JPH05505823A - 細胞成長抑制法およびそれに有用な組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞成長抑制法およびそれに有用なＪｕｌ成物本物本発明ノクローナル抗体に関 するものである。１観点においては、本発明はモノクローナル抗体の組合せに関 するものである。他の観点においでは、本発明は細胞成長の抑制に用いられる新 規な用途のモノクローナル抗体の組合せに関するものである。

発明の背景 抗体は医学的診断、たとえば血液型の判定、および生物学的実験に以前から用い られている。しかし抗体の複雑さおよび多様性のため同質な抗体を得るのか極め て困難であるので、その有用性は若干限られている。抗体は動物を異種物質に対 して保護するために動物の免疫系により産生される複雑な蛋白質または蛋白質系 分子である。医学用の抗体は一般に、動物の免疫系を刺激する異種物質を動物に 注射し、そして最も一般的には抹消血清または腹水から抗体画分を単離するこき により得られる。この抗体画分は、注射された異種物質に対して特異的な抗体、 および動物か産生じた他の種々の抗体を含有する。既知の方法によれば、特定の 異種物質に対して特異的な抗体を実質的に単離することは可能である。しかし特 定の異種物質に対する抗体が単離された場合ですら、その抗体は実際にはその異 種物質または関連物質の種々の抗原決定因子を認識する数種類の抗体の混合物で ある。若干の個々の抗体分子は特異性か高く、特定の異種物質またはその一部の みを認識するかも知れないが、他の抗体分子はこれらより選択性か低く、対象と する異種物質のみでなく、他の初雪をも認識するかも知れない。一般にはすべて の関連抗体を分離することは実際上不可能であるため、極めて慎重に精製された 抗体画分ですら、２物質以上と反応する可能性がある。

近年モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の製法が開発され、これによって同質な、特 異性の高い抗体を得ることか可能となった。一般にそれらの抗体は、動物を蛋白 質画分または他の異種物質で免疫処置し、動物から抗体産生細胞を採取し、これ らの抗体産生細胞を骨髄腫細胞株、たとえば腫瘍細胞と融合させてノ＼イブリド 一マを形成させ、これらを単離し、モノクローンとして培養することにより調製 される。これらのモノクローナルハイブリドーマはインビトロで培養するか、ま たは腫瘍として宿主動物内で成長させることができる。抗体産生細胞それぞれが 単一のユニークな抗体を産生ずるので、ハイブリドーマのモノクローナル培養体 それぞれか同質な抗体を産生じ、これをインビトロで成長させたハイブリドーマ 培養体の培地から、または腫瘍を保有する宿主動物の細胞、腹水もしくは血清か ら採取することができる。

新生細胞を抗体産生細胞と融合させることにより得られるハイブリドーマクロー ンのすへてか、目的とする異種物質または抗原（抗体がそれと反応する物質）に 特異的であるわけではない。それは、多くのハイブリドーマは動物が他の異種物 質と反応するために産生じていた抗体を形成するからである。異なる細胞により 産生される抗体は同一分子の異なる抗原決定因子と反応する可能性があるので、 対象抗原に対する抗体ですら、クローン毎に異なるであろう。従って各クローン から得られた抗体、または抗体を含有する培地、血清もしくは腹水を採取し、そ れか他の物質を認識する場合はそれが何であるかを判定することにより、それと 対象抗原との反応性およびその特異性の双方を試験する必要かある。各クローン の抗体の解明か必要であることはモノクローナル抗体調製の複雑さを増すが、得 られる多様な同質抗体は体細胞の構造および発達をマツプするための極めて正確 な多数の手段を研究者に与えるであろう。

同質の高特異性ＭＡｂが得られれば、診断用、実験用および療法用手段としての 抗体の価値は劇的に高まる。ＭＡｂを腫瘍およびウィルスの検出に用いることは 米国特許第４，１７２．１２４および４．１９６．２６５号明細書に記載されて いる。

ＭＡｂは、細胞か異なるタイプの体細胞に分化して身体の種々の組織を形成する 経路および過程を研究するのに特に好適である。細胞の分化は複雑な問題であり 、関与する過程の理解は始まったばかりである。個々の細胞タイプに特異的であ り、異なるＭＡｂにより検知される蛋白質は、細胞の発生および分化を研究する ための正確なマーカーとして役立つ。特定の蛋白質に特異的なＭＡｂは、細胞内 の既知蛋白質の存在を確認するために用いられるたけてなく、これまで発見され ていなかった物質を検出するためにも利用しうる。理論的には最終的に体内のあ らゆる高分子に対するＭＡｂを得て、種々の蛋白質の完全なマツピングなどを行 うことが可能である。

細胞分化の領域における重要な課題は、活発に増殖している（ｐｒ（＋ｊｉｆｅ ｒａｔｉｎｇ）幹細胞に由来する、成熟した形では非増殖性である細胞を研究す るこみである。このような細胞の多数の例か抹消血液内に見出される。赤血球お よび白血球は骨髄の幹細胞に由来し、双方とも普通は血流中で成熟細胞、として 非増殖性である。体細胞の誤った発生か癌を生し、これには血球関連の癌、たと えば骨髄腫および白血病か含まれる。ＭＡｂはこのような細胞内に存在する蛋白 質を判定し、それらの発生および由来をより完全に追跡するのに有用である。

近年、ヒトトランスフェリン（Ｔｆ）レセプターと反応するＭＡｂか開発された 。それらのＭＡｂの少なくとも１種類は細胞へのＴ［結合をブロックし、これに より細胞の増殖能を妨害する。たとえば米国特許第４．４３４．１５６号明細書 を参照されたい。その記載全体をここに参考として引用する。これらのＭＡｂは 細胞の増殖を抑制するために有用であることか示された。しかしこれらの開発に より表される進歩にもかかわらす、細胞成長を調節するためのより効果的な手段 を提供する進歩の余地は常にある。

発明の要約 本発明によれば、ＭＡｂの特定の紹合せか、増殖性細胞の成長を抑制するのに個 々のＭＡｂの活性の和のみを考慮することにより予想されるより実質的に有効で あることか見出された。本発明の組合せは、たとえば特定のヒト細胞、特に腫瘍 細胞を死滅させ、またはその成長を抑制するのに有用である。

他の大部分の潜在性細胞表面ターケｌト抗原に対するＭＡｂの場合と同様に、制 癌藁としての抗−ＴｆレセプターＭＡｂの有効性についての従来の研究を制限し ていた主な要因は、最適特性を備えたものを同定するための多数のＭＡｂを産生 じ得ないことであった。精製された組換えヒトＴｆレセプター、たとえばバキュ 人ｏ、１．Ｃｈ−虹−−２６３：　１．３３８６−１３３９２　（１９８８）コ を免疫処置およびハイブリトーマのスクリーニングに十分な量で人手しうろこと によって、この問題が克服され、さらにヒトＴｆレセプターの外部ドメイン（ｅ 　ｘ　ｔ　ｅ　ｒ　ｎａｌｄｏｍａｉｎ）に対する多数の新規なＭＡｂの産生が 可能になった。本発明によれば、意外にも特定の対の抗−ＴｆレセプターＭＡｂ が、これら２種類の別個のＭＡｂのいずれより効果的にヒト造血細胞パネルのイ ンビトロ成長を抑制することかμ出された。このインビトロ試験に基づいて、Ｍ Ａｂの対をインビボでの抗腫瘍活性について試験した。このＭＡｂの組合せは別 個に投与された個々のＭＡ、ｂと対比して、ヌードマウスにおいて、株化したＣ ＣＲＦ−ＣＥＭ白血病の皮下腫瘍細胞の成長を著（７く抑制し、場合により腫瘍 の退行を誘導することが証明された。

発明の詳細な説明 本発明によれば、桶７シ動物における腫瘍細胞の成長を抑制する方法において、 哨乳動物に少なくとも第１および第２のＭＡｂを含む有効量の組合せを投与する ことよりなり、その際それらの抗体はそれぞれヒトトランスフェリンレセプター 糖蛋白質に結合することができ、かっこの少なくとも２種類の抗体の組合せはそ の細胞成長の抑制に対してそれらの抗体が個々に投与された場合より有効である 方法が提供される。

この形態の本発明の現在好ましい観点においては、２種類の抗体が投与され、そ れらの抗体のうち少なくとも１種類はレセプター糖蛋白質へのＴｆの結合をブロ ックするのに有効ではない。それら個々の抗体のうち１種類は単独では腫瘍細胞 の成長に対して実質的に抑制効果をもたず、かつ第２抗体は単独でレセプター糖 蛋白質へのＴ［の結合をブロックすることが特に好ましい。それぞれの抗体がレ セプター糖蛋白質に同時に結合しうろことが特に好ましい。

本発明の他の形態によれば、哺乳動物における腫瘍細胞ゐ成長を抑制するための 療法用組成物において、組成物が有効量の少なくとも第１および第２のＭＡｂの 組合せ、ならびに薬剤学的に許容しうるキャリヤーを含み、その際それらの抗体 はそれぞれヒトトランスフェリンレセプター糖蛋白質に結合することができ、か つこの抗体の組合せは特定の浦乳動物腫瘍細胞の成長の抑制に対してそれらの抗 体か個々に投与された場合より有効である組成物か提供される。

この形態の本発明の好ましい観点においては、それらの抗体のうち少なくとも１ 種類はレセプター糖蛋白質へのＴｆの結合をブロックするのに有効ではない。

それら個々の抗体のうち１種類は、単独では腫瘍細胞の成長に対して実質的に抑 制効果をもたず、かつ第２抗体は単独でレセプター糖蛋白質へのＴｆの結合をブ ロックすることか特に好ましい。それぞれの抗体がレセプター糖蛋白質に同時に 結合しうろことか特に好ましい。

本発明のさらに他の観点においては、以下Ｄ６５．３０　（ＡＴＣＣ登録番号Ｈ Ｂ　１０３９４）、Ａ２７．１５　（ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ　１０３９５）、３ ４１．２．２３２．３の表示により呼ばれる新規なＩ　ｇ　Ｇ群ＭＡ　ｂ　、お よびこれに類する他の抗体が提供される。

本発明の実施に際して用いられるＭＡｂは、ヒトＴｆレセプターの外部ドメイン （分裂中の細胞、特に増殖中の腫瘍細胞の表面に見られる）に対して特異的であ る。Ｔｆレセプター糖蛋白質は、還元条件下でのＳＤＳポリアクノルアミドケル 上でのその泳動により測定して約９５，０００のモノマー分子量をもち、その天 然状態ではジスルフィド結合した２量体として存在することか解明された。オ０ −１４３５　；　トラウブリッシおよびオマリー（Ｔｒｏｗｂｒ　ｉｄｇｅ、Ｏ ｍａ精製したヒトＴｆレセプター糖蛋白質は天然源、組換えにより調製された材 料などから得られ、造血細胞の表面に見られる糖蛋白質に対する抗体の産生を誘 発するために動物に導入される。ヒトＴｆレセプター糖蛋白質の外部ドメインの 一部もしくは全部または交叉反応性物質を含有する免疫原−一無傷のヒト細胞お よび合成ペプチドを含むｍ−はいずれもＭｕレセプターの代わりに使用しうるか 、後者の方か好ましい。接種のために選ばれる動物は決定的ではないか、十分に 解明された系統、たとえばラット、マウスなどのネズミ類の系統を用いることか 好ましい。さらに種々のネズミ由来の新生細胞も十分に解明された培養体として 利用される。従って、ここに記載する抗体産生のためにはマウスが選ばれるが、 本発明はネズミが産生じた抗体、またはハイブリドーマ細胞において産生された ＭＡｂの使用に限定されるものではないと解すべきである。

細菌、植物および他の動物細胞において組換えＤＮＡ法によりこの一般型のＭＡ ｂを産生ずる方法は当業者に既知である。さらにハイブリドーマに由来するネズ ミＭＡｂは、抗体フラグメントを産生すべく、またはネズミＭＡｂをヒト化すへ く、組換えＤＮＡ法によって有利に修飾することかできる。

バキュロウィルス発現系において産生された組換えヒトトランスフェリンレセプ ター５０μｇをフロイントの完全アジュバントと混合して、ＢＡＬＢ／ｃマウス に皮下接種する。６週間後に、マウスにレセプターの外部ドメインの精製画分少 なくとも５０μｇのブースターを食塩液中において静脈内接種する。２回目の接 種の４日後にマウスを層殺し、それらの膵臓を摘出する。膵臓細胞懸濁液を調製 し、得られた細胞懸濁液を、無蛋白質のダルベツコの改良イーグル培地中で２回 遠心分離することにより（８００Ｘｇ）洗浄する。

膵臓から得られた抗体産生細胞は独立して再生することはなく、従って培養でき ないので、それらをインビボまたはインビトロで独立して培養しうる細胞と融合 させる。これは、融合ハイブリトーマの遺伝および代謝の過程が親細胞それぞれ の特性を備えた状態で行われる。これは、得られた細胞のあるものは独立して再 生し、かつ抗体を産生ずる親細胞の抗体を産生ずる能力を備えていることを考慮 したものである。ある種類の腫瘍細胞、特に骨髄腫細胞は、抗体産生細胞と有ｆ ｉｌに融合してハイブリドーマを形成しうる。親細胞の遺伝的および生化学的特 性か適合性であり、従って生存性ハイブリトーマを形成する可能性を高めるため には、腫瘍細胞および抗体産生細胞が同一種に由来することが、必要ではないが 好ましい。多数の骨髄腫培養体が解明されており、ここではハイブリドーマを形 成するためにマウス由来の非−抗体産生一骨髄腫細胞系ＳＰ２１０−Ａｇ１４　 （アイザック　（Ｉｓａｃｋｅ）　ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　２３． ３２６−３３２　（１９８６））を使用する。他の腫瘍系−一これにはＢ３、￥ ３．３１９４１５、ＸＸＯ，ＢＵ、１、ＩＶＩＰｃ−１１おヨびツレらの誘導体 が含まれるが、これらに限定されないｍ−も使用しうろことを理解すべきである 。抗体を産生じない骨髄腫系を選ぶことか有利であり、これにより得られたノλ イブリントは親細胞であるｓｉｉ細胞またはリンパ節細胞の抗体鎖のみを産生ず るであろう。抗体を療法の目的で、たとえば細胞成長を調節するために用いる場 合は、これが特に重要である。この場合は副作用を生じる可能性のある外来抗体 を導入することは望ましくない。

骨髄腫細胞は、１０％ウマ血清を補充したダルベツコの改良イーグル培地に維持 される。骨髄腫細胞１０７個、および組換えヒトトランスフェリンレセプターで 免疫処置したマウスから得た細胞１０８個を、トララブリッジ（Ｔｒｏｗｂｒｉ ｄｇｅ）（１９７８）前掲、の方法に従って融合させるために、ポリエチレング リコール１５００の４５％（Ｖ／Ｖ）溶液に再懸濁する。細胞ノ・イブリッドは ヒポキサンチンーアミノプテリンーチミシン（ＨＡＴ）培地中で選択される。Ｈ ＡＴ培地中での成長はすべてマウス牌臓細胞とマウス骨髄腫細胞のハイブリダイ セーシヨンが成功したことを示す。マウスへの接種に用いた精製Ｔｆレセプター に対する抗体を産生ずるものを単離し、後記の例１に記載したＥＬＩＳＡアッセ イ法により試験する。ハイブリッド細胞はファルコノミクロタイタープレートに おける限定希釈法によりクローン化される。

ハイブリドーマのクローンは、インビトロで既知の組織培養法、たとえばコツト ン（’Ｃｏｔｔｏｎ）　ら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、３．　１３６　（ １９７３）に記載の方法により成長させることかできる。あるいは／＼イブリト ーマは、インビボで組織適合性動物または無胸腺ヌードマウスにおいて腫瘍とし て成長させることができる。抗体はインビトロ培地から、または動物の血清もし くは腹水から、当技術分野で既知の手段により、たとえばケルハルト（Ｇｅ　ｒ ｈａ　ｒｄ）７８）により採取することができる。場合により、培養物または腫 瘍の細胞から直接に抗体を得ることが有利である。

次いで各クローンからの抗体をＥＬＩ　ＳＡアブセイ法により抗−Ｔｆレセプタ ーＭＡｂにつきスクリーンした。次いで、抗−Ｔｆレセプター抗体を産生ずるハ イブリドーマを限定希釈法によりクローン化し、ＥＬＩＳＡ法により再度アッセ イした。ＥＬＩＳＡア７セイ法は当業者に周知の方法により実施することができ 、本明細書の実施例１に詳述される。

次いでヒトＴｆレセプターの外部ドメインに反応したＭＡｂを判定するために抗 −ＴｆレセプターＭＡ、ｂをスクリーンし、生存性ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に結合 する能力により同定したーーＦＡＣ５分析により測定。

有用なハイブリドーマクローンが形成された場合、もはや抗体を産生じない変異 細胞を含む培養の過剰成長を避けるために、細胞系をリフローン（ｒｅｃｔａｎ ｅ）することが一般に有利である。ハイブリドーマは親細胞それぞれの遺伝物質 をすべてではなく若干含むので、１１イブリドーマの完全な特性は未知である。

しばしばハイブリドーマクローンは当初の遺伝的欠失またはその後の染色体喪失 のため、数世代後にそれが再生する能力および／または特定の抗体を産生ずる能 力を喪失する場合がある。従って抗体産生ハイブリドーマの機能性株が得られる のを保証するために、最初のハイブリダイゼーションの直後に、目的とするノ＼ イブリド−マクローンをリフローンすることが重要である。Ｂ６５．３０、Ａ２ ７１５、Ｂ４９．１、Ｂ７７．２、Ｃ４５，１、Ｄｌｌ、１．１４８．１．２３ ２゜３．２８９．２．３４２．２．４１７．１、Ｗ４Ｂ、５、Ｈ８，１０、Ｈ８ ８゜１、Ｂ５６．４２．１２８．１．１４４．１．２３５．１、Ｈ５９，２、Ｚ ３５２、Ａ１１．１、Ａ１７３、Ｂ２７、Ｃ９５，７、Ｂ７９．２０、Ｂ８６． 　Ｂ３、Ｂ２．３．３４１．２．３９８．Ｌ、４５４．　１．４５６．１および Ｈ５１゜１と同定される細胞系培養物、ならびにそれらの誘導体は、Ｔｆレセプ ター糖蛋白貫に特異的なＭＡｂを産生ずる。Ｂ６５．３０およびＡ２７．１５細 胞系は、アメリカン・ティッシュ−・カルチャー・コレクション、マリーラント 州２０８５２、口ｌクビル、バークローノ・ドライブ１２３０１に寄託されてお り（それぞれ登録番号ＨＢ　１０３９４およびＨＢ　１０３９５Ｌ本発明に有用 なものの一例であるＭＡｂを産生ずる。

本発明の組合せに用いるものとして考慮されるＭＡｂは一般に３群に分類される 。第１群には、単独でＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に投与された場合にＣＣＲＦ−ＣＥ Ｍ細胞の成長をほとんど抑制せず、このためここでは細胞増殖のプロ・ツクに無 効であると言われる抗体か含まれる。上記の基準を満たす抗体の多数の例が前記 方法により調製され、以下のコード表示で呼ばれる：Ｂ３／２５、Ｂ４９．Ｌ、 Ｂ７７２、Ｃ４５１、Ｄｌｌ　１．３４２．２．４１７．１、Ｈ４８，５、Ｈ８ ，１０、Ｈ８８，１、Ｂ５６．４２．１２８１．１４４１．２３５．Ｌ、Ｈ５９ ，２、Ｚ３５．２、Ａ１１．１、Ａ１７３、Ｂ２７、Ｃ９５，７、Ｂ７９．２０ 、Ｂ８６．１３、Ｂ２．３．３９８１．４５４．１．４５６．１およびＨ５１１ ゜ 本発明の実施に際して用いるものとして考慮される他の抗体には、第２群の抗体 が含まれる。これらは単独で投与された場合、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ！ＥＩＩＰｉ！ および他のヒト細胞系、たとえばＫＧ−１、ＨＬ−６０などの成長を少なくとも 実質的な程度に抑制する。Ｔｆレセプターに結合し、かつ細胞成長を抑制すると いう基準を満たす抗体の例には以下のものか含まれる　４２／６　（ＡＴＣＣ登 録番号ＨＢ−８０９４）　、Ｂ６５．３０　（ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ　１０３９ ４）　、Ａ２７゜１５　（ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ　１０３９５）、２３２．３お よび３４１．２゜本発明の実施に際して用いるものとして考慮される第３群の抗 体には、単独で投与された場合、ＴｆがＴｆレセプターに結合する能力を少なく とも実質的な程度にブロックし　かつＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（および前記の他の ヒト細胞系）の成長を少なくとも実質的な程度に抑制する抗体が含まれる。この 基準を満たす抗体の例には４２／６　（ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−８０９４）など が含まれる。

本発明の実施に際して用いられる抗体の比率は広範に及び、なおかつ細胞成長を 抑制するために個々の抗体のいずれかより有効な組合せが得られる。一般に第１ 抗体（細胞成長の実質的な抑制に有効でない抗体）と第２抗体の比率は約０゜５ ・１−５１の範囲にある。好ましくは第１抗体と第２抗体の比率は約１１−２１ の範囲にある。

療法の目的で用いる場合、本発明の抗体の組合せは、当業者に周知の多様な方法 で投与することができる。たとえば前記の少なくとも２種類の抗体の組合せおよ び薬剤学的に許容しうるキャリヤーを対象に投与することかできる。

本発明の実施に際しては、当業者か容易に決定しうる薬剤学的に許容しうる多様 なキャリヤーを用いることができる。現在好ましいものは液体キャリヤー、たと えばリン酸緩衝食塩液または他の等張の中性水溶液である。これらのキャリヤー 中における抗体の組合せの濃度は広範に及びうる。キャリヤー中のＭＡｂの実際 の濃度は投与形式、全ターゲｌト用量、処置される個体、取り扱いおよび貯蔵の 要件などの関数として変化するであろう。

一般的な投与手段には静脈内および腹腔的注入または注射が含まれる。この療法 用組合せは、好ましくはレシピエンドの体重ｋｇ当たり約０１−約１５ｍｇの１ 日量で投与される。より詳細には、抗体の組合せはレシピエンドの血清中の抗体 濃度を少なくとも約１μｇ／ｍｌの水準、好ましくは少なくとも約１０μｇ／ｍ ｌの水準となすように投与される。

本発明方法は種々の異常な細胞成長状態、たとえば白血病の細胞成長、黒色腫の 細胞成長、造血性腫瘍の細胞成長、赤白血病の細胞成長などの処置に特に有用で ある。一般に本発明方法は正常または異常に分裂する細胞の細胞成長を抑制し、 細胞を死滅させるのに有用である。後記の実施例において証明されるように、本 発明のＭＡｂの組合せは細胞毒性である。すなわち細胞増殖抑制性（ｃ　ｙ　ｔ 　ｏ　５ｔａｔｉｃ）、すなわち処理された細胞の５ｆＣ長を単に停止させるの とは異なり、処理された細胞の死をもたらす。

本発明を限定ではない下記の実施例につき詳述する。

実施例Ｉ ＭＡｂの調製、トミンゴおよびトララブリッジ（Ｄｏｍｉｎｇｏ、Ｔｒｏｗｂｒ ｉｄｇｅ）　ｒＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６３：１３３８６−１３３９２　（ １９８８）］の記載に従ってバキュロウィルス発現系において組合せヒトＴｆレ セプターを調製し、ヒトＴｆアフィニティヵラムにより精製したｍ一本質的には 先にアンダーソン、マツケラス、パラエルおよびハリディ（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、 Ｇ。

Ｊ、、Ｍａｃｋｅｒｒａｓ、Ａ、、Ｐｏｗｅｌｌ、Ｌ、Ｗ、、Ｈａｌｌｉｄａｙ 。

Ｊ、Ｗ、）　［Ｂｉｏｃｈｅｍ、ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　８８．４： ２２５−２３３　（１９８６）］の記載に従うが、ただしＩＭＫＣＩの代わりに ＩＭＮａｌを最終溶出緩衝液に含有させた。組換えヒトＴｆレセプターの収率は 約０．５ｍｇ／ｍｌ　（細胞）であった。

Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを、フロイントの完全アジュバント中の精製した 糖蛋白質５０μｇを背部皮下に用いて免疫処置した。２週間後の同様な免疫処置 ののち、種々の期間後にマウスを食塩液中の組換えＴｆレセプター５０μｇの静 脈内注射により免疫処置した。３日後に、免疫処置マウスの肺臓を摘出し、Ｓ　 Ｐ　２１０−Ａｇ１４骨髄腫細胞系と融合させたｍ一本質的にはアイザック、サ ウヘノン、ノ・イマン、レスリー、シュルテおよびトラウブリッシ（Ｉｓａｃｋ 、ｅ、Ｃ，Ｍ、Ｓａｕｖａｇｅ、Ｃ，Ａ、、Ｈｙｍａｎ、Ｒ，、Ｌｅｓｌｅｙ、 Ｊ、、５ｃｈｕｌ胞とＩ×１０７個の骨髄腫細胞の融合により得られた細胞を、 ９６ウエルーミクロタイタープレート（コスタ−、マサチュセッツ州ケンブリッ ジ、＃３５９６）に接種し、次いで１０−２１日後にハイブリドーマ上清をＥＬ ＩＺＡアｌセイ法により抗−ＴｆレセプターＭＡｂにつきスクリーンした。次い で直ちに、抗−Ｔｆレセプター抗体を産生ずるハイブリドーマを限定希釈法によ りクローン化し、ＥＬ［ＺＡにより再度アッセイした。クローン化された／’ｔ イブリトーマ細胞５×１０’個を、１−３週間前に予め０．４ｍｌブリスタン（ アルドリッヒ・ケミカル社、ワイオミング州ミルウオーキー）で初回抗原刺激し たＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスに腹腔内注射することにより、ＭＡｂを含有す る腹水を得た。次いでＭＡｂを５０％硫酸アンモニウム沈殿法により腹水から部 分精製した。

ＥＬＩＺＡアイソタイピング（ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ）キットを業者の指示に従っ て使用して（サイムト・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州すンフランシスコ 、モノＡｂｌＤ　ＥｒＡキット）、ＭＡｂのアイソタイピングを行った。ｌ・イ ブリトーマ上浦の？７］′ＩＡスクリーニングのためのＥＬＩＺＡア７セイを下 記により実施した・９６ウエルーイムノプレート（ナックｔｔ１イリノイ州ネイ パービル、マクシソープＦ９６）を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝Ｍ（ｐＨ９ ，６）中の精製した組換えヒトＴｆレセプター５０　ｎ　ｇ／ウェルにより４℃ で一部コーティングした。次いでＥＬＩＺＡアッセイを、本質的には先のボラ− 、ビドウエルおよびバートレｙト（Ｖｏｌｌｅｒ、Ａ、、Ｂｉｄｗｅｌｌ、Ｄ、 Ａ、、Ｂａｒｔ１５５−５６　（１，９７６）の記載に従って実施した。次いで ヒトＴ「レセプターの外部ドメインに幻するＭＡｂを、生存性ＣＣＲＦ−ＣＥＭ 細胞へのそれらの結合能により同定したｍ−ロス・アロモス・デザイン・フロー ・サイトメーターによるＦＡＣ３分析［レスリー、ハイマン、シュルテおよびト ロツタ−（Ｌｅｓｌｅｙ、Ｊ、、ｌ（ｙｍａｎ、Ｒ，，５ｃｈｕｌｔｅ、Ｒ，、 Ｔｒｏｔｔｅｒ、Ｊ、）。

Ｃｅ　ｌ　１．Ｉｍｍｕｎｏ　１．８３　：１４−２５　（１９８４）］により 測定。細胞（２Ｘ１０６）を１−１−０Ｏのハイブリドーマ上清、続いて第２段 階抗体として飽和量のヤギ抗−マウスＩｇ（オルカノン・テクニカーカソペル、 ペンシルベニア州ウェストチェスター）で染色した。

ヒトＴｆレセプターに対するＭＡｂ　４２／６およびＢ３／２５は、先にトラウ ブリノジおよびロペツ（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ、ｌ　Ｓ、、Ｌｏｐｅｚ、Ｆ、） ［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、７９：１１７５−１１ ７９　（１９８２）］　；ならびにトラウブリノンおよびオマリー（Ｔｒｏｗｂ ｒｉる。

実施例２ 採用した培養およびアッセイ法 細胞系および１織培養。　これらの試験で用いたヒト腫瘍細胞系、ＣＣＲＦ−Ｃ ＥＭ、ＨＩ、−６０、ＫＧ−１１顆粒球性白血病）、Ｋ５６２（ヒト赤白血病） 、ナマルバ、Ｕ９３７およびＭ２１（黒色腫）については、先にテトル、／％二 セント、トラウブリッン（Ｔａｅｔｌｅ、Ｒ，、Ｈｏｎｅｙｓｅｔｔ、Ｊ、Ｍ、 、Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ、［、Ｓ、）［Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　３２：３４ ３−７４３．７　（１９８５）］に記載されている。それらは５％ウシ胎仔血清 または８％ウソ成体（ｄｅ　ｆ　１ｎｅｄ　ｃａ　ｌ　ｆ）血清を補充したＲＰ ＭＩ　１６４０培地においてルーティンに二次培養された。ＣＣＲＦ−ＣＥＭ二 次培養系はヌードマウスにおいて皮′Ｆ腫瘍として成長する。

Ｈｌ、６０コロニー形成アツセイ。　抗−ＴｆレセプターＭＡｂの細胞毒性を、 先のテトル、ハニセノトおよびハーケロン（Ｔａｅ　ｔ　ｌｅ、Ｒ，、Ｈｏｎｅ ｙｓｅｔ　ｔ、Ｊ、Ｍ、、Ｂｅｒｇｅｒｏｎ、Ｒ，）、Ｊ、Ｎａｔ　１．Ｃａｎ ｃｅｒＩｎｓｔ、　８１：１２２９−１２３５　（１９８９）の記載に従って、 ＨＬ−６０コロニー形成ア／セイにおいて評価した。要約すると、対数期の細胞 を洗浄し、ＲＰＭｌ　１６４０培地および１０％ウシ胎仔血清を用いて、単独で 、または１０ｍｇ／ｍｌ抗−ＴｆレセプターＭＡｂ（単独もしくは組合せ）と共 に培養した。

１−５日後に、細胞を洗浄し、コロニー形成アッセイにおいて同一の全細胞数を 接種した。１０−１４日のインキュヘーション後に、細胞５０個以上の凝集をコ ロニーとして計数した。これらの試験における対照培養は、細胞１０’個当たり ７６３±１７コロニーが成長した。

細胞サイクルの分析。　抗−ＴｆレセプターＭＡｂを用いて、または用いずに培 養した細胞のＤＮＡ含量を、先のテトル、Ｉ＼ニセットおよびバーゲロン（Ｔａ ｅｔｌｅ、Ｒ，、Ｈｏｎｅｙｓｅｔｔ、Ｊ、Ｍ、、Ｂｅｒｇｅｒｏｎ、Ｒ，）（ 前掲）の記載に従ってヨウ化プロピシウムにより測定した。

５９Ｆｅ取込み実験。　ヒトＴｆをヘーツおよびシュラバッハ（Ｂａｔｅｓ、５ ｃｈｌａｂａｃｈ）　［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４８：３２２８−３２３２ 　（１９７３）］の方法により５９　Ｆｅて標識した。５９Ｆｅ取込み実験のた めに、対数期ＨＬ−６０細胞を無血清ＲＰＭ１　１６４０培地で２回洗浄し、次 いで２４時間、エタノールアミン、インシュリンおよびセレンを含有する無血４ ＲＰＭＩ培地において、４ｕｇ／ｍｌの５９Ｆ　ｅ　ａｔＡ　Ｔ　ｆの存在下に 、５０μｇ／ｍｌの濃度の抗−ＴｆレセプターＭＡｂを用いて、または用いずに 培養した［テトル、ライナー、カスタグノラ、トー、メンデル７−：、／　（Ｔ ａｅ　ｔ　ｌｅ、　Ｒ，、Ｒｈｙｎｅ　ｒ。

Ｋ、、Ｃａｔａｇｎｏｌａ、Ｊ、　、Ｔｏ、Ｄ、、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、Ｊ、 ）。

種々の期間後に、細胞をＲＰＭＩ　１６４０培地で２回洗浄し、細胞に付随する Ｓ　９　Ｆｅをガンマ計数器て計数することにより測定した。

インビボ抗腫瘍アンセイ。　ヌードマウスにおいて皮下腫瘍として成長させたＣ ＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を用いて、抗−Ｔｆレセプターモノクローナル抗体の抗腫瘍 活性を測定した。４−６週令の雌（Ｎｕ／Ｎｕ）ヌードマウスをチャールズ・リ バー・ラボラトリーズ（マサチュセッツ州つイルミントン）から入手し、２×１ ０７個のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を背部皮下に接種した。次いで動物に種々の時点 てＭＡｂを腹腔内注射し、カリパスによる腫瘍直径の２回の直角方向測定により 腫瘍の大きさを測定した。次いで次式に従って腫瘍の大きさを算出した・腫瘍の 大きさ−（幅、ｍｍ）　２Ｘ　（長さ、ｍｍ）／２：先のテトル、ローゼン、ア ブラムソン、ベンティ’ｙティおよび／１ウウエル（Ｔａｅｔ　ｌｅ、Ｒ，、Ｒ ｏｓｅｎ、Ｆ、、Ａｂｒａｍｓｏｎ、１．、Ｖｅｎｄｉｔｔｉ、Ｊ、、Ｈｏｗｅ ｌｌ、Ｓ、）。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　７１：２９７−３０４　 （１９８７）のｇ己載１こよる。

実施例３ 抗体の組合せによる相乗効果の証明。　前記に従って、精製した組換えヒトＴｒ レセプターで免疫処置したＢＡＬＢ／ｃマウスのＩＩＩｐＩｉｌ細胞の融合によ り、ヒトＴｆレセプターの外部ドメインに対するＭＡｂを産生ずる３２のクロー ン化Ｉｓイブリドーマ細胞系を調製し、第１表に挙げる。これらはまずＥＬＩＺ Ａアγセイにおいて、Ｍ製した組換えＴ［レセプターとの反応性により同定され た。次いでこれらは、ＦＡＣ３分析により測定した生存性ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞 へのそれらの結合能によって、天然ヒトＴｆレセプターの外部ドメインを認識す ることが証明された。第１表に示すように、得られたＭＡｂは主としてＩ　ｇＧ 、サブクラスであった（３２ＭＡｂのうち３０）。次いでＭＡｂを、組織培養に おけるヒトＴ白血病細胞系、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、の成長抑制能につき個々に試験 した。

２４ウェル−組織培養プレート（＄３５２４、コスタ−、マサチュセッッ州ケン ブリッジ）中の、８％ウシ成体血清（ハイクローン、ユタ州ローガン）を補充し たＲＰＭＩ　１６４０培地１゜Ｏｍｌに、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞を２Ｘ１０’個 ／ウェルの密度で接種した。抗体を単独で、または組合せて、５０μｇ／ｍｌの 濃度で二重試験ウェルに添加し、４日目および７日目に二重試験ウェルがら細胞 を採取し、クールター計数器により２回計数した。反復計数は通常は＜１０％の 差である。Ｋ５６２、ＫＧＩ、ＨＬ〜６０およびＭ２１細胞を用いて成長抑制試 験を同様に実施した。用量依存曲線については、アッセイを上記に従って実施し 、ただし用いたＭＡｂａ度を変更した。

これらの試験に用いたモノクローナル抗体はネズミ腹水から５０％（Ｗ／Ｖ）硫 酸アンモニウム沈殿によって部分Ｍ製され、５０μｇ／ｍｌの濃度で使用された 、抗体の組合せを用いる場合、一般に約１１の抗体比で全抗体濃度を約５０μｇ ／ｍｌに維持した。

第１表に示した結果は、未処理対照培養につき得られた細胞成長と比較した抗体 処理培養における７日目の細胞成長の平均抑制％である」上止０　−　ＭＡｂ処 理培養における一担艷　×　１００未処理培養における細胞 第１表 抗−ヒトＴｆレセプターＭＡｂ単独または組合せにょるＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の インビトロ成長の抑制成長抑制率“　％ ４２／６　ＩｇＡ　６２　６６　ＮＤｃＤ６５．３０　幻Ｇ、　６５　ＨＤ　６ ６Ａｎ　Ａ２７．１５　工ｇＧ、　４０　９３　９２Ｂ４９．ｌ　工ｇＧ、　０ 　９１８８ Ｂ７７．２　工ｇＧ、　０　９２　８７Ｃ４５，１工ｇＧ、　１５　９２　８９ Ｄ１１．ｌ　工ｇＧ、　１３　９１　９１１４Ｂ、１　工ｇＧ、　ココ　９４　 ９１２コ２．３　工ｑＧ、　３８　９５　９１２８９．２　ＩｇＧ、　コ０　９ ４　９２３４１２　工ｇＣ，２７９３９１ ４１７，１工ｇＧ、　１７　９４　９１Ｗ４８．５　１９Ｇ、　０　９Ａ　１１ ８群　Ｈａ、ユ０　工ｑＧ、　２０　１コ　５０ＨＢＢ、ＩＸｑＧ、　１２　２ １　６７Ｈ５６，４２工ｇＧ、　１７　１４　３９１２ａ、１　工ｑＧ、　０　 ４　６９ １４４−１　１ｇＧ２．　０　１１　９０２］５．１　ＩｇＧ、　Ｏｌ　６コ Ｗ５９．２　工ｇＧ、　１１　９　６４Ｚ３５．２　ＸｑＧ、　１３　１６　６ ２Ｇ群　入１ユ、Ｉ　ＩｇＧ、　０　４２　９０Ａ１７＋コ　エｇＧ、　０　４ １　９０８２７　ＸｑＧ、　０　７２　７Ｂ Ｃ９５，７功Ｇ、　１３　７０　７２ Ｄ７９．２０　幻Ｇ、　１１　７５　Ｂ９ＤＢＳ−１３工ｑＧ、　０　６９　８ ８Ｅ２．コ　エｇＧ、　２０　７６　９２３４１．２　工ｇＧ、　４８　５４　 ９１３９８．１　τｇＧ、　２　６２　４Ｂ４５４．１　ＸｑＧ、　０　、　７ ９　８９４５６．１　工ｇＧ、　１７　７２　８９Ｗ５１１　ＸｑＧ、　Ｏ５４ ７６ ゛　ＣＣＲＦ−ＣＥＭＭＩ胞を二重試験培養法に設定し、細胞の計数は各培養の ４日目および７日目にクールター計数器により二重試験法で行われた。提示され た結果は、未処理対照培養と比較した抗体処理培養における７日目の細胞成長の 平均抑制率％である （１００　−　ＭＡｂ処理培ｉ１！、：おける細胞）　Ｘ　１００未処理培養に おける細胞 細胞の反復計数は通常は１０％以下の差である。

’　ＭＡｂはネズミ腹水から５０％（ｗ／ｖ）（ＮＨ４）２ＳＯ４沈殿により部 分精製され、５０μｇ／ｍｌの濃度で使用された。

“　測定されなかった。

被験抗体の大部分は、個々に投与した場合、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の成長にほと んど、または全く作用を及ぼさなかった（第１表）。しかし［ｇＧの１種類、Ｍ Ａｂ　Ｄ６５．３０はＩｇＡ　ＭＡｂ、４２／６−−これまでに知られている唯 一の実質的な抗−増殖活性をもつ抗−ＴｆレセプターＭＡｂ−一と同様に効果的 にＣＣＲＦ−ＣＥＭの成長を抑制した［トラウブリッノおよびロベツ（Ｔ　ｒ　 。

ｗｂｒｉｄｇｅ、ｒ、Ｓ、、Ｌｏｐｅｚ、Ｆ、）［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ 。

Ｓｃ　ｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、７９　：１１７５−４１７９　（１９８２）］。他の 数種類のＩｇＧ＋　ＭＡｂ−一最も特ｉすべきものはＡ２７．１５および３４１ ゜２であるｍ−もある程度のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の成長抑制を示すか、これよ りは程度か低い。

抗体Ｎｏ、Ｄ６５．３０と組合せた個々のモノクローナル抗体を用いて得られた 結果は驚異的であり、種々の被験抗体か３群に分類されることを示す。Ａ群の抗 体はＭＡｂ　Ｄ６５．３０の成長抑制効果を極めて顕著に高めた。これに対しＢ ｇ！の抗体はＭＡｂ　Ｄ６５．３０の成長抑制効果を実質的に低下させた。一方 、０群に分類される残りの抗体はＭＡｂ　Ｄ６５．３０単独により誘発される成 長抑制にほとんど、または全く作用を及はさなかった。それぞれ単独ではＣＣＲ Ｆ−ＣＥＭの成長に作用を及ぼさないある種類のＭＡｂ（特にＢ４９．１、Ｂ７ ７゜２およびＷ２Ｂ、５）かＭＡｂ　Ｄ６５．３０と相乗作用して増殖を抑制す ることは明らかである。実施された試験において両抗体は飽和濃度で存在するか らである。

同様に、抗体４２／６と組合せて１験したＩｇＧ　ＭＡｂの多数が、４２／６の 場合より著しい増殖抑制を示した。これには、単独で使用した場合にＣＣＲＦ− ＣＥＭ細胞の成長に対して検出しうるほどの作用を示さなかった抗体が含まれる 。

しかしＭＡｂ　Ｄ６５．３０と４２／６の組合せは、いずれかの単一抗体単独よ り抑制的ではなかった。また同様に、それ自体有意の抑制効果を示す抗体３４１ ２は、ＭＡｂ　Ｄ６５．３０により誘発された成長抑制を高めない。

抗−ＴｆレセプターＭＡｂの組合せがＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の成長に及ぼす相乗 的抑制効果は、抗体Ｂ３／２５ａ　（ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−８０３４）を用 いた用量応答実験によっても確認された。Ｂ３／２５ａおよび４２／６ＭＡｂの 組合せは、明らかにすべての濃度の試験につき、いずれかの抗体単独により誘発 された抑制の相より著しくＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の成長を抑制する。同様にＢ２ Ｏ１およびＢ７７．２もＭＡｂ　Ｄ６５．３０と相乗作用する。

ＣＣＲＦ−ＣＥ〜１細胞の増殖を効果的に抑制するＭＡｂの組合せは、ＨＬ−６ ０細胞、すなわち前骨髄球性白血病細胞系、およびＫＧ−１細胞、すなわちヒト 顆粒球性白血病細胞系の成長も〉９０％抑制する。これらのＭＡｂの組合せは、 Ｋ５６２ヒト赤白血病細胞およびＭ２１ヒト黒色腫細胞のインビトロ成長に対し ても、これらより低いが、容易に検出しうる効果を示した。これら両細胞系はＭ Ａｂ　４２／６単独による処置に抵抗性であると先に指摘されている［トラウブ リソノおよびニューマン（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ、１．Ｓ、、Ｎｅｗｍａｎ、Ｒ Ａ、）、トラノスフェリンレセブターに対するモノクローナル抗体　グリーブズ ＣＭ、Ｆ、Ｇｒｅａｖｅｓ）（監修）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　Ｒｅｃｅ ｐｔｏｒｓ：Ｐｒｏｂｅｓ　ｆｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅａ ｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、ｐｐ、２３５−２６２．　ロンドン　チャツプマン・ アンド・ホール（１９８５）］。２種類の抗−ＴｆレセプターＭＡｂの組合せに よるこれら２種類の抵抗性細胞系の処理により達成された最高水準の成長抑制は 、７日間のアッセイにおいて４０−５０％であった。しかし３種類のＭＡｂ、Ｄ ６５．３０、Ａ２７．１５および８７７．２の組合せによりに５６２細胞を処理 した場合、約７０％の成長抑制が得られた。

実施例４ インヒポにおけるＤ６５．３０およびＡ２７．１５　ＭＡｂの組合せの抗腫瘍効 果。　〜ＩＡｂ　Ｄ６５．３０およびＡ２７．１５の単独および組合せの双方か 、ヌードマウスの皮下部位に移植されたＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の成長に及ぼす作 用を測定した。最初の実験では、０．４および７日目に腹腔的投与されたＤ６５ ゜３０およびＡ２７．１５　ＭＡｂそれぞれ３ｍｇの組合せか、背部に２ＸｌＯ ”個のＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の皮下接種により攻撃した６匹のマウスすへてにお いて腫瘍の成長を完全に阻止することが認められた。同一のスケジュールで投与 されたＭＡｂ　Ｂ３／２５ａおよび４２／６の組合せはこれよりわずかに有効性 が低く、６匹のマウス中４匹において腫瘍の成長を阻止し、他の２匹においては 成長を遅延さ世ることが認められた。

次いで、Ｄ６５．３０およびＡ２７．１５　ＭＡｂの組合せによる処理が株化し た腫瘍の成長も抑制するか否かを調べた。マウスに２ＸｌＯ７個のＣＣＲＦ−Ｃ ＥＭ細胞を注射し、１０日後にマウスを比較可能な範囲の腫瘍サイズを保有する ４群に分けた。次いでこれら４群を、処理せず、あるいは１０．１４．１７．２ １．２４および２７日目（こ３ｍｇのＭＡｂ　Ｄ６５．’３０１１独もしくはＭ ＡｂＡ２７．１５単独、または３ｍｇの両ＭＡｂを注射（腹腔内）した。

ＭＡｂ　Ｄ６５．３０およびＡ２７．１５の組合せによる処理は、腫瘍の成長に 対して驚異的な効果を与えた。ＭＡｂの組合せにより処理したマウスすべてにお いて顕著な腫瘍成長抑制か見られ、５匹中３匹においては腫瘍が退行した。これ に対しＭＡｂ　Ｄ６５．３０単独で処理したマウス５匹中３匹、ＭＡｂ　Ａ２７ １５単独で処理したマウス５匹中４匹においては、腫瘍が未処理対照と同様な速 度で成長し続けた。

インビトロで検出された抗−ＴｆレセプターＭＡｂの組合せによる抗増殖活性か ら、インビボでの抗腫瘍活性を予想しつると思われる。ＭＡｂ　Ｄ６５．３０お よびＡ２７．１５の組合せは、株化したＣＣＲＦ−ＣＥＭ腫瘍の成長に対して驚 異的な効果を与え、若干の例においては腫瘍の完全な退行をもたらした。これに 対し別個に投与されたＭＡｂ　Ｄ６５．３０またはＡ２７．１５のいずれも、腫 瘍の成長に対して顕著な効果を示さず、両ＭＡｂを組合せたインヒポ抗腫瘍効果 は相乗的相互作用の結果であることが明らかに確認される。

実施例５ ヒトＴｆの結合およびインターナライセージ５ン（ｉｎｔｅ　ｒｎａ　ｌ　ｉｚ ａ　ｔｉｏｎ）試験。　抗−ＴｆレセプターＭＡｂが細胞表面Ｔｆレセプターの 発現およびイノターナライセ−ジョンに及ぼす作用を調べるために、ＨＬ−６０ 細胞を１０μｇ／ｍｌの抗−Ｔｆ　ＭＡｂ単独または組合せ中において４８時間 成長させた［テ１−ル、カスタグノラおよびメンデルソーン（Ｔａｅ　ｔ　ｌｅ 、Ｒ，、Ｃａｔａｇｎｏｌａ、Ｊ、、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、Ｊ、）、Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｒｅ５４６　：１７５９−４７６３　（１９８６）］。次イテ細胞を無血 清ＲＰＭＩ　１６４０培地中で２回洗浄し、飽和量の１２５■−標識シフェリＩ り（ｄ　ｉ　ｆ　ｅ　ｒ　ｒｉｃ）ヒトＴｒと共に４°Ｃて６０分間インキュベ ートした。細胞を無血清培地中で３回洗浄し、ガンマ計数器により計数した。１ ００倍過剰の非標識ヒトＴｆの存在下に非特異的結合を測定し、これらの数値を 全細胞結合から差引いた。

抗−ＴｆレセプターＭＡｂかヒトＴｆのインターナライセージ５ンに及ぼす作用 を調べるために、細胞を前２ｉこ従ってＭＡｂの存在下または不在下で４８時間 成長させた。次いで細胞を洗浄し、４μｇ／ｍｌの１２５ｒ−標識ヒトＴｆ中に おいて４℃で３０分間、次いて３７°Ｃで３０−４５分間インキュベートして、 Ｔｆレセプターの定常状態の細胞内および細胞表面分布を確立させた。次いて細 胞を１ｍｌの食塩液により４℃で３回洗浄し、次いで４℃で５分間、０．５Ｍ　 ＮａＣ＋−０，２Ｍ酢酸と共にインキュｌ＼−トして、表面結合Ｔｆを除去した 一−テトル、カスタグノラおよびメンデルソーン（Ｔａｅ　ｔ　ｌｅ、　Ｒ，、 Ｃａ　ｔ　ａｇｎｏｌａ、Ｊ、、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ、Ｊ、）（前掲）に従う 。ＨＬ−６０！胞については、この操作により結合＋２Ｊ−標ｍＴｆの９５％以 上が４℃で除去されることか示された。次いで細胞ペレツト内の残りのインター ナライズされた酸抵抗性放射能をガンマ計数器により測定した。

ヒトＴｆ結含の抑制実験。　抗−ＴｆレセプターＭＡｂがＴｆレセプターへの＋ ２５１−ＦｍＴｆの結合を抑制する能力を、先のシン、スペンサー、ミラー、ホ プキンスおよびトラウブリッン（Ｊ　ｉｎｇ、Ｓ、、５ｐｅｎｃｅｒ、Ｔ、、Ｍ ｉＣｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、１１０：２８３−２９４　（１９９０）］の記載に従っ て調へた。たたし“テイルレス（ｔａｉｌｌｅｓｓ）’突然変異体ヒトＴｆレセ プターを発現するニットｌＪ［線維芽細胞をＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞の代わりに使 用した［トラウブリ７シおよびロベツ（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ、１．Ｓ、、Ｌｏ ｐｅｚ。

Ｆ、）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、７９：ＩＬ７５ −１１７９　（１９８２）コ。細胞（ＩＸＩＯ’／ウェル）をコスタ−２４ウエ ル紹織培養プレートに接種し、−夜インキユベートした。細胞をダルベツコの改 良イーグル培地（ＤＭＥＭ）により４°Ｃで３回洗浄し、次いで三重試験ウェル を４０Ｃて１時間、種々の濃度の抗−ＴｆレセプターＭＡｂを含有する１５０ｍ １のＤＭＥＭと共にインキュベートした。細胞をＤＭＥＭで３回洗浄し、次いで ４°Ｃで１時間、０．５％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを含有するＤＭＥＭ中 の１２５ｒ４ｍヒトＴｆ　（４μｇ／ｍｌ　；比放射能約２　μＣｉ／ｍｇ）　 １５０ｕ　ｌと共にインキュベートした。細胞を３回洗浄し、ＬＭ　ＮａＯＨに よりウェルがら取り出し、ガンマ計数器により測定した。

第１表に挙げたＭＡｂはすべて、それらがＴｆレセプターへのヒトＴｆ結合をプ ロｙりする能力につき試験された。４２／６がＴｆ結合を〉９０％抑制した条件 下で、他の被験ＭＡｂはいずれもＴｆ結合を抑制しなかった。さらにＴｆ結合は 高い増殖活性をもつＭＡｂの組合せにより抑制されなかった。

抗−ＴｆレセプターＭＡｂ単独または組合せに長期間暴露された細胞かＴｆレセ プター発現に及ぼす作用を第２表に示す。

第２表４　抗トランスフェリンレセプターＭＡｂと共に培養したのちのＴｆ結合 およびインターナライセーショノ” ＭＡｂ ４２／６＋　Ｄ６５．３０＋ 対照　４２／６　Ｂ３／２５　Ｂ３／２５　０６５．３ＯＡ２７゜１５　Ａ２７ ．１５Ｔｆ結合　４０９１’）６±１６８２５１５±７゛３１±２　１６±７　 １６±３８０±１４２６±４４℃ 全Ｔｆ結合　３６１７３±７４６０　３９±１７５２　２９±９１９±７９２± １４３４±８３７°Ｃ 全Ｔｆ％　５３±３°　２１±７　５８±４　１５＋１２　８１１　二±：５　 ４３±６　２７±６インターナライゼー／！ンされたもの ”　ＨＬ６０白血病細胞を１０μｇ／ｍｌの抗−ＴｆレセプターＭＡｂ単独また は組合せと共に４８時間成長させた。、Ｔｆのインターナライセ−ジョンは、表 面Ｔｆ結合部位を４°Ｃで飽和させ、そして細胞を３７℃に３０−４５分間加温 することにより評価された。別個の実験において、３７°Ｃ（表面およびインタ ーナライズされた）およびインターナライズされた（酸安定性）Ｔｆも測定した 。

対照細胞は３７°Ｃで全Ｔｆの５３±３％かイノターナライズされた。結果は二 重試験の平均または３回の試験の平均±ＳＥである。

”　”Ｊ−標ｍＴｆ結合は細胞１０’個当たりのＣｐｍとして表された。

°　未処理細胞による結合に対する％。

６３７°Ｃて結合した、酸洗浄抵抗性の全Ｔｆに対する％単独ＭＡ、ｂまたはＭ Ａｂ対で４８時間処理すると、Ａ２７．１５１１独の場合を除いて、４°Ｃにお けるＴｆ結含によりｉ＋＋定した表面Ｔｆレセプター発現か実質的に低下した。

別個の一連の実験において、３７℃におけるＴｆ結合により測定した全Ｔｆレセ プター数の同様な低下が、４８時間のＭＡｂ処理ののちにも観察され、た。

Ｔｆレセプター発現の低下のほか、ＭＡｂ処理はそれらの定常状態での細胞内分 布も混乱させた。未処理対照細胞または単一のＩｇＧ抗−ＴｆレセプターＭＡｂ 単独で処理した細胞と比較して、４２／６単独−一組合せＢ３／２５ａおよび４ ２／′６、またはＤ６５．３０およびＡ２７．１．５と比較−一で処理した細胞 の残留Ｔｆレセプターのうち、より少ない部分か細胞内にあることか試験により 示された。

実施例６ 抗−ＴｆレセプターＭＡｂの組合せは細胞毒性である。　本発明方法により生し る成長抑制は本発明の抗−ＴｆレセプターＭＡｂの組合せか細胞増殖抑制性（Ｃ ｙｔｏｓｔａｔｉｃ）であるからか、または細胞毒性であるからかを判定するた めに、ＨＬ−６０コロニー形成に対して抗−ＴｆレセプターＭＡｂの組合せか及 ぼす細胞毒性作用の定量的推定を行った。２種類の抗−ＴｆレセプターＭＡｂの 組合せを用いた　Ｂ　３／２５　＋　４２／６およびＤ６５．３０＋Ａ２７．１ ５゜これらの組合せは白血病細胞系の成長抑制において最も有効なものに含まれ 、異なる種類の有効ＭＡｂの組合せを表す　すなわちＩｇＧおよびＩＫＡならび に２種類のＩｇＧ、ＭＡｂであり、これらはそれぞれ単独で増殖抑制活性を備え ている。

ＨＬ−６０細胞をそれぞれ１０μｇ／ｍｌのＭＡｂ単独または組合せの存在下で 培養し、洗浄し、次いで同数の細胞をＭＡｂの不在下でのコロニー形成アッセイ に際して再接種した。

ＭＡｂの組合せはそれぞれ、コロニー形成に対して強力な作用をもっことが認め られた。２日後にＭＡｂ　４２．／６およびＢ３／２５、またはＭＡｂ　Ｄ６５ ゜３０およびＡ２７．１５の組合せのいずれかにより処理した細胞によるコロニ ー形成は〉９０％抑制された。５日後にこれら２種類のＭＡｂの組合せはコロニ ー形成を〉９５％抑制した。これは明らかに、ＭＡｂに長期間暴露することは細 胞毒性であることを示す。

本発明をその特定の好ましい形態につき説明したか、本明細書および請求の範囲 に記載される本発明の精神および範囲内において変更および修正をなしうろこと は理解されるであろう。本発明の個々の特色は以下の請求の範囲において強調さ れる。

要約書 細胞成長の抑制に極めて有効であるモノクローナル抗体の組合せ、および新規な 組合せのモノクローナル抗体を用いて細胞成長を抑制する方法が開示される。

本発明の実施に用いられる抗体は、ヒトトランスフェリンレセプター糖蛋白質に 結合可能である。好ましい組合せにおいては、組合せのうち少なくとも１員子が 単独で細胞成長の抑制に極めて有効であり、組合せのうち他の少なくとも１員子 は単独では細胞成長の抑制に実質的に無効である。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１功

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物における腫瘍細胞の成長抑制法において、該哺乳動物に少なくとも 第１および第２のモノクローナル抗体を含有する組合せを有効量投与することよ りなり、その際それらの抗体はそれぞれヒトトランスフェリンレセプター糖蛋白 質に結合可能であり、かつその際これらの抗体の組合せは該細胞の成長抑制に対 してそれらの抗体のいずれかを単独で投与した場合より有効である方法。
2. ２．第１抗体が単独では腫瘍細胞の成長に対して実質的に抑制効果を有しない、 請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．第１抗体がレセプター糖蛋白質へのトランスフェリンの結合をブロックする のに有効でない、請求の範囲第２項に記載の方法。
4. ４．第２抗体が単独で腫瘍細胞の成長を実質的に抑制する、請求の範囲第１項に 記載の方法。
5. ５．第２抗体が単独でレセプター糖蛋白質へのトランスフェリンの結合をブロッ クする、請求の範囲第４項に記載の方法。
6. ６．第１および第２抗体の双方が同時にレセプター糖蛋白質に結合しうる、請求 の範囲第１項に記載の方法。
7. ７．第１および第２抗体の双方が同時にレセプター糖蛋白質に結合しうる、請求 の範囲第４項に記載の方法。
8. ８．処置されるレシピエントに少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ体重の１日量で抗 体の組合せが投与される、請求の範囲第１項に記載の方法。
9. ９．処直されるレシビエントにレシビエントの血清中の抗体濃度を少なくとも約 １μｇ／ｍｌとなすのに十分な１日量で抗体の組合せが投与される、請求の範囲 第１項に記載の方法。
10. １０．処置されるレシビエントにレシビエントの血清中の抗体濃度を少なくとも 約１０μｇ／ｍｌとなすのに十分な１日量で抗体の組合せが投与される、請求の 範囲第１項に記載の方法。
11. １１．該方法が白血病細胞の成長の処置に用いられる、請求の範囲第８項に記載 の方法。
12. １２．該方法が黒色腫細胞の成長の処置に用いられる、請求の範囲第８項に記載 の方法。
13. １３．該方法が造血性腫瘍細胞の成長の処置に用いられる、請求の範囲第８項に 記載の方法。
14. １４．該方法が赤白血病性腫瘍細胞の成長の処置に用いられる、請求の範囲第８ 項に記載の方法．
15. １５．さらに哺乳動物に少なくとも第３のモノクローナル抗体を組合せの一部と して投与し、その際第３抗体はヒトトランスフェリンレセプター糖蛋白質に結合 可能であり、かつその際これらの抗体の組合せは該細胞の成長抑制に対してそれ らの抗体のいずれか１種類を単独で投与した場合より有効であり、またはそれら の抗体のいずれか２種類を組合せて投与した場合より有効である、請求の範囲第 １項に記載の方法。
16. １６．第１モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−８０３４と指定さ れるもの、Ａ２７．１５と表示されるもの、およびそれらの抗体産生リクローン から選ばれる細胞系より得られるものである、請求の範囲第１項に記載の方法。
17. １７．第２モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−８０９４と指定され るもの、Ｄ６５．３０と表示されるもの、およびそれらの抗体産生リクローンか ら選ばれる細胞系より得られるものである、請求の範囲第１項に記載の方法。
18. １８．少なくとも１種類の抗体がＩｇＧ１抗体である、請求の範囲第１項に記載 の方法。
19. １９．哺乳動物における腫瘍細胞の成長抑制のための療法用組成物において、該 組成物が少なくとも第１および第２のモノクローナルの組合せならびに薬剤学的 に許容しうるキャリヤーを含み、その際それらの抗体はそれそれヒトトランスフ ェリンレセプター糖蛋白質に結合可能であり、かつその際これらの抗体の組合せ は特定の哺乳動物腫瘍細胞の成長抑制に対してそれらの抗体のいずれかを単独で 投与した場合より有効である組成物。
20. ２０．第１抗体が単独では腫瘍細胞の成長に対して実質的に抑制効果を有しない 、請求の範囲第１９項に記載の組成物。
21. ２１．第１抗体がレセプター糖蛋白質へのトランスフェリンの結合をブロックす るのに有効でない、請求の範囲第２０項に記載の組成物。
22. ２２．第２抗体が単独で腫瘍細胞の成長を実質的に抑制する、請求の範囲第１９ 項に記載の組成物。
23. ２３．第２抗体が単独でレセプター糖蛋白質へのトランスフェリンの結合をブロ ックする、請求の範囲第２２項に記載の組成物。
24. ２４．第１および第２抗体の双方が同時にレセプター糖蛋白質に結合しうる、請 求の範囲第１９項に記載の組成物。
25. ２５．第１および第２抗体の双方が同時にレセプター糖蛋白質に結合しうる、請 求の範囲第２２項に記載の組成物。
26. ２６．該組合せがヒトトランスフェリンレセプター糖蛋白質に結合可能である第 ３モノクローナル抗体を含み、これらの抗体の組合せは該細胞の成長抑制に対し てそれらの抗体のいずれか１種類を単独で投与した場合より有効であり、または それらの抗体のいずれか２種類を合わせて投与した場合より有効である、請求の 範囲第１９項に記載の組成物。
27. ２７．第１モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ登録番号ＣＲＬ−８０３４と指定さ れるもの、Ａ２７．１５と表示されるもの、およびそれらの抗体産生リクローン から選ばれる細胞系より得られるものである、請求の範囲第１９項に記載の組成 物。
28. ２８．第２モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ登録番号ＨＢ−８０９４と指定され るもの、Ｄ６５．３０と表示されるもの、およびそれらの抗体産生リクローンか ら選ばれる細胞系より得られるものである、請求の範囲第１９項に記載の組成物 。
29. ２９．少なくとも１種類の抗体がＩｇＧ１抗体である、請求の範囲第１９項に記 載の組成物。
30. ３０．組成物としての、ヒトトランスフェリンレセプター糖蛋白質に結合可能で あるＩｇＧ−群抗体において、該抗体がＤ６５．３０およびＡ２７．１５と表示 されるもの、ならびにそれらの抗体産生リクローンから選ばれる細胞系より得ら れる抗体。