JPH05504474A - βレチノイン酸応答エレメント組成物およびアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 レチノイン酸応答エレメント組　物およびア、セイ本明細書に記載され、請求さ れている発明は、米国国立衛生研究所からの支援によって行なわれた。米国政府 は、本発明についての権利を留保する。

１豆旦立旦 本発明は、一般的にステロイド／サイロイドホルモン受容体およびそれらと同種 の応答のエレメントとして知られている該受容体のスーパーファミリーに関連し ている。さらに詳細には、本発明は、プロモーターの転写活性を促進するのに使 用され得る、βレチノイン酸応答エレメント（βＲＡＲＥＳ）の発見に関連して いる。

１五Δ１見 真核生物の分子生物学の中心課題は、特定のＤＮＡ結合タンパク質がどの様に制 御配列に結合して細胞の機能および運命に影響を与えるかということである。ス テロイド／サイロイドホルモン受容体は、リガンド依存性の転写因子のスーパー ファミリーを形成している。このスーパーファミリーは、このような細胞の機能 および運命を担っていると考えられている。例えば、これらの受容体は、細胞外 ホルモン信号を標的遺伝子に変換して伝えることが知られている。この標的遺伝 子は、ホルモン応答エレメント（ＨＲＥｓ）として知られる特定のエンハンサ− 配列を含む。各々の受容体は、リガンド結合ドメインおよびＤＮＡ結合ドメイン を含む。この受容体は、リガンドに結合する際に立体配座変化を受ける。この立 体配座変化によって、受容体−リガント複合体がその同種の応答エレメントに結 合し、それによって会合したプロモーターの転写活性を制御している。このプロ モーターは、作動可能に結合した構造遺伝子の転写を駆動する。

配列の比較および突然変異による、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）のような ホルモン受容体の分析によって、転写の活性および抑制、核の局在性、ＤＮＡ結 合およびホルモンの結合を担う機能的ドメインが同定された。転写を活性化する ために要求されるＤＮＡ結合ドメインは、９個のシスティン（Ｃ＋からＣｓ）を 含む約２０の部位の６６〜６８個のアミノ酸で構成されており、異なる受容体の 間でも不変である。

この受容体のスーパーファミリーのモジュール構造によって、機能的なキメラ状 の受容体を作製するのに、あるドメインと別のドメインとを入れ替えることが可 能となる。

ホルモン応答エレメントは、一般的に構造上の関連があるが、実際上、機能的に は異なっている。ＧＲ（ＧＲＥ）　、エストロゲン受容体（ＥＲＥ）およびサイ ロイドホルモン受容体応答エレメント（ＴＲＥ）についての構造と機能は、詳細 に特徴づけられている。このような応答エレメントは、半サイト（’ｈａｌｆ　 ５ｉｔｅｓ″）のパリンドローム構造対からなる（Ｅｖａｎｓ、５ｃｉｅｎｃｅ 　２４０，８８９（１９８８）；Ｇｒｅｅｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｍｂ。

ｎ、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　４．３０９（１９８８））。最 も効果的な偽あるいは一致した応答エレメントでは、ＧＲＥおよびＥＲＥでは一 個の半すイト当り２個の核酸のみが異なっている（Ｋｌｏｃｋら、　Ｎａｔｕｒ ｅ　３２９．７３４（１９８７））。一方、同一の半サイトがＥＲＥとＴＲＥで 見られ得る。しかし、その空間的配置は異なっている（Ｇｌａｓｓら、　Ｃｅ１ ｌ　５４．３に３（１９８８））。そのうえ、ＴＲＥが、ＣＶ−１細胞中でトラ ンスフェクトされたレチノイン酸受容体（ＲＡＲｓ）によって、転写の活性化を 媒介することが示されている。ところが一方、トランスフェクトされなかった細 胞は何の応答も示さない（Ｕｍｅｓｏｎｏら、　Ｎａｔｕｒｅ　３３６，２６２ （１９８８））。言い換えれば、ＴＲ受容体およびＲＲ受容体は、共にＴＲＥｓ を活性化し得る。

このように、驚くべき事には、本明細書に開示されているβ−レチノイン酸応答 エレメント（βＲＡＲＥｓ）は、パリンドローム配列とは反対に直列繰り返し配 列を持ち、そして既知の応答エレメント（ＧＲＥ、ＥＲＥＳＴＲＥ）よりも、非 同種の受容体く例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）、ＧＲ，サイロイドホルモ ン受容体（ＴＲ）、等）による転写の活性化に対してはるかに影響を受けにくい 。さらに驚くべき事に、広範な種類の哺乳動物細胞におけるβＲＡＲＥｓを有す る構築物は、共にトランスフェクトさせたレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）をコー ドする発現ベクターの非存在下でも、強力なレチノイン酸（ＲＡ）依存性誘導を 示す。この発見によって、実際上全哺乳類細胞が低レベルの内因性βＲＡＲを発 現することが示唆される。この低レベルのβＲＡＲは、βＲＡＲＥを含むベクタ ーの効果的な活性化に十分であるか、明らかに事前に研究したＴＲＥｓの活性化 のための闇値より低い。

このように、βＲＡＲＥおよび機能的プロモーターを含む転写制御領域を用いる ことで、今や、以下の組み換えＤＮＡベクターを供給することが可能になる。す なわち、プロモーターの制御下にその転写がおかれており（そして、それによっ て発現も）、そして転写活性がＲＡＲを発現させるベクターを共にトランスフェ クトさせる必要なしにレチノイル酸に応答する（そして増加する）ような遺伝子 を含むベクターである。

曳コ！と【旨 我々は、βＲＡＲＥｓであるＤＮＡセグメントおよびこのセグメントとプロモー ター間の連結部とを発見し、配列によって特徴づけを行った。βＲ、Ａ　ＲＥ　 ｓおよび連結部は、哺乳動物細胞におけるプロモーターの転写活性にレチノイン 酸に対する応答性を与えるように作用する。我々はまた、βＲＡＲＥｓの転写活 性促進効果は、レチノイル酸の存在下で全ての哺乳動物細胞で生じ、βＲＡＲが すべての哺乳動物細胞に内因的に存在することが示唆されていることを発見した 。

ｌ豆ユ１皿呈説所 本明細書および請求の範囲において用いられるために特に定義された技術的な語 句について以下のように言及しておく本明細書の用語ＲＡＲβあるいはβＲＡＲ は、レチノイン酸βを意味する。

本明細書の用語ＣＡＴは、クロラムフェニフールアセチルトランスフェリエース 、ＬＵＣは、ホタルのルシフェラーゼ；β−Ｇａｌは、βガラクトシダーゼを意 味する。

本明細書の用語ＣＯ８は、Ｔ抗原（Ｔ　ａ　ｇ）を発現するサル腎臓細胞を意味 する。Ｇｌｕｚｍａｎ、　Ｃｅ１１．２３：１７５（１９８１）を参照のこと。

本明細書の用語ｃ　ｖ　−１は、ある細胞株から“ＣＶ−１″として改変した不 ズミ腎臓細胞を意味する。ＣＶ−１は、ＣＱＳの母細胞株である。５Ｖ４０Ｔ抗 原（Ｔ　ａ　ｇ）を発現するように形質転換されているＣＯ８細胞とは異なり、 Ｃｖ−１細胞は、Ｔ抗原を発現しない。

本明細書の用語βＲＡＲＥは、レチノイン酸応答エレメントのことである。βＲ ＡＲＥは、エンハンサ一様のＤＮＡ配列である。このＤＮＡ配列は、βＲＡＲ− ＲＡ複合体との相互作用を通じたレチノイン酸（ＲＡ）に対する応答性を、その ような応答性のためにβＲＡＲＥへ作動可能に連結されているプロモーターの転 写活性へ与える。

本明細書の用語「転写制御領域」あるいは「転写制御エレメント」は、プロモー ターの転写活性がレチノイン酸に対スる応答性を持つように、プロモーターに作 動可能に連結されたβＲＡＲＥを含む、ＤＮＡセグメントを意味する。。

本明細書の用語「作動可能に連結された」という表現は、そのように連結された ＤＮＡセグメント間の連結（すなわち、ＤＮＡセグメント）が、連結された一方 のセグメントが他方のセグメントに対して記述された効果を生じ得るように行わ れることを意味する。

本明細書で述べたような様々な目的のために作動可能な連結を行うことは、特に 本明細書の教示する範囲内では、当該技術分野の当業者には、自明である。

本明°細書の用語「本来はＲＡに応答しないプロモーター」という語句は、ＲＡ が哺乳動物細胞中でそのプロモーターから観察できる程度での転写促進をしない ことを意味する。組み換えＤＮＡあるいは遺伝子工学的方法によって、プロモー ターの上流側（そこからの転写の方向に対して）を含めＤＮＡセグメントへ、β ＲＡＲＥが接合あるいは挿入され、そのプロモーターからの転写活性がＲＡに作 動可能に応答するようにそのプロモーターに連結させない限り、このような促進 が無いことを意味する。

本明細書および請求の範囲における「実質的な配列相同性」という用語の使用は 、本明細書に開示されそして請求された実際の配列から、配列が多少異なり、か つ同様な機能を保持している、ＤＮＡあるいはＲＮＡ配列も添付の請求の範囲に 入ることを意図する。

本明細書に記載の様々なヌクレオチド配列に登場するヌクレオチドには、当分野 で日常的に使われる通常の一文字名称（Ａ％Ｇ、Ｔ、ＣあるいはＵ）がある。

本明細書および請求の範囲の本文中では、ギリンヤ文字の参照はα、β、等とし て書かれ得る。明細書内の図や他の所では、相当するギリシャ文字記号が時折使 用される。

ある面では、本発明は、あるタンパク質の哺乳動物細胞内での発現のためのベク ターである。この発現は、ベクターの転写制御領域の制御下にあり、この転写制 御領域は、以下の（１）および（２）を含む。（１）タンパク質として発現され る第一のＤＮＡセグメントに、転写のために作動可能に連結されている、プロモ ーター；および（２）配列５’　−ＧＴＴＣＡＣｎ、ｎ２ｎ３ｎ４ｎ５ＧＴＴＣ ＡＣ−３’のサブセグメントを含む、第二のＤＮＡのセグメントであって、ｎｌ 、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立にＡ、Ｔ、ＣあるいはＧである 、ＤＮＡセグメント。この第二のＤＮＡセグメントのサブセグメントは、そのプ ロモーターからの転写活性がレチノイン酸に対する応答性を持つようにプロモー ターに作動可能に連結されている。このプロモーターの転写活性は、本来ではレ チノイン酸に応答しないと規定されている。

本発明の転写制御領域の部分であるプロモーターに関しては、実際上いずれのプ ロモーターでも、次の様な場合である限り使用し得る。すなわち、そのプロモー ターの転写活性が、プロモーターから上流側に適切に位置しているβＲＡＲＥを 含むＤＮＡセグメントによって促進され得、そして、そのプロモーターの転写活 性が本来はレチノイン酸に応答しない場合である。そのようなプロモーターには 、δ−ＭＴＶプロモーター、ヘルペスチミジン牛ナーセ（ｔｋ）プロモーターお よびベーサル５Ｖ−４０プロモーターがある。非常に望ましイフロモーターは、 活性化に応答エレメントが必要なプロモーターである。一方、エンハンサ−が無 くとも転写を駆動する非常に強力なプロモーターは、本発明での転写制御領域お よびベクターでの使用に望まれるプロモーターではない。

実際上関連のすべてのタンパク質およびポリペプチドは、本発明の発現ベクター によって形質転換された哺乳動物細胞から作製され得る。このようなタンパク質 には、ホルモン、リンホカイン、受容体あるいは受容体サブユニ、７ト、免疫グ ロブリン鎖等が含まれる。ＬＵＣ，ＣＡＴおよびβ−Ｇａｌのような指示タンパ ク質もまた作製され得る。

他の面では、本発明は、タンパク質発現のためのベクターからタンパク質を発現 するように形質転換された哺乳動物細胞に関する。このベクターは、以下の（１ ）および（２）を含む転写制御領域を含んでいる。（１）タンパク質として発現 される第一のＤＮＡセグメントに、転写のために作動可能に連結されている、プ ロモーター；および（２）配列５′−ＧＴＴＣＡＣｒｚｎ２ｎ３ｎ４ｎ５ＧＴＴ ｃＡｃ−３’のサブセグメントを含む、第二のＤＮＡのセグメントであって、ｎ ｌ、ｎ２、ｎ８、ｎ４およびｎ５は、それぞれ独立にＡ、Ｔ、ＣあるいはＧであ る、ＤＮＡセグメント。この第二のＤＮＡセグメントのサブセグメントは、その プロモーターがらの転写活性がレチノイン酸に対する応答性を持つようにプロモ ーターに作動可能に連結されている。このプロモーターの転写活性は、本来では レチノイン酸に応答しないと規定されている。

本発明に従って形質転換の可能な哺乳動物細胞の種類には、ＣＶ−１、ＣＯ３， Ｆ９、ＰＩ３、ＣＨＯｌＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｒａｔ２フィブロブラスト、 ＨＴ１０８０．Ｔ。

ニワトリ胚フィブロブラストおよびウズラＱＴ６細胞がある。

さらに他の面では、本発明は、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、レチノ イン酸のアゴニストあるいはアンタゴニストとしての試験化合物の活性を試験す るための方法に関する。

（ａ）（ｉ）レチノイン酸が存在し、そして試験化合物は存在しない条件、およ び（ｉ　ｉ）レチノイン酸および試験化合物が共に存在する条件で、タンパク質 発現のためのベクターからタンパク質を発現するように形質転換されている哺乳 動物細胞を培養する工程であって、そのベクターは以下の（１）および（２）− を含む転写制御領域を含む：（１）タンパク質として発現される第一のＤＮＡセ グメントに、転写のために作動可能に連結されている、プロモーター。

（２）配列５　’　Ｇ　Ｔ　Ｔ　ＣＡ　Ｃｎ　１ｎ　２　ｎ　３　ｎ　４　ｎ　 ５　Ｇ　Ｔ　Ｔ　ＣＡ　Ｃ−３′のサブセグメントを含む、第二のＤＮＡのセグ メントであって、ｎｌ、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５が、それぞれ独立にＡＳＴ 、ＣあるいはＧである、ＤＮＡセグメント。この第二のＤＮＡセグメントのサブ セグメントは、そのプロモーターからの転写活性がレチノイン酸に対する応答性 を持つようにプロモーターに作動可能に連結されている。このプロモーターの転 写活性は、本来ではレチノイン酸に応答しないと規定（ｂ）工程（ａ）の二種の 培養の培養期間中に発現されたタンパク質の量を比較する工程。

化合物のＲＡ活性を試験する方法に使われる細胞も含めて、本発明の細胞は随意 に、βＲＡＲを発現する発現ベクターと共に形質転換され得る。

実際、βＲＡＲＥｓの低レベルの応答性（作動可能にリンクされたプロモーター からの転写の促進において）もまた、ＴＲ’ｓおよびビタミンＤ３受容体（ＶＤ ３Ｒ）で観察される。このため、サイロイドホルモンおよびビタミンＤ３のアゴ ニストおよびアンタゴニストは、上述のように化合物を試験することによってス クリーニングが可能である。ただし、本発明の適切なベクターを導入した細胞お よびＴＲあるいはＶＤ３　Ｒを発現するベクターを使用する。

受容体、アッセイ方法および本明細書の項目に関連した他の項目は、本明細書に 参考として援用されている、以下の文献の中に見い出し得る二本願と同一の出願 人による１９８７年１０月２０日出願の米国特許出願第１０８，４７１号、およ びＰＣＴ国際公開第Ｗ０　８８１０３１６８号；本願と同一の出願人による１９ ８８年１１月３０日出願の米国特許出願番号２７６．５３６号、およびヨーロッ パ特許出願公開第０　３２５　８４９号；本願と同一の出願人による１９８９年 ６月２２日出願の米国特許出願第３７０，４０７号、この出願にはγレチノイン 酸受容体をフードしているｃＤＮＡを持つプラスミドのブタペスト条約寄託をリ ストしており、この寄託は１９８９年６月２２日になされ、そしてアメリカンタ イプカルチャーコレクション受託番号４０６２３号を有している；　Ｚｅｌｅｎ ｔら、Ｎａｔｕｒｅ　３３９，７１４（１９８９）：Ｐｅｔｋｏｖｉｅｈら、　 Ｎａｔｕｒｅ　３３０．４４４（１９８７）　：　Ｂｒａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ 　３３２，８５０（１９８ｇ）。

本発明の他の面では、哺乳動物細胞で遺伝子の転写を制御するＤＮＡセグメント に関する。そのセグメントは、転写のために遺伝子に作動可能に連結されている プロモーターおよび以下の配列を持つサブセグメントを含む。このサブセグメン トの配列は、５’　−ＧＴＴＣＡＣｒｚｎ２ｎ３ｎ４ｎ５ＧＴＴＣＡＣ−３’で あり、この中でｎｌ、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ、はそれぞれ独立にＡ、Ｔ、Ｇ あるいはＣである。このサブセグメントは、そのプロモーターからの転写活性が レチノイン酸に対する応答性を持つようにプロモーターに作動可能に連結されて いる。そのプロモーターの転写活性は、本来ではレチノイン酸に応答しないと規 定されている。

βＲＡＲＥは、５ｂｐ配列によって分離された６ｂｐのモチーフ５″−ＧＴＴＣ ＡＣの直列繰り返しを持つＤＮＡセグメント上に供給され得る。５ｂｐの配列は 、無作意に選ばれた任意のヌクレオチド配列でもあり得る。特に、好ましいβＲ ＡＲＥ　ｓは、次のセグメント上に与えられる：　５’　−ＡＡＧ　ＣＴ　Ｔ　 Ａ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　ＣＡ　ＣＣＧ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　ＣＡ　 ＣＴ　ＣＡＧＣＴＴ、５’　−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＧＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＧ ＴＴＣＡＣＴＣＧＣＡＴＡＧＣＴＴおよび５゛−ＡＡ　Ｇ　ＣＴ　Ｔ　Ａ　、Ａ 　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　ＣＡ　ＣＣＧ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　ＣＡ　ＣＴＣ ＧＣＡＴＡＴＡＴＴＡＧＣＴＴ、これらのＤＮＡセグメントは、５′側および３ ′側の末端に都合のよい制限エンドヌクレアーゼ部位を含むようにつながれてい る。

βＲＡＲＥを包むＤＮＡセグメントは比較的短いために、合成によって供給され 得る。すなわち当該技術分野で知られているように、ＤＮＡ合成機で、βＲＡＲ Ｅ含有のオリゴヌクレオチドを合成することによって得られる。オリゴマーの３ ゛側および５′側末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を与えることが非常に望ま しい。そして、合成βＲＡＲＥはＤＮＡ発現ベクターのプロモーターの上流側に 都合よく挿入され得る。このプロモーターの転写活性は促進され、そして所望の 遺伝子の転写を駆動する。当業者には理解されているように、他の応答エレメン トと同様に、βＲＡＲＥｓは、広い許容範囲を持った配向および部位独立性であ る。このように、βＲＡＲＥは、どちらの配回でも機能的であり、影響を受ける プロモーターから約３０ヌクレオチド上流から約１０，０００ヌクレオチド上流 までの任意の便利な位置に配置し得る。

βレチノイン酸応答エレメントを含む転写制御領域を利用する本発明の促進発現 系を用いるのに好ましい哺乳動物細胞は、ＣＯＳ細胞およびＣＶ−を細胞である 。ＣＯ３−１（ＣＯ８として表示される）細胞は、ＳＶ４０　Ｔ抗原（Ｔ　ａ　 ｇ）を発現するマウスの腎臓細胞である；ＣＶ−１は、ＳＶ４０Ｔａｇを発現し ない。ＣＶ−１細胞は、低レベルのβＲＡＲを産生ずること以外には、いかなる 内因性のグルココルチコイドまたはミネラルコルチコイドまたは他の既知のステ ロイドまたはサイロイドホルモン受容体も存在しないので都合が良い。このよう に、本発明の転写制御領域の制御下に異種遺伝子を含む適切な発現ベクターによ る遺伝子伝達によって、レチノイン酸による誘導に応答して所望のタンパク質を 多量に産生ずるような形質転換された細胞へと宿主細胞を変換させることが可能 である。

複製起点ＳＶ４０を含む発現プラスミドは、ＳＶ４０　Ｔａｇを発現する任意の 宿主細胞中で高いコピー数で増殖し得る。このように、複製起点ＳＶ４０を有す る発現プラスミドは、ＣＯ８細胞中で複製し得るが、ＣＶ−１細胞中ではできな い。高いコピー数によってもたらされる増加した発現が望まれるが、そのことは 開示したアッセイシステムにとっては必須ではない。ＣＶ−１細胞が遺伝子伝達 の研究のために特に好都合であり、そして高感度でかつよく理解された宿主細胞 システムを提供するが、宿主にどのような特定の細胞株を使用しても、それもま た重大なことではない。

Ｋ立五 以下にマウスのＲＡＲｂ遺伝子のプロモーター中の配列が、ＲＡ応答性を与え、 そしてこれらの配列が、３種類のＲＡ受容体サブクラス（α−１β−１そしてγ −ＲＡＲ）に対して標的特異性を示すことを示す。ＲＡ応答エレメント（ＲＡＲ Ｅ）は、エストロゲン、グルココルチコイドによる顕著な転写活性化を媒介しな いが、ビタミンＤまたはサイロイドホルモン受容体（同種のリガンドとの複合体 ）による弱い（約−桁少ない）転写活性化を媒介する。

λベクターＥＭＢＬａ上のマウス肝臓染色体ＤＮＡライブラリ（Ｃ１ｏｎｅｔｅ ｃｈ）は、ＲＡＲｂ遺伝子上のＲＡＲＥの場所を探すために、ヒトＲＡＲｂのｃ 　ＤＮＡプローブを使ってスクリーニングされた。その結果、完全な第一エクソ ンである約１０ｋｂの上流側配列および第一イントロンの１０ｋｂを含む染色体 フラグメントが単離された。第一エクソンおよび近隣した５’　ＤＮＡを含むこ のクローンの部分の配列を図１に示す。１０ｋｂの上流領域は、ＲＡＲり翻訳開 始コドンのすぐ下流側で、ｂ−ガラクトンダーゼリポーター遺伝子とインフレー ムで融合された（図２ａ）。ＲＡＲ−ＰＬ−ｂＧＡＬは、ＲＡＲ発現ベクターを 共にトランスフェクトさせたサル腎臓ＣＶ−１細胞に導入された。酵素活性は、 レチノイン酸の付加で誘導された。このことは、染色体ＤＮＡのこの領域が、レ チノイン酸に応答する機能的なプロモーターを含んでいることを表している。こ れは、５ａｌＩ制限部位を、部位特異的突然変異導入法を用いて、指示される部 位で染色体クローンに導入し、；次に、１０ｋｂの染色体フラグメントを取り出 し、モしてｂ−ガラクトンダーゼベクターｐＬＳＶ中にクローンしくｐＬＳＶは ｐ　Ｇ　Ｈ１０１（Ｈｅｒｍａｎ。

Ｇ、　Ｅ、　、　Ｏ’　Ｂｒ１ｅｎ、　Ｗ、　Ｅ、およびＢｅａｕｄｅｔ、Ａ、 Ｌ、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１４、７１３０　（１９８６）、の誘 導体、５ａｌＩ部位およびポリリンカー配列をオリゴの付加によって含むように 改変し、ＲＡＲ−ＰＬ−ｔ）ＧＡＬを作成することによって、成し遂げられた。

ＲＡＲ−ＰＬ−１：＋ＧＡＬの５′末端からの一連の欠失によって、ＲＡによる 誘導を媒介する配列が、２ｋｂのＮｈｅＩ−Ｓａｃｎフラグメント内に存在する ことが明らかになる（図２ａ；下記の表）。この領域のサブフラグメントは、エ ンハンサ−依存性のルシフェラーゼリポータ−プラスミドＤＭＴＶ−ＬＵＣ中＋ Ｃり０　７された。ＤＭＴＶ−ＬＵＣは、本来のＧＲ応答エレメントを欠失した マウス乳腺腫瘍ウィルスプロモーターを含有している（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、 　Ｓ、Ｍ、およびＥｖａｎｓ。

Ｒ，Ｍ、　Ｃｅ１１．５５，８９９−９０６（１９８８））。１８３ｂｌ）のＳ ｍａ　Ｉフラグメント（図１参照）は、どちらの配向でもこの異種プロモーター にレチノイン酸応答性を与える（表）。次に、この領域から得られたオリゴヌク レオチド配列（図２ｂ）は、更にＤＭＴＶ−ＬＵＣあるイハＤ　Ｍ　Ｔ　Ｖ　− ＣＡ　Ｔ　テＲＡ応答エレメントを明かにするために用いられた（下記の表）。

サイロイドホルモン応答エレメント（ＴＲＥ）は、ＣＶ−１細胞においてトラン スフェクトされたＲＡＲｓによる転写活性化を媒介することが示されているが、 トランスフェクトしない細胞は何の応答も示さない。Ｕｍｅｓｏｎｏら、　Ｎａ ｔｕｒｅ　３３６゜２６２−２６５（１９８８）。驚（べき事には、δ−ＭＴＶ 　ＣＡＴが構築されると、βＲＥＩ、βＲＥ２、およびβＲＥ３　（、図２）は 、共にトランスフェクトさせるＲＡＲ発現ベクターが無くとも、顕著なＲＡ依存 性の誘導を示した。ＲＡＲ−α発現ベクターを共にトランスフェクトさせると誘 導は二倍増加したのみであり、ＣＶ−１細胞か低レベルの内因性ＲＡ受容体を発 現することが示された。この内因性のＲＡ受容体の発現は、βＲＥを含むベクタ ーの有効な活性化に十分な量であるが、明かに先に研究したＴＲＥｓを活性化す る閾値より低い。以下に挙げる細胞株の調査により、全てのものがＲＡ　Ｒ発現 ベクターのトランスフェクトなしにＲＡ依存性の形で効果的にβＲＡＲＥをトラ ンス活性化できることを示している：　ＣＶ−１、Ｆ９およびＰＩ３（マウスの テラトカルシノーマ）、ｃＨＯ，ＨｅＬａ５ＮＩＨ３Ｔ３、Ｒａｔ２フィブロブ ラスト、ＨＴ１０８０．７　（ヒトのリンパ球）、ニワトリ胚フィブロブラスト 、およびウズラＱＴ６細胞。これまで調べた細胞株の中で、この活性化を示さな いものはなかった。

ベクター。

βＲＥＩ、βＲＥ２およびβＲＥ３の配列（図２ｂ）の調査によって、６ｂｐの モチーフＧＴＴＣＡＣの直列繰り返しが同定された。これらの繰り返しの間の１ ｌｂｐの中心間の分離は、ＤＮＡ螺旋の一回転である。５′あるいは３′の半サ イト（βＲＥ４およびβＲＥ５）のいずれか一つのフビーを含む構築物は、ＲＡ Ｒ発現ベクター（図２６）を共にトランスフェクトさせた時にだけ機能する。こ のことは、ＲＡＲＥが、クローン化ｃ　ＤＮＡかろ発現したＲＡＲサブタイプの ３種順全てにとっての本物の標的であることを示すだけでなく、これらの半サイ トが、δ−ＭＴＶプロモーターの中で最小のＲＡ応答エレメントとして作用し得 ることをも示している。明らかに、単一の半サイト（５’　−ＧＴＴＣＡＣ−３ ’　）は、活性化のために高いレベルの受容体が必要な低い親和性ノ標的であり 、そして直列繰り返しとして併置された時に、二つの配列は、高い親和性の結合 部位を作る（協調的相互作用を通じて）。この結合部位は、ＣＶ−１細胞および 他の細胞で低レベル存在する内因性ＲＡＲに応答できる。

上述した配列がＲＡＲの直接の結合部位であることを示すために、トランスフエ フｌ−した細胞の抽出物を、３２ｐ標識のＲＡＲＥと混合し、そしてできた複合 体を、トランスフェクトした受容体に特異的な抗体と免疫沈降させた。この目的 のために、ハイブリッド受容体（ＧＲＲと呼ぶ）が作られた。

このハイブリッド受容体は、グルココルチコイド受容体のアミノ末端にＲＡ　Ｒ ａ　（１）　Ｄ　Ｎ　Ａ結合ドメインおよびリガンド結合ドメインが結合してい る。このハイブリッド受容体は、ＲＡ依存性およびＲＡＲの標的遺伝子特異性を 示した（Ｄ、　Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら未発表の知見）。このハイブリッド受 容体を含むＣＯ８細胞の抽出物は、標識したβＲＥ２オリゴを特異的に免疫沈降 する。このアッセイでのβＲＥ２へのＧＲＲの結合ハ、未標識のＧＲＥ競合物の 過剰な付加による影響は無かったが、しかしβ一応答エレメントそれ自身あるい は他の既知のＲＡＲ結合部位である、ＴＲＥ配列のどちらかの過剰な付加によっ て競合される。平行した一連の実験で、ＧＲ抽出物は標識されたＧＲＥへ特異的 に結合し、過剰の未標識のＧＲＥによって競合さ゛れ、そしてβＲＥ２配列を認 識しない。このように、β一応答エレメントへの特異的な結合は、ハイブリ、ド ＧＲＲ受容体によって観察される。

多くのこれまでに明らかにされた応答エレメントは、一種類より多い受容体の標 的である：　ＲＡＲおよびＴＲはともにＴＲＥを活性化し得る；ＲＡＲＳＴＲ， およびエストロゲン受容体は全て、ビテロジェニンＥＲＥを活性化する；プロゲ ステロン、ミネラルフルチコイド、およびＧＲは全て、ＧＲＥを活性化する（Ｈ ａｍら、　Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６．５２６３−５２７６（１９８ ８））。このように、ＲＡＲｔ）遺伝子の応答エレメントは、お互いに、ＴＲ， ＥＲｌおよびあるいは他の受容体のスーパーファミリーに対する応答性がある。

構築物βＲＥＩとともにＣＶ−１細胞へＥＲ，ＧＲをトランスフェクトさせると 、適切なりガントなしでの、あるいは適切なリガンドの付加後の顕著な活性化を 生起できない。しかし、構築物βＲＥＩとともにＣＶ−１細胞へＴＲおよびビタ ミンＤ受容体（ＶＤ３Ｒ）をトランスフェクトさせると、それらと同種の応答エ レメントを弱く　（約１０分の１から２０分の１）活性化できる。

以下の表に示されている各々の構築物の５μｇをＣＶ−１細胞ＩＩ：　ＲＳ　Ｖ 　−Ｌ　Ｕ　ＣあるいはＲ３Ｖ−ｂＧＡＬのどちらかと共にトランスフェクトさ せ、トランスフェクションの効果を標準化した。トランスフェクションでは、Ｒ ＡＲａ発現ベクターをも含んでいた。各々の値は、１０−７Ｍ　ＲＡ　（βＧＡ Ｌ実験）あるいは１０−６ＭＲＡ（ルシフェラーゼ活性）で処理したプレートの 二回の計測を、溶媒のみで処理したプレートと比較して表している。１８３ｂｐ のＳ　ｍ　ａ　Ｉ制限フラグメント（図１に示される）は、δ−ＭＴＶプロモー ターに対して正（Ｆ）あるいは逆（Ｒ）の配向のどちらかで挿入された。（ＮＲ ）構築物は、ＲＡに応答性のなかったＲＡＲｂプロモーターの中のｂＲＥ　１の ２４ｂｐ３’側に位置する４５ｂｐオリゴ配列を含む。

プラスミドは、ＣＶ−１細胞にトランスフェクトさせ、そして１０−７ＭＲＡの 付加の有無のいずれかで、β−ガラクトシダーゼ活性を分析した。負の応答は、 ２倍以下の誘導とした；正の誘導は７倍以上とした。

細胞は１０Ｃｍのディノシニ中で、それぞれ１０μｇのＤＮＡでトランスフェク トさせた。このＤＮＡには、５μｇのリポータ−プラスミド；　Ｒ３Ｖ−ＬＵＣ （ａ）　、あるいはＲ３Ｖ−ｔ）ＧＡＬあるいはｐｃＨｌ　１０　（ｃおよびｄ ）のいずれかの１〜２μｇ１キャリアーＤＮＡとしてｐＧＥＭ４；そしてａおよ びｄに示された実験では１μｇＲ３Ｖ−ＲＡＲ発現ベクターあるいは同じ量のナ ンセンス転写物を生じるＲ３Ｖベクターが含まれる。細胞はレチノイン酸を付加 した１日後に採取された。すべてのＣＡＴアッセイは、等しい量のｂ−ガラクト シダーゼ活性を示す；　ｂＧＡＬアッセイはルシフェラーゼ活性で標準化された 。

リポータ−染物のレチノイン　誘導性 １蚤史　ｏｆ、ｆ（−ｕ ＲＡＲ−ＰＬ−ｂＧＡＬ　１４ ＲＡＲ−ＤＸＮ−ｂＧＡＬ　２２ ＲＡＲ−ＤＮｈＳ　ｃ−ｂＧＡＬ　２ ＤＭＴＶ−ＬＵＣ２ ＤＭＴＶ−３ｍａ　１８３　Ｆ−ＬＵＣ１０ＤＭＴＶ−３ｍａ　１８３　Ｒ−Ｌ ＵＣ９ＤＭＴＶ−ＬＵＣ２ ＤＭＴＶ−（ＮＲ）−ＬＵＣ２ ＤＭＴＶ−ｂＲＥｌ−ＬＵＣ１４ １１旦脱」〜 図１は、マウスβＲＡＲプロモーター領域および最初のエクソンの配列を表示し ている。ＴＡＴＴおよびＧＴＴＣＡＣのモチーフは下線をひいである；第一エク ソンスプライス部位は矢印で示しである。λベクターＥ　Ｍ　Ｂ　Ｌ　ａ中のマ ウス肝臓染色体ＤＮＡライブラリー（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ）は、ヒ）ＲＡＲｂ　 ｃＤＮＡクローンＢ　ｌ　−ＲＡＲｅのＢａｍＨＩ−８ｐｈｌフラグメントを用 いてスクリーニングした。Ｂｅｎｂｒｏｏｋら、Ｎａｔｕｒｅ　３３３．６６９ −６７２（１９８８）を参照のこと。このプローブは、βＲＡＲ遺伝子にとって ただ一つしかな％Ｘ、第一エクソンの配列のみを含んでいる。２０ｋｂの挿入物 を含むクローンが単離され、そして第一エクソンを囲んでいる領域がサブクロー ンされ、ジデオキシ配列分析法に供された。

図２（ａ）は、βレチノイン酸応答エレメントを含む配列の５゛・末端からの一 連の欠失およびそれに続＜　ＲＡＲβのＲＡ応答エレメントの配列の生体内分析 を表示する。マウスＲＡＲβ遺伝子およびβ−ガラクトンダーゼ受容体遺伝子の 間の接合部の配列は表示しである通りである。番号の打たれたアミノ酸は、天然 のＲＡＲβの翻訳産物に相当する。制限部位は、Ｎ、ＮｏｔＩ；Ｘ、ＸｈｏＩ； ＫＳ　ＫｐｎＩ；Ｓ、Ｓａｌ　Ｉ；Ｎｈ、ＮｈｅＩ；Ｓｃ、５ａｃＩＩである。

破線は、プラスミドの配列を示す。

図２（ｂ）は、この実験に使われたβレチノイン酸応答エレメントを含むオリゴ ヌクレオチドの配列を表示している。

末端にある小文字の塩基は、ＲＡＲβプロモーターにとって外来のものであり、 これによってδ−ＭＴＶベクターの唯一のＨｉｎｄＩＩ［部位への挿入がなされ る。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年５月１５日溜

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳動物細胞におけるタンパク質発現のためのベクターであって、該発現が ベクターの転写制御領域の制御下にあり、該転写制御領域が以下の（１）および （２）を含む、ベクター： （１）タンパク質として発現される第一のＤＮＡセグメントに、転写のために作 動可能に連結されている、プロモーター、および （２）配列５′−ＧＴＴＣＡＣｎ１ｎ２ｎ３ｎ４ｎ５ＧＴＴＣＡＣ−３′のサブ セグメントを含む、第二のＤＮＡのセグメントであって、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ ４およびｎ５は、それぞれ独立にＡ、Ｔ、ＣあるいはＧであり、該第二のＤＮＡ セグメントのサブセグメントは、該プロモーターからの転写活性がレチノイン酸 に対して応答性を持つように、プロモーターに作動可能に連結されており、該プ ロモーターの転写活性は、本来ではレチノイン酸に応答しないと規定される、第 二のＤＮＡセグメント。 ２．ｎ１はＣ、ｎ２はＧ、ｎ３はＡ、ｎ４はＡならびにｎ５はＡである、請求項 １に記載のベクター。 ３．請求項２に記載のベクターであって、前記第二のＤＮＡセグメントのサブセ グメントが、配列５′−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＧＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＧＴＴＣ ＡＣＴＣＡＧＣＴＴ−３′のセグメントのサブセグメントである、ベクター。 ４．請求項３に記載のベクターであって、前記第二のＤＮＡセグメントのセグメ ント５′−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＧＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＧＴＴＣＡＣＴＣＡＧ ＣＴＴ−３′は、配列５′−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＧＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＧＴ ＴＣＡＣＴＣＧＣＡＴＡＧＣＴＴ−３′のセグメントのサブセグメントである、 ベクター。 ５．請求項４に記載のベクターであって、前記第二のＤＮＡセグメントのセグメ ント、５′−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＧＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＧＴＴＣＡＣＴＣＧ ＣＡＴＡＧＣＴＴ−３′は、配列５′−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＧＴＴＣＡＣＣＧ ＡＡＡＧＴＴＣＡＣＴＣＧＣＡＴＡＴＡＴＴＡＧＣＴＴ−３′のセグメントのサ ブセグメントである、ベクター。 ６．請求項１〜５のいずれかに記載の組み換えＤＮＡベクターであって、前記の プロモーターがマウス乳腺腫瘍ウィルスのδ−ＭＴＶプロモーターである、ベク ター。 ７．請求項６に記載のベクターであって、前記転写制御領域の制御下で発現する タンパク質が、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラ ーゼおよびβ−ガラクトシダーゼでなる群から選択される、ベクター。 ８．タンパク質発現のためのベクターから該タンパク質を発現するように形質転 換された哺乳動物細胞であって、該ベクターが以下の（１）および（２）を含む 転写制御領域を含有している、哺乳動物細胞： （１）タンパク質として発現される第一のＤＮＡセグメントに、転写のために作 動可能に連結されている、プロモーター、および （２）配列５′−ＧＴＴＣＡＣｎ１ｎ２ｎ３ｎ４ｎ５ＧＴＴＣＡＣ−３′のサブ セグメントを含む、第二のＤＮＡのセグメントであって、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ ４およびｎ５は、それぞれ独立にＡ、Ｔ、ＣあるいはＧであり、該第二のＤＮＡ セグメントのサブセグメントは、該プロモーターからの転写活性がレチノイン酸 に対して応答性を持つようにプロモーターに作動可能に連結されており、該プロ モーターの転写活性は、本来ではレチノイン酸に応答しない条件である、第二の ＤＮＡセグメント。 ９．請求項８に記載の哺乳動物細胞であって、前記細胞はＣＶ−１、ＣＯＳ、Ｆ ９、Ｐ１９、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｒａｔ２フィブロプラスト、Ｈ Ｔ１０８０．Ｔ、ニワトリ胚フィブロプラスト、およびウズラＱＴ６細胞でなる 群から選択される型の細胞である、哺乳動物細胞。 １０．試験化合物のレチノイン酸のアゴニストあるいはアンタゴニストとしての 活性を試験する方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、方法： （ａ）（ｉ）レチノイン酸が存在し、そして試験化合物は存在しない条件、およ び（ｉｉ）レチノイン酸および試験化合物が共に存在する条件で、タンパク質発 現のためのベクターから該タンパク質を発現するように形質転換されている哺乳 動物細胞を培養する工程であって、該ベクターが以下の（１）および（２）を含 む転写制御領域を含む、工程：（１）該タンパク質として発現される第一のＤＮ Ａセグメントに、転写のために作動可能に連結されている、プロモーター、およ び （２）配列５′−ＧＴＴＣＡＣｎ１ｎ２ｎ３ｎ４ｎ５ＧＴＴＣＡＣ−３′のサブ セグメントを含む第二のＤＮＡのセグメントであって、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４ およびｎ５が、それぞれ独立にＡ、Ｔ、ＣあるいはＧであり、該第二のＤＮＡセ グメントのサブセグメントは、該プロモーターからの転写活性がレチノイン酸に 対して応答性を持つように、プロモーターに作動可能に連結されており、該プロ モーターの転写活性は、本来ではレチノイン酸に応答しないと規定される、第二 のＤＮＡセグメント、 ならびに （ｂ）工程（ａ）の二種の培養法の培養期間中に発現された該タンパク質の量を 比較する工程。 １１．哺乳動物細胞中で遺伝子の転写を制御するＤＮＡセグメントであって、該 セグメントは転写のために該遺伝子に作動可能に連結されているプロモーターお よび配列５′−ＧＴＴＣＡＣｎ１ｎ２ｎ３ｎ４ｎ５ＧＴＴＣＡＣ−３′のサブセ グメントを含み、ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４およびｎ５はそれぞれ独立にＡ、Ｔ、 ＧあるいはＣであり、該サブセグメントは、該プロモーターからの転写活性がレ チノイン酸に対する応答性を持つようにプロモーターに作動可能に連結されてお り、該プロモーターの転写活性は、本来ではレチノイン酸に応答しないと規定さ れる、ＤＮＡセグメント。 １２．ｎ１はＣ、ｎ２はＧ、ｎ３はＡ、ｎ４はＡそしてｎ５はＡである、請求項 １１に記載のＤＮＡセグメント。 １３．請求項１２に記載のＤＮＡセグメントであって、前記配列５′−ＧＴＴＣ ＡＣＣＧＡＡＡＧＴＴＣＡＣ−３′のサブセグメントが、配列５′−ＡＡＧＣＴ ＴＡＡＧＧＧＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＧＴＴＣＡＣＴＣＡＧＣＴＴ−３′のセグメ ントのサブセグメントである、ＤＮＡセグメント。 １４．請求項１４に記載のＤＮＡセグメントであって、前記配列５′−ＡＡＧＣ ＴＴＡＡＧＧＧＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＧＴＴＣＡＣＴＣＡＧＣＴＴ−３′のセグ メントが、配列５′−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＧＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＧＴＴＣＡ ＣＴＣＧＣＡＴＡＧＣＴＴ−３′のセグメントのサブセグメントである、ＤＮＡ セグメント。 １５．請求項１４に記載のＤＮＡセグメントであって、配列５′−ＡＡＧＣＴＴ ＡＡＧＧＧＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＧＴＴＣＡＣＴＣＧＣＡＴＡＧＣＴＴ−３′の セグメントが、配列５′−ＡＡＧＣＴＴＡＡＧＧＧＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＧＴＴ ＣＡＣＴＣＧＣＡＴＡＴＡＴＴＡＧＣＴＴ−３′のセグメントのサブセグメント である、ＤＮＡセグメント。 １６．請求項１１−１５のいずれかに記載のＤＮＡセグメントであって、前記プ ロモーターがマウス乳腺腫瘍ウィルスのδ−ＭＴＶプロモーターである、ＤＮＡ セグメント。