JPH05502664A - 氷核形成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 氷核形成 本発明は、改良された氷の核形成特性を有することが予期せずに見出だされた公 知物質の新規な形態を用いる氷核形成に関する。本発明は、人工雪の製造、凍結 乾燥、雨、雪又は雪を誘導するための雰囲気中の種晶形成小水滴又は、水含有食 料品の冷凍におけるように水性媒体中の氷核形成方法にも及ぶ。特に生物試料へ の損傷を軽減又は回避するために低温保存中の不十分な冷却効果を最小にするた めに、生物試料を低温保存する方法を企図する。後者の点において、本発明はヒ トの胚（ｅｍｂｒｙｏｓ）及びその他の動物の胚の低温保存に特別な使用を見出 だすことができる。

雪の形態での氷の生産はスキー産業において商業的に重要である。自然の降雪は しばしば不安定であり、適するスキー条件を確保するために雪の人工生成か用い られる。従って、激しく使われたスキー用スロープは回収され、新鮮な雪を用い ることにより使用可能になる。人工雪のスロープは、繊維のマント材料ではなく 、雪から生産され得る。雪の生産は又、厳しい冬の条件において農作物を覆うた めに潜在的に重要である。又、極地方における調査ドリリングのための乗降場の ような氷の構造を海水の噴霧凍結によって築くことができることか示唆されてき た。

官製造機により通常、水の煙霧質を空気中に生成させ、その後に自然に凍結させ る。しかし、官製造機を用いる主な問題は、水の小滴における核形成が非常に効 率の悪い方法であり、氷の融点は０℃であるのに、小滴が凍結前に一４０℃もの 低い温度に過冷却することである。従って、約−５℃のような高い周囲温度では 官製造機は有効でなく、同時に低温度では、その方法が効率が悪い。

最近では、氷形成を開始させるために、シュードモナス　シリンジエ［（ＰＳｅ ｕｄｏｍｏｎａｓ　＋７＋ｉｎｇａｅ）　、イーストマン　コダック社により商 標名スノウマックスとして製造コの添加が、ある環境条件において用いられてい る。

この微生物は氷の結晶格子に似た表面構造を有し、効率の良い氷核形成であるこ とができる。雪の製造機に添加すると、生産を１５０％まで増加させる。しかし 、その使用には欠点がある： ａ）　それが高価な物質である（本願出願時にキロ当り４１１ポンドはどにもな る）こと及び ｂ）　策２に、たとえ生存不可能であるように処理された、天然に存在する微生 物であっても細菌を環境に放出することは、重大な法律上のそして環境上の問題 を有する。

従って、特に、雪又は氷粒子の生成方法において、改良された水の核形成技術の 必要性が存在する。

物理化学的好奇心として又は、降雨の開始物質とじて気象学的応用において氷核 形成剤が数年知られてきた。

２５年程前にヘッド（Ｈｅａｄ）は雲の種晶生成操作における氷核生成物質とし てステロイドを用いることを論じているが［ヘッド、不一チャー１０５８　（１ ９６１年９月９日）及びＩ、ＰｈＨ，Ｃｈｅｍ、５ｏｌｉｄ＋　２３巻（１９６ ２年＞　１３７１頁コ、雲の種晶生成の気象学的目的のために、ヨウ化銀のよう な無機物質が恐らく最も研究されてきている。これらの研究において、氷核形成 が、降雨をもたらす雲を生成するための触媒として作用することか提示されてい た。しかし、雲の種晶形成作用に付随する以外の、氷又は雪の形成については提 示されていない。フクタ（Ｆａｋｕａ）及びメーソン（Ｍａｓｏｎ　）は有機結 晶上の氷のエピタキシャル成長について研究した［ｊ、Ｐｈｙｔ、　Ｃｈｅｗ、 ５ｏｌｉｄ＋　、　２４巻（１９６３年）７１５頁］が、それらの観察に対する 有用な応用については何ら示唆していない。有機化合物による氷　゛核形成が、 気象学的目的での氷核形成において達成される仕事の非常に小割合を示すことを 指摘すべきであったが指摘していない。例えば、ホップス（Ｊｌｏｂｂｉ　）に よる約１０００頁もの長さのテキストブック［アイス　フィジックス」［クラレ ノドン　プレス（Ｃｌａｒｅｎｄａｎ　Ｐｒｅｔｓ　）、オックスフす−ド（１ ９７４年）コでは、有機氷核形成について１乃至２頁しか割かれていない。この 研究のすべてにおいて、氷核形成は顕微鏡の低温載物台上で調べられているが塊 で又は分散した流体で研究されていない。

本発明は又、生物試料の低温保存（凍結）の範囲における応用を有する。細胞の ような生物試料の低温保存による貯蔵は、長期間、細胞の生存能力を保持する通 常の方法である。しかし、低温保存での生な問題は、生物試料の冷却中、周囲の 媒体が氷核形成が起こる前に、周囲媒体の凍結点より低く過冷却される傾向があ ることである［このことは、過冷却（Ｉｌｎｄ！＋ｃｏｏｌｉｎｇ）としても知 られているコ。この過冷却は、後に説明するように、生物試料に損傷をもたらし 、過度の過冷却は胚の生存を妨げる。

周囲（水性）媒体中で氷が形成されるにつれ、残りの液体媒体中のいずれの溶質 の濃度も増加する。浸透圧により、細胞は、より濃縮された媒体への水の移動に よって脱水する。もし細胞が脱水するのに十分な時間を優ざない場合は、細胞内 の氷が形成され、その形成は、一般に細胞を致死させる。

しばしば、凍結防止剤（ＤＭＳＯ又はグリセロール）及び、凍結点を低下させる その他の添加剤（塩のような）を凍結保存媒体に添加する。しかし、胚の場合、 生存は、凍結が起こる前に胚細胞か脱水により収縮されることに依存する。

過冷却の効果を回避するか又は最小にする、一般的な必要性か存する。この目的 は、氷の核形成物質を媒体中に導入するか又は媒体と接触させるこてにより達成 される。例えば、欧州特許公開０２４６８２４号では、広範囲の固体物質を媒体 と接触させたときに水性媒体における水をもたらし、媒体の凍結点で又は凍結点 付近で核形成される。

周囲媒体において過冷却の程度が試料の生存に臨界的である、胚のような生物試 料を用いるには、特別な注意をしなければならない。従って、媒体における過冷 却の量を低減させる要求がなお存する。本発明者らは、１つの特別な有機固体が 、特別に処理された場合、媒体の凝結点より少し低い温度の重要範囲内に過冷却 温度か存する程度にさらに一層、過冷却の程度を低減し、それに付随して試料の 損傷が低減することを全く予期せずに見出だした。

さらに、本発明は、過冷却における数度の違いにより胚が生存するかしないかを 決定する場合に、低温保存中の過冷却の量を数度、従来技術を改良するものであ る。

従って、本発明の第１の面は、メタノール又は酢酸からコレステロールを結晶化 することにより得られる結晶構造を有するコレステロールを供給することである 。

本発明者らは、酢酸又はメタノールからコレステロールを結晶化（この用語は再 結晶化も含んで用いられる）することによって、エタノールのような他の溶媒か らの結晶化に比べ、過冷却効果が低減されることを見出だした。従って、本発明 におけるコレステロールは特に有効な氷核形成物質であり、換言すれば、氷核形 成（氷形成）の誘導に有効であることを見出だした。最も広範囲の用語において 、本発明はメタノール又は酢酸からの結晶化により得られる、氷核形成物質とし てのコレステロールの使用を企図する。

本発明におけるコレステロールは、コレステロールのメタノール又は酢酸溶液を 生成し、その後に、メタノール又は酢酸を蒸発させ、それによりコレステロール 結晶を生じさせることにより適当に製造される。そのような蒸発は迅速に行われ るのが好ましい。メタノール又は酢酸は好ましくは試薬級又は分析級でさえ好ま しく、実質的に（完全でなくても）水を含まない。生成工程中にコレステロール を水と接触させなければ、最適の結果か得られる。

本発明の第２の面は、メタノール又は酢酸からコレステロールを結晶化させるこ とにより得られる結晶構造を有するコレステロールを含む氷核形成組成物に関す る。

好ましい態様ではその組成物は水性媒体であるが、この組成物はコレステロール のみであり得るし、又は不活性担体上に供給され得る（後記）。この水性媒体は 水（水道水又は蒸留水）であり得るが、はとんどＯの濃度（無限希釈度）から冷 凍させるのに利用できる遊離の水がなお存在するという範囲の濃度までその他の 溶解できる成分を含み得る。前記組成物は１種以上の塩又は電解質（塩化ナトリ ウム等の）を含み、生理的バランス、スクロースのような糖又は凍結防止剤、例 えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び／又はグリセロールを保持できる。

塩又は電解質が用いられる場合、これらは、０．４Ｍ乃至０．５Ｍのような、好 ましくは約０．５Ｍのような０、ＩＭ乃至１０．０Ｍの濃度で存在し得る。糖の 場合には、濃度は、　５乃至１５　ｖ／ｖ％、好ましくは約ＩＱｗ／ｖ％のよう な１乃至５０　ｖ／ｖ％である。凍結防止剤が存在する場合は、濃度は、５乃至 １５マ／マのような、最適には約ｔｏｖ／ｖ％のような　１乃至６０マ／マ％で ある。

媒体中のコレステロールの濃度は、媒体中の他の物質の存在によって異なるが、 過冷却の防止に重要な効果を有するためのコレステロールには０．０００１乃至 ０．００１　ｇ／ｍｌ（又は、媒体が固体ならｇ／ｃｅ）もの低い濃度であり得 る。

しかし、実際には、好ましくは媒体は０．２５乃至１５■／ｍｌのコレステロー ル、最適には０．７５乃至１．２５■／　ｍｌのコレステロールを含む。

本発明は、コレステロールの予期しない改良された氷核形成特性の理由であると 考えられるものに限定されないが、本発明者らは、メタノール又は酢酸からの結 晶化で得られるときのコレステロールの結晶構造によるものであると考える。

第１図及び箪２図（どちらも従来技術）かられかるように、市販のコレステロー ルの結晶は、外観は一般的に小さく緻密でスフェルライトである。しかし、本発 明により、コレステロールか酢酸又はメタノールのどちらから結晶化されるとき に（例えば実施例３及び４を参照）、結晶構造は非常に異なり、結晶が外観上針 状である。結晶構造におけるこの注目される相違は、高温で氷核形成を誘導する ことにより低温保存中過冷却を誘導する原因であると考えられる。

本発明の第３の面は、メタノール又は酢酸からコレステロールを結晶化すること により得られる結晶構造を有するコレステロールと接触させながら水性媒体を冷 却することを含む、水性媒体において氷核形成を誘導する方法に関する。

「水性媒体」という用語は、その中で氷核形成を誘導するのに望ましい、水を含 有する物質又は原料を意味する。これは液体を含むだけでなく、又、水及び水含 有固体さえも含む気体をも含む。加えて、用語「水性媒体」は、連続性（１相） 媒体を包含するだけでなく、液体一固体、液体−液体（例えばエマルジョン）又 は気体−液体、例えば水性媒体を分散又は懸濁液（例えばエアゾール）の形態で 水性媒体を有する気体（例えば空気）のような２相の媒体をも包含する。前記用 語は又、３相、気体−液体一固体系をも包含する。実際、本発明の方法は、その 他に、例えば、水性媒体を例えば大気中に噴霧することによる水性媒体のエアゾ ールの形成を包含する。

１つの実施態様では、水性媒体は、好ましくは冷凍されることか望まれる食品又 は食料品である。食料品は固体又は半固体であり、水辺外のかなりの数の成分を 有し得る。企図される食料品は、氷のせ菓子（ＩＯＩＩＹ　）　、シャーベット 、ヨーグルト、クリームやアイスクリームのような酪農製品、果物、肉及び海産 物（例えば魚）製品のようなしばしば冷凍で売られている食料品及び食用のそれ らの組み合わせ（及びその他の適する食料品）、例えばケーキ及び菓子（ｇａ＋ ｅａｕ）　（Ｌばしばクリーム及び果物を含む）を含む。コレステロールは時に は食品の好ましい成分ではないが、本発明における非常に少量のコレステロール が氷核形成を助けるために、下記のように必要とされる。いずれの場合でも、本 発明におけるコレステロールの量が、いくつかの食品（例えば菓子）のコレステ ロール含量に比較して無視できる。

本発明におけるコレステロールを適するときに食品に添加し得るが、一般に製造 工程中に添加される。従って、本発明は、冷凍工程をある程度、調整できること によって、消費者の認容性、食品の貯蔵特性及び／又は工程時間に影響を与える 。認識される特別の利点は、凍結工程時間を低減することである。

水性媒体の冷却は、自動冷却装置［（ｐａｓｓｉｖｅ　Ｃ０ＱＩＩ＋）、セル　 システムズ　リミテッドの名で１９９０年８月７日に出願の国際特許出願に記載 されているような］、冷凍装置［好ましくはプログラム可能な、例えばプラナ− プロダクツ（Ｐｌａｎｅ＋　ＰＩｏｄｏｃ＋＋　）　、ミドルセックス、サンベ リー　オン　テームズ（Ｓｏｎｂｕ＋ｙ　ｏｎ　Ｔｈａｍｅ＋　）から入手可能 のコを用いることにより又は水性媒体の冷却環境条件にさらすことにより、例え ば水性媒体を水性媒体の融点より低い温度の空気又は大気にさらすことにより達 成される。

はとんどの水性媒体は、多かれ少なかれ冷凍前に過冷却を行うこと及び過冷却の 程度は水性媒体の性質によることを理解すべきである。特に、溶解できる物質（ 溶質）は、冷却される水性媒体の量及び水性媒体の冷却速度のような他の因子が 影響を与えるように過冷却の度合いにかなり影響を与える。

本発明におけるコレステロールが用いられる水性媒体の性質は、化学的添加物質 としてのコレステロールの使用がある理由のために排除されないという条件を満 たせば広範囲であり変化する。

例えば、水性媒体は、氷核形成を誘導し、雪又は氷を生成する場合には単に水で あり得る。本発明のこの点においては後に記載する。

それに対し、水性媒体は、液体及び／又は固体廃棄物、毒性の、有毒な及び／又 は有害な物質、例えば放射性物質を含み、その後の処理又は貯蔵目的のためによ り適するように、氷核形成を用いる水性媒体の固体化が水性媒体（又は、そのと きにあり得るように実質的に固体媒体）を安定化する。

従って、本発明は、水性媒体から固体（たとえ冷凍されたものでも）を生成する のが望ましい場合に冷凍安定化方法における特定゛の用途を見出たしている。通 常、固体である生成した物質（例えは２相の、例えばどろどろした粘稠度を有す る固体の氷及び水性媒体の組み合わせ）は扱うのに又は輸送するのに容易にされ 得る。

本発明の第４の面は、氷が第３の面による方法により生成されている場合に氷を 含む物質に関する。従ってその物質は、ある状況において、いくつかのでなく、 すべての水性媒体が固体に凍結するのがよいが、一般に、水性媒体を含む。

「水性媒体」という用語は、第３の面において記載したように、好ましくは必要 な変更を加えることか好ましい。しばしばそうであるか１相に限定されるように 解釈されず、種々の溶解性物質が存在し得る。実際、本発明は特に水性媒体中に 固体（通常、水不溶性である）の存在、特に生物試料を低温保存する方法におけ るような生物試料を企図する。その物質は又、上記のように食料品であり得る。

従って、本発明の特に好ましい（第５の）面においては、メタノール又は酢酸か らコレステロールを結晶化することにより得られる結晶構造を有するコレステロ ールと接触させた水性媒体中の生物試料を冷却することを含む、生物試料を低温 保存する方法を提供する。水性媒体は好ましくは第２の面で記載したように、必 要な変更を加えるのが好ましい。

「生物試料」という用語には、天然の又は遺伝子操作された又はその他の、細胞 （真核生物の及び原核生物の両方の）、細胞から成る器官及び組織、胚、ウィル ス及び、核酸、蛋白質、糖蛋白、脂質及びリポ蛋白のような生物学的活性分子を 包含する。

市販されているコレステロール（例えば分析級又は試薬級の）は、種々の供給源 から、例えばシグマ　ケミカルスから得られる。このコレステロールは本発明に おいて用いられるために、一般にメタノール又は酢酸からの再結晶化に適してい る。

氷核形成を補助するために用いられるコレステロールの量は、はんの少量、例え ば約Ｌ［１２■（２Ｘ　１０−５ｇ　）を必要とする。

別個の結晶形の又は不活性担体上のコレステロールを媒体（又は試料自体）と接 触させる。

生物試料に対する好ましい冷却の実験計画は、恒温保持及び／又は液体窒素への 投入を含む。適する冷却は、０５℃乃至１５℃のような０３℃乃至２．０℃／分 の速度である。液体窒素中に投入する前に試料を一１５℃乃至−４０℃に冷却す るのが好ましい。

従って、本発明の第６の面は、メタノール又は酢酸からコレステロールを結晶化 させることにより得られる結晶構造を有するコレステロールで少なくとも部分的 に被覆された物質を提供することである。そのような被覆された物質は第５の面 における、水性媒体中の生物試料を低温保存する方法に用いられる。

好ましくは、支持体は、アンプル、管、ストロ−又はバッグのような適する低温 保存容器の内部表面又は、特に担体、例えばガラス、ポリマー又は他のビーズで ある。

適する支持体は、ガラス又は、プラスチック物質（ポリプロピレン又はポリビニ ルクロリドのような）又はアクリルポリマーである適当なポリマーのような生物 学的に不活性の物質で作られる。修飾デキストランビーズが特に適する物質であ り、ｒｃＹＴＯＤＥＸ　Ｊという商標名でファルマシアから市販されている。又 、好ましい物質は、バイオ　ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）から「バイオ−ビーズ ＪＳＭ７として市販されているアクリルポリマービーズである。

これらのビーズは、適当に被覆され、低温保存媒体に単に添加され得る（本発明 の第２の面によるような）。

コレステロールの支持体への被覆密度は通常、少なくとも０．０００７■／１２ であり、実施上の便利性により決定される限度までである。被覆密度は少なくと も０００１■／ｌｌｌｌ１１２が適しており、好ましくは０，１■／＝２未満、 最適には約０．ＱＯ３５■／ｍ２である。本発明の第六の面の他の好ましい特徴 は、前記面でのように必要な変更が加えられる。

本発明の第７の面は、第６の面の支持体の製造法に関するもので、その方法は、 支持体をコレステロールのメタノール又は酢酸溶液と接触させ、そしてメタノー ル又は酢酸を蒸発させることを包含する方法である。好ましくはその溶液はコレ ステロールを少くとも　０２％、好ましくは０４％含有する。第７の他の好まし い特性は、第６面のように必要な変更が加えられる。

本発明の第８の面は、大気中に雨又は雪又は氷の粒子を生成する（雪、雪又は氷 のように）方法に関し、その方法は、大気中の水性媒体の粒子を、メタノール又 は酢酸からコレステロールを結晶化することにより得られる結晶構造ををするコ レステロールと接触させ、水性粒子中の水を核形成させ、雪又は氷を形成させ、 水性粒子及び／又は大気が水性粒子の凍結点より低い温度であることを含む。雨 は一般に雪又は氷の粒子の融解（もしこれが起これば）から生じる。

水性粒子は通常は水滴、例えば、雲におけるような、成層圏において見られるも のである。このようにコレステロールは、雲に「種をまく」ために氷核形成物質 のように作用し、雪又は雪を導（。コレステロールを、一般に飛行機又は（気象 ）気球のような航空機を用いることによって水性粒子と接触させる。この接触は 、コレステロールを放出（例えば重力下）することにより又は噴霧することによ り達成される。

本方法は、加えて、大気中に水性媒体の粒子を発生させることを包含する。従っ て、篤９の面における本発明の好ましい方法は、雪又は氷の粒子を生成する方法 に関し、その方法は、水性媒体を大気中に噴霧し、水性媒体又は大気又はその両 方が水性媒体の融点より低い温度であり、メタノール又は酢酸からコレステロー ルを結晶化させることによって得られる結晶構造を有するコレステロールを水性 媒体中に分散させ、水性媒体中の水を核形成させ、雪又は氷の粒子を生成するこ とを包含する。

通常、水性媒体は便利さから水である。水性媒体か大気中に噴霧される前か、同 時か又は後に、コレステロールが水性媒体中に分散される。噴霧前に水性媒体中 にコレステロールを分散させる場合、コレステロールは噴霧される水性媒体の溜 め（ｒｅｘｅｒｖａＩｔ　）に分散される。噴霧時に水性媒体中にコレステロー ルを分散させる場合は、二重ノズル集成装置（ｄｏａｂｌｅ　ｎｕ＋ｌｅ　ａｒ ｒａｎｇｅｍｅｎｔ　）が用いられ、コレステロールを発生しようとしている水 性媒体の小滴中に分散させる。噴霧後にコレステロールが水性媒体中に分散され る場合は、コレステロール霧を起こし、水性媒体の小粒子（小滴のような）領域 を通過し、その後に粒子中に分散されることができる。

水が用いられる場合、完全に純粋である必要はない。

実際、不純物の要素が好ましい。例えば、媒体（水のような）中に存在するある 量の溶質は核形成を助ける。しかし、一般に、もし存在するなら、溶質の量は、 余りに過度で媒体の凍結点を低下させることがないように過度の量より少なく保 つのが好ましい。

媒体は、非常に細かい霧（ｓｐ＋ａ丁）として、言い換えればエアゾールとして 噴霧される。そのような霧は、便利に空気を圧縮する、圧縮機を用いることによ り発生される。しかし、液体から蒸発する気体、例えば窒素のような液化大気ガ スを用いて適する霧を生成することが可能である。環境への影響のために、なる べくなら、フレオン類の使用は避けるべきである。エアゾールを発生させる機械 的方法も又用いられる。

本発明の第１０の面は、水性媒体を大気中に噴霧する手段及びメタノール又は酢 酸からコレステロールを結晶化することにより得られる結晶構造を有し、媒体中 の水を核形成させ、雪又は氷の粒子を生成するコレステロールを水性媒体中に分 散させる手段を含む、雪又は氷の粒子を生成するのに適する装置に関する。

本発明の第１１の面によれば、第９の面の方法により及び／又は第１０の面の装 置により生成されるときには、（人工）雪又は氷の粒子が供給される。

本発明の１つの面の好ましい特徴や特性は他のように必要な変更を加えられるこ とが認識されるであろう。

本発明を、添付図面を参考にし、例として記載する。

第１図（従来技術）は、シグマケミカルズから市販されているコレステロールの 顕微鏡下（Ｘｆ［ｌ’）での写真である。

第２図（従来技術）はシグマケミカルズから得られ、そしてエタノールから結晶 化されたコレステロールの顕微鏡下での写真（ＸＩＯ５）である。

第３図は、酢酸から結晶化された本発明によるコレステロールの顕微鏡下での写 真（ＸＩ０５）である。

第４図はメタノールから結晶化された本発明によるコレステロールの顕微鏡下で の写真（ＸＩＯ５）である。

第５図及び第６図は、公知技術と本発明の両方の低温保存を用いてスクロース及 び塩水溶液をそれぞれ冷却する間の核形成プロフィールを示す、時間に対する温 度のプロットである。

コレステロールの試料（シグマケミカルズ）をメタノール、エタノール及び酢酸 に別個に１００ｍ１中０．６２５ｇ溶解させた。その後にその溶液を無塵の大気 中で７０℃で暖め、乾燥させる。この処理のそれぞれからの結晶を容器から機械 的に取り出し、室温で無水条件下で貯蔵した。４つのプラスチック万能管（ｐｌ ＋＋＋ｉｃ　ａｎｉｖ＋＋＋ａｌ　ｔｕｂｅ）を試験容器として用い、各々にｌ ｏｗ／ｖ％のスクロース２０ｍ１を添加した。そのとき、３つの管はその中に添 加された３つのコレステロール標品の１つを０．２ｇ有した。Ｔ型態電対をコン ブニーター処理データーロガーに接続し、密閉された容管の内部の中央点に置い た。すべての管を家庭用冷凍庫で冷却し、冷却速度、発熱量生成の温度及び融解 の潜熱を記録した（第５図）。第５図において、核形成プロフィールの記号は、 １、コレステロールを含まない対照を表わす、２、エタノールから結晶化された コレステロールを表わす、 ３、酢酸から結晶化されたコレステロールを表わす、４、メタノールから結晶化 されたコレステロールを表わす。

データーは明らかに、メタノールから結晶化されたコレステロールの存在下で過 冷却の量がかなり低減され、酢酸から結晶化されたコレステロールとともに、対 照及びエタノールから結晶化されたコレステロールを改良した。

比較例　２ コレステロール（シグマケミカルズ）の試料をエタノール、メタノール、酢酸及 びエーテル中に１００ｍ１中０．６２５ｇ溶解させた。５つの低温管［ｃＢｌυ ｂｅｓ　、ヌンクリミテッド（Ｎｕｎｅ　Ｌｔｄ）を無塵の大気中の７０°Ｃの 水浴に置き、適するコレステロール溶液０．１ｍｌを各々に添加した。その管を 、含有した溶媒が完全に蒸発するまで水浴中に保持した。０．５ＭのＮａＣｌ、 ０．５ｍｌの試料を容管に添加し、挿入したＴ型態電対をデーターロガーに連結 した。冷却及び核形成の分布（ｐｒｏｆｉｌｅ　）を比較例１におけるように記 録した（第６図） 第６図において、核形成分布は下記の溶媒から結晶化されたコレステロールを表 わす。

１６　メタノール ２、酢酸 ３、エタノール ４、なしく非被覆の低温管、対照、コレステロールを用ｒＡＪと記された水平破 線は０．５ＭのＮａＣ１の融点（−１，７℃）を表わす。

そのデーターは、明らかにメタノール又は酢酸から結晶化されたコレステロール が冷却試料を核形成することにおいて、エタノールから誘導したコレステロール よりもより有効であることを示す。エーテルから結晶化されたコレステロールは 不活性のようである。

比較例　３ ５つの異なる水性溶液を低温保存管又はストロ−中で異なる冷却速度で凍結する まで冷却した。冷却実験を２つの組に分けた。第１の組では、各溶液には、メタ ノールから結晶化されたコレステロールが１■／　ｍｌの濃度まで添加された（ 比較例２で製造されたように）。第２の組（対照）はコレステロールを存在させ ずに実施した。

この結果を第２表に示す。

本実施例はメタノールから結晶化されたコレステロールを用いる２つの利点を表 わしている。第１は、核形成温度が理論値にかなり近くなり、過冷却の低減をも たらす。第２は標準偏差がコレステロールを用いることによりかなり低減し、試 料間の非常に大きな再現性を与える。

実施例　１ 細菌の細胞の低温保存 ５つの異なる種類の細菌を、１０マ／Ｖ％のグリセロールを有する栄養培地１０ ｍ１中の培地勾配から採集し、得られた、ポリプロピレン低温管（２ｍｌ　）中 の１ｍｌ試料中に懸濁された細菌個体数を測定した。メタノールから結晶化され たコレステロール（約００２■）を各試料に添加し、核形成を誘導した。

それらの管を従来のプログラムできる冷凍庫［プラナ−プロダクツ、ミドルセッ クス、サンベリー　オン　テームズ）又は自動冷凍装置（セル　システムズ、ケ ンブリッジ）のどちらかに移し、１分当り一１℃で一７０℃まで冷却し、管を取 り出して液体窒素中に投じた。試料温度をＴタイプ熱電対／電子温度計を、試料 中に浸したプローブ（ｐｒｏｂ＋　）と組み合わせて用いてモニターする。

その管を２５°Ｃの水中に浸し、次第に暖め、試料を栄養培地に螺旋状に培養さ せ、生存能力のある細胞を数える。

細菌　生存能力のある細胞％ （２度培養の平均） プラナ−冷凍庫　自動冷凍庫 大腸菌 （Ｅ＋ｃｈｅ＋１ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　８２．４５　８２．７０スタフイロコ ツカス （Ｓｔａｐｂｙｌｏｃｏｃｃｕ＋　ａｕ＋ｅｕ＋）　８０．７０　８１．４５（ Ｎｅｉｓ＋ｅ＋ｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ＋ｌ　６３．８５　５９．４５（ ｔｌ＋ｅｍｏｐｈｉｌｏ＋　１ｎｌｌａｅｎ＋ａｅ）　５９．５０　７Ｇ、６５ 本実施例は、メタノールから結晶化されたコレステロールを用いて、ある種の細 菌の好結果の低温保存を示した。

ウシの胚の低温保存 ４細胞発生期の牛の胚を１０マ／マ％のグリセロールを有する卵培地（ｏｖｕｍ 　ｃ’ｏｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　）中でインキュベートシ、その後側々に１ ０の０．２５ｍ１のプラスチックスドロー内に充填した。メタノールから結晶化 したコレステロールを５つのストロ−に約０，５■／ｍｌの濃度まで入れ、スト ロ−を液体窒素中に投入する前に実施例１で用いたように自動冷凍庫中で、分当 り一０３℃の冷却速度で一３５℃まで冷却するようにした。残りの５つのストロ −をプラナ−Ｒ２０６制御速度冷凍庫中で冷却し、−６℃において手で接種した 。

その機械の冷却分布は、 １．２０乃至−５℃まで分当り５．０℃冷却、２、−５℃から一６℃まで分当り 　０．２℃冷却、３、第２工程の間に接種、 ４、−６°Ｃから一３２℃まで分当り　０５℃冷却、５、その後、液体窒素中に 投入。

凍結した胚を、ストロ−を３０℃の水中に浸すことにより次第に暖め、徐々に低 減させた濃度の凍結防止剤を有する培地で数回すすぎ、１晩培地中でインキュベ ートした。

自動冷凍庫中で凍結させた５つの胚のうち４つは培養後優れた条件にあり、５番 目はなお移植するのに認容できる質を有した。プランナー冷凍庫中で冷却した胚 は３つ優れていると評価され、２つはなお生存能力を有したが移植に認容できな かった。

実施例　３ 哺乳動物細胞系の低温保存 培養した哺乳動物の細胞の３つのタイプをｌＯｙ、＃％のＤＭＳＯを有する９１ ％ＦＢＳ培地中に懸濁し、メタノールから結晶化したコレステロールを２．５ｍ ｌのプラスチックアンプルに入れ、次に実施例１において用いられたように、分 当り一１５℃で冷却するように自動冷凍庫で凍結した。試料が＝Σ３℃になった ときに細胞を冷凍庫から取り出し、直接液体窒素中に２４時間の最少貯蔵時間、 投入した。回収した細胞をイン・ビトロで培養し、２つのアンプルの平均に基づ いて生存能力を有する細胞の数を数えた。

細胞系　生存能力（％） ＮＲＫ−４９Ｆ９７ ラット繊維芽細胞 ＣＯＳ　−７Ｎ サル腎細胞 本実施例は、ある哺乳動物の細胞系か、メタノールから結晶化されたコレステロ ールを用いて低温保存を成功して行うことができることを示している。

時間 国際調査報告 １＋ＮｌｌＮ１１Ｉ１＾ＩＩ””””６　ＰＣＴ／ＧＲＱｎ／ｌｉ１％０国際調 査報告 ＧＢ　９００１２６９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　メタノール又は酢酸からコレステロールを結晶化すル。 ２　メタノール又は酢酸からコレステロールを結晶化することにより得られる、 結晶構造を有するコレステロールを含む氷核形成組成物。 ３　水性媒体である、請求項２に記載の組成物。 ４　凍結防止剤を含有する、請求項３に記載の組成物。 ５　グリセロール又はジメチルスルホキシドを含有する、請求項４に記載の組成 物。 ６　メタノール又は酢酸からコレステロールを結晶化することにより得られる結 晶構造を有するコレステロールで接触しながら水性媒体を冷却することを含む、 水性媒体中に氷核形成を誘導する方法。 ７　請求項６に記載の方法により生成された氷を含む物質。 ８　メタノール又は酢酸からコレステロールを結晶化することにより得られる結 晶構造を有するコレステロールで少なくとも部分的に被覆された支持体。 ９　アンプル、チューブ、バッグ、ストロー（ｓｔｒａｗ）又は、ガラスビーズ 又はポリマービーズである、請求項８に記載の支持体。 １０　コレステロールの被覆密度が少なくとも０．０００７ｍｇ／ｍｍ２である 、請求項８に記載の支持体。 １１　コレステロールのメタノール又は酢酸溶液を支持体に接触させ、メタノー ル又は酢酸を蒸発させることを含む、メタノール又は酢酸からコレステロールを 結晶化することにより得られる結晶構造を有するコレステロールで少なくとも部 分的に被覆された支持体を製造する方法。 １２　メタノール又は酢酸から結晶化されたコレステロールを接触させた水性媒 体において生物試料を冷却することを含む、生物試料を低温保存する方法。 １３　生物試料が、天然、遺伝子的に修飾された又はその他の細胞、細胞から成 る器官又は組織、胚、ウイルス、生物学的に活性の分子、核酸、蛋白質、糖蛋白 又はリポ蛋白である、請求項１２に記載の方法。 １４　メタノール又は酢酸からコレステロールを結晶化することにより得られる 結晶構造を有するコレステロールを大気中の水性媒体の粒子に接触させ、水性粒 子中の水を核形成させ、雪又は氷を生成させ、水性粒子及び／又は大気が水性粒 子の凍結点より低い温度であることを含む、大気中に雨又は雪又は氷の粒子を生 成する方法。 １５　水性媒体を大気中に噴霧し、前記媒体又は大気又は両方が前記媒体の凍結 点より低い温度であり、メタノール又は酢酸からコレステロールを結晶化するこ とにより得られる結晶構造を有するコレステロールを水性媒体中に分散させ、水 性媒体中の水を核形成させ、雪又は氷を生成させることを含む、雪又は氷の粒子 を生成する方法。 １６　水性媒体を大気中に噴霧する手段及び、メタノール又は酢酸からコレステ ロールを結晶化することにより得られる結晶構造を有するコレステロールを水性 媒体中に分散させる手段を含む、水性媒体中の水を核形成させ、雪又は氷を生成 させる、雪又は氷の粒子を生成するのに適した装置。 １７　請求項１５による方法及び／又は請求項１６に記載の装置により生成され た雪又は氷の粒子。