ Ｈｅｌｓｏｎ　ｅｔ　ａｌｌ、ｌ　９７５　、ネイチャー［Ｎａｔｕｒｅ１２５ ８，７３１−７３２）。 ＴＮＦ　（活性化されたマクロファージの生産物）は、その後、内毒素性ショッ クの病理学で主要な化学伝達物質であることが示された（トレイシー、その他［ Ｔｒａｃｅｙ　ａｔ　ａｌｌ　１９８６　、サイエンス［５ｃｉｅｎｃｅ１２３ ４，４７０−４７４）。 また、ＴＮＦは、その病理上の影響に加えて、ウィルス、バクテリア等の寄生的 病原体に対する宿主防御手段において中心的役割を有している。 宿主防御において重要なＴＮＦの標的細胞としては、好中球と好酸球と単球／マ クロファージとリンパ球とが含まれる。これに関連して、ＴＮＦは好中球活性化 の主な化学伝達物質である。ＴＮＦは高められた粛食作用能を刺激しくシャラビ 、その他［５ｈａｌａｂｙ　ｅｘ　ａｌｌ　１９８５　、Ｊ　、イムツル、　［ Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｌ、１３５．２０６９−２０７３）、超醗化物陰イオンの 生産が高められ（ツジモト、その他［Ｔｅｕｊｉｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌｌ、１ ９８６　、バイオタム。パイオフィス、レス、コミュン、　［Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、］、１３７．　１０９４−１１ ００）、リゾチーム及び水素過酸化物の放出と好中球の脱顆粒を引き起こす（ク レバノフ、その他［Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ　ｅｔａｌｌ、１９８６　、Ｊ　−イム ツル、　［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、］、１３６　。 ４２２０−４２２５）。 ＴＮＦによって刺激されると、好中球は、高められた殺菌活性と殺腫瘍活性とを 示す（シャラビ、その他［５ｈａｌａｂｙｅｔａｌ］、１９８５．　Ｊ　、イム ツル。 ［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、］、１３５．２０６９　２０７３　：デュー、そのた（ Ｄｊｃｕ　ｃｔ　ａｌｌ、１９８６、Ｊ−イムツル、　［Ｊ、ｒｍｍｕｎｏｌ、 ７．　１３７．２９８０−２９８４　；ブランチヤード、その他（Ｂｌａｎｃｈ ａｒｄｅｔａｌ］、１９８９．　Ｊ　、ロイク、パイオル［Ｊ、Ｌｅｕｋ。 Ｂｉｏｌ、］、４５．　５３８−５４５）、ＴＮＦの細胞増殖抑制効果は、好中 球によって生じさせられた過酸化水素の高い局所的集中によって媒介されること が仮定された（シ＊　−［５ｈａｕｌ　１９８６．　Ｊ　、イムツノ叩、Ｉｍｍ ｕｎｏ＋、］、１４１　。 ２３４−２４０）。 ＴＮＦによる前処理は、特異的受容体を介してのＮ−フォルミル〜Ｌ−メチオニ ル−し一ロイシルーし一ファエニルアラニン［Ｎ−ｆｏｒｍｙｌ−Ｌ−ｍｅｃｈ ｉｏｎｙｌ−Ｌ−１ｅｕｃｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｕｌａｌｇｎｉｎｅ）　（Ｆ−ｒ ｎｅｃ−１ｅｕ−ｐｈｅ@）　（ｆ　Ｍ　Ｌ Ｐ）及び酢酸ミリスチン酸ホルボールｆｐｈｏｒｂｏｌ　ｍｙｒｉｓｔａｔｅ　 ａｃｅｔａｔｅ）に対する好中球の応答性を高める（フエランテ、その他［Ｆｅ ｒｒａｎｔｅ　ｅｔ　ａｌｌ　１９８８　＊インドアーチ、アレクジ。アプリ、 イムニュアル、　［Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ、　Ａｌｌｅｔｇｙ　Ａｐｐｌ。 Ｉｍｍｕｎｏｌ、ｌ、　８６．　８２−９１）　ｃ＋好中球の炎症箇所への集中 は、一つにはＴＮＦによる補体受容体の発現の増加によってもたらされる（バー ガー、その他［Ｂａｒｇｅｒ　ｅｃ　ａｌｌ　ｌ　９８８　、ブラッド［Ｂ１ｏ ｏｄ１７１．　１５１−１５８）　、さらに、ＴＮＦは、皮膚への好中球の漏出 を引き起こす（キブルスキ［Ｃｙｂｕｌｕｓｋｙ　ｅｔ　１１１１１９８８、Ｊ 、イムツル［Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、］１４０．　３１４４−３１４９）。 好中球の機能は、多くのウィルス、バクテリア等の寄生的伝染病を低下させるも のとして知られている（アブラムンンとミルク［Ａｂｒａｍｓｏｎ　ａｎｄ　Ｍ ｉｌｌｓｌ、１９８８、レプ、インフエクト、ディス［Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ 、　Ｄｉｓ、］、１０．　３２６−３４１；　フェランテ、その他［Ｆｅｒｒａ ｎｔｅ　ｅｔ　ａｌｌ、１９８９　、イムツル、レッ。 ［Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｌｅｔｔｓ、ｌ、　２２．　３０１−６）　ｏたとえば、好 中球のａ能の低下は、後天性免疫不全症候群とされた（トールセン、その他［Ｔ ｈｏｒｓｅｎ　ｅｔ　ｉｌｌ、１９８９、エイズ［ＡＩＤＳ］、３．　６５１− ６５３　；エリス、その他［ＥＩ！１ｓｅｃａ１７．　１９８ｇ、Ｊ、インフエ クト、ディス［Ｊ、Ｔｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、］、１１５８．　１２６８−１２７ ６；マーフィ、その他［Ｍｕｒｐｈｙｅｔａｌｌ、１９８８．　Ｊ、インフエク ト、ディス。 ［Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、］、１５８．　６２７−６３０）　、上述したよ うにインビーポ及びインビトロの両方で、明らかに、好中球の活性化について重 要な役割を演じているように見えるＴＮＦは、外因的に、好中球の欠乏を克服す る可能性を持っている。しかしながらＴＮＦの投与がＴＮＦの生産過剰は、血小 板減少とリンパ球減少と肝毒性と腎臓の損傷と高血圧のような異常の発生及び深 刻な副作用と関連付けられている。 本発明者らは、好中球活性を刺激する人間のＴＮＦの主要なアミノ酸配列に由来 する新規なペプチドを同定した。これらペプチドにより人間のＴＮＦの５４番目 から９４番目までのアミノ酸の部分が、前もって発見されていなかった好中球刺 激活性を持っていることが示された。 この結果は、前記ペプチドによる治療が、全ＴＮＦ分子の治療への使用に関係す る深刻な副作用を引き起こすことなく、低下もしくは異常をきたした好中球活性 を回復させることを予期させるという重要な臨床への効用を有している。 従って、最初の対応において本発明は、実質的に図１の５４番目から９４番目ま でのアミノ酸に対応するアミノ酸配列もしくはその一部を有するペプチドからな り、該ペプチドは、好中球により超酸化物生産を引き起こす能力と、好中球にＮ −フォルミルーＬ−メチオニルーＬ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニン［Ｎ−ｆ ｏｒｍｙｌ−Ｌ−ｍｅｃｈｉｏｎｙｌ−Ｌ−１ｅｕｃｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｕｌａ ＪａｎｉｎｅＪによる処理の間、高められたレスビラトリーバースト［ｒｅｓｐ ｉｒｘｔｏｒｙ　ｂｕｒｓｔ］のための準備をする能力とにより特徴づけられる 。 本発明のより好ましい実施態様として、前記ペプチドは、実質上、図１の５４番 目から９４番目までのアミノ酸に対応したアミノ酸配列を有する。 本発明のより好ましい実施態様として、前記ペプチドは、実質上、図１の６３番 目から８３番目までのアミノ酸に対応するアミノ酸配列を有する。 本発明のより好ましい別の実施態様として、前記ペプチドは、実質上、図１の５ ４番目から６８番目までのアミノ酸に対応するアミノ酸配列を有する。 さらに、本発明のより好ましい別の実施態様として、前記ペプチドは、実質上、 図１の７３番目から９４番目までのアミノ酸に対応するアミノ酸配列を有する。 さらに、本発明のなおいっそう好ましい実施態様として、前記ペプチドは、実質 上、図１の７０番目から８０番目までのアミノ酸に対応するアミノ酸配列明者ら は、人間のＴＮＦの５４番目のアミノ酸から９４番目のアミノ酸までの部分が、 好中球の刺激について重要で機能的役割を演じることを論証した。 さらに、本発明者らは、好中球刺激活性を有し、　にこで言及されるように）ペ プチド３０４．３０８．３０９及び３９５と名付けられたペプチドを生産した。 １９８９年にエラグとスブラング［Ｅｃｋ　ａｎｄｓｐｒ＋ｔｎｇｌ　（、Ｔ　 、パイオル、ケム。 ［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、ｌ、２６４　：　１８７９５−１７６０５＞によっ て明らかにされた２、６ＡのＴＮＦの結晶構造の座標の援助と、この情報とがあ れば、この技術に熟練した者が、３次元における本発明の前記ペプチドを模倣し て、非ペプチド構造を設計することができる。 これらの非ペプチド構造が本発明の前記ペプチドの生理的効果を模倣できると考 えられる。 そのような非ペプチド構造が本発明の範囲内に含まれることが意図されている。 例えば、前記ペプチドの領域が使っている場所に向けられた突然変異誘発による ＴＮＦ分子の変化が、好中球活性に影響を及ぼすことが予期される。 ＴＮＦａの３次元構造の概要図が図４に示される。 従って、第２の態様における本発明は、本発明の最初の態様のペプチドの３次元 構造に実質上相当する３次元構造の化合物からなり、該化合物は、好中球により 超酸化物生産を引き起こす能力と、好中球にＮ−７オルミルーＬ−メチオニル− し−ロイシル−し−フェニルアラニン［Ｎ−ｆｏｒｍｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎ ｙｌ−Ｌ−１ｅｕｃｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｕｌａＪａｎｉｎｅＪによる処理の間、 高められたレスビラトリーバースト［ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｂｕｒｓｔ、ｌ のための用意をする能力とにより特徴づけられる。 本発明のより好ましい実施態様として、前記化合物は、実質上、図工の６３番目 から８３番目までのアミノ酸の３次元構造に対応する３次元構造を有する。 本発明のより好ましい別の実施態様として、前記化合物は、実質上、図１の５４ 番目から６８番目までのアミノ酸の３次元構造に対応する３次元構造を有する。 さらに、本発明のより好ましい別の実施態様として、前記化合物は、実質上、図 １の７３番目から９４番目までのアミノ酸の３次元構造に対応する３次元構造を 有する。 さらに、本発明のなおいっそう好ましい実施態様として、前記化合物は、実質上 、図１の７００番目ら８００番目でのアミノ酸の３次元構造に対応する３次元構 造を有する。 さらなる態様として、本発明は、好中球機能が低下している患者を治療する方法 からなり、この方法は、本発明の最初の態様の前記ペプチドの治療量を患者に投 与するものである。 本発明の第３態様のより好ましい実施態様として、前記患者は、後天性免疫不全 症候群に患っている。 ペプチド３０８は、好中球脱顆粒に対する選択的影響により、炎症性症候群、例 えば、リューマチ性関節炎や成人呼吸窮迫症候群に罹った固体に投与されるかも しれない。 本発明の性質がいっそう明らかに理解されるように、ここで、以下の実施例に関 連して、好ましＳＸ形式で図を用いて説明される。・図１は、人間のＴＮＦのア ミノ酸配列を示す図面である。 図２は、ｆＭＬＰが誘引する人間の好中球応答に対するペプチド３０４　（○） 、３０Ｂ　（ロ）、３０９（Δ）の影響を示すグラフである。ペプチドは、２０ 分の前培養段階において１００μｇ／　１０’ｃｅｌｌｓで用いられた。 図３は、ペプチド３９５（・−・；３９５　（５０ｇｇ）＋ｆＭＬＰ：厘−画； ３９５（５０ｇｇ）；ムーム　ＨＢＳＳ＋ｆＭＬＰ　；○−ＯＨＢＳＳ）によっ て誘引された化学発光応答の動力学を示すグラフである。 図４は、好中球刺激ペプチドの位置を示すＴＮＦα単量体の図面である。 中　刺激活性に対　る人間ＴＮＦペプチド生産の試験合成された以下のペプチド は、アミノ酸残基を１．Ｕ、Ｐ、Ａ、Ｃ，−字省略形コードにより記述した。な お、カッコ内に、前記ペプチドのＴＮＦ配列における領域を示した。 ペプチド２７５ ＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬ（１１１−１２０）ペプチド３０１ ＶＲ５ＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡ　（１−１８）ペプチド３０２ Ｌ　ＲＤ　Ｎ　Ｑ　Ｌ　Ｖ　Ｖ　Ｐ　Ｓ　Ｅ　Ｇ　Ｌ　Ｙ　Ｌ　ｒ　（４３−５ ８）ペプチド３０３ ＬＳＡＩＫＳＰＣＱＲＥＴＰＨＧＡ（９４−１０９）ペプチド３０４ ＬＦＫＧＱＧＣＰＳＴＨＶＬＬＴＨ丁Ｉ　Ｓ　Ｒｒ　（６３−１１３）ペプチド ３０５ ＬＳＡＥｒＮＲＰＤＹＬＤＦＡＥＳＧＱＶ（１３２−１５０）ペプチド３０６ ＶＡＨＶＶＡＮＰＱＡＥＧＱＬ（１３−２６）ペプチド３０７ ＡＥＧＱＬＱＷＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧ（２２−４０）ペプチド３０８ ＧＬＹＬＩＹＳＱＶＬＦＫＧＱＧ（５４−６８）ペプチド３０９ ＨＶＬＬＴＨＴＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫＶＮＬＬ（７３−９４）ペプチド３２３ ＴＩＳＲＩＡＶＳＹＱＴ（７９−８９）これらのペプチドは、以下の一般的な実 験方法を用いて合成された。 全てのペプチドは、固相ペプチド合成の　Ｆｍｏｃ−ポリアミド［Ｆｍｏｃ−ｐ ｏｌｙａｍｉｄｅｌ法を使って合成された（アセルトン、その他［Ａｔｈｅｒｔ ｏｎ　ｃｔ　ａｌｌ、１９７ｇ、Ｊ、ケム・　コミュ［Ｊ、ｃｈｅｍ、ｃｏｍｍ ｕｎ、Ｊ、１３．　５３７−５３９）。 用いられた固体樹脂は、機能リンカ−としての４−ヒドロキシメチルフェノキシ アセティツクアシド［４−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｃｈｙｌｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔ ｉｃ　ａｃｉｄｌに支持されたケイソウ上上のボリジメチアクリルアミド）ｐｏ ｌｙｄｉｍｅｔｈｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｌゲルであるペプシン［ＰｅｐＳｙｎ ｌ　ＫＡであった（アセルトン、その他（Ａｔｈｅｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌｌ、ｌ 　９７５　。 Ｊ、アム・ケム・　ツク、　［ｊ、ａｍ、ｃｈｅｍ、ｓｏｃ、］、　９７．　６ ５８４−６５８５０）。 アミノ酸のカルボキシ端末は、ＤＣＣ／ＤＭＡＰ−メディエイテッド［ｍｅｄｊ ａｔｅｄｌシンメトリカル無水物エステル化［ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ　ａｎｈ ｙｄｒｉｄｅｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｎｔｉｏｎｌによって固体支持体に付着され ている。 全てのＦｍｏｃ−グループが、ビベジリン［ｐｉｐｅｒｊｄｉｎｅＪ／　Ｄ　Ｍ 　Ｆ洗浄によって取り除かれ、そして、ペプチド結合が、ペンタフルオロフェニ ル活性エステル［ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｏｐｈｅｎｙｌ　ａｃｔｉｖｅ　ｅｓｔ ｅｒｓｌを経るか、表１に指定された特定のアミノ酸を除いて、ＢＯＰ／ＮＭＭ ／ＨＯＢｔ　（カスドロ試薬）によって直接形成される。 アミノ酸のために選択された側鎖保護は、合成の後に残されるシスティン上のＡ ｃｍを除いて、分離の間に付随して取り除かれる。 表１ Ａｒｇ　Ｍｔｒ　ｏｒ　Ｐｍｃ　ＥｉｔｈｅｒＡｓｐ　０Ｂｕｃ　Ｅｉｔｈｅｒ Ｃｙｓ　Ａｃｍ（ｐｅｒｍａｎｅｎｔ）　ＥｉｔｈｅｒＧｌｕ　０Ｂｕｔ　Ｅｉ ｔｈｅｒ Ｈｉｓ　Ｂｏｃ　０Ｐｆｐ　ｏｎｌｙ Ｌｙｓ　Ｂｏｃ　Ｅｉｔｈｅｒ Ｓｅｒ　Ｂｕｔ　ＢＯＰ　ｏｎｌｙ Ｔｈｒ　Ｂｕｔ　ＢＯＰ　ｏｎｌｙ Ｔｙｒ　ＢＬＩＥ　Ｅｉｔｈｅｒ Ａｓｎ　ｎｏｎｅ　０Ｐｆｐ　ｏｎｌｙＧｉｎ　ｎｏｎｅ　０Ｐｆｐ　ｏｎｌｙ シ転じ１１ ペプチド３０２゜　ペプチドは、前記樹脂から９５％ＴＦＡ及び５％チオアニソ ル（１，５時間）により分離され、逆相Ｃ４カラムにより精製された。 （緩衝液Ａ−０．１％水溶性ＴＦＡ、緩衝液Ｂ−８０％　ＡＣＮ２０％Ａ）ペプ チド３０４゜　ペプチドは、前記樹脂から９５％ＴＦＡ及び５％フェノール（５ 時間）により分離され、逆相Ｃ４カラムにより精製された。（緩衝液Ａ−０，１ ％　水溶性ＴＦＡ、緩衝液Ｂ−８０％　Ａ、ＣＮ２０％Ａ）ペプチド３０８゜　 ペプチドは、前記樹脂から９５％ＴＦＡ及び５％水（１゜５時間）により分離さ れ、逆相Ｃ４カラムにより精製された。（緩衝液Ａ−０゜１％水溶性ＴＦＡ、緩 衝液Ｂ−８０％ＡＣＮ２０％Ａ）ペプチド３０９゜　ペプチドは、前記樹脂から ９５％ＴＦＡ及び５％チオアニソルにより分離され、逆相Ｃ４カラムにより精製 された。（ｆｉｇ液Ａ−０゜１％水溶性ＴＦＡ、緩衝液Ｂ−８０％　ＡＣＮ２０ ％　Ａ）それに加えて、ペプチド３０９の合成断片が合成された。これらのペプ チドは、以下に示すアミノ酸配列を有する。また、カッコ内にこれらペプチドの ＴＮＦ配列における領域を示した。 ペプチド３９３ Ｌ　Ｔ　ＨＴ　Ｉ　Ｓ　ＲＩ　Ａ　（７６−８４）ペプチド３９４ ＳＲＩＡＶＳＹＱＴＨＶＮＬＬ（８１−９４）ぺ゛プチド３９５ Ｐ　Ｓ　Ｔ　ＨＶ　Ｌ　Ｌ　Ｔ　ＨＴ　Ｉ　（７０ＪＩＯ）ペプチド３９６ Ａ　Ｖ　Ｓ　Ｙ　Ｑ　Ｔ　ＨＶ　Ｎ　Ｌ　Ｌ　（８４−９４）１９８８年にフェ ランテ［Ｆｅｒｒａｎｔｅｌらによって説明されたように（インド。 アルチ、アレジ、アプル、イムヌル［ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ、　ＡＩｌｅｒｇｙ　 Ａｐｐｌ、　ｒｍｍｕｎｏｌｌ、８６　＋８２−９１）、この分析では、好中球 のためにＦ−ｍｅｔ−１ｅｕ−ｐｈｅ応答を用意することに対するＴＮＦペプチ ドの影響を調べた。 精製された人間の好中球は、ｆ−ｍｅｔ−１ｅｕ−ｐｈｅの添加前の２０分間、 前記ペプチドにより前処理された。 超酸化物生産を反映し、ルシゲニン［Ｉｕｃｉｇｅｎｉｎｌ依存の化学発光応答 が計測された。 得られた結果が、ルシゲニン［ｌｕｃｉｇｅｎｉｎＪ依存の化学発光のｍＶとし て表２に示され、この結果が達成された最大の細胞活性を示す。 それに加えて、ペプチド３０４．３０８及び３０９の効果を図２に図表として示 す。 この実験は、ペプチド３０４．３０８及び３０９により再現された。 その実験では、また、ペプチド３９３．３９４．３９５及び３９６も用いられて 行われた。 これらのペプチドにおいてペプチド３９５だけが、好中球のレスビラトリーバー スト［ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｂｕｒｓｔｌを刺激することができた（表４） 。 実験結果（表５）から示されるように、ペプチド３９５の効果は容量依存であっ た。 ペプチド３９５によって引き起こされた化学発光応答の動力学が、図３でペプチ ド　濃度　（μｇ／　１０’ｃｅｌｌｓ）２７５　１．０２　０．９９　０，６ ９　０，４３　０．８０３０１　０．３４　０．９３　０，７４　０．５５　１ ．１０３０２　０．３７　０．１６　０，１８　０．２９　’３０３　０．３７ 　０，２３　０，１７　０．２２３０４　０．３７　０．１８　０，４３　２． ５６　２．７６゜３０５　０．３７　０，２７　０．３６　Ｑ、２４３０６　０ ．３７　０，２７　０，３５　０．２３３０７　０．３７　０，３５　０，３７ 　０．４２３２３　０．３７　０，２３　０，１７　０．４７３０ｇ　０．３７ 　０，９１　４．８０　４９．５２３０９　０．３７　０．３１１１　０．９８ 　１３．４４結果は、応答のピークすなわち最大細胞活性に達した値をルシゲニ ン［１ｕｃｉｇｃｎｉｎ　ｌ依存化学発光のｍＶとして示した。 表３ ペプチド濃度（ｐ　ｇ／　１０　ｃｅｌｌｓ）ペプチド ３０４　０．０４　０．３６　０．６４３０４＋ｆＭＬＰ　０．７１　０．９１ 　６．９７３０ｇ　０．０４　１．００　１１．７６３０ｇ＋ｆＭＬＰ　Ｏ，４ ２２，７４２８，５６３０９０，０４０，３１０，６９ ３０９＋ｆＭＬＰ　Ｏ，４２２，４６１２，８４表４　ペプチド３０９とその断 片ペプチドとの好中球レスビラトリーバース）　［ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｂ ｕｒｓｔｌの比較希釈　０．５８ ３０９　４．７０ ３９５　５．３２ ３９６　０．７０ 表５　好中球レスビラトリーバースト［ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｂｕｒｓｔｌ に対する３９５の効果 処理　化学発光（ｍＶ） Ｅｘｐ、Ｉ　Ｅｘｐ、２　Ｅｘｐ、３ 希釈　０．５８　０，６８　０．３８ ｆＭＬＰ　１．５３　３．５３　１．９６１μｇ　３９５　３．２５　０，８９ 　０．０３１μｇ　３９５＋ｆＭＬＰ　３，３６　４，５５　０．２９１Ｏμｇ 　３９５　４．９２　３．９７　０．６４１Ｏμｇ　３９５＋ｆＭＬＰ　７．３ １　９．１０　２．３４５０μｇ　３９５　８．０！　１０．８１５０μｇ　３ ９５＋ｆＭＬＰ　１２．５８　２２．０９１００μｇ　３９５　２．３６　１９ ．１４　５．２６１００ｐｇ　３９５＋ｆＭＬＰ　５．２９　ｉｇ、　１０　１ ０．５９１００μｇ　３０９　５．９８　６．６８　１．．２４ｉｏｏμｇ　３ ０９＋ｆＭＬＰ　２７．４４．　２２，７７　６．６９超酸化物形成に対する影 響 １９８９年のフエランテ［Ｆｅｒｒａｎｔｅｌの手ａ　＜インフエクション　ア ンドイムヌテイ［Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｆｍｍｕｎｉｔｙｌ）　、５７　； 　２１１５−２１２２）　によるチトクローム還元分析によって、超過酸化物形 成に対するペプチド３０８及び３゜９の影響が調べられた。 結果は、表６に、Ｏ，／　５　Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｃｅｌｌｓのＮモルとして示した。 表６ ペプチド　ペプチド濃度Ｃｐ　ｇ／　５　Ｘ　Ｉ　０５ｃｅｌｌｓ）３０８　０ ．２７０　２．７８　４．８９２３０ｇ＋ｆＭＬＰ　２．７５７　５．００　６ ．７２９３０９　０．２７０　０．６２　２．３０．３０９＋ｆＭＬＰ　２．７ ５７　３．８７　５゜Ｉ４細胞の遊走は、細胞が伝染箇所に至る重要な性質であ る。 また、細胞の伝染箇所への蓄積は、前記伝染箇所からの細胞の遊走を阻害する炎 症性の化学伝達物質の量に依存している。 本発明者らは、好中球の遊走に対する影響について、ＴＮＦ及びペプチド３０４ ．３０８及び３０９を試験した。 これらの試験において、好中球は、前記ペプチドもしくはＴＮＦによって前処理 され、そして、１９８８年にフエランテ［Ｆｅｒｒａｎｔｅｌらによって説明さ れた方法（アーチ、アレルギ、アプリ、イムツル［Ａｒｃｈ、　Ａｌｌｅｒｇｙ 、　Ａｐｐｌ、　Ｉｍｍｕｎ、ｏｌ、］８６；８２−９１）方法によって、アガ ロースの縦穴から外へ遊走する能力が試験された。 結果を表７に示す。 結果に示されるように、ＴＮＦは、ｌ　００　ｕｎｉｔｓ／　１０　’ｃｅｌｌ ｓにおいて、僅かに遊走阻害を示した。 ペプチド３０８及び３０９の両方は、有力な遊走阻害を示した。しかし、ペプチ ド３０４は、ケモカイネティック［ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｔｉｃｌなのが分かった （ペプチド３０４は細胞の遊走を刺激する）。 表７ ＴＮＦ　ＮＤ　ＮＤ　４％ ３０４傘　−１６％　−４３％　−８８３％３０８　０　０　１００％ ３０９　０　０　１００％ 傘ペプチド３０４が、刺激することが発見された（キモ力イネティック［ｃｈｅ ｍｏｋｉｎｅｔｆｃｌ　） ＴＮＦとペプチドのケモタクティック［ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃｌな特性以下の 方法により、ＴＮＦとペプチド３０４及び３０８及び３０９のケモヵイネテイツ ク［ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｔｉｃｌな特性が試験された。 アガロース２％溶解液３ｍｌに、仔牛脂児の血清を１０％含む２倍濃縮された１ ９９培地３ｍｌを混合し、ペトリ皿に注入した。 直径２．５ｍｍの３つの縦穴が、それぞれ３ｍｍの間隔をおいて、アガロース中 に形成された。 ５μｌの好中球（２Ｘ　Ｉ　０５ｃｅｌｌｓ）が、縦穴内に添加されると共に、 ケモタクティック［ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ１作用剤もしくはコントロール培地 が縦穴の外に添加された。 そして、種々の時間間隔で、遊走が計測された。 これらの試験結果を表８に示す。 表８ 作用剤中　以下の時間における遊走距離（ｍｍ）１．５時間　２．５時間 作用剤無　作用剤有　作用剤無　作泪剤有ｆＭＬＰ　Ｏ，５０１，４６０，６６ ２，４５−ＴＮＦ　Ｏ，５００，４ｇ　０．６６　０．６９３０４　０．４ｇ　 ０．４７　０．６８　０．７２３０ｇ　０．５０　０．６６　０．６３　１．４ １３０９　０．５０　０．５３　０．６３　０．６８串ケモタクテイツク［ｃｈ ｅｍｏｔａｃｔｊｃｌな縦穴は、ペプチド３０４、ペプチド３０８及びペプチド ３０９もしくは１０’Ｕ／ｍ１のＴＮＦαを添加したものではなく、ｌＸ１０’ ＭのｆＭＬＰを５ｍｌ添加したものであった。 の　に　るＴＮＦペプチドの 脱顆粒の測定条件は、１９８９年、ファランテ［Ｆｅｒｒａｎｔｅｌらによって 説明されたものによった（インフエクト　アンド　イムヌテイ（Ｉｎｆｅｃｔ　 ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１５７．３１１０−３１１５）。 これらの研究において、１００μｌの好中球（１０’／ｍｌ）が、サイトキャラ シンＢ［ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ　Ｂｌ　１０　ｍ　ｌを添加後、３７℃で２ ０分間培養した。 １０分間培養後、ハンクス液［Ｈａｎｋｓ　Ｂａ１ａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏ ｌｕｔｉｏｎ　（ＨＢＳＳ）］を加えて細胞懸濁液を１ｍｌにした。 ３７℃でさらに培養後、細胞のない上澄み液が集められ、酵素レベルが測定され た。 Ｂ−グルクロニダーゼ活性［Ｂ−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅｌは、基質として ４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙ−Ｂ−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ用 いて蛍光定量法により計測された。 これは、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム−リン酸塩緩衝液に２．５ｍＭの基質を 含んだもの５０μｍをｐＨ４，５，３７℃で３時間培養したものを必要とする。 ｐＨ１ｏ、７ｔ’０．２Ｍのグリシン−水酸化ナトリウムを１．５ｍｌ添加する ことにより反応を止めた。そして、３３６ｎｍと４４６ｎｍの励起波長と放射波 長を用いて、それぞれ、計測が行われた。ビタミンＢｌ！結合タンパク質は、ｓ ７コービタミンＢ１□を用いて計測された。 この分析は、結合タンパク質が、５７コービタミンＢ　、　２　［”　Ｃｏ−ｖ ｉｕｍｆｎ　Ｂ　１２７に結合する原則に基づき、結果として放射性ビタミンＢ １□は、炭に結合しない。 上澄み液中の放射能が試料中のビタミンＢ１２結合蛋白質の濃度に等しい結果表 ９　７ＮＦペプチドの好中球脱顆粒に対する影響好中球は、ｆＭＬＰ添加、無添 加の１００　μｇ／　１０’ｃｅｌｌｓの３０４．３゜５もしくは３０８のペプ チドにより処理された（Ｂ細胞の存在下において）。 Ａ。 β−グルクロニダーゼ［Ｂ−Ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅｌの放出（％）ＨＢＳ Ｓ　３．６３　１．１１１４　２．７２　６．２３ＨＢＳＳ＋ｆＭＬＰ　２３． ６２　４１．４１　４０．１９　２７．５４３０４　３．６３　３．］、４　２ ．５２　９Ｊ２３０４＋ｆＭＬＰ　２６．９５　３６．４３　３５．３４　３６ ．６５コント０−にへ°フ゛チト“　−−−１３，４１ゴントトルべ７°チト＋ ｆＭＩ、Ｐ　−−−３５，６９３０８０Ｊ　Ｏ，６５２，７６０，７２３０８＋ ｆＭＬＰ　ｔ７．５２　２８．６２　１７．８６　１８．２０ＨＢＳＳ　９．２ １　９．２７　９．６７　４．８０ＨＢＳ５　２ｇ．８５　２７．９１　４５． ３１　２７．３３３０４　１１．４０　１０．８２　１３．０６　Ｌ４２３０４ ＋ｆＭＬＰ　４３．７６　３５．６０　５９．１５　３７．１２コントロール八 ゜７゛チト゜　−　−　−　７．４９コントロールヘ゜　フ゛チト＋ｆＭＬＰ　 −　−　３８．６２３０８　２．００　２．０８　５．７０　’　２．２５３０ ８＋ｆ〜幻しＰ　３５．８１　２７．５９　２６．５５　２１．５１好中球レス ビラトリーバースト［ｒｅｓｐｉｒａｃｏｒｙ　ｂｕｒｓｌと脱顆粒と遊走阻害 とケモケモカイネシス［ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓｉｓ］とケモタクシス［ｃｈｅｍ ｏｔａｘｉｓｌの刺激に対するＴＮＦａベブチドの影響が調査された。 上記の結果から、上述のべブチドのうちのペプチド３０４、３０８及び３ｏ９だ けが、ｆ−ｍｅ　ｔ−１　ｅｕ−ｐｈｅ処理と関係する好中球のレスビラトリー バースト［ｒｅｓｐｉ．ｒａｔｏｒｙ　ｂｕｒｓｔｌの準備（たとえば、ある意 味で、ＴＮＦアルファに類似している）を行うことが分かった。 これらのべブチドは、ともに、人間のＴＮＦαの５４番目のアミノ酸から９４番 目のアミノ酸までのアミノ酸配列の主要な部分を含む。 ペプチド３０ｇは、この分析において、特に有カな好中球のプライマである。 しかしながら、人間のＴＮＦの７９番目のアミノ酸から８９番目のアミノ酸に対 応する配列を有するペプチド３２３から、ｆ−ｍｅｔ−１ｅｕ−ｐｈｅ処理に関 連する好中球のレスピラトリーバースト［ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｂｕｒｓｔ ｌを準備する能力が見つからなかったのは、注目すべきことである。 また、このベブチドの好中球刺激活性の欠如の理由が、解明されなかった。 しかし、このペプチドの活性の欠如の一つの仮説として、ペプチド３２３は、Ｔ ＮＦ受容体に結合するアミノ酸残基を含まないのかもしれない。 ペプチド３０４がｃｈｅｍｏｋｉｎｅｔｉｃなのが分がっな一方で、ベブチド３ ０８と３０９は、好中球遊走の有力な阻害剤であるのが分かった。 また、ペプチド３０８は、強くケモタクティック［ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃｌな のが分かった。 好中球の脱顆粒に対するＴＮＦペプチド３０４及び３０８の影響（表９）から、 ビタミンＢ１２結合蛋白質の放出とＢ−グルクロニダーゼ［Ｂ−ｇｔｕｃｕｒｏ ｎｉｄａｓｅｌ放出とのそれぞれから計測されたように、ペプチド３０８が特異 性及びアズール性顆粒の中身の放出を減少させることが示された。 ペプチド３０８の効果は、ｆＭＬＰとの刺激によって発現された。 対照的に、ベブチド３０４は、ｆＭＬＰの存在下において、好中球の脱顆粒に対 する効果を示さなかった。 ｆＭＬＰの存在下において、特異性顆粒からの放出を高めたが、アズール性顆粒 顆粒からの放出は高めなかった。 広く表現された発明の謎囲もしくは精神から離れることない、詳細な実施態様 から、多数の変形例及び／または修正例が発明されるかもしれないことは、技術 に熟練した人々によって理解されるだろう。 それゆえに、本実施憇様は、全ての点で実例となって、そして制限的でないよう に熟慮されている。 ＦＩＧ．　Ｉ ＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＩＯＫＰＶＡＨＶＶＡＮＰ２０ＱＡＥＯＱＬＱＷＬＮ３０ ＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧ４０ＶＥＬＲＤＮＱＬＶＶ５０ＰＳＥＧＬＹＬＩＹＳ６０ ＱＶＬＦＫＧＱＧＣＰ’ＯＳＴＨＶＬＬＴＨＴＦＯＳＲＩＡＶＳＹＱＴＫ９０Ｖ ＮＬＬＳＡｉＫＳＰｌｏＯｃＱＲＥＴＰＥＧＡＥ１１０ＡＫＰＷＹＥＰＩＹＬ１ ２０ＧＧＶＦＱＬＥＫＧＤ１３０ＲＬＳＡＥＩａＰＤ１４０ＹＬＤＦＡＥＳＧＱ Ｖ１５０ＹＦＧＩＩＡＬ　ＩＳフｒ図２１

【ｖ！：ｉ３１ 要約 本発明は、好中球を刺激する能力を有するペプチドを提供するものである。 特に、このペプチドは、Ｎ−フォルミルーし一メチオニルーし一ロイシルーＬ− ファエニルアラニン［Ｎ−ｆｏｒｍｙｌ−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−Ｌ−１ｅｕ ｃｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｕｌａｌａｎｉｎｅｌとの処理によって、好中球のレスビ ラトリーバーストを準備する。前記ペプチドは、実質上、図１の５４番目のアミ ノ酸から９４番目のアミノ酸までに対応するアミノ酸配列を有し、もしくは、そ の一部を有する。これらのペプチドは、好中球機能が低下した患者の治療に用い ることができるだろう。 国際調査報告 ＩｎｔｙＩＩｓｔｌｅ１１社１ｏｅＬｌｅａ＋ｌｕ＋１ｌａｒ（＝ｒ／Ｉｎｍ１ ０ＩＸＩＩ！ｉｌｌ１ｔ＊ｒＩｌ＊ｔｌａ＋＋＊ｌ真−τ―言幡−内粋ａ、ｐｃ ｒ１ｘｔｙロ００−６に１豪ズＴクフ侶ｎ打Σ印９Ｊコ】ＯＬ鵠λにΣＲ臼Ｘ窮 ＴｑＮ夕沼穐五頃罷便にに訂力ロ回］ウハ更Ｔ匹凶竪５．１８８／１７５／１

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）図１の５４番目のアミノ酸から９４番目のアミノ酸までに実質上対応する アミノ酸配列を有し、もしくは、その一部を有し、Ｎ−フォルミル−Ｌ−メチオ ニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニン〔Ｎ−ｆｏｒｍｙ１−Ｌ−ｍｅｔｈ ｉｏｎｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ］と共に処理 されることで、好中球の超酸化物生産及びレスビラトリーバースト〔ｒｅｓｐｉ ｒａｔｏｒｙｂｕｒｓｔ］を高めるための準備をする能力を有するペプチド。
2. （２）請求項１記載のペプチドにおいて、図１の５４番目のアミノ酸から９４番 目のアミノ酸までに実質上対応するアミノ酸配列を有するペプチド。
3. （３）請求項１記載のペプチドにおいて、図１の５４番目のアミノ酸から６８番 目のアミノ酸までに実質上対応するアミノ酸配列を有するペプチド。
4. （４）請求項１記載のペプチドにおいて、図１の７３番目のアミノ酸から９４番 目のアミノ酸までに実質上対応するアミノ酸配列を有するペプチド。
5. （５）請求項１記載のペプチドにおいて、図１の７０番目のアミノ酸から８０番 目のアミノ酸までに実質上対応するアミノ酸配列を有するペプチド。
6. （６）請求項１ないし５のいずれかに記載のペプチドの３次光構造に実質上対応 する３次元構造を有し、Ｎ−フォルミル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ− フェニルアラニン［Ｎ−ｆｏｒｍｙ１−Ｌ−ｍｅｔｈｉｏｎｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃ ｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ］と共に処理されることで、好中球の超 酸化物生産及びレスビラトリーバースト〔ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｂｕｒｓｔ］ を高めるため準備をする能力を有する化合物。
7. （７）好中球の機能低下を有する患者の治療方法であって、請求項１ないし５の いずれかに記載のペプチドの効果的治療量を前記患者に投与することからなる方 法。
8. （８）請求項７記載の方法において、前記患者が後天性免疫不全症候群に罹って いる方法。
9. （９）請求項７記載の方法において、前記患者が癌に罹っている方法。
10. （１０）請求項３記載のペプチドの効果的治療量を炎症性症候群に罹っている患 者に投与することからなる方法。
11. （１１）請求項１０記載の方法において、前記炎症性症候群がリューマチ性関節 炎もしくは成人呼吸窮迫症候群である方法。