JPH0550269B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、土壌微生物の生育抑制に関する。よ
り詳しく述べると、本発明は、嫌気状態下で、土
壌微生物の生育を抑制して、細菌培養するための
必要なものが含まれ、直ぐに使用できかつ通常乾
燥している細菌培養フイルム用の希釈溶液、ま
た、前記細菌培養フイルムと前記希釈溶液とを組
み合わせてなる培養フイルム、ならびに、この培
養フイルムを用いて、乳酸菌を嫌気的に培養する
方法に関するものである。 〔従来の技術〕 近年、乾燥培養プレートの開発が盛んに進めら
れ、その代表的な例が、アメリカ合衆国 ミネソ
タ州55144 セントポールに所在するスリーエム
社の医薬品事業部から、「ペトリフイルム
（Petrifilm）」（商標名）として販売されているも
のである。 この製品は、主として、ベースフイルムにコー
トされ、例えば、上からポリエチレンフイルムで
被覆されている、乾燥し、必要なものが含まれか
つ直ぐ使える細菌培養基からなつている。このベ
ースは、標準的な栄養素、および冷水に可溶なゲ
ル化剤も有している。 また、被覆用フイルムには、ゲル化剤のほか
に、計数を容易にするため、支持染料である２，
３，５−トリフエニルテトラゾリウムクロリドが
塗布されている。ベースフイルムには、計数作業
をし易くする１cm²の枡目がつけられている。１枚
の「ペトリフイルム」の大きさは、20cm平方であ
る。 この種の乾燥培養プレートは、既に述べたよう
に、接種や細菌増殖用に通常使用されている極く
一般的なペトリ皿および寒天プレートより、便利
なことが多い。 例えば、極く一般的で旧式なペトリ皿や栄養寒
天培地を使用すれば、否応なく、容積、重量、お
よび場所のことが問題になる。これが、細菌試料
を、現場から実験室へ移す設定作業を難航させて
しまう。 他方、液体試料を簡単に加え、細菌の増殖を維
持しうるようになつている乾燥培養フイルムは、
現行の方法より、細菌の数を計数し易くするとい
う点で、一層有効な方法を提供してくれる。 しかし、入手しうる乾燥培養フイルムは、ベー
スフイルムにコートされた標準的培養基を含んで
いるだけに過ぎない。言い換えると、現在使用さ
れている培養基は、あらゆる種類の細菌を増殖さ
せるのに適しているものであつて、いずれか特定
の種類を選択的に増殖させることができない。 従つて、特定の細菌を増殖させる研究をおこな
つている細菌学者は、これまで、真に所望する培
養フイルムを使いたくても諦めざるをえない。 止むを得ず、従来の寒天プレートを使うことに
なつてしまうが、これは、所望の特定細菌の増殖
を高める一方で、同時に不要の細菌の増殖を抑制
することが分かつている培養基に、特別に誂えて
作らせなければない。 細菌学者や微生物学者は、更に分離し、研究
し、評価し、かつ使用するため、特定の細菌に絞
つて増殖させたいと希望することが多くあるた
め、乾燥培養フイルムを含む標準培養基は、非選
択性のものであるという理由から、多くの場合、
役に立たない。 〔発明が解決しようとする問題点〕 本発明は、上に述べた従来の欠点を解消するこ
とを目的としている。 〔発明の目的〕 本発明の第１の目的は、必必要なものが含ま
れ、しかも直ぐに使用でき、通常乾燥している培
養フイルムを、土壌微生物の増殖を抑制させなが
ら、ある種の細菌の選択増殖用に特定させること
ができる方法を提供することである。 より詳しくいうと、前記目的は、前記培養フイ
ルムを、嫌気状態の下で、他の不要な土壌微生物
を抑制させながら、乳酸菌の選択増殖用に特定さ
せることである。 本発明の第２の目的は、前記スリーエム社製の
「ペトリフイルム」なる名称の培養フイルムを、
乳酸菌科微生物、即ち乳酸菌の増殖用に特定させ
る方法を提供することである。 本発明の第３の目的は、土壌微生物の増殖を抑
制させながら、乳酸菌に特定しうる必要なものが
含まれ、かつ直ぐに使用できる培養フイルムに対
し、接種用試料調製時に使用する希釈溶液を提供
することである。 以上の目的および他の目的を達成するための方
法および手段は、後述の具体的な説明から明らか
になろう。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明によれば、嫌気状態の下で、土壌微生物
の生育を抑制して、細菌培養するための、、必要
なものが含まれ、かつ直ぐに使用でき、通常乾燥
している細菌培養フイルムが提供される。 これは、グラム陰性菌抑制剤を、水溶性の殺真
菌剤および水溶性の亜硝酸塩と組合せてなる、水
をベースにした希釈溶液、即ち希釈剤によつて達
成される。亜硝酸塩は、特に亜硝酸ナトリウムが
好ましい。 溶液のPH領域は、約6.5乃至約7.5の範囲内とす
る。好ましくは中性である。 この溶液は、それを細菌接種に対する希釈剤、
即ち担体として使用する際、ベースフイルムにコ
ートされているほかの標準的な培養基を、乳酸菌
に特定しうるよう作用する。 〔発明の具体的説明〕 標準的な培養基を含んでいる乾燥培養フイルム
は、水性試料を簡単に加えることにより、細菌増
殖を維持できるようになる。 本発明によれば、水性試料が、後段で詳述する
特殊な溶液を使用して培養フイルムにまかれる場
合、このフイルムは、乳酸菌に特定されたものに
なる。 細菌学者や微生物学者が、他を排除し、特定細
菌だけを増殖させたいと希望する背景には多くの
理由がある。 本発明によりつくられる担体溶液、即ち希釈溶
液は、特に、培養フイルムと使用し、それを、乳
酸菌に特定することができる。従つて、この希釈
溶液は、乳酸菌だけに特定して培養する時でさ
え、培養フイルムを、現場採取、運搬、および研
究などのために、所望通り適宜使用できる便利さ
を提供する。 本発明において使用される希釈溶液は、３成分
系であり、かつ水がベースである。 溶液は、グラム陰性菌抑制剤、殺真菌剤、およ
び水溶性の亜硝酸塩を含んでいる。 溶液のPH領域は、約6.5乃至約7.5にする必要が
ある。とりわけ、中性が好ましい。 これらの条件が満たされ、希釈溶液を乾燥培養
フイルムに施すと、このフイルムを乳酸菌に特定
させることができる。 グラム陰性菌抑制剤は、ポリミキシンであり、
かつ希釈溶液における濃度範囲を、24ユニツト／
ml乃至約40ユニツト／mlとする。ポリミキシンＢ
スルフエートが十分機能しうる濃度は、24ユニツ
ト／mlである。 好適な抗生物質は、ポリミキシンであり、ポリ
ミキシンＢスルフエートが、好適なポリミキシン
である。 接種用溶液は、更に、水溶性の殺真菌剤を、
10μg／ml乃至250μg／mlの濃度範囲で含んでい
る。この濃度は、約10μg／ml乃至20μg／mlとす
るのが好適である。 好適な殺真菌剤は、シクロヘキシミドである。
しかし、シクロヘキシミド以外に、他の殺真菌
剤、例えば、ソルビン酸カリウム、ブチルヒドロ
キシアニソール（BHA）、およびブチルヒドロキ
シトルエン（BHT）なぜによつて代表されるも
のも使用できる。 担体溶液、即ち希釈溶液の第３の成分は、
600μg／ml乃至約1800μg／mlの濃度範囲の水溶性
亜硝酸塩である。 亜硝酸塩は、あらゆる水溶性亜硝酸の金属塩を
使用できるが、好ましくは、亜硝酸の第族金属
塩であり、亜硝酸ナトリウムか亜硝酸カリウムが
特に好ましい。最も好ましいのは、亜硝酸カリウ
ムである。 前記の濃度範囲で亜硝酸塩を使用すれば、乳酸
菌以外の細菌の増殖を抑制することができる。 担体溶液のPH領域は、6.5乃至約7.5の範囲に保
たなければならない。好ましくは、約6.5乃至約
7.0の範囲である。 理想的には、希釈溶液は中性である。培養フイ
ルムを乳酸菌に特定させる際、PHを、概ね中性の
領域、即ち約6.5乃至約7.5の範囲に保つことが大
切である。 これは、前記スリーエム社が販売している「ペ
トリフイルム」のような市販のフイルムが、細菌
を染色してその数をかぞえ易くするため、培養菌
を赤く染めるテトラゾリウム染料を含んでいるた
めである。 しかも、もし、このPHが酸性側、例えばPH5.5
に傾くと、テトラゾリウム染料が、すべての増殖
細菌に対して毒性を現わす。 従つて、本発明による担体溶液のPH領域は、一
定の範囲内におさめておかなければならず、それ
により、テトラゾリウム染料の逆効果をなすこと
ができる。 他の細菌の増殖による影響を最大限抑制するた
め、本発明では、接種フイルムを嫌気状態で培養
することが大切である。言い換えると、希釈溶液
は、嫌気状態において、乳酸菌のみに特定される
ものである。 嫌気状態をつくるには、いろいろな方法があ
り、例えば、アメリカ合衆国 メリーランド州
コキースヴイルに所在するBBL・マイクロバイ
オロジー・システムズ社が製造している「ガス
パツク（Gas pack）」なる名称の嫌気発生器を使
用する。 グラム陰性菌抑制剤としてポリミキシンを用い
るという点については、既に述べたところであ
る。 このほかに、さまざまな目的に合つた製剤が開
発されており、場合によつては、それが、既に述
べたものより優れた効果を発揮する。 それは、基本的に、グラム陰性菌抑制剤とし
て、２−フエニルエタノールを使用する。 ２−フエニルエタノールを使用する場合、好適
な組成は、次のようにする。 ２−フエニルエタノールの濃度は、約１mg／ml
乃至約４mg／mlとする。殺真菌剤の濃度は、約
10μg／ml乃至約250μg／mlとし、かつ水溶性の亜
硝酸塩の濃度は、約600μg／ml乃至約800μg／ml
とする。その際、PH領域は、約6.5乃至約7.5の範
囲内、好ましくは、約6.5乃至約7.0とする。 乾燥培養基がコートされたフイルムと、本発明
の担体溶液との使用方法は、細菌学者や微生物学
者が扱う際、難しい技術を必要としない。 基本的に、この使用方法は、次のような技術的
操作からなつている。 フイルムを平らな面の上に載せ、細菌を有して
いる希釈剤からなる試料１mlが、ベースフイルム
上に施されるよう、頂部の透明なフイルム層を持
ち上げる。 頂部フイルムを、注意深くベースフイルムの上
に被せて行く。担体溶液が、培養基を含んでいる
ベースフイルムに行きわたるよう、プラスチツク
試料用スプレダーを用いて、頂部フイルムを軽く
押圧する。 それから、約１分間、フイルムを静かにそつと
させておき、ゲル化させる。 フイルムの透明側を上にし、水平状態で、32℃
に保つて48時間、フイルムを培養する。細菌が、
ベースフイルム中の指示用テトラゾリウム染料を
還元し、フイルム上には、細菌の集落が赤い斑点
となつて現われるので、それを計数する。 〔実施例〕 以下、本発明の好適実施例を詳細に説明する。
ただし、これらの実施例は、本発明による方法、
技術および組成物を制約するものではない。 各実施例において使用した乾燥培養フイルム
は、アメリカ合衆国 ミネソタ州 55144 セン
トポールに所在するスリーエム社の医薬品事業部
が開発した「ペトリフイルム」である。 このペトリフイルムは、ベースフイルムにコー
トされ、ポリエチレンフイルムによつて被覆され
ている、必要なものが含まれかつ直ぐに使用でき
る乾燥細菌培養基からなつている。 また、このベースフイルムは、標準的栄養素、
および冷水に可溶なゲル化剤によつてもコートさ
れた被覆用フイルムは、細菌の計数が容易にでき
るようにするため、指示染料として、２，３，５
−トリフエニルテトラゾリウムクロリドを含んで
いる。 １cm×１cmの四角い枡目が、計数をし易くする
ため、ベースフイルムに設けられている。ペトリ
フイルム全体の大きさは、20cm角である。 希釈剤からなる貯蔵溶液の調製を含む基本操作
を済ませ、ペトリフイルムに接種を行なつてか
ら、嫌気条件の下で、32℃にて48時間培養してか
ら、細菌の数（cfu／ml）を計数する。 温室から採取した土壌試料を、テスト培養とし
て使用し、かつ乳酸菌培養として知られている指
定のＳ／80なる別の試料を対照として使用した。
土壌試料は、乳酸菌以外の多くの菌を含んでいる
ことが知られている。 希釈貯蔵液を、この溶液（容量）に対する亜硝
酸ナトリウム（重量）の割合が、それぞれ、１
（Ｗ／ｖ）％、６（Ｗ／ｖ）％、12（Ｗ／ｖ）％、
および18（Ｗ／ｖ）％となるように調製し、また、
シクロヘキシミドを、その割合が、それぞれ、
0.1（Ｗ／ｖ）％、0.5（Ｗ／ｖ）％、１（Ｗ／ｖ）
％、および2.5（Ｗ／ｖ）％となるように加えた。 これら最初の一連の実験では、亜硝酸ナトリウ
ムおよびシクロヘキシミドの濃度変化による影響
を調べるため、ポリミキシンＢは、0.03（Ｗ／ｖ）
％と一定の割合にして使用した。 貯蔵溶液を濾過滅菌し、次に、97mlの滅菌精製
水と、更に、水100mlに対し、３種類の成分、即
ち亜硝酸ナトリウム、シクロヘキシミド、および
ポリミキシンＢがそれぞれ既に述べたような濃度
範囲になつているもの１mlとを加えて、最終希釈
液をつくつた。次に、滅菌混合物を、無菌状態に
して試験管１本につき、９mlの割合で加えた。 以下の混合物を調製した。

【表】 標準ペトリフイルムの希釈処理に引続き、Ｓ／
80対照の接種準備に入る。つまり、一昼夜培養液
１mlを、テスト用液を用いて順次希釈し、１ml量
をプレートにまいた。 最初、11ｇの温室土壌試料を、100mlのバター
フイールド緩衝液で希釈した。この調製液を、テ
スト用液を使つて順次希釈した。 Ｓ／80を10^-6、10^-7、および10^-8の濃度に薄め
た希釈液各10mlを、それぞれ、ペトリフイルム平
板培養基にまいた。土壌を10^-4、10^-5および10^-6
の濃度に薄めた希釈液各1.0mlを、それぞれ、ペ
トリフイルム平板培養基にまいた。 接種試料を、BBL社製の「ガス・パツク」（商
標名）発生器を含むジヤーを用いて嫌気状態で、
32℃の温度に保ち48時間培養した。 上で述べた希釈液を用い、その結果生じたコロ
ニー形成数を次表（）に示す。

【表】 上表から明らかなように、亜硝酸塩の濃度が
600μg／mlから1200μg／mlへ増加すると、希釈剤
の土壌微生物に対する抑制効果が顕著に現われ
る。 Ｓ／80の場合、亜硝酸塩の濃度とシクロヘキシ
ミドの濃度が、それぞれ、100μg／mlから
1800μg／mlおよび10μg／mlから250μg／mlに変化
しても、それによる影響は殆どみられない。 また、希釈剤は、培養フイルムを乳酸菌に特定
することができ、かつ他の細菌の増殖を抑制して
いることが分かる。 使用例１乃至７に示されているものに対し、ポ
リミキシンＢの濃度を変えて同様の実験を行なつ
たところ、24乃至40ユニツト／mlの範囲では、
Ｓ／80細菌に対する影響はなかつた。土壌細菌の
場合、ポリキシンＢの濃度が24ユニツト／ml以下
になると、抑制効果がそがれる。 ポリミキシンＢスルフエートの代わりに２−フ
エニルエタノールを使用した実施例 シグマ・サイエンテイフイツク社（Sigma
Scientific）から購入した液体状２−フエニルエ
タノール（PEA）（比重1.02）を希釈剤に使用し
た。以下に記載の濃度を得るため、PEAを所望
量の精製水に加え、オートクレーブに入れる。 濾過滅菌した６（Ｗ／ｖ）％の亜硝酸ナトリウ
ムおよび0.1（Ｗ／ｖ）％のシクロヘキシミド溶液
を、希釈剤100mlに対し、１mlづつ加え、次表の
ような混合物（使用例）を調製した。

【表】 接種要領は、前に述べた試料の場合と同じであ
る。テスト試料として、Ｓ／80溶液と土壌を用い
た。 希釈混合物による一昼夜培養を行なつてから、
Ｓ／80を順次希釈し、10⁷倍および10⁸倍に希釈し
て、ペトリフイルム上で平板培養した。 土壌は、最初99mlの改良型バターフイールド緩
衝液を用いて１：10に希釈し、次に、所望の希釈
度に順次希釈した。 土壌を、10^-4、10^-5、および10^-6の濃度にした
ものをベトリフイルムにまいた。フイルムを、
BBL社製の「ガス・パツク」を用い、嫌気状態
にして、32℃で48時間培養した。 結果を表に示す。

【表】 上表から明らかなように、ポリミキシンＢスル
フエート抗生物質の代わりのフエニルエチルアル
コールは、土壌微生物の抑制に極めて有効であ
る。 次に実施例は、グラム陰性菌抑制剤として、フ
エニルエチルアルコール（PEA）を用い、組成
をいろいろ変えて行なつたものである。

【表】 ユニツト／mlのポリミシキンを含む。
テスト試料として、Ｓ／80および土壌を用い
た。Ｓ／80は、10^-7および10^-8の濃度に希釈して
まいた。 土壌は、最初に、99ml（１：10）の改良型バタ
ーフイールド緩衝液を用いて希釈し、それから、
10^-3および10^-6の濃度にしてまいた。前段の実施
例で説明した要領と同じように、BBL社製の
「ガス・パツク」を使用し、32℃の温度で48時間、
嫌気状態でペトリフイルムを培養した。 結果は、次の通りであつた。

【表】 上表から明らかなように、土壌の場合、使用例
13が、最高の抑制効果を示した。これに対し、
Ｓ／80の増殖のほうは、影響を受けていない。 以上述べた実施例から明らかなように、有効な
希釈組成物を使用することにより、培養フイルム
は、乳酸菌に特定され、従つて、所期の目的は完
全に達成される。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 嫌気状態下で、土壌微生物の生育を抑制し
   て、細菌培養するための必要なものが含まれ、直
   ぐに使用できかつ通常乾燥している細菌培養フイ
   ルム用の希釈溶液であつて、 (a) 約1.0mg／ml乃至約4.0mg／mlの濃度の２−フ
   エニルエタノール、 (b) 約10μg／ml乃至約250μg／mlの濃度の水溶性
   殺真菌剤、及び (c) 約600μg／ml乃至約800μg／mlの濃度の水溶
   性亜硝酸塩、 とを含み、かつ (d) PH領域が、約6.5乃至7.5の範囲であることを
   特徴とする前記細菌培養フイルム用希釈溶液。 ２ 殺真菌剤が、シクロヘキシミド、ソルビン酸
   カリウム、ブチルヒドロキシトルエン（BHT）、
   およびブチルヒドロキシアニソール（BHA）よ
   りなる群から選択されることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項に記載の細菌培養フイルム用希釈
   溶液。 ３ 殺真菌剤が、シクロヘキシミドであることを
   特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の細菌培
   養フイルム用希釈溶液。 ４ PH領域が、約6.5乃至約7.0の範囲であること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の細菌
   培養フイルム用希釈溶液。 ５ 亜硝酸塩が、亜硝酸の第族金属であること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の細菌
   培養フイルム用希釈溶液。 ６ 亜硝酸塩が、亜硝酸ナトリウムであることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の細菌培
   養フイルム用希釈溶液。 ７ (A) 嫌気状態下で、土壌微生物の生育を抑制
   して、細菌培養するための必要なものが含ま
   れ、直ぐに使用できかつ通常乾燥している細菌
   培養フイルム用の希釈溶液であつて、 (a) 約1.0mg／ml乃至約4.0mg／mlの濃度の２−
   フエニルエタノール、 (b) 約10μg／ml乃至約250μg／mlの濃度の水溶
   性殺真菌剤、及び (c) 約600μg／ml乃至約800μg／mlの濃度の水
   溶性亜硝酸塩、 とを含み、かつ (d) PH領域が、約6.5乃至7.5の範囲であること
   を特徴とする前記細菌培養フイルム用希釈溶
   液、と (B) 前記細菌培養フイルム、 を組合わせてなることを特徴とする細菌培養フ
   イルム。 ８ 必要なものが含まれ、かつ直ぐに使用でき、
   かつ通常乾燥している細菌培養フイルムが、 (a) ベースフイルムに塗布され、かつ上から透明
   フイルムで被覆されている細菌培養基を含み、 (b) 前記ベースフイルムは、標準的栄養素、およ
   び冷水に可溶なゲル化剤を有し、かつ、 (c) 被覆用フイルムには、ゲル化剤と、細菌数の
   計数を容易にするための２，３，５−トリフエ
   ニルテトラゾリウムクロリド指示染料とが塗布
   されていることを特徴とする特許請求の範囲第
   ７項に記載の細菌培養フイルム。 ９ 希釈溶液が、 (イ) 約24ユニツト／ml乃至約40ユニツト／mlの濃
   度のポリミキシン抗生物質、 (ロ) 約10μg／ml乃至約250μg／mlの濃度の水溶性
   殺真菌剤、及び (ハ) 約600μg／ml乃至約1800μg／mlの濃度の亜硝
   酸塩、 を含有する水溶液であり、かつ前記水溶液のPH領
   域が、約6.5乃至7.0の範囲であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第７項に記載の細菌培養フイル
   ム。 １０ 希釈溶液が、 (イ) 約1.0mg／ml乃至約4.0mg／mlの濃度の２−フ
   エニルエタノール、 (ロ) 約10μg／ml乃至約250μg／mlの濃度のシクロ
   ヘキシミド、及び (ハ) 約600μg／ml乃至約800μg／mlの濃度の亜硝
   酸ナトリウム、とを含むことを特徴とする特許
   請求の範囲第７項に記載の細菌培養フイルム。