JPH05506149A - 線虫、菌類、培養組織等を育成し、線虫を採集するための装置と方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 線虫、菌類、培養組織等を育成し、線虫を採集するための装置と方法 技術分野 本発明は固体培養において昆虫病原性線虫（ｅｎｔｏｍｏｐａｔｈｏｇｅｏｉｃ 　ｎｅｍａｔａｄｅｓ）を大量育成し、その後の採集を促進するために開発され た。しかしながら、本発明の培養槽形態はその他の形態の線虫、昆虫、病原菌類 、原生動物、バクテリヤ、培養組織等を育成するためにも使用しつる。昆虫病原 性線虫の生産に対する本発明の歴史的な関連を検討すれば、本発明のこの局面は 本発明の詳細な説明において顕著となる。

発明の背景 昆虫等の管理で使用するための線虫の育成はそれらの昆虫宿主において線虫を培 養することにより開始された。

それは遅くて高価な生産方法であった。（ｐＩ前のコストの百分の−まで生産コ ストを低減させた）培養技術における顕著な改良が、アール、ニー、ペップイン ク（Ｒ，Ａ。

Ｂｅｄｄｉｎｇ　）に対する米国特許第４，１７８．３６６号および同第４，３ ３４．４９８号の明細書と、対応するオーストラリア特許第５０９．８７９号の 明細書に記載されている。これらの明細書は、培養スタックの大きな表面積と、 十分な間質性空間とを利用する三次元の生体外の単一微生物同伴の培養（ｍｏｎ ｏｘｅｎｉｃ　ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ　）技術を記載している。要約すれば、これ らの生体外技術は動物の組織を適当サイズの片に切断し、それらを適当に積み重 ねるか、あるいは不活性材料のスタックを形成し、それをホモジネートでコーテ ィングすることを含む。このようにつくられたスタックは次にオートクレーブに より殺菌され、媒体表面において線虫の特殊な共生細菌（クセルハブダスーＸｅ ｎｏｒｈａＭｕｓ　ｓｐ、　）を培養することにより線虫の栄養および再生に適 した粗基本媒体が作られる。

アール、エイ、ベツディング（Ｒ，Ａ、　Ｂｅｄｄｉｎｇ）により開発された技 術、特に、１９８４年刊、Ａｎｎａｌｓ　ｏｆＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ のｖｏｌ　１０４．　ｌ　１７−１２０頁において刊行されたｒＬａｒｇｅ　５ ｃａｌｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　Ｓｔｏｒａｇｅａｎｄ　Ｔｒａｎｓｐｒｏ ｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　［ｎ５ｅｃｔｐａｒａｓｉｔｉｃ　ＮｅｍａｔｏｄｅｓＮｅ ｏａｐｌｅｃｔａｎａ　ｓｐｐ、　ａｎｄ　Ｈｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　 ｓｐｐ　Ｊ　という名称の彼の論文に記載の技術は極めて効果的である。しかし ながら、商業的に大量の昆虫病原性線虫に対する需要が急速に増加したことによ り、例えば大きい範囲の作物の処理に必要な大量の線虫を生産するためのより適 当な技術に対する必要性が明らかにされた。

これまで、前述したＡｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｙにおける論文において ベツディングが記述している方法を用いた線虫の商業生産は以下の順次の段階を 含んでいる。

１、　オートクレーブで処理可能のポリプロピレン製チューブをインパルスを用 いたシール装置によりシールして袋を作る。全てのシール部の両側にオートクレ ーブテープが付与されて十分な強度を有する袋を提供する。テープで補強したシ ームを介して空気入口および出口チューブが導入され、シリコンゴム溶液を用い て適所に接着される。オートクレーブテープの帯片が接種パネルとして使用する ため前記袋の中心に位置される。

２．３から５キロの間のくずボリエーテルボリウレンタフォームを小片にほぐし 、鶏くず肉のホモジネートでコーティングする。ポリプロピレンの袋にこの媒体 を充てんする（充てん作業の間、袋の口は清浄に保つ必要がある）。次いで袋を シールし、媒体をそれが袋内で均一な厚さとなるように分配する。次いで袋から 空気を抜き、最小特開で媒体を殺菌できるようにし、袋をヘシアンで包み、オー トクレーブに平たく位置させる。ヘシアンはポリプロピレン袋材料の局部的な燃 焼を阻止する。

３、　袋は１２１’Ｃ（あるいはそれより僅かに高い温度で）約７５分から約９ ０分間オートクレーブで処理される。

４、　数時間冷却した後、袋は空気層流の殺菌ボックスに位置され、バクテリヤ の肉汁懸濁物を導入する。接種パネルのスリットを介して挿入された小さい殺菌 ずみ漏斗を用いて通常接種が行われる。バクテリヤ懸濁物を添加した後、髪ソ≠ ＞　ｄ　Ｉ−Ｑ’ｎ−ｔ　Ａ’ｂ’−てスリットがシールされ、袋はシリコンゴ ム溶液が固定しうるよう３０分放置廻され、媒体を通してバクテリヤ懸濁物を広 げる。

６、　次に、袋は定温室に置かれ、定温室では入口および出口チューブを通して 空気が袋の内部に供給され、空気はバクテリヤフィルタを介して供給される。袋 がふくらみすぎでないように数時間空気の流量をモニタした後、袋は濾過した空 気が４日から５日にわたり袋を通るように放置しバクテリヤを培養する。

７、培養時間の終りにおいて、袋は線虫培養で培養する。

接種は５０ミリリットル３個あるいは４個の成熟線虫培養媒体の中味を殺菌状態 において袋へ注入し、不当に混合することなく袋の中味の表面にわたつて培養媒 体を分配することにより実行される。通常殺菌状態は、袋をアルコールで完全に 噴射した後殺菌ボックスを通して空気層流内で接種を行うことにより確保される 。接種パネルはスリットを作り、直径５センチの漏斗チューブが該スリットへ挿 入できる。中実の培養媒体が漏斗チューブを介して袋中へ振り込まれ、新鮮な袋 媒体面にわってできるだけ広く接種材料を慎重に導く。接種の後、スリットはシ リコンゴム溶液でシールされ、ゴム溶液が固定するまで次の３０分間スリットを 乱すことがないよう極端に慎重に扱われる。

８、　接種スリットをシールしているゴム溶液が固定すると、細菌フィルタを介 して袋は再び空気源に接続される正確な空気供給速度が設定されたことを確認す るために再び袋を観察した後、袋は２から３週間定温室に放置さ９、　次に、袋 の中味を、細かいステンレス鋼の金網からなる床を有する篩に入れることにより 線虫が採集される培養媒体を入れた篩が僅かにより大きい受皿に置かれ、培養媒 体は約２時間水で覆われる。この間に、線虫は培養から離れ、水中に拡散する。

次に、篩の中味は拒否され、残りの液体が沈澱槽へ汲み上げられ、そこで線虫は 繰り返し沈降し、洗滌水がそそがれる。この処理が行われた茶袋は、若干の有機 堆積物と共に約０．５キログラムの線虫を生成する。但し袋環境の外部からのバ クテリヤがオートクレーブ処理段階の後袋中へ何ら入っていないことを前提とす る。そのような外部からのバクテリヤは線虫の生成を著しく低下させ、生成量を 皆無に近いものとする可能性がある。

この技術の欠点は、 ｆａｔ　各培養に対して新しい袋を構成する必要のあること、（ｂ）　（それら は３回再利用はきくものの）茶袋に対して（決して安価でない）を少なくとも２ １１のバクテリヤフィルタを要すること、 （ｃ）　（ｉ）袋の充てんとシール（これは２人の作業者によって行われる必要 がある）する、（ｉｉ）空気を抜く、シ（ｉｉｉ）バクテリヤと線虫との双方で 接種する、および（ｉｖ）シリコンゴムシールが乾燥するのを待機する段階に対 して著しい時間を要すること、 （ｄ）　接種分散が効率的でないこと、（ｅ）　フィルタの詰まり（これは袋の ふくらませおよび再ふくらませをモニタするにもかかわらず時折発生する）ある いはフィルタを介して空気を吸入するポンプへの給電停止により袋が無用となる 可能性があること、（ｆｌ　茶袋の中心での媒体の深さは１０センチを越えるべ きでないので、袋をウェイトを用いて平たく保持しない限り袋をふくらませるこ とにより基底の表面積を著しく低下させる。このことは茶袋に含まれる媒体の量 が低下しうることを意味する。

（ｔｌ　（ｉ）ふくらんだ袋が実際の培養媒体の収納容量の何倍ものスペースを 占めるという事実および（ｉｉ）空気流量を調整するために全ての袋に直ちに近 接する必要のあることから、スペースが不経済的に使用されること、（社）袋は 袋を保持するための適当な棚を要し、そのため、全ての欄領域に空気源を連ぐか 、あるいは茶袋に対して個別の空気ポンプを設ける必要があること、および（ｉ ｔ　空気ポンプの保守と交換に著しい費用がかかることの欠点を育している。

これらの欠点にもかかわらず、ヘクタール当り少なくとも２個の袋を作ることを 要し、５０ヘクタールまでの大規模なフィールド実験に十分な線虫を生産するこ とができる。しかしながら何千ヘクタールもの商業的な収穫に対処するに十分な 線虫を生産することは本技術を用いて技術的に可能ではありえないようである。

本発明の開示 本発明の主要な目的はスタイナーネマチデ（Ｓｔｅｉｎｅｒ−ｎｅｍａｔｉｄａ ｅ　）およびヘテオルハブデイチデ（Ｈｅｔｅｒｏｒ−ｈａｂｄｉｔｉｄａｃ） 系の昆虫病原性線虫、その他の昆虫病原性線虫および（カビや培養組織を含む） 広範囲のその他の生体を大量に、安定して、かつ低コストで採集する上で使用す る装置を提供することである。

この目的は、バクテリヤシールを提供する蓋を備え、かつ培養槽内の酸素レベル が約１２パーセント以上に保たれ、かつ培養槽内の二酸化炭素が約１０パーセン トを上廻らないようにするに十分な空気が受皿へ出入りできるようにした大型の 受皿から培養槽即ち培養セルを構成することにより達成される。さらに、培養槽 即ちセルは、該槽内の媒体が著しい程度まで乾燥しないように、かつ培養槽へ汚 染物が混入する危険性なくしてバクテリヤ懸濁物や培養線虫（等）を受皿に添加 できるように構成する必要がある。

本発明の発明者は、もし受皿にオーバラップした蓋と、蓋と受皿との間で部分的 シールを形成する中密度ポリエーテル、ポリウレタンフォーム（あるいは類似の 材料）製の圧縮性ガスケットとを備えるとすれば前記の特徴を育する自動通気性 受皿を作りうろことを発見した。本発明の発明者はまた、そのような自動通気受 皿を用いる場合、ゴム成分、ネオブレンあるいは同様の可撓性で柔軟なオートク レーブで処理しうる材料から作ったシールによって閉鎖され、そこを通って接種 材料を受皿へ噴射しつる少なくとも１個の（好ましくは２１ｍ１以上の）開口を 蓋に設けることが好ましいことを発見した。

ポリエーテル、ポリウレタンフォーム製ガスケットがセル内でのバクテリヤ汚染 を阻止するという発見は驚異的な発見であった。培養フラスコの栓をするために コツトンウールが通常用いられるが、汚染性バクテリヤやカビの胞子はコツトン ウールの栓を横行しつるものの、培養フラスコの構造は本発明においてはコツト ンウールを用いても、そこを通してガスが十分流れつるようにはしない。ポリエ ーテル、ポリウレタンフォームはバクテリヤ細胞より数百倍も大きい直径を有す るチャンネルを内部に含んでいる。フオーム内の静電力が、フオーム内のチャン ネルを通してのバクテリヤやカビの胞子の運動を抑制する上で効果的であると考 えられている。また（蓋は縁部を育する必要があるので）蓋のオーバラップもガ ス流と殺菌性を保つ上で重要と考えられている。

バクテリヤ肉汁、培養線虫等を添加するために蓋が外されると培養槽の中味の汚 染が発生しうることが本発明の発明者によって発見された。この種の汚染を阻止 するために、本発明の発明者は、針で穿孔しつる弾性シールで閉鎖される少なく とも１個の開口を蓋に含めるよう培養槽の蓋を修正した。そうすれば、シールの 外側をアルコールで殺菌し、シールを殺菌ずみの中空の針即ちカニユーレを用い て穿孔し、バクテリヤ、あるいは線虫等を受皿上へ噴射させることができる。カ ニユーレを外しても、シールの材質の自然弾性により針の孔を有効に閉鎖するの で殺菌状態を損うことはない。（各）シールはグロメットタイプシールであるこ とが好ましい。

このように、本発明によれば、感染性幼若病原線虫、カビ、培養組織等を育成す るための培養槽は、（ａ）　受皿の周囲から概ね直交方向に延びる連続した壁あ るいは複数の隣接壁を有する概ね平坦な受皿と、（ｂｌ　前記受皿と基本的に同 じ形状であるが前記受皿より寸法が大きい蓋であって、そのため前記蓋が前記受 皿を覆うように位置されると、前記受皿の周囲が前記壁の外側に来るようなもの で、かつその周囲から概ね直交方向に延びる連続した側壁あるいは複数の隣接す る側壁を有する蓋と、 （Ｃ１前記蓋の側壁内で、かつすぐ隣接して前記蓋の縁部の周りに位置した中密 度ポリエーテル、ポリウレタンフォーム（あるいは類似のフオーム材）製のガス ケットであって、前記蓋が前記受皿に位置すると、受皿の壁の上縁部と接触する ガスケットとを含む。

前述のように、オートクレーブで処理可能のゴム化合物、ネオブレン等製の少な くとも１個のグロメットタイプのシールを蓋に装着することが好ましい。

典型的には、受皿の壁の高さは約１２センチで、蓋の周囲は受皿の壁の約１セン チ外側にあり、受皿の側壁の高さは約６センチで、ガスケットの幅は約４センチ である。しかしながら、これらの寸法は、培養槽のユーザの都合に合わせて著し く変えてもよい。

受皿（したがって蓋も）はいずれかの所望の形状とじつる。円形あるいは楕円形 の受皿の場合その周囲から延びる単一の壁を有し、同様形状の蓋も単一の側壁を 育する。しかしながら、三角形、長方形あるいはその他の多角形の蓋や受皿はそ れらの周囲から延びる複数の隣接する直線の壁をそれぞれ有することになる。通 常、取扱いや収納の便宜上受皿と蓋とは長方形である。

蓋には、その側壁がそこから延びる蓋の面に取り付けた傾斜フランジを備えるこ とが好ましい。そのようなフランジは蓋の側壁に対して概ね平行であって、蓋の 面から遠い方のフランジの縁部はガスケットの幅より僅かに小さい距離だけ蓋の 縁部から離隔されている。典型的な培養槽においてはこれは約６センチの距離で ある。そのようなフランジは、蓋の側壁と共に、蓋の周囲で溝を形成する。そう すれば、フオーム製ガスケットはフオーム材の弾性により溝内で保持され、蓋の 面に付着させる必要はない。

積み重ね可能の培養槽を提供することが都合がよいので、受皿には多数の内部ブ ラケットあるいはブロックを設けることができる。そのようなブラケットあるい はブロックの各々は受皿の壁の頂部近傍において剛性の内部停止部材を提供する 。培養槽か積み重ねられると、下方の培養槽の蓋に乗っている培養槽の重量は、 攬重体における下方の培養槽の各々の蓋における内部フランジが各各の停止部材 によって提供される停止手段と接触するまで下方の培養槽のフオーム製ガスケッ トを圧縮する。それからは停止部材はフオーム製ガスケットのそれ以上の圧縮を 阻止する。

本発明はまた、（ｉ）本発明による培養槽において線虫を育成する方法、（ｉｉ ）線虫の三者接種材料を育成するための培養槽、（ｉｉｉ）培養された線虫を採 集する方法、および（ｉｉ）Ｊ　３段階と成体線虫とを分離する方法も網羅する 。

したがって、本発明によれば、以下の順次段階からなる、感染性幼若病原線虫を 育成する方法も提供される。

（ａ）　はぐされたポリエーテル、ポリウレタンフォーム（あるいは類似の材料 ）をくず肉ホモジネートでコーティングし、コーティングされたほぐれフオーム を本発明によって構成した培養槽の受皿の基部の上に均一に分配し、次に、フオ ーム製ガスケットが受皿の壁の頂部全体と接触するように培養槽の蓋を受皿の上 に置き、（ｂｌ　培養槽とその中味とを約１２１℃の温度で約１時間オートクレ ーブ処理し、 （Ｃ）　オートクレーブ処理した槽が冷却するようにし、（ｄ）　オートクレー ブ処理したフオームとホモジネートを、培養すべき昆虫病原性線虫種の一次形懇 の共生細菌、クセノルハブダス（ＸｅｎｏｒｈａＭｕｓ　）　ｓｐで接種し、ｔ ｅｌ　培養槽とその中味とを約２３°Ｃの温度で共生細菌を接種するに十分な時 間保持し、 げ）　培養槽の中味を線虫の三者懸濁物で接種し、（ｇ　線虫種が線虫種の感染 性幼若（Ｊ３）線虫を再生し、かつ生成しつるに十分な時間約２３°Ｃの温度で 培養槽を保持し、 （社）培養槽から幼若病原線虫を採集する、そして本発明の別の局面においては 、培養された線虫を採集する装置は、 （ａ）　全体的に平坦な床から概ね垂直方向に延びる連続した側壁あるいは隣接 した側壁を存するタンクと、（′ｂ）全体的に平坦な網目基部がその周囲におい て連続した側壁あるいは隣接した側壁に接続されている篩であって、該篩が前記 タンク内に位置しつるような寸法を有し、タンクの床から離れて網状基部を備え た篩を支持するようにされた複数の脚即ちアダプタを育する篩と、（Ｃ）　篩に 適合する通気チューブであって、加圧されたガス（空気）源に該チューブを接続 する手段を育し、かつ該チューブ内の離隔位置において複数の空気出口開口を育 している通気チューブとを含む。

本装置を用いた昆虫病原性線虫を採集する方法は本発明のさらに別の局面であっ て、以下の順次段階を含む。

（ａｌ　篩をタンクへ挿入し、通気チューブを篩の網目上に位置させ、 （ｂｌ　篩の網目基部上にＪ３段階の線虫を培養した後培養槽の中味を装てんし 、 （Ｃ）　篩の綱目上の培養槽の中味を完全に覆うに十分な深さまでタンクに水を 充たし、 ｆｄ）　空気を通気チューブに供給し、約９０分の間液体並びに篩の網目上に位 置したその他の材料を通して激しく空気を泡立たせ、 （ｅｌ　篩とタンク内の材料が約６０分落ちつくようにし、その間に材料中のＪ ３段階線虫と成体線虫とが篩の網目基部の下方で沈澱物を形成し、 げ）余分の水とその中に懸濁した何らかの培養媒体とをタンクから除去し、 （ｇ）　！ｉと、該篩の網目基部とに残っている全ての材料とをタンクから除去 し、 九　線虫のきれいな懸濁物が形成されるまで線虫を水で繰返し洗滌し、洗滌の度 毎に余分の水を沈澱させ、排出させる時間か続き、 （ｉｌ　きれいな懸濁物から線虫を収集する。

本発明のさらに別の局面においては、線虫の収集された容積中に介在する成体線 虫を以下の段階によりＪ３段階の線虫から分離することができる。

（１１床と側壁とを有する容器内に、容器の床の上方に位置した第１の網目スク リーン上に前記第１の網目の縁部まで延びているコツトンクロスの層を位置させ 、（２）前記コツトンクロスの層の頂部上に第２の網目スクリーンを位置させ、 （３）第２の網目スクリーンの頂部に、収集した線虫の懸濁物を位置させ、 （４）収集された線虫が約１５センチの深さまで覆われるまで容器に水を加え、 （５）複数の空気出口を有する通気チューブを第２の網目スクリーン上に位置さ せ、 （６）上に来た水を通して約１２時間空気を泡立させ、その闇に成体線虫がクロ スの層へ浸透し、成体線虫がクロスの層の上方に留っている間に、第１の網目ス クリーンの下の、比較的落ちついた水まで効果的に移動し、（７）容器から通気 チューブ、網目スクリーン、クロス層および成体線虫を除去し、次いで容器に残 っている成体線虫を洗滌し、収集する。

前述のように、本発明のさらに別の局面は本発明の大量育゛成方法において使用 する線虫の接種材料を生産する培養槽であって、 （ａｌ　全体的に長方形の受皿と、 （ｂｌ　概ね平坦な網目の床と、前記網目の床から概ね直交方向に延びる隣接側 壁と端壁とを有する全体的に長方形の内側受皿と、 （Ｃ）　前記内側受皿に取り付けられた一対のハンドルであって、各々横部材と 一対の側方アームとを含み、各側方アームか内部受皿の側壁に対して概ね平行の 平面において内部受皿の各側壁の枢点の周りて回転運動するように取り付けられ ており、各横部材は一対の側方アームの上端領域を接続し、側方アームの下端と 、その関連枢点との間の距離が、枢点と内側受皿の網目基部との間の最短距離よ り大きい、一対のハンドルとを含む培養槽を提供することである。

培養槽、Ｊ３段階の線虫を大量育成する方法、感染性の幼若（Ｊ３段階）の昆虫 病原性線虫を採集する装置と方法、線虫の接種材料を便利に生産する培養槽およ び成体およびＪ３線虫を分離する新規な方法の実施例とを添付図面を参照して例 示のみとして以下説明する。

図面の簡単な説明 第１図は、蓋を開けた状態の、本発明による培養槽の実施例の斜視図、 第２図は、培養槽の蓋をその閉鎖位置で示す、第１図に示す槽の２−２から視た 断面図、 第３図は、本発明による大量育成法において使用するための線虫の接種材料を調 製する培養槽の好適形態の諸要素を示す斜視図、 第４図は培養された線虫を採集するために使用する装置の一形態の斜視図、 第５図は線虫の懸濁において成体線虫から幼若Ｊ３線虫を分離するための容器に おける諸要素の組立体の概略断面図である。

図示実施例の詳細説明 第１図および第２図に示す培養槽は長方形の受皿１０と蓋ＩＩとから構成されて いる。蓋１１は受皿１０の縁部上に嵌合し、かつオーバラップするようにつくら れている。受皿は垂直の壁１２を有している。蓋はそこから直交方向に延びる側 壁１３と、蓋のそれぞれ円形の開口に取り付けられた一対のグロメットタイプの シール１７を有している。特に第２図に示すように、各グロメットタイプのシー ルは相対的に厚い環状即ちドーナツ形の縁部分を有し、縁部の外面には連続した 溝が形成されている。この連続した溝は蓋に形成されたそれぞれの円形開口の縁 部に隣接した蓋１１の材質部分を低圧ガス密シールして受け入れる。また、各グ ロメットタイプのシールは相対的に薄い円形の中央部分を存する。通常、グロメ ットタイプシールの縁部分と中央部分とは、例えばネオブレン、あるいは適当な ゴム成分のような弾性のオートクレーブ処理可能の材料から、一体形成される。

グロメットタイプシールは任意のものであるが好ましいものである。

蓋１１が受皿ｌＯの上に置かれ培養槽を形成し、中密度ポリエーテル、ポリウレ タンフォーム製のガスケット１４か蓋と受皿の壁１２の頂部との間で「シール」 を形成する。前述のように、シールは気密シールでなく、ガスが培養槽から出入 りできるようにする。中密度ポリエーテル、ポリウレタンフォームの代りにその 他の弾性フオームの材料をガスケット１４用に用いることかできる。

第１図と第２図とに示す実施例の蓋１１にはフランジ１５が設けられ、該フラン ジは側壁１３が突出している側の蓋の面から延びている。フランジ１５は蓋の外 縁部から短い距離をおいて蓋の周りを完全に延びることか好ましい。第２図に示 すフランジ１５は蓋の平面に対して鋭角をつけている。フランジ１５と側壁１３ とは、フオーム製ガスケット１４を側壁１３に沿った適所において保持するよう 作用する溝を形成する。フオーム材の自然弾性によりガスケットを溝内に保持し 、そのためガスケット１４を蓋に対して接着する必要性を排除している。

しかしなから、ガスケットを適所に保持するために希望に応じて接着材を点（あ るいは帯片、あるいは層）状にして用いてよい。実際に、傾斜したフランジ１５ が無い場合、側壁１３に沿った必要位置においてフオーム状ガスケットを保持す るために通常少量の接着剤が用いられる。

本発明について試験するために多数の培養槽を構成した。培養槽の蓋の中のある ものはグロメットタイプのシールＩ７を存していなかった。その他の培養槽は第 １図と第２図とに示すようなシール１７を有する蓋と共に構成した。培養槽の全 ては長方形の受皿と蓋とを存していた。２種類のサイズのプロトタイプの培養槽 を製作した。

大きい方の培養槽は長さが７５センチ、幅が４５センチ、深さか１２センチの受 皿を有していた。小さい方の培養槽は長さが４５センチ、幅が３８センチ、深さ が１２センチの受皿を育していた。大きい方の受皿に対する蓋は７８．５センチ ×４７センチで小さい方の受皿に対しては４８．５Ｘ４０センチであり側壁は蓋 から６．５センチ延びていた。全ての場合において、フオーム製ガスケットは幅 が５センチで、厚さか３センチであった。勿論これらの寸法は変わりうる。

プロトタイプの培養槽の受皿のあるものには第１図と第２図とに示すように、受 皿の壁１２の中の２個の内側に取り付けた４個のブラケット１６を備えていた。

ブラケット１６は傾斜したフランジ１５と関連して作用し、多数の培養槽が上下 に積み重ねられたときフオーム製ガスケットか不具合な程度にまで圧潰あるいは 圧縮されるのを阻止する。フランジ１５の下縁はフオーム製ガスケットが所定最 大圧縮されると、ブラケット１６の上面と接触する。そうすればガスケット材料 のそれ以上の圧縮は起こりえない。勿論、もし受皿を相互に積み重ねる意図かな いならば、ブラケット１６あるいはブラケット１Ｇと同じ機能を果すために壁１ ２に取り付けた他の形状のブロックあるいは停止部材は必要でない。

プロトタイプの受皿と蓋、並びにフランジ１５とブラケット１６とはアルミニウ ムで作ったが、プラスチック材を含むその他の適当な材料を用いて培養槽を構成 してもよい。

前述のように、プロトタイプ培養槽の第１のバッチは、グロメットタイプのシー ルＩ７を備えていない蓋を存していた。これらの第１のプロトタイプの培養槽を 用いた約１０００回の試験において、多分清浄な層流の空気流環境において極め て慎重に取り扱ったにもかかわらず２回にわたり受皿内で媒体の汚染が発生した 。汚染のそのような低い発生率はフオーム製ガスケットかバクテリヤやカビ胞子 の侵入に対して効果的なシールを提供しうることを示している。しかしながら、 汚染かこのように２回にわたり発生したという事実は、もし本発明の発明者によ って創り出されたちの以下の殺菌外部状況が線虫の大量生産の間に存在するとす れば、バクテリヤ肉汁や培養線虫を添加するために培養槽の蓋を完全に取ること は好ましくないことを示している。したかってグロメットタイプのシールが考え られ、プロトタイプの培養槽の第２のバッチにおいて採用された。

感染性の幼若線虫を生産するために本発明のプロトタイプの培養槽を使用するた めに、本発明の方法を示す以下の手順か採用された。

段階ｌ アール　エイ、ベデイングによる前述のＡｎｎａｌｓ　ｏｆＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙの論文に記載の方法を用いて、はぐしたポリエーテル・ポリウレタ ンフォームをくず肉ホモジネートでコーティングする。

段階２ ２キロから３キロの間のコーティングし、はぐしたフオームを各受皿へ積み込み 、約８センチの深さまで受皿の基部上に均一に分配する。（この層の深さは重要 なパラメータである。プロトタイプの受皿の面積より面積か大きい、あるいは小 さい受皿を用いることにより、量の異なるコーティングをした、はぐした）オー ムが用いら（フオーム製ガスケットを備えた）蓋を受皿上に位置させ、次に受皿 は約１２ビＣの温度で１時間オートクレーブ処理される。このオートクレーブ処 理の間数側の受皿を上下に積み重ねることができる。但し、厚さが約２．５セン チのスペーサを用いて各受皿の周りで蒸気が循環できるように受皿を分離させる 。

段階４ 冷却の後、培養すべき昆虫病原性線虫の第１の形態の共生細菌、Ｘｅｎｏｒｈａ ｂｄｕｓ　ｓｐて接種される。

もし培養槽の蓋にグロメットタイプのシールが設けられていないとすれば、受皿 と蓋の外側を９０パーセントのエチルアルコールで（殺菌のために）完全に噴射 された後そこを通して清浄な（殺菌性の）空気の層流が流れるキャビネット内で 接種が行われる。各受皿の蓋は垂直方向にその受皿から持ち上げられ、受皿の蓋 の一端か、層流キャビネットの上側壁に固定された（本発明の発明者によって使 用される装置における２、５センチ幅の棚である）棚上に載置される。蓋の他端 はキャビネットの天井から懸吊されたフックにより中間点において支持されてい る。蓋に対するこの支持方法により、受皿に対して容易に近接できるようにしな がらその殺菌性を保つ。

次に、約３００ｃｃの栄養バクテリヤ肉汁（例えば、共生殺菌が２４時間培養さ れたイースト塩（ＹＳ）肉汁）が、今の状態はスポンジに似ているコーティング され、はぐされたフオームの表面に可及的均一に噴射される。この「スポンジ」 は次に、バクテリヤかフオームの全ての小片に確実に拡散されるように殺菌器具 を用いてかきならされる。次に蓋は受皿上に置き直される。

もし培養槽が、２個のグロメットタイプシールを装嵌した蓋を有するとすれば、 接種は以下の要領で実行される。まず、シールの外側と蓋の周囲部分とにアルコ ールが噴射され、共生細菌の肉汁の供給源に接続されたカニユーレ（中空の針） に焔か供給される。殺菌したカニユーレが殺菌したシールの中の１個を通して押 され、肉汁の約半分が受皿に噴射される。その後、殺菌したカニユーレは他方の 殺菌したシールを通して押され、肉汁の残りが受皿へ噴射される。肉汁の噴射の 間のカニユーレの運動により肉汁が受皿内のほぐしたフオーム上に均一に分配さ れるのを保証する。空気の層流キャビネット内では肉汁の噴射は受皿により実行 する必要はない。共生細菌か２４時間にわたり培養されてきた、例えばイースト Ｉ　塩（ＹＳ）肉汁のような）約３００ｃｃの栄養バクテリヤ肉汁がこの要領で 、コーティングし、はぐしたフオームの表面上に噴射される。この時点ではフオ ームはスポンジに似ている。希望に応じこの時点て受皿を振って受皿上にバクテ リヤ肉汁が均一に分配されるようにしつる。

段階５ 培養槽（受皿とその蓋）は次に定温室まで動かされ、そこで約４日間約２３℃の 温度に保たれ共生細菌を培養する。この培養時間は、該当するバクテリヤ種に応 じて変えることかできる。ある環境においては、このバクテリヤ培養段階は省略 してもよい。

段階６ 次に受皿は昆虫病原性線虫で無菌状態で培養する。培養は前述の段階４に記載の 技術を用いるが、バクテリヤ肉汁を、無菌状態で採集された（殆んど全体的に幼 若線虫である）線虫の水中懸濁物に代えて実行される。培養した線虫を受皿中の 媒体の表面にわたって可及的均一に分配するよう慎重を期する必要がある。

段階７ 次に受皿が定温室領域まで動かされ、そこで所定時間約２３°Ｃの温度に保たれ る。この時間は生長している線虫の種によって変わる。Ｓｔｅｉｎｅｒｎｅｍａ 　８１の場合感染性幼若体は１４日間で生長する。Ｈｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔ ｉｓ種の場合、この培養時間は２Ｉ日から２８日である。

次にＪ３段階の昆虫病原性線虫か受皿から採集される。

前記段階６において使用された昆虫病原性線虫の接種材料を培養するために、本 発明の発明者により新規な培養槽が考案された。

この培養槽は本発明の別の局面を構成する。それは、その基部としてステンレス 鋼の篩を育する長方形の内部受皿がその中に位置している長方形の受皿を含む。

内部受皿はその基部から直交方向に延びた隣接壁と一対のハンドルとを有してい る。各ハンドルは一対の側方アームを接続する横部材を含む。各側方アームは側 壁の端部からある距離をおいた点において内部受皿の各側壁に枢着され、そのた めアームは内部受皿の＃壁に対して平行の平面において運動可能である。各側方 アームはそれぞれの枢点の下方をある距離だけ延び、そのためもし横部材か内部 受皿の中心に向かって動くとすれば、側方アームの下端は内部受皿の基部のレベ ルより上方に位置する。

しかしながら、もし横部材が内部受皿の中心から離れる方向に動くとすれば側方 アームの下端は内部受皿の基部のレベルより下方に突出することにより側方アー ムの下端部分は内部受皿のためのスペーサあるいは脚として作用する。

この培養槽の実施例が第３図に示されており、第３図はその３個の主要な要素即 ち、受皿ＩＯ１蓋１１および内部受皿２０を明瞭に示している。蓋ＩＩは基本的 に第１ＦＡと第２図とに示す蓋１１と同じである。受皿１０は第１図と第２図と に示す受皿１０と類似であるが、壁１２はより高く、ブラケット１６を備えてい ない。内部受皿は鋼の網（篩）の基部２１と、側壁２２と、端壁２３とを育する 。一対のハンドルは横部材２４と側方アーム２５とを有している。側方アーム２ ５は枢点２６において側壁２２に枢着されている。第３図に示すように、枢点２ ６は側方アーム２５の端部２７には無く、端部２７から距離をおいて位置するこ とにより横部材が第３図に示す位Ｉｆ（即ち内部受皿２０の中央領域の上方）に あると、側方アーム２５の端部２７は基部２１のレベルより下方に突出しない。

しかしながら、もし横部材２７がそれらが端壁２３上方に位置する位置まで動く と、側方アームの端部２７は基部２７のレベルの下方にあり、側方アームは内部 受皿に対する脚を効果的に提供する。

線虫（等）を培養するために使用されると、ハンドルはその最中央位置まで動き 、そこで横部材２７（あるいは側方アーム２５に取り付けられた適当位置の停止 部材）は側壁２２の上縁部と接触するようになる。この位置において、ハンドル は、第１図および第２図に示す本発明による培養槽の受皿１０の壁１２に取り付 けることが好ましい停止部材あるいはブラケット１６と同じ機能を果すことかで きる。

第３図に示す培養槽を用いて昆虫病原性線虫を育成するためには、はぐし、コー ティングしたフオームが、外側受皿ｌＯの基部に内側受皿を載置させて受皿１０ 内に位置した内側受皿中へ装入されることを除いて前述したのと同じ手順が採用 される。

第３図に示すタイプの多数のプロトタイプの培養槽が構成され、かつ試験されて きた。いずれの場合も、汚染がそのようなプロトタイプの培養槽での線虫の育成 に影響しなかった。

接種材料として使用するために第３図に示す培養槽において育成された線虫を無 菌状態で採集するために、培養槽が空気の層流キャビネットに位置され、外側受 皿と（蓋のオーバラップした領域の下側を含む）蓋の外側とにアルコール（通常 、殺菌のために９０パーセントのエチルアルコールが使用される）を噴射した後 、蓋１１が培養槽から外される。次に内側受皿２０のハンドルの横部材２４が内 側受皿の端壁２３の概ね上方の位置まで動き、内側受皿の網目基部２１が受皿１ ０の基部即ち床の上方にある。次に殺菌水が、内側受皿のフオームが約１５セン チの深さまで完全に覆われるまで受皿１０に添加される。

水で覆ったフオームは約２時間そのままとされる。この間に、培養媒体（即ち） オーム）における線虫が媒体を出て、水の中へ入り、そのため成体および幼若線 虫の懸濁体となる。

次に、内側受皿即ち篩２０は培養媒体と共に受皿１０から外され、受皿１０に昆 虫病原性線虫の懸濁物を残す。

この液体は殺菌水ボウルに注入され、そこで沈澱および注入法を用いて線虫が殺 菌水で洗滌される。１ミリリットル当り約１００，０００個の線虫を含有する線 虫の洗滌された沈澱物か次に殺菌フラスコへ注入され、そこから線虫は接種材料 として使用できる。

第１図および第２図に示す本発明の培養槽において大量に育成された線虫を無菌 状態で採取することは、線虫を含存する培養媒体の薄い槽を篩上に広げ、かつ培 養媒体の層を水で覆うことを含む従来の要領で実行することができる。線虫は培 養媒体から水中へ移動し、次いで篩を通して落下し、側壁を有しその基部に篩が 位置している受皿で集められる。線虫を生産するための従来から使用されている 技術についての前述の説明がこの採取技術を概説している。

しかしながら、この採取技術は時間とスペースを要し、線虫の新規な採取技術が 本発明の装置を育成法とを補完するために開発されてきた。本発明の別の局面を 構成するが、その使用が前述の方法あるいは第１図および第２図に示す装置を用 いて培養された線虫の採集に限定されないこの新規な抽出技術は深タンクの抽出 を含む。

第４図に示す装置はこの深タンク抽出技術のために開発された。この装置は壁３ ０と＃３２に支持された鋼製網目基部３Ｉとを育する長方形受皿の形態の篩を含 む。

篩はタンク３３に位置している。本発明の発明者によって構成されたプロトタイ プ採集装置において、受皿と、脚と、タンクとはアルミニウムから構成されてい るが、これらの要素に対していずれかのその池の適当な材料を用いることか認め られる。プロトタイプ採取装置は（例示のみであって限定的でないが）以下の寸 法を存している。

篩の壁の高さくｈ）−２０センチ 篩の基部３１の寸法−６８センチ×４２センチ脚３２の長さ一８センチ タンク３５の長方形寸法−７２センチ×４５センチタンクの壁の高さくｄ）−３ ０センチ （プロトタイプ装置のアルミニウム製の）全体的に長方形あるいは楕円形のチュ ーブ３４が篩の鋼網目の床３Ｉ上に位置している。この楕円形のチューブ３４に おける孔（長円形チューブの各鋼において４個の孔がある）はチューブからの空 気出口として作用する。

空気はバイブ３５を介してチューブ３４へ供給される。

通気チューブは長方形あるいは楕円形である必要はなく、その他の適当な形状を 存する通気チューブを使用しうることに注目すべきである。

線虫を採集するためにこの装置を用いるためには、第１図および第２図に示すタ イプの２個の培養槽からフオーム上の天然の培養線虫が１１１３１上に供給され る。次にタンク３３は、水位がタンクの壁の頂部から約３センチ下に来るまで水 で充てんされる。タンクにこの深さの水が入るとフオーム培養媒体は完全に水中 に浸漬される。

次に空気が楕円形チューブ３４の出口から篩のフオームを通して激しく泡立てさ れる。約９０分のこの通気の後、チューブ３４が取り出され、タンクは約６０分 静かにされる。この時間の終りにおいて、少なくとも９０パーセントの線虫は外 側タンク３３の底部において沈澱物を形成する。

次にフオームと余分の水とか除去される。全ての材料を篩の床まで抽出するため に吸引ポンプを用いることができる。代替的に、タンク３３の基部の上方約５セ ンチのところに位置するタップ３６が開放され、（水、種々の溶質および使用済 みの培養媒体の小さい粒体とを含む）その上に位置している液体の殆んどを排出 する。

次に、篩がタンク３３から除去され、フオームが篩に残っているその池の材料と 共に捨てられる。水がタンク３３に添加され、線虫は約４５分安定するようにさ れる。

次に余分の水が排出される。洗滌、安定化および排出・作業は線虫が清浄な懸濁 物となるまで繰り返される。洗滌水の排出や送入は電気制御のソレノイド弁を用 いて実行することが好ましい。

次に通気用楕円形チューブ３４がタンク３３の床上に位置され、少なくとも２日 間水中の線虫の懸濁物を通して泡立たされる。この通気段階は残りの培養媒体の 殆んどが確実に分解するようにされる。

次に、線虫が最終的に洗滌され、線虫の沈澱物がタンク３３から、微細なコツト ンクロスあるいはリネンクロスで裏打ちされ、そこを通って水が容易に通るが線 虫は侵入することのできない篩へ汲み込まれる。依然として残っている余分の水 はクロスの縁部を心させ、ある種のチーズ製造において用いる要領で請求心した クロスを手で絞ることにより除去することができる。このように作られた線虫の クリームは、好ましくはＷＩＰ○公告番号第ＷＯ３８１０８６６８である国際特 願Ｐ　ＣＴ／Ａ　Ｕ８８１００１２７の明細書に記載の技術を用いて収納するこ とができる。

前述の二種類の採集技術の各々によって採集された線虫は成体線虫と感染性のＪ ３幼若体との混合物からなる。

本発明の別の局面は成体およびいずれかの残留培養媒体の有機堆積物から幼若線 虫を分離する方法である。

この分離法は（例えばボウルのような）容器５０内で第５図に示す組立体を使用 する。この組立体は、水平方向に取り付けられた２個の網目スクリーン５２．５ ３の間に挟持されたコツトンクロス材の層５１を含む。下方の網目スクリーン５ ２は容器５０の床の上方のブロック５４に支持されている。コツトンクロスは下 方の網目スクリーン５２の縁部まで延び、上方の網目スクリーン５３の縁部では クロスは余っている。下方の網目スクリーンは第４図に示す種類の篩であること が好ましい。実際に、第４図に示す装置はクロス層と第２の網目スクリーンを追 加し、成体および幼若体（Ｊ３段階の）線虫を分離するこの方法のために使用す ることができる。

線虫懸濁物５５は上方の網目スクリーン５３上に置かれる。線虫懸濁物か約１５ センチの深さまで覆われるまで水が容器５０に添加される。第４図に示す種類の 通気装置５６が上方のスクリーン５３上に位置され、約１２時間水を通して激し く空気を泡立ちさせる。

この通気時間の間、線虫の大部分は懸濁状態にある。

しかしながら、水の旋回運動により線虫は少量づつ上方の網目スクリーン５３上 に連続的に落下する。感染性幼若体か上方の網目スクリーン５３上に落下すると 、それらはクロス層５１上へ運動し、次にそこを通って、下方の網目スクリーン ５２の下方の相対的に静かな水中へ入り、そのため別の線虫が上方の網目スクリ ーン５３へ落下しうるスペースを作る。成体線虫は網とクロスのサンドイッチを 通って動くためのエネルギが不十分であって、そのため再び懸濁物中へ運ばれる か、あるいは網目スクリーン５３の上に残るようである。

著しい数の線虫が幼若体から成体を分離するこの方法を受ける場合通気は重要で ある。何故なら、通気を行わなければ、大量の線虫の酸素付加が不十分であって 、多くの成体が上方網目に達し、クロス層を通して移動する機会が欠除するから である。

通気時間の後、鯛サンドイッチが外され、それと共に成体線虫も除去される。次 にＪ３幼若体か安定するようにされる。最終的に線虫は通常の沈澱および排出技 術を用いて殺菌水により洗滌される。

前述の線虫育成、採集および分離技術は（以前はＨｅｏａｐｌｅｃｔａｎａ　ｂ ｉｂｉｏｎｉｓとして知られており、本明細にＮｅｏａｐｌｅｃｔａｎａの別称 としている）　Ｓｔｅｉｎｅｒｎｅｍａ　ｆｅｌｔｉａｅ。

ストラリャ、中国および米国からのＳｔｅｉｎｅｒｎｅｍａのまだ命名されてい ない６種類の新しい種、オーストラリヤからのスタイナネマタイド（ｓｔｅｉｎ ｅｒｎｅｍａｔｉｄ）の新しい種、オーストラリヤ、中国、キューバおよび欧州 からのＨｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔ　ｉｓの４種類の未命名の種を含む昆虫病原 性線虫の公知の種の殆んどに対して首尾よく試験された。

当該技術分野の専門家には本発明による線虫育成装置は他の生体の育成にも十分 適合していることが認められる。そのような他の生体には、昆虫病原性カビ、原 生動物、およびバクテリヤ並びに熱帯魚の餌に適した線虫や線虫病原性カビがあ る。ある範囲の動物や植物からの培養組織およびそのような培養組織に対するウ ィルスも、本発明の装置を用いて大規模に育成することができる。

本発明をさらに示すために、昆虫病原性線虫と昆虫病原性カビの生産の選択した 例を以下提供する。

例１ ２週間以上にわたって第１図と第２図とに示す種類の４０個の培養槽を以下のよ うに準備した。各培養槽に対して、腸、心臓および肝臓を含むが砂嚢は含まない 鶏のぐず肉２０００グラムを５００グラムの水で５リツトルのウェアリング（Ｗ ａｒｉｎｇ）ブレンダにおいて均質化した。

このホモジネートを１８０グラムのほぐしたポリエーテル、ポリウレタンフォー ムと手で均一に混合してフ１−ムの全ての隙間にわたって可及的均一なコーティ ングを作った。コーティングされたフオームは次に培養槽の受皿中へ均一な深さ で装入し、培養槽を約１２１”Ｃで１゜５時間オートクレーブ処理した。培養槽 を線虫とバクテリヤとで接種するために、完全に無菌の手順を採用した。

数時間冷却した後、各培養槽を、フオームの表面上に栄養培養肉汁を３００ｃｃ 噴射することにより共生ｍ菌で接種した。使用したバクテリヤ培養は、２４時間 ２８℃で培養されたＳｔｅｉｎｅｒｎｅｍａ　ｆｅｌｔｉａｅの全ての菌株から 得たＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ　ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓであった０次に各培養 槽を、線虫で接種する前に５日間２３°Ｃで培養した。　Ｓｔｅｉｎｅｒｎｅｍ ａ　ｃａｒｐｏｃａｐｓａｅ全菌株の２個の単一微生物同伴の５００−フラスコ 培養の中味がその中の媒体の表面上に噴射された。（接種材料の培養は培養組織 について前述したように鶏くず肉ホモジネートをコーティングした、はぐしたポ リエーテル、ポリウレタンフォームにおいて公知の要領で準備された。バクテリ ヤ接種材料を振ることによりフオーム／媒体に混合させ、線虫接種材料が５８後 成熟したフラスコ培養から添加された。）線虫接種材料を分配した後は、それ以 上の混合を試みなかった。それはこの段階での混合は線虫の生産に有害であるこ とが公知であるからである。次に培養槽は２３℃で１６日間培養され、前述のよ うに採集した。但し各培養槽の中味は個別の採集装置で採集した。培養槽当り１ ０００百万の感染性幼若Ｊ３線虫から培養槽当り２１００百万の感染性幼若Ｊ３ 線虫の範囲（平均は培養槽当’：ｌ　Ｉ　３００百万（７）Ｊ　３Ｊ１！虫）が 得うレ、Ｏ，Ｘｔ＜−１０個の培養槽を正確に例１と同様に準備したが、培養線 虫はバクテリヤの直後噴射した。これらの培養槽からの平均生産量は培養槽当り １２５０百万のＪ３段階の線虫であった。

例３ 例１と同様に準備した８個の培養槽をＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ５００−培養の中 味で接種した。２週間後培養を採集し、生産量は１２２０百万から１６００百万 の感染性幼若（Ｊ３段階）線虫であり、平均は培養槽当り１３６０百万５３段階 線虫であった。

例４ 例１のように準備した１０個の培養槽をし、生産量は培養槽当り５００百万から １４００百万（平均は９００百万）のＪ３段階の線虫であった。

例５ 例１のように２０個の培養槽を準備したが、各々の培養槽に対して、２０００グ ラムの鶏くず肉、２８５グラムの脂肪、５７１グラムの水を２０９グラムのフオ ームの上に入れた。Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ　Ｉｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓを含有す る栄養ＹＳ肉汁３００ｃｃをバクテリヤ接種材料として用い、２３℃で５日間培 養した後、Ｈｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｈｅｌｉｏｔｈｉｄｉｓ　ｃ　Ｉ菌 種を入れた２個の培養フラスコを各培養槽に追加した。培養槽は２８日間培養さ れ、例１と同様に採集された。生産量は培養槽当り８００百分から１６００百万 （平均は１１００百万）の５３段階線虫で２０個の培養槽を準備し、接種し、例 ５と同様に培養したが、線虫接種材料としてＨｅｔｅｒｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　 ｓｐ　ＮＺが用いられた。生産量は培養槽当り７００百万から１３００百万（平 均９５０百万）のＪ３段階の線虫であった。

例７ 昆虫病原性カビ、ＭｅｔａｒｒｈｙｚＩｕｒｎ　ａｎｉｓｏｐｌｉａｅの大量育 成のために、２キログラムの米と３リツトルの水を入れた１個の培養槽を１．５ 時間オートクレーブ処理した。

培養槽を冷却した後、先に行った培養からの菌の米培養で接種した。２週間援受 皿の蓋を外し、米を数日間乾燥体群に菌を導入するために利用した。

例８ 昆虫病原性菌Ｂｅａｕｖａｒｉａ　ｂａｓｓｉａｎａでオートクレーブ処理後接 種したことを除いて例７と同様に別の培養槽を準備し、接種し、培養した。この 受皿による生産量は例７で得られた生産量と同様であった。

ＦｔＧ、２ Ｆｔａ、Ｊ。

要約書 側壁（Ｉ２）を備えた受皿（１０）と、これも側壁（１３）を備えたオーバラッ プした蓋（１１）とからなる培養槽において昆虫病原性線虫が培養される。ポリ エーテル、ポリウレタン、フオーム製のガスケット（１４）か蓋の内縁部の周り に位置される。好適な培養槽においては、受皿の壁の内面に取り付けられた停止 部材（１６）が、蓋のフランジ（１５）が停止部材と当接すると受皿へ向かって の蓋の強制的な運動を阻止する。そのような配備によって、フオームガスケット を圧縮しすぎることなく培養槽を相互に積み重ねることができる。

培養層の中味を線虫の三者懸濁物で接種することを含む、前述の培養槽を用いて 幼若（Ｊ３段階）の線虫を育成する方法も開示されている。線虫を採集する方法 と装置、接種材料として用いる線虫を培養する槽、および３３段階と成体線虫を 分離する方法も記載されている。培養槽はまた、カビ、原生動物、バクテリヤお よび培養組織を培養するためにも使用できる。

国際調査報告 １１１１１１ｒｌｌａｔ１６１１１１１Ａ４−、Ｉｅ−虻嘲、管＋ｍ、に？／［ ９１ＡＸ＋１３１１！ＩＩＩＣｒＬＩｍ＋＋６１′１聰覗＾Ｌ、、Ｉｅ＠ｌ１６ ＩＩｋ、ＰＣゴμａＨＭｌ　７８９１５／８１　−）　８３０１５８１　ＥＰ　 ９２５４フ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．感染性幼若昆虫病原性線虫、菌類、培養組織等を育成する培養槽において、 （ａ）概ね平坦な受皿であって、該受皿の周囲から概ね直交方向に延びる連続し た壁あるいは複数の隣接した壁を有する受皿と、 （ｂ）前記受皿と基本的に同じ形状を有するが前記受皿より寸法が大きい概ね平 坦な蓋であって、そのため前記蓋が前記受皿を覆うよう位置されると、前記受皿 の周囲が前記壁の外側に来て、前記蓋はその周囲から概ね直交方向に延びる連続 した側壁あるいは複数の隣接側壁を有する蓋と、 （ｃ）前記蓋の側壁内ですぐ隣接して前記蓋の縁部の周りに位置されることによ り前記蓋が前記受皿上に位置されると、受皿の壁の上縁部と接触する中密度ポリ エーテル、ポリウレタンフォーム（あるいは類似のフォーム材料）製のガスケッ トとを含むことを特徴とする培養槽。 ２．蓋には、可撓性で弾性で、オートクレーブで処理可能の材料のシールによっ て閉鎖される少なくとも１個の開口が設けられていることを特徴とする請求の範 囲第１項に記載の培養槽。 ３．各開口が円形の開口であり、前記シールがグロメットタイプのシールであり 、前記グロメットタイプのシールが（ｉ）最外縁部に連続した溝が形成している 相対的に厚い環状即ちドーナツ状の縁部であって、前記溝が低圧でガス密で、シ ールを付属した開口の縁部にすぐ隣接した蓋の材質部分を受け入れるようにされ た縁部分と、（ｉｉ）前記環状縁部分にその周囲において接続されている相対的 に薄い円形の中央部分を有していることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の 培養槽。 ４．前記各シールがゴム化合物あるいはネオプレンから作られていることを特徴 とする請求の範囲第２項又は第３項に記載の培養槽。 ５．蓋から延びている少なくとも１個のフランジを含み、前記少なくとも１個の フランジが蓋の側壁と同じ蓋の面から延びており、前記少なくとも１個のフラン ジが蓋の側壁と概ね平行であり、かつ蓋の側壁に向かって傾斜していることによ って前記の少なくとも１個のフランジと蓋の側壁とが、その中に前記ガスケット が位置する溝を形成していることを特徴とする請求の範囲第１項から第４項まで のいずれか一つの項に記載の培養槽。 ６．前記受皿の壁の内面に固定された複数の停止部材を含み、各停止部材が、蓋 が受皿に向かって押圧され、かつガスケットが所定量圧縮すると、蓋から延びる 関連のフランジの縁部が停止部材と当接するように位置していることを特徴とす る請求の範囲第５項に記載の培養槽。 ７．感染性の幼若昆虫病原性線虫を育成する方法において、 （ａ）ほぐしたポリエーテル、ポリウレタンフォーム（あるいは類似の材料）を くず肉のホモジネートでコーテイングし、コーテイングし、ほぐたフォームを請 求の範囲第１項から第６項までのいずれか１項により構成された培養槽の受皿の 基部の上に均一に分配し、次に、そのフォームガスケットが受皿の壁の頂部全体 と接触するように受皿の上に培養槽の蓋を置き、 （ｂ）培養槽とその中味とを約１２１℃の温度で約１時間オートクレーブ処理し 、 （ｃ）オートクレーブ処理した槽が冷却するようにし、（ｄ）オートクレーブ処 理したフォームとホモジネートとを、培養すべき昆虫病原性線虫種の共生細菌、 Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ　ｓｐの第１の形態で接種し、（ｅ）培養槽とその中味 とを共生細菌を培養するに十分な時間約２３℃の温度に保ち、 （ｆ）培養槽の中味を線虫の二者懸濁物で接種し、（ｇ）線虫種が線虫種の感染 性幼若（Ｊ３）体を再生し、発生させることができるに十分な時間約２３℃の温 度で培養槽を保持し、 （ｈ）培養槽から幼若昆虫病原性線虫を採集する順次段階を含むことを特徴とす る方法。 ８．培養された昆虫病原性線虫を採集する装置において、 （ａ）タンクの全体的に平坦な床から概ね垂直方向に延びている連続した側壁あ るいは隣接した側壁を有するタンクと、 （ｂ）全体的に平坦な網目の基部がその周囲において篩の連続した側壁あるいは 隣接した側壁に接続されている篩であって、前記タンク内に篩を位置させること のできる寸法を有し、タンクの床から網目の基部を離して篩を支持するようにつ くられた複数の脚即ちスペーサを有する篩と、 （ｃ）前記篩に適合する通気チューブであって、加圧された空気源に該チューブ を接続させる手段と前記チューブの離隔位置において複数の空気出口開口を有し ている通気チューブとを含むことを特徴とする装置。 ９．請求の範囲第７項に記載の装置を用いて、培養槽において培養された昆虫病 原性線虫を採集する方法において、 （ａ）篩をタンク中へ挿入し、通気チューブを篩の網目の上に位置させ、 （ｂ）篩の網目基部上にＪ３段階の線虫を培養した後培養槽の中味を装入し、 （ｃ）篩の網上の培養槽の中味を完全に覆うに十分な深さまでタンクに水を充て んし、 （ｄ）通気チューブに空気を供給し、篩の網上に位置した液体と、その他の材料 を通して約９０分空気を激しく泡立させ、 （ｅ）篩とタンク内の材料を約６０分間安定させ、その時間中にＪ３段階の線虫 と成体線虫とがタンク内で篩の基部の下で沈澱物を形成し、 （ｆ）その中に懸濁した余分の水といずれかの培養媒体とをタンクから除去し、 （ｇ）篩と、その網目基部に残っている全ての材料とをタンクから除去し、 （ｈ）線虫の清浄な懸濁物が形成されるまで線虫を無菌水で繰返し洗滌し、洗滌 の都度余分な水の沈澱時間と排出時間が続き、 （ｉ）清浄な懸濁物から線虫を収集する順次段階を含むことを特徴とする方法。 １０．Ｊ３段階および成体昆虫病原性線虫の懸濁物から幼若（Ｊ３段階）昆虫病 原性線虫を分離する方法において、 （１）床と側壁とを有する容器内に、該容器の床の上方に位置した第１の網目ス クリーン上のコットンクロスの層であって、前記第１の網目の縁部まで延びるク ロスを位置させ、 （２）コットンクロス層の頂部上に第２の網目スクリーンを位置させ、 （３）第２の網目スクリーンの頂部に線虫の懸濁物を位置させ、 （４）線虫の懸濁物が約１５センチの深さまで覆われるまで容器に水を加え、 （５）第２の網目スクリーンに、複数の空気出口を有する通気チューブを位置さ せ、 （６）約１２時間、上にある水を通して空気を泡立させ、その間幼若線虫がクロ スの層へ侵入し、成体線虫がクロスの層の上方に留っている間、相対的に静かな 、第１の網目スクリーンの下方の水まで効果的に移動し、（７）容器から通気チ ューブ、網目スクリーン、クロス層および成体線虫を取り出し、容器に残ってい る幼若線虫を洗滌し、収集する順次段階を含むことを特徴とする方法。 １１．請求の範囲第７項に記載の線虫育成方法において使用する線虫の接種材料 を生産する培養槽において、（ａ）全体的に長方形の受皿と、 （ｂ）概ね平坦な網目層と、前記網目層から概ね直交方向に延びる隣接側壁と端 壁とを有する全体的に長方形の内側受皿と、 （ｃ）それぞれ横部材と一対の側方アームとからなり、内側受皿に取り付けられ た一対のハンドルであって、各側方アームが内側受皿の側壁に対して概ね平行の 平面において、内側受皿の各側壁上の枢点の周りを回転運勢するように取り付け られ、各横部材が一対の側方アームの上端領域を接続し、側方アームの下端とそ の関連の枢点との間の距離が、枢点と内側受皿の網目基部との間の最短距離より 大きい一対のハンドルとを含むことを特徴とする培養槽。