JPH05501969A - 外科器具および細胞分離および移植術 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 外科器具および細胞分離および移植術 発明の背景 本発明は一般に外科器具、外科技術および細胞もしくは組織の分離技術に関する 。更に詳しくは、本発明は網膜細胞、上皮（ｅｐｉ　ｔｈｅｌ　ｉｕｍ）および 脈絡膜（ｃｈｏｒｏ　１ｄｅａ）を正常とされる平面的な形状のもとに移植する ための外科器具と、眼の網膜下領域（５ｕｂｒｅｔｉｎａｌ　ｒｅｇｉｏｎ　） に移植するための移植組織（ｇｒａｆｔ　）と、このような移植組織を移植のた めに準備する方法と、そして、異常な網膜、網膜色素上皮層（ｒｅｔｉｎａｌ　 ｐｉｇｍｅｎｔ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　１ａｙｅｒｓ）および脈絡膜を再形成 する方法、に関する。

網膜は、眼の後部に位置された感覚上皮面（ｓｅｎｓｏｒｙｅｐｉｔｈｅｌｉａ ｌ　５ｕｒｆａｃｅ）であり、水晶体によって形成された像を受け取り、この像 を神経衝動に変換し、そしてその情報を視神経によって脳へ伝える。この網膜は 多数の層、すなわち神経細胞層、内側叢状（ρＩｅｘｉｆｏｒｒｎ　）層、内側 核（ｕｎｃｌｅａｒ　）層、外側叢状層、外側核層、先爪受体の内側節（ｓｅｇ ｍｅｎｔｓ）および外側節、を含んでなる。

外側核層は先爪受体細胞の細胞体部（ｃｅｌｌ　ｂｏｄｙ　）を含み、内側節お よび外側節はそれらの細胞体部の延長部となっている。

脈絡膜は大きな分岐した色素細胞を含む脈絡膜であり、を椎動物の眼（ｖｅｒｔ ｅｂｒａｔｅ　ｅｙｅ）の網膜と硬化外膜（ｓｃｌｅｒｏｔｉｃ　ｃｏａｔ）と の闇に位置している。脈絡膜と網膜とのすぐ中間に網膜色素上皮か位置され、先 爪受体細胞との親密な構造的且つ機能的な関係を確立している。

失明における幾つかは、網膜、網膜色素上皮、脈絡膜に生じた欠陥や恐らくその 他の要因（例えば強力な光、網膜剥離、眼内出血）によって引き起こされた先爪 受体細胞の損失に基本的に関係している。幾つかの網膜変性（ｄｅｇｅｎｅｒａ ｔｉｖｅ）疾患においては、選ばれた細胞集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　 ｃｅｌｌ）か失われる。特に、斑状変性（ｍａｃｕｌａｒ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔ ｉｏｎ）および網膜炎においては、色素網膜光摂受体（ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ　 ｒｅｔｉｎａｌ　ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）が変性を生しるか、網膜の他 の細胞は網膜中央連絡部分と同様に保全される。これまで修復不能に損傷された 網膜と考えるべきものを回復させる１つの努力において、調査によって移植組織 および移植技術の様々な形態が示唆されてきたが、異常な網膜を再構成するため に有効な方法を構成するものはなかった。

眼に網膜細胞を移植することは、グロース（Ｇｒｏｗｔｈ）２３：３１３〜３３ ６（１９５９）におけるロヨ民地による論文によって確かめることができる。こ れにおいて胎児（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　）の網膜が母親（ｍａｔｅｒｎａｌ）の 眼の前眼房に移植された。さまざまな細胞が生存できると報告されており、これ に先爪受体も含まれている。続いてデル・セック（ｄｅｌ　Ｃｅｒｒｏ　）がこ れらの実験を再現し拡張することができた（でる・セツロ民地、インベストオフ タルモル　ダイス。サイ、（Ｉｎｖｅｓｔ、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、Ｖｉｓ。

Ｓｃｉ、）２６：１１８２〜１１８５．１９８５）　、すぐ後にターナ−民地は 、デヴ　プレイン　レス、　（Ｄｅｖ。

ＢｒａｉｎＲｅｓ、）　２６　：　９１〜１０４　（１９８６）、新生児の網膜 組織か網膜の損傷部位に移植できることを示した。

関連する研究において、シモンズ氏池は、ツク　ニューロサイ　アブストラ、（ Ｓｏｃ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ａｂｓｔｒ、　）上皮：　６６８　（１９８４）で 胎児の網膜が頭蓋内に移植でき、生存し、かなり正常に成長することの示される こと、中央構造部へ神経を分布することが可能で、光依存によりこれらの構造部 を活性させることができること、を論証した。更に、このような頭蓋内移植は光 依存の行動反応（瞳孔反射）を引き出すことができ、これらはホストの神経系統 を通じて伝えられる。クララセン民地のエクスブ　＝　ニー　ロル　（Ｅｘｐ、 ＮＥｕｒｏｌ、　）　１０２　：　１０２〜１０８　（１９８８）およびクララ セン民地のブロック。

ナトル、アカデ、サイ、ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　ｌ。

Ａｃａｄ、、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）　８４　：　６９５８〜６９６０　（１９８７） がある。

り氏およびターナ−氏は、エクスブ、アイ、レス。

（Ｘｘｐ、Ｅｙｅ　Ｒｅｓ、）土ユニ９１１（１９８８）に、治療方法としての 取り組みにおいてＲＣ３異常のネズミの網膜色素上皮（ＲＰ　Ｅ）を網膜下側空 間に移植して、欠陥のある突然変異体のＲＰＥ細胞を健全な野生（ｗｉ　Ｉｄ− ｔｙｐｅ）の対部分（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）と交換することを提案してい る。彼らの方法によれば、ＲＰＥは生後６または８日の黒眼ネズミから分離され 、きょう膜および脈絡膜を通して進入する病変パラダイムを使用して網膜下側空 間内に移植される。ＰＲＥの１μ＋　（４０，０００〜６０．０００個の細胞） が切開位置にて１０μＩの注射器によって網膜下側空間内に注入される。この注 射器には３０番ゲージの針が取り付けられている。しかしなから、この方法は細 胞の極性を乱し、移植か望まれるドナーの元々の網膜色素上皮組織を破壊してし まう。

のストリップを前眼房もしくはホストの網膜に移植する方法を報告している。こ れらのストリップはドナーの眼から神経織の網膜を切除して準備される。網膜は 次に適当な組織ストリップに切断され、これらか次に３０番ゲージの針或いはマ イクロピペットによって所定位置に射出される。ストリップの幅は針の内径（２ ５０μｍ）に制限され、ストリップの長さは１ｍｍよりも小さい。デル・セック は網膜ストリップの眼内の移植が生存できることを報告する一方、彼はこの方法 が成る制限を有していることを書き留めている。例えば、彼の技術はまさに失わ れた細胞（例えば先爪受体）の置換は行えず、常に網膜細胞の混合を含んでなる 。従ってこのような移植では、セルの特定の集団（例えば先爪受体）が欠けた異 常網膜の適当な再構成は不可能なのである。

デル・セツロ民地はまた、ニニーロサイ　し・ソト。

（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、Ｌｅｔｔ、）　９２　：　２１〜２６、ｌ９８８にて、散 逸した神経網膜細胞の移植の手順を報告している。この手順においては、ドナー の網膜は小片に切断され、１５分間にわたってトリプシン中て培養され、そして 微細に引き伸ばし加工されたピペットを通して吸入されることで１つの細胞懸濁 液となるように粉砕される。り氏およびターナ−氏の上述した方法に比較すれば 、この手順は、ドナーの外側核層を含めて移植組織の元々の構造を破壊してしま う。色素上皮に向けられた外側節を有する先爪受体の厳密な組織、および外側叢 状層に向いた神経筋連接ターミナルか失われてしまう。更に、網膜細胞（先爪受 体）の何れかの所定の集団を他の網膜細胞から分離し純化する方法はまったく論 証されていない。

本発明の発明者によれば、視力を成る程度回復させるために組織化された外側核 層構造部に先爪受体を保持させることか必要であると確信された。この結論は先 爪受体のよく知られている光学的特徴（他の節が光ガイドとして働く）、および 、例え網膜の幾何学形状の崩壊か僅かであっても皺や同様部分か鮮明な視力を著 しく損なうことになるということを示す臨床的事実、に基づし）て０る。

それ故に本発明の多くの目的の中から、異常のある網膜を再形成するのに使用さ れる移植組織の準備方法の提供と、ドナーの眼から採取された組織の比較的大き な範囲を保護するこのような方法の提供と、採取時における細胞の極性（ｐｏ　 ｔａｒ　ｉ　ｔｙ）および組織か移植組織に維持されるこのような方法の提供と 、異常網膜の再形成に使用される移植細胞の提供と、先爪受体の極組織の保全に よって、また移植されて隣接された外側叢状層に神経筋後方の標的を近接させて 保持することによって先爪受体の軸索の再成長を容易化するこのような移植組織 の提供と、適当な位置決めをを許容し且つまた先爪受体もしくはその他の移植さ れた組織を外科用器具か眼中に位置決めされる前およその間に保護するようなこ の移植方法に使用する外科用器具の提供と、そして、眼の網膜下側部分に移植組 織を移植するための方法の提供と、が注目される。

それ故に要約すると、本発明はホストの網膜下側部分に移植する移植組織の準備 方法に関する。この方法は、ドナーの組織を準備すること、その組織から網膜細 胞、上皮組織または脈絡膜組織の中の選択された細胞集団を採取すること、そし てこの細胞集団はその眼の正常な組織に存在しているのと同じ組織および細胞極 性を存していることを含んでなる。細胞集団は無毒且つ柔軟な成分に重ねられ、 この成分は体温で実質的に分解するものとされる。

本発明は更にホストの眼の網膜下側部分に移植される先爪受体の細胞体部を含ん でなる移植組織を準備する方法に関する。この方法は、先爪受体の細胞体部の層 を含むドナーの網膜の準備を包含する。充積受体細胞体部（よドナーの網膜の少 なくとも１つの他の層から、充積受体細胞体部の層かその種類の正常な組織に存 在するのと同じ組織化および細胞極性を維持するようにして、分離される。

本発明は更にホストの眼の網膜下側部分に移植する移植組織に関する。この移植 組織は、体温て実質的（二分解する無毒の柔軟な混合物と、ドナーの眼力）ら採 取した細胞集団との積層体を含んでなる。この細胞集団（よ網膜細胞、上皮組織 および脈絡膜組織から選択される。細胞集団は、その種類の正常な組織に存在す るのと同じ組織イヒおよび細胞極性を育する。

本発明は更にホストの眼の網膜下側部分（こ移植される移植組織に関する。この 移植組織は、ドナーの網膜力１ら採取された充積受体細胞体部の集団を含み、先 爪受体の集団はその種類の正常細胞に存在するのと同じ組織および細胞極性を育 し、移植組織はドナーの網膜（こ存在する細胞の少なくとも１つの層が本質的に ない状態とされる。

本発明は更に細胞集団を含んでなる移植組織をホストの眼の網膜下側部分に移植 する方法に関する。この方法は、網膜における層の少なくとも１つの他の層から 分離された網膜細胞、上皮組織および脈絡膜組織から選択された細胞集団を含ん でなる移植組織を準備することを包含する。この細胞集団はその種類の正常組織 に存在するのと同じ組織および細胞極性を維持する。ホストの眼を通して切開か 施され、網膜か少なくとも部分的に剥離され、これにより網膜下側部分に対する アクセスか可能とされて、その移植組織がアクセスした網膜下側組織に位置決め できるようになされる。

本発明は更に眼における網膜と支持組織との間に無傷の平たくされた細胞構造体 を移植する器具に関する。この器具は平たくされた細胞構造体を保持する細長い 支持プラットフォームを含む。このプラットフォームは眼の中に挿入される先端 と、基端とを存する。ブラ・ノドフオームの先端は凸状に湾曲され、プラットフ ォームを眼の中に挿入し易く且つまた網膜と支持組織との間にてプラットフォー ムを進入し易くなしている。この器具はプラットフォームの各側にサイトレール を有し、平たくされた細胞構造体をプラットフォーム上に保持できるようになさ れている。サイトレールの先端は丸められ、サイトレールの基端はプラットフォ ームの先端へ向けてテーノく−を灯影され、網膜と支持組織との間での器具の挿 入を容易にしている。

本発明は更に眼の中で網膜と支持組織との間に無傷な平たくされた細胞構造体を 移植する器具に関する。この器具は細長いチューブを含み、このチューブは平た い幅広の横断面を有していて、頂部と、平た（された細胞構造体を支持するため の底部と、両側の側部とを備えている。このチューブは先端縁を傾斜されていて 、眼の中へのチューブの挿入および網膜と支持組織との間でのチューブの前進を 容易化していて、この器具はまた平たくされた細胞構造体をチューブの先端から 排出するためのプランジャ一手段を含む。

本発明は更にホストの眼の網膜下側部分に移植組織を移植するためのキットに関 する。このキットは網膜細胞、上皮組織および脈絡膜組織から選択された細胞集 団を含んでなる移植組織を含む。細胞集団はその種類の正常細胞に存在している のと同じ組織および細胞極性を維持する。このキットは細長いチューブを含む外 科用器具を付加的に含む。このチューブは平たく幅広な断面を有し、頂部と、平 たくされた細胞構造体を支持する底部と、両側の側部とを備えている。この頂部 は先端縁を傾斜されていて、眼の中へのチューブの挿入および網膜と支持組織と の間でのチューブの前進を容易化している。この外科用器具はまた平たくされた 細胞構造体をチューブの先端から排出するだめのプランジャ一手段を含む。

本発明の他の目的および特徴は以下の説明で一部明かとなり、一部指摘される。

図面の簡単な説明 第１図は、例１に説明したように正常なネズミの網膜″。湿状”０断“０写真・ 　ぎ、 第２図は、例１に説明したように一定の証明を与えた後の失明ネズミの網膜の写 真； 第３図は、ドナーの網膜の概略図： 第４図は、平たくされたＩ＠膜の概略図；第５図は、基体に取り付けられた平た くされた網膜の概略図： 第６図は、基体に取り付けられた網膜の一部の概略図； 第７図は、支持且つ安定化する基体の上に網膜部分を含む積層体の概略図。

第８図は、先爪受体細胞層および支持且つ安定化する基体を含んでなる移植組織 （点線）を示す第７図の積層体の概略的な頂部平面図： 第９図は、眼中における網膜と支持組織との間に無傷な平たくされた細胞構造を 移植するのに応用される器具の第１の実施例の斜視図： 第１０図は、眼中における網膜と支持組織との間に無傷な平たくされた細胞構造 を移植するのに応用される器具の第２の実施例の、プランジャーか収納位置とさ れ、細部を示すために部分か破断されて示された側面立面図； 第１Ｉ図は、第１０図に示した器具の頂部平面図；第１２図は、プランジャーが 伸長位置とされ、細部を示すために部分が破断されて示された第２の実施例の器 具の側面立面図： 第１３図は、第１２図に示した器具の頂部平面図。

第１４図は、内部に装填された平たくされた細胞構造の一部を示している器具の 部分的な長手方向断面図。

第１５図は、第２の実施例の第１の代替構造を示す頂部平面図。

第１６図は、第２の実施例の第２の代替構造を示す頂部平面図： 第１７図は、第２の実施例の第３の代替構造を示す頂部平面図： 第１８図は、代替プランジャ一手段を示す第２の実施例の頂部平面図： 第１９図は、角膜を通る外科的方法を示す眼の水平断面図。

第２０図は、脈絡膜およびきょう膜を通る外科的方法を示す眼の水平断面図； 第２１図は、例１に説明したように移植した光種受体の写真： 第２２図は、例１に説明したように受容体の眼の後接における移植されたドナー の光種受体の写真。

第２３図は、例！に説明したように移植部分と外側核層のない隣接された網膜と の間の境界面を示す写真：第２４図は、例１に説明したように特にオプシンに関 する抗体ＲｅｔＰ−１のＦＩＴＣ蛍光染料による顕微鏡写真を示す写真： 第２５図は、一連の写真パネルであって、Ａにおいては受容体すなわちホストの 網膜に取り付けられた移植された光種受体、Ｂにおいては移植された組織を認識 するためにＤｉｒ蛍光染料による蛍光状態を示す移植された細胞を示す蛍光染料 による顕微鏡写真、そしてＣにおいては例１に説明したように特にオプシンに関 する抗体のＦ　ＩＴＣ蛍光染料による蛍光状態を示す写真；第２６図は、２つの 顕微鏡写真パネルを含み、八においては失明した成体の受容体すなわちホストに 対する成熟した不ズミの光種受体の移植組織、そしてＢにおいては例４に説明し たように成人トナーから失明した成体ネズミのホストすなわち受容体への人間の 光種受体の移植組織。

第２７図は、＋４０２デオキシグルコース（２ＤＧ）オートラジオグラフであり 、例５に説明したようにＤＹＳＴ＝異常養症、ＴＲＡＮＳ＝移植組織であり；第 ２８図は、例９に説明したように光に対する瞳孔反射を示す一連の写真である。

詳細な説明 ここで使用するように、“ドナー“なる用語はホストに関して同じまたは別の組 織体を意味し、“ドナー組織“はホストに関して同じまたは別の組織体から採取 した組織を意味する。

色素形成網膜炎、網膜剥離、斑状変性および光に曝されたことに係わる失明のよ うな幾つかの種類の失明は、眼の中の光種受体の損失に本質的に関係している。

しかしながら光種受体の破壊は残された網膜や、網膜を脳に連結している軸索の 損失を必然的に導くものではない。

驚くことに成る程度の視覚は、損傷を受けた先爪受体をドナーから採取され且つ また本来の組織体および細胞極性の状態に維持されている先爪受体と置き換える ことで回復できることか見いだされてきた。

第１図は正常なネズミの網膜の低温状態の断面の写真である。第２図は、先爪受 体（外側核）層を破壊するがその他の網膜層や細胞は大部分無傷で残すように一 定の照明を与えた後のネズミの網膜の低温状態の断面の写真である。これらの図 面および続く図面において、網膜もしくはその層、例えば神経細胞層（“Ｇ″） 、内側層状層（“ＩＰＬ″）、内側核層（“ＩＮＬ”）、外側褒状層（“ＯＰＬ ”）、外側核層（“ＯＮＬ”）、内側節（“ＩＳ”）、外側節（“Ｏ８”）およ び網膜色素上皮（“ＲＰＥ”）、かそれぞれ上部から下部へ向かって示されてい る。

第３図を参照すれば、先爪受体を含む移植組織は本発明の方法によってトナーの 内側網膜層５２および先爪受体層５４を含んでなる網膜５０をドナーの眼から除 去することによって準備される。このドナーの網膜５０は、その中心位置付近か らその外縁まで網膜を通る複数の切断線を入れる（第８図を参照されたい）こと によって、平たい状態（第４図）となるようにされる。この切断線は必要ならば これ以外の方向に形成することかできる。

第５図に示されるように、平たくされた網膜５６は先爪受体の１Ｉｆｆ５４を下 側にしてセラチンスラブ５８上に置かれる。このゼラチンスラブは振動装置のブ レードに平行な平面６０を形成するように表面を形成されている。

ゼラチンスラブ５８は振動装置の通常の振動チャックに固定される。溶けた４〜 ５パーセントのゼラチン溶液が隣接する平たい網膜／ゼラチン面の境界面に付着 されて毛細管作用によって平たくされた網膜の下側に吸引されるようにして、平 たくされた網膜がゼラチンスラブ５８の上に浮かび上がるようにされる。過剰の 溶けたゼラチンは速やかに除去され、浮上したこの平たくされた＃ｌ＃は次にこ のゼラチンブロックを取りまく氷のように冷たいリンゲル溶液によってほぼ４℃ まで冷却され、これによって溶けたゼラチンかゲル状となって平たくされた網膜 の下面を被覆して網膜をゼラチンブロックに付着させるようになされる。

第６図に見られるように、内側網膜部分５２が上面がら下方へ向けて先爪受体５ ４に達するまで約２０〜５０ミリミクロンはど切除されて、これにより先爪受体 層を網膜の内側の層、すなわち神経細胞層、内側層状層、内側核層およびその他 の嵌状層、から分離する。先爪受体層に達すると、振動段階が進められて約２０ ０〜３００ミリミクロンの厚さの断面（部分）が第７図に示すように得られる。

この部分のこの厚さは先爪受体をアンダーカットして、先爪受体細胞の層および これに付着したゼラチンで構成された積層体６２を形成するのに十分である。

第８図に示されるように、この積層体６２は点線に沿って垂直に切断されてほぼ 移植寸法を有する移植組織か作られる。この移植組織の表面は約１平方ミリメー トル以上、好ましくは２平方ミリメートル以上、特に好ましくは４平方ミリメー トル以上もしくは実際に操作できるようにてきるだけ大きい面積を存していなけ ればならない。このように構成された移植組織は網膜面のかなりの範囲に対応す ることができる。

ゼラチン基体は損傷しやすい先爪受体層に機械的強度および安定性を与える。こ の結果、平たくされた網膜組織は移植の際に損傷を受けにくく且ついっそう容易 に取り扱えることになる。

ゼラチンはその柔軟性、天然組織に対する毒性のないことか明らかなこと、そし て体温にて分解できること、によって現在のところ基体として好ましいとされて いる。

しかしなからゼラチンの望ましい特性を同様に有しているオウガ−（ａｕｇｅｒ 　）もしくはアガローゼ（ａｇａｒｏｓｅ）のような成分も代用することができ る。重要なこととして、ゼラチンは組織の成長を干渉したり移植組織とその下側 に位置する網膜色素上皮との間に相互作用を生じたりすることか見いだされてい ないのである。

ゼラチンは網膜組織を基体に積層させる接着剤として一般に好まして。しかしな がらコンカナバリンＡ、麦芽アゲルチン、或いは光に露出されてゲル化もしくは 固化するとともにゼラチンの望ましい特性をも育する光反応試剤を含むその他の 成分を代用することができる。

有利なことに、ゼラチンその他の基体はｊＩＡ維芽細胞の成長要素のような栄養 要素、サイクロスポリン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｊｎ　）　Ａのような免疫抑制剤 を含む薬理学上の薬剤、デキサメタシン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ　）のよ うな抗炎症剤、抗脈管形成要素、抗神経膠剤そして抗有糸分裂要素、の多くのも ののためのキャリヤとして付加的に働くことかできる。基体か分解することによ って、これらの要素もしくは薬剤は所要の効果を周囲組織に伝えることができる ようになる。適量は確立されている経験的な技術に基づいて決定されることがで きる。基体は生体減成可能（ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ　）なポリマーを含み 、基体に含まれ得る薬理学的物質のための遅速解放剤として働かせることができ る。

切除された平たい網膜組織および上述したような基体を含んでなる移植組織は単 なる概略であって、ドナーの物質か変化するにつれて変化する。更に、切除が容 易に行えるようになり、振動厚さが網膜の厚さの組織学的測定によって更に較正 され、これにより切除深さにまでの案内が与えられる。適当な切除厚さすなわち 深さは顕微鏡的な試験および断面の観察によって更に決定される。

機械的な、例えばミクロトーム、切除、に代わるものとして、ドナーの網膜は化 学的に切除できる。特に、カイニン酸のような神経毒剤は先爪受体層を除く全て の網膜層の細胞に毒である（すなわちカイニン酸は光摂受体細胞を損傷させない ）ことが知られている。それ故にドナーの網膜が適当な神経毒剤によって処理さ れているならば先爪受体層を分離することかできる。この技術は網膜のミュラー 細胞（カイニン処理によって殺されない）を充積受体細胞と保全できる利点を有 する。ミュラー細胞は充積受体細胞の保全（生体化学的且つ構造的の両方におい て）を助け、ミュラー細胞の充積受体と一緒の分離か有利となる。

望まれるならば、移植組織は付加的に網膜色素上皮細胞を含むことかできる。Ｒ ＰＥが網膜に対して弱く付着しているならば、ドナーの眼から網膜を剥離すると ＲＰＥを網膜から引き離して脈絡膜に取り付いたまま残す。しかしながら、イン ベストオブタルモル　ヴイス、サイ（ｒｎｖｅｓｔ、Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ、Ｖｉ ｓ、Ｓｃｉ、　）　２５　、　１５９９〜１６０９．１９８５年のメイヤーソン 民地に記載されているように、酵素技術を使用して、網膜はドナーの眼からＲＰ Ｅを付けたまま分離することができるのである。

本発明によれば、脈絡膜を含む移植組織が付加的に準備される。このようにする ために、脈絡膜（ＲＰＥか取り付いたままか、離れている）か眼のきよう膜内層 から剥ぎ取られ、半径方向に切断線を入れることによって平たくされる。ドナー の脈絡膜か既に充積受体細胞に関して説明したように次に基体に付着され、およ び／または上述したように準備された先爪受体層と組み合わされて、基体に付着 した先爪受体層、ＲＰＥ層および脈絡膜層を含む積層体か形成されるようになさ れる。

再び図面を参照すれば、本発明の外科用器具の好ましい実施例か示されている。

この外科用器具は充積受体の分離および移植方法に関連して説明される。本発明 の外科用器具および方法は、ドナーの網膜から細胞の無傷のシートを分離して受 容体の網膜に移植するのに殿に使用され、移植された組織層の細胞組織体の保全 を特徴とする。

無傷な平たい細胞構造を眼の中の網膜と支持組織との間に移植するための器具の 第１の実施例は、第９図に全体を符号１．０で示されている。この器具１０はア クリリック材料或いはその他の柔軟で且つ殺菌可能な適当な材料で作ることがで きる。器具１０は平たくされた細胞構造体を保持する細長いプラットフォーム１ １を含んでいる。このプラットフォーム１１は受容体の眼の中に挿入される先端 １６および基端１８を有する。ここに示し且つ説明されるように、プラットフォ ーム１１は約２〜ｌＯセンチメートルの長さで、げつ歯動物や低級霊長類に移植 するのに適した長さである。プラットフォーム１１は眼の中に、網膜と支持組織 との間にて延在するのに十分な長さとされねばならない。従って異なるプラット フォーム長さが使用できるのであり、これは使用される手順および受容体によっ て決まる。ここに示し且つ説明するように、プラットフォームは約２．５ミリメ ートルの幅で、これはげっ歯動物や低級霊長類に移植するのに十分な幅である。

プラットフォーム１１は移植のための無傷な細胞構造体を担持するのに十分な幅 とされねばならず、従って異なるプラットフォーム幅か使用できるのてあり、こ れは受容体によって決まる。

第９図に示されるように、プラットフォーム１１の先端１６における縁部１１ａ は好ましく凸状に湾曲され、器具１０の眼中への挿入、および傷を最小限に抑え て一時的に網膜を剥離するための網膜と支持組織との間における器具の進入、の 両方を容易化する。ブラ・ソトフォーム１１は、先端１６から基端１８へ向かう 長手方向軸線に沿って好ましく凹状（プラットフォーム１１の頂面に対して）に 湾曲されている。このプラットフォームの湾曲は眼中における器具ＩＯの操作、 特に眼の湾曲壁土の網膜と支持組織との間での操作、を容易にする。

プラットフォーム１１は両側にサイトレール１２および１４を有し、プラットフ ォーム上に平たくされた細胞構造体を保持する。第９図に示すように、サイトレ ールの先端部１２ａおよび１４ａはその先端および基端の中間点から先端へ向け てテーパーを灯影されている。サイトレールの先端は緩やかな湾曲部１２ｂおよ び１４ｂｉ二て終端している。これらはプラットフォームの先端１６の近くに位 置する。レールの先端の偏倚は丸められた形状とともに器具の眼中への挿入およ び網膜と支持組織との間の進入を容易化している。図示し説明するように、サイ トレール１２および１４は約１ミリメートルの高さて、基端１２ａおよび１４ａ は約０．５ミリメートルとなるようにテーパーを付されている。サイトレールの 高さはできるだけ低くされる。しかし平たくされた細胞構造体および支持基体の 厚さよりは僅かに高（されねばならず、従ってドナーおよび移植の形式（すなわ ち幾つかの細胞層か移植されるか、そして基体の厚さ）に応じて変化される。

眼中の網膜および支持組織の間に無傷の平たくされた細胞構造体を移植するため の器具の第２の実施例は、第１０図〜第１４図および第１８図に全体を符号３０ て示されている。この器具３０ポリエチレンもしくはその他の適当な柔軟で且つ 殺菌できる材料から作ることかできる。例えば、この器具はシリコーンゴムまた はシラスチックで作られる。器具３０は細長いチューブ３２を含み、このチュー ブは平たい幅広の横断面をしており、頂部３２ａ、平たくされた細胞構造体を支 持する底部３２ｂおよび両側部３２ｃおよび３２ｄを育している。チューブ３２ は眼中に挿入される先端３４および基端３６を有している。チューブ３２の先端 ３４は平たくされた細胞構造体を排出するために開かれている。この第２の実施 例の器具３０は少なくとも１つの点に関しては第１の実施例の器具ｌＯよりも望 ましい。何故ならばチューブ３２が頂部３２ａを存し、これが解放プラットフォ ーム１１よりも移植される平たくされた細胞構造体をいっそう層良好に保護する からである。

ここに示し説明するように、チューブ３２は約３．５センチメートルの長さを育 し、これはげっ菌類動物および低級霊長類に移植するのに適当な長さである。従 ってチューブ３２は眼中へ網膜と支持組織との間にて延在できるだけの十分な長 さとされねばならず、従って別のチューブ長さも使用できる。これは使用される 手順および受容体に応じて決まる。ここに示され説明されるように、チューブは 約２．５センチメートルの幅とされる。これはげっ菌類動物および低級霊長類に 移植するのに適当な幅である。チューブは移植する無傷の細胞構造体を担持する ために十分な幅を有していなければならない。従って、別の幅か使用でき、それ は受容体によって決まる。

示され説明されるように、側部３２ｃおよび３２ｄは約０゜７５ミリメートルの 高さを有する。側部の高さはできるだけ小さく作られねばならない。しかしそれ らは平たくされた細胞構造体および基体の厚さよりも僅かに大きくされねばなら ない。従って、ドナーおよび行われる移植の形式（すなわち幾つの細胞層が移植 されるのか、そして基体の厚さ）に基づいて変化する。

チューブの先８３４は眼中へチューブを挿入することおよび傷を最小に抑えて網 膜と支持組織との間にチューブを進入させることの両方を容易化している。端部 は頂部３２ａから底部３２ｂへと約４５°で傾斜されているのか好ましい。第１ ０図および第１２図に示されるように、チューブ３２の先端は基端へ向けてチュ ーブ（すなわち側部３２ｃから３２ｄへ）を横方向に横断して傾斜しているのか 好ましい。この傾斜角度は約４５°が好ましい。傾斜した先端はまた眼中へのチ ューブの挿入および網膜と支持組織との間でのチューブの進入を容易にしている 。更に、先端を傾斜させたことは組織を損傷しかねない鋭い隅部を解消している のである。

チューブ３２は先端３４から基端３６へと長手方向軸線に沿って凹状に湾曲して 、頂部３２ａか湾曲の内側に位置し、底部３２ｂが湾曲の外側に位置されるよう になされるのか好ましい。頂部のこの湾曲か眼中での器具３０の操作を容易化し 、特に眼の湾曲壁上の網膜と支持組織との間における器具の操作を容易にしてい る。チューブの湾曲半径は手順および受容体によって決まる。

器具３０はまたプランジャ一手段を含む。第１０図〜第１４図に示すように、プ ランジャ一手段はチューブ中にスライド可能に受け入れた平たいプランジャー４ ０とされるのか好ましく、チューブ３２およびプランジャー４０の相対的なスラ イド動作かチューブ中に位置された平たくされた細胞構造体をチューブ先端から 押し出すようにする。プランジャー４０はポリメチルメタクリレートで作られる ことができる。プランジャー４０の基端はチューブ３２の先端から十分な長さだ け突出して、例えチューブの先端か眼中に位置しているときでもプランジャーの 端部が操作できるようになされる。器具３０を外する好ましい方法は、チューブ の先端が網膜下部の面積部分内に位置されたならば、チューブ３２が細胞構造体 を排出するように徐々に引張られる際にプランジャー４０が所定位置に保持され る。

この代わりに、第１８図に示されるように、プランジャ一手段はチューブ内蔵物 に対して流体圧を作用させる手段を含むことができる。この場合、チューブ３２ の基端３６は加圧流体の供給源に接続されているライン４１に接続される。流体 か選択的にライン４１を通してチューブの基端へ供給され、その内蔵物を排出さ せる。この流体は例えば２％カルボキシメチルセルロースのような粘性のもの、 或いは非粘性のものとされることかできる。

特に後者の場合、ゼラチンブロック４３またはその他の物質をチューブ中に存し て、機械的プランジャーとして働くように、或いは移植される細胞構造体から流 体を分離するようにさせるのか望ましい。ゼラチンは半固体であり、チューブか ら排出されても分解して無害なので満足できる。

第１Ｏ図〜第１３図に示されるように、器具３０はルーメン４２を含むのが好ま しい。このルーメンはチューブ３２とほぼ平行に延在される。ここに使用される ようにルーメンは、別個に備えられるか、或いは他の構造部に通路として形成さ れた何れかのチューブ状容器を示す。

ルーメン４２はチューブ３２の両側の一方に取り付けられる。また、側部３２ｃ とされ、チューブの先端かルーメンから離れる方向へ傾斜されるようになされる のか好ましい。ルーメン４２はチューブの先端にほぼ隣接した先端４４を存する 。チューブの先端に対して僅かに前進されるのが好ましい。基端４６は先端から 離れ、加圧された流体の供給源と接続されるコネクター４８を備えることができ る。従ってルーメン４２は先端４４から流体の流れを排出でき、これが器具の前 方に流体空間を形成し、これか器具の前進に際して網膜を支持組織から分離、す なわち剥離する助けをなす。流体は塩溶液、或いは敏感な眼組織を傷つけないそ の他の何れかの流体とされる。

酸化防止剤、抗炎症剤、抗存糸分裂剤および局部麻酔剤のような粘性物質が流体 中に与えられて眼や移植組織の処理を行うようになす。

チューブ３２の傾斜した先端は流体によって開かれた通路を全体的に追従し、従 って器具と眼組織との直接接触は最小限に抑えられる。ルーメンの先端は傾斜さ れて器具の前進を容易にする。特に流体がルーメンから排出されていないときの 前進を容易にする。端部は約４５゜に傾斜されるのが好ましい。勿論別個のルー メンを備える代わりに、ルーメンはチューブ３２の壁部に一体的に形成されるこ とかできる。

器具３０の第１の代替構造が第１５図に符号３０Ａで示されている。このルーメ ン３０Ａは器具３０に非常に似ており、対応する部分は同じ符号で示されている 。しかしながら、器具３０とは相違して、器具３０Ａはルーメン４２とほぼ平行 に延在し且つルーメン４２およびチューブ３２の間に位置された繊維光学フィラ メント６４を含む。この繊維光学フィラメント６４は器具の操作を容易化し、ま た移植組織の適当な位置決めを２つの方法にて容易にする。すなわち光源か繊維 光学フィラメントの先端に備えられてそのフィラメントが移植組織の先端に光を 与え、瞳孔を通しての目視観察を容易にするようになす。これに代えて、レンズ か繊維光学フィラメントの先端に備えられて、フィラメントか器具の先端での直 接観察に使用することかできる。更に、繊維光学フィラメントは網膜下側の出血 を制御するようにレーザー光による焼灼を可能にする。勿論別個の繊維光学フィ ラメント６４を備える代わりに、繊維光学フィラメントはチューブ３２またはル ーメン４２の壁部内に組み込まれることができる。

器具３０の第２の代替構造か第１６図に符号３０Ｂとして示されている。この器 具３０Ｂは器具３０に非常に似ており、対応する部分は同じ符号で示されている 。しかしなから、器具３０とは相違して、器具３０Ｂはルーメン４２とほぼ平行 に延在し且つルーメン４２およびチューブ３２の間に位置されたルーメン６６を 含む。このルーメン６６は器具の端部からの物質の吸入を可能にする。ルーメン ６６の基端は吸入源に接続され、過剰流体および破片を除去するようになされる 。ルーメン６６をチューブ３２の壁部内に組み込むことができる。

器具３０の第３の代替構造か第１７図に符号３０Ｃとして示されている。この器 具３０Ｃは器具３０に非常に似ており、対応する部分は同じ符号で示されている 。しかしながら、器具３０とは相違して、器具３０Ｃは一対のリード線６５を含 む。これらのリード線は先端にて電極６７で終端している。電極６７は血管の焼 灼を可能にする。リード線６５の基端は電源に接続されて破損した血管をシール することかできるようになされる。リード線６５をチューブ３２の壁部内に組み 込むことかできる。

勿論、代替実施例３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃに関する説明した２つまたはそれ 以上の特徴は望まれるならば組み合わされることができる。

充積受体を含む網膜細胞を移植するために、ホストの眼は出血および外科的な傷 を軽減するために準備かなされる。網膜下側の空間へ至る角膜を通る外科的方法 かこのような１つの方法であり、きょう膜や脈絡膜を通るようなその他の外科的 方法も使用できることが理解される。

第１９図のようにげっ書類動物に対する好ましい外科的方法は、角膜７２に十分 な寸法の横断傷７０を形成して、符号１０または３０で概略的に示された外科用 器具の挿入を可能にする。器具１０は第１９図に示すように虹彩の下側を角膜７ ２を通して鋸状縁７４へと前進される。

虹彩は例えば局部麻酔によって広げられていなければならない。器具ＩＯか使用 される場合には、これは網膜下側を前進されて眼の後接に対する網膜下側空間の 中に入る際に網膜を剥離する。

サイトレール１２．１４によって形成された溝および中間の細胞支持プラットフ ォームか、器具１０上に配置されるゼラチン基体に取り付けられて網膜下側空間 の中に案内される先爪受体層５４を含んでなる移植組織のために準備される。鉗 子やその他の適当な器具と一緒に準備されるのが好ましい。先爪受体層を所定の 移植場所に位置決めした後、キャリヤか移動される間ゼラチンは鉗子で所定位置 に保持される。角膜に形成した傷の縁は鉗子を取り外した後に当接され、速やか に無縫合癒着されるようになされる。眼は回復期間は眼帯を当てられねばならな い。

外科用器具３０（第１θ図〜第１４図および第１８図）が器具１０に代えて使用 されるならば、ゼラチン基体６２に取り付けられたドナーの充積受体の無傷なほ ぼ平たくされたシート５４を含んでなる移植組織が細長いチューブ３２の中に吸 入される。器具３０は次に角膜に形成された適当な寸法の傷を通して挿入され、 虹彩の下側を前進される。虹彩は例えば局部麻酔によって広げられていなければ ならない。器具３０はホストの眼の鋸状縁７４へ向けて前進される。器具３０が ルーメン４２を含んでいれば、網膜はルーメン４２から排出された塩水に似た流 体、カルボキシメチルセルロースまたは１〜２％のヒルロニック酸（ｈｙｌｕｒ ｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）のような潅流液の穏やかな力によって剥離される。育利な ことに、この流体は更に酸化防止剤、抗炎症剤、麻酔剤或いはホストの網膜の代 謝要求を遅くする薬剤を追加して含むことができる。

器具３０がルーメン４２を含んでいないならば、網膜はその下側を器具か前進し て眼の後接７６に対する網膜下側空間の中に入る際に外科用器具の壁部によって 剥離される。ゼラチン基体に付着された先爪受体層を含んでなる移植組織は次に チューブ３２を眼から離れる方向へ移動させることで移植される。この間、プラ ンジャー４０は静止状態に保持される。プランジャー４０は眼から注意深く引き 出され、角膜の傷の縁部はこれが取り外された後に当接されて速やかな無縫合癒 着が行えるようになされる。網膜の再結合は速やかに生じ、先爪受体シートは網 膜とその下側の眼組織との間にサンドイッチ状の配置で所定位置に保持される。

この傷は縫合を必要とする。

第２０図は上述した角膜を通る方法の代替例として脈絡膜およびきょう膜を通る 外科的方法を示している。進入箇所を除いてこの外科的方法は上述した概要と本 質的に同じである。それにも拘らずに角膜を通る方法の方が好ましい。何故なら ば出血および外科的な傷が少ないと見いだされたからである。

更に他の外科的方法は出血を軽減するために平坦部領域（ｐａｒｓ　ｐｌａｎｎ ａ　ａｒｅａ）にてシアチルミーを行うものである。きょう膜は次に切開され、 脈絡膜および上皮組織がシアチルミー処置される。外科的器具が次にこの切開箇 所を通して挿入され、網膜が鋸状縁の位置で切り取られ（ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ　 ）て移植組織がこのどこかに概要を説明されているように網膜下側に位置決めさ れる。

更に他の外科的方法において、上述にて概要を説明した平坦部領域を通して進入 され、切開は網膜マキュール斑に近い網膜にて行われる。外科的器具は次にこの 網膜切開箇所を通してマキュール斑へ挿入される。

にビガミ民地によって開示され、またマツニーネル民地のプレイン　リサ　（Ｂ ｒａｉｎ　Ｒｅｓ、）　、２４１　：　３６２〜３６５（１９８２）に開示され たような成人の中央神経系統とは相違して、神経膠傷痕の形成を必ずしも受けな い、ということが知られている。

マツニーネル民地は、傷痕組織のないという特徴は網膜細胞が眼の切断された軸 索か再成長する潜在能力に貢献すると示唆している。

本発明によれば、単摂受体の軸索の再成長は隣接する外側叢状層内に先爪受体の 神経筋連接後部の標的を近接させることによって容易化されることか認識された 。更に、実質的に介在する神経すなわち神経膠傷痕を横断する成長は、移植され た先爪受体に対して神経の連結を含む受容体の網膜との適当な連結を作ることを 必要としない。

以下の例は本発明を示している。

例　１ にオスターン氏が記載しているように、平均１９００ルツクスの一定照明に２〜 ４週間にわたり曝された。第１図に示すようにこの露光は大半の先爪受体を破壊 し、外側核層の細胞を殺した。しかし網膜神経は無傷で残した。

移植のための先爪受体か同じ血統の生後８日の正常ネズミから取られた。このネ ズミは１２時間／１２時間の明／暗サイクルで群体室に保持されていた。実験動 物はケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）およびベンドパルビタルナトリウムによって 麻酔された。デクサメタゾン（ＩＯｍｇ／ｋｇｒＰ）の術前服用も実施された。

先爪受体の準備 麻酔された生後８日のネズミから網膜か取り出され、半径方向に切断線を入れて 平たくされ、供受側を下にしてゼラチンスラブ上に置かれた。このゼラチンスラ ブは振動チャックに固定された。溶けたゼラチン（４〜５％溶液）か網膜／ゼラ チンの境界面にて網膜に隣接させて付着され、次に氷のように冷たいリンゲル溶 液で４°Ｃにまで冷却された。網膜は先爪受体層に達するまで約２０〜５０ミク ロン切除された。先爪受体層に達したとき、段階か進行されて厚い（２００〜３ ００μｍ）の部分か取り出され、ゼラチンベースに固定されたこの先爪受体のア ンダーカットか行われた。

ｄｉｌラヘル付は 分離された外側核層は、９５％１５％の酸素／炭素の二酸化物混合物の下で室温 にて培養された１０％の胎児牛血清を含むアートのＭＥＭの中に４０μｇ／ｍｌ のｄｉｒ（１，１’−ディオクタデシル−３，３，３’。

３′−テトラメチルインドカルボンアニン過塩素酸塩）を加えて一晩培養された 。ラベル付は技術および蛍光顕微鏡技術はホーニツタ民地によってジエー　セル 　ノくイオル　（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　Ｉ　０３　：　Ｉ　７．１９８ ６に概略を説明されている。ｄｉｒは従来のアセトン中での洗浄に先立ってＦＩ ＴＣラベル付けされたＲＥＴ−Ｐ　Ｉオプシン抗体で染色（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔ ａｉｎ）されるべき部分から取り除かれた。

外科手順 ２．５ｍｍ幅て０．５ｍｍ高さのサイトレールを育する外科用器具ＩＯ１または 外科用器具３０の挿入を可能にするために、横断切開か角膜に施された。器具は 虹彩（局所麻酔によって広げられている）の下側を鋸状縁の位置まで前進されて 網膜を剥離した。このキャリヤは次に網膜の下側を眼の後接に対する網膜下側空 間内に前進された。この器具はセラチン基体（２，５Ｘ４ｍｍまで）に取り付け られた先爪受体層の小片を含んでなる移植組織を微細な鉗子によって網膜空間の 中に案内することか可能であった。この器具は次に取り出され、ゼラチンは鉗子 によって所定位置に保持された。鉗子の取出しに続いて、角膜の切開箇所の縁部 か当接されて、速やかな無縫合癒着を可能にした。眼は回復期間は眼帯をされ、 ペニシリンの予防投与か施された。眼帯を取り去って眼の抗生軟膏か塗布された 。

移植受容体は１２時間／１２時間の明／暗サイクルに基づいて５０ルツクスの平 均明度で保持された。適当な回復期間の後、この動物はベントバービタールを過 剰投与され、フォスフェートで緩衝された３％パラフォルムアルデヒド−２％グ ルチルアルデヒド溶液を心臓を通して潅流された。失明眼（対照）および先爪受 体移植を受けた眼の両方の低温状態の部分か次に切断（２０μｍ）オプシンに関 する抗体ラベル付けか３％パラフォルムアルデヒドで固定された網膜に施され、 ２０μｍに低温切断された。免疫組織化学方法はヒックス民地のジエー。

ヒストケム　シトケム（Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ）　３５　 ：１．３１７（＋９８７）に記載されている。主抗体の排除は特にオプシンに関 する特別なラベル付けを排除した。

低温切断 低温切断は移植後４週間たった時点で作られた。第２２図はホストの眼のＢａｒ ＝０．５ｍｍ０後極における先爪受体移植位置を示す低倍率の顕微鏡写真である 。第２３図は移植組織とその隣接する外側核層のない網膜との境界面を示す高倍 率のの顕微鏡写真である。矢印は移植組織（Ｔ）を示している。矢印頭部は一定 照明で生き残った３つの可能な残留光摂受体を示している。丸い形状に比べて紡 鍾形は移植された先部受体のより正常な形状であることに注目されたい。Ｈ＆Ｂ 染料。Ｂａｒ＝１００μｍ０第２４図は第２３図に示した箇所に隣接する断面に おけるオプシンに関する抗体Ｒｅｔ　Ｐ＝ｌのＦＩＴＣ蛍光による顕微鏡写真で ある。矢印は移植範囲を示している。移植細胞はオプシンに関してラベル付けさ れて先部受体であることを示している。成る特別でない蛍光か移植組織に明らか に隣接している。Ｂａｒ＝１００μｍである。

移植後３週間で作られた低温状態の断面か第２５Ａ図〜第２５Ｃ図に示されてい る。第２５Ａ図はＨ＆Ｂ染料による移植組織およびホストの網膜の顕微鏡写真で ある。

ホストの網膜と移植組織との間に介在した外側叢状層に似た細胞−疎らな層に注 目されたい。第２５８［ｆｆｌはｄｉｌ蛍光による隣接断面の顕微鏡写真である 。移植された先部受体はｄｉｌ蛍光を示しており、これはトナーの組織と同しで ある。第２５Ｃ図は第２５Ａ図に示された断面に隣接する断面における抗体Ｒｅ ｔ　Ｐ＝ｌのＦＴＴＣ蛍光による顕微鏡写真である。移植細胞はオプシンに関し てラベル付けされており、それらか先部受体でであることを示している。Ｂａ　 ｒ＝５０μｍ０角膜を通る方法を使用すれば、眼のホストの網膜と隣接する上皮 層および脈絡膜層との間に先爪受体層を位置決めすることは脈管損傷およびこれ に続く眼中への出血を最小限に抑えて達成できることか見いだされた。更に、こ の方法は網膜とＲＰＥとの間に移植された先部受体を介在させて眼の後部に再結 合される網膜の一体性を破壊するようには見えないことが見いだされた。第２１ 図〜第２４図に示されるように、網膜再結合は移植中央部分にて容易化されるよ うに見られる。（“Ｔ”は先爪受体細胞の移植されたシートを示す）。この挿入 方法を使用して、網膜の後接に先部受体を位置決めすることが可能となった（第 ２２図）。

移植された先部受体の活力を決定するために、失明した眼（対照）および先部受 体の移植組織を受容した移植後２．４または６週間後の眼の両方から低温状態の 断面（２０μｍ）が作られた。全てのテストで移植後生存している先部受体か見 いだされた（５４移植組織中３６）。

最も多くの場合において、生存している先部受体の寸法は移植時における寸法に 近いものである。更に重要なことは、長い生存期間にわたって移植寸法に明確な 減少がなかったことであり、これは移植か安定していることを示唆している。

対照として先爪受体移植を受容しなかった対側の眼が試験された。これらの眼で は網膜は外側叢状層とＲＰＥとに隣接して位置した極めて小数の残留光摂受体を 保有していた。しかしながらこれらの残留細胞は外観か異常であり、正常の先部 受体の丸い細胞形状のかわりに平たくなった萎縮した細胞を有していた。更に、 残留光摂受体は柱状に積み重なった細胞体部で構成された外側核層を形成してお らず、このかわりに分離状態で、或いは、網膜周縁に主として位置されている単 重もしくは二重の細胞層（第２３図を参照されたい）として、そのほとんどか見 られた。

移植された細胞は多くパラメーターによって残留光摂受体から容易に識別できた 。まず第１にこれらは個々の斑点（バッチ）の中に見いだされ、約１２個の細胞 までの特徴的な柱状の積み重なり配列を存していた。これは正常網膜の外側核層 における先爪受体細胞の特徴である。

これらは残留した元々の先部受体の平たくされた外観を存しておらず、このかわ りに丸く、正常な移植された細胞の典型的な萎縮していない細胞体部を育してい た。更に、移植された先部受体は移植された培養された網膜の特徴である菊座形 状を形成する一方、これに対して残留光摂受体はこのような形状か見られなかっ た。

外科的方法か何等かの理由で元々の先部受体の変性を生み出す可能性を排除する ために、虚偽の手術か行われた。全ての手順は挿入されたゼラチンスラブに先部 受体が取り付けられていない点を除いて先爪受体移植と同じに行われた。網膜は 眼の後部に再結合された。何れの場合も先部受体の斑点（バッチ）は見いだされ なかった。

実験動物に於ける先部受体の斑点を移植組織として積極的に識別するために、ド ナーの外側核層は蛍光マーカーｄｉｌによって移植の前にラベル付けか行われた 。第２５Ｂ図に示されるように、先部受体の斑点は蛍光によりラベル付けされる 一方、ホストの網膜はｄｉｌ蛍光を示さなかった。

先部受体によって構成された移植組織を確認するために、特にオプシンに関して モノクローン（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）の抗体であるＲＥＴ−ＰＩか使用された 。先部受体にのみオプシンか見いだされるときは、オプシンに関するラベル付け を示す何れかの細胞があり、それ故に先部受体として識別できる。第２４図およ び第２５Ｃ図に見られるように、移植細胞の染色はオプシンに関して強烈であり 、これに反して他の網膜細胞は染色されていない。オプシンに関する積極的な染 色はこれらの細胞を先部受体として識別するだけでなく、これらの細胞が依然と して可視色素のプロティン成分を製造できることを示している。移植組織領域に 隣接した網膜は僅かな数の独立した先爪受体細胞体部（第２３図）のみを示し、 これらの先爪受体細胞体部はオプシンに関して染色されていない（第２４図）。

このことはこれらが円錐体であることを示唆している。オプシン染色のなされて いないことはＨ＆Ｅ−染色物質における位置および外観と同様に、これらのセル かホストの残留光摂受体であることを確証する（第２３図）。

新生児の網膜から先爪受体層を採取することは組織の組織化（編成）を崩すとは 見られない。一度移植されたならば、試験された生存期間の全てに対して先爪受 体層はその細胞体部の特徴的な柱状の配置を維持し、従ってホストの網膜の中に 新たな外側核層を形成した。幾つかの場合においては、厳密な極性が失われ、菊 座形成された。低倍率の顕微鏡検査によれば、新たな層かホストの外側叢状層に 付着したのが見られた（第２２図および第２５Ａ図）。この層は通常は充積受体 と網膜との間の神経筋連接側の位置である。

例　２ 例１の手順が説明するような相違を除いて繰り返された。スブラガー・ダウレイ のネズミに代えてｒｄマウスおよびＲＣＳマウスが使用された。これらのマウス は遺伝した網膜変性を病んでいる。ｒｄマウスにおいて欠損は充積受体にあると 考えられており、これに対してＲＣＳマウスでは欠損は色素上皮にあると考えら れている。これらの動物において殆ど全ての充積受体は排除され、残る網膜は保 存されている。ｒｄマウスもＲＳＣマウスも例１に説明したように一定の照明を 与えて失明したのではない。ｒｄマウスおよびＲ３Ｃマウスはそれぞれ未成体（ 生後７〜８非のマウスすなわちネズミ）および成体マウスの充積受体を受容した 。

ｒｄマウス 移植技術は小さなサイズのマウスに応用された。この改良は、無傷の外側核層の シートかマウスの眼の網膜下側空間に移植できるようにした。新生マウス（生後 ８日）の充積受体かｒｄ対照マウスから成体マウスの網膜下側空間に移植された 。生存期間は約２週間から３力月であった。生存期間の全ての時点において、移 植された生存する充積受体はホストの網膜の外側部分に物理的に取り付き、また オプシンに関して積極的に染色されるのか見いだされた。更に、この補すしの網 膜は色素上皮に再結合するようになった。

ｒｄマウスにおいて殆ど全ての充積受体か２１日で排除された。異常でない同類 （ｃｏｎｇｅｎｉｃ）の対照マウスからの充積受体か、充積受体の欠損した成体 ｒｄマウスの眼の中の適当位置に移植できることか見いだされた。これらの移植 された充積受体はテスト期間（３力月）にわたって生存するのが見いだされた。

この期間の長さは、ｒｄマウスの充積受体が約２週間後に変性を生じる兆候を示 し、また３週間後に大半が完全に排除されるということから、十分である。同類 の正常ドナーからｒｄマウスの中で成体ｒｄマウスへ移植された充積受体が生存 していることは、充積受体の変性を生じたｒｄマウスにおける欠損がｒｄ光摂受 体それ自体の内因によることを示す発見を支えた。

Ｒ３Ｃネズミ 生後７〜８日のＲ３Ｃ対照から得た充積受体は成体（３力月）のＲ３，Ｃネズミ の眼の中の網膜下側空間に移植された。２力月に及ぶ生存期間は、この期間内に 殆と全ての充積受体がＲ３Ｃネズミにおいて変性することを許容した。移植され た充積受体はＲ３Ｃネズミの網膜下側空間に対する移植にて生存し、正常な充積 受体の免疫学的特徴と同様に組織の典型（ｈｉｓｔｏｔｙｐｉｃ）を示すことが 、見いだされた。更に、移植された充積受体はＲＳＣネズネズ同じ位置にて生存 し、これに対してＲ３Ｃ自体の充積受体はそうでなかった。

結果 移植された充積受体は生存し、オプシンを製造し、そして受容体の網膜と明らか に一体化することか見し）だされた一方、それらは完全に正常であるとは見られ ず、外側節の数は減少した。しかしながら、外側節に欠乏する充積受体は依然と してブ民地の、ジエー、ネオロサイ。

（Ｊ、Ｎｅｏｒｏｓｃｉ、　）　４　：　１５５９〜１５７６．１９８４に示さ れたような光変換（ｐｈｏｔｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏ口）ができるのである。

外側節の相対的な欠損はまた視蓋に移植された網膜において注目されている。こ れらの網膜はシモン民地の、ツク、ネオロサイ、アブストラ、（Ｓｏｃ。

Ｎｅｏｒｏｓｃｉ、Ａｂｓｔｒ、　＞　１０　：　６６８、（１９８４）ｌこ指 摘されているように機能することが示された。

従来の推論は、観察された外側節における欠乏がラベイル民地の上述した（１９ ７１）に指摘されたように充積受体に対するＲＰＥの適当な並置（ａｐｐｏｓｉ ｔｉｏｎ）の不足の結果となる可能性があることに帰するのである。しかしなか ら、ＲＰＥは存在し、充積受体に対して明らかに正常に並置状態にあることが見 いだされたのてあり、従って外側節の不足かここでは充積受体とＲＰＥとの間の 不適当な接触に関するとは見られないのである。

ＲＰＥに対する充積受体の並置の存在において外側節の成長か失敗することは、 アンダーソン民地の、インベスト、オフタルモル、ヴイス　サイ、（Ｉｎｖｅｓ ｔ、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、Ｖｉｓ、Ｓｃｉ、）　２　４　：　９　０　６　〜 ９　２　６　、　１９ｇ３に報告されたように引き続く網膜の再結合にも見られ る。

例　３ 例１の手順が説明箇所を除いて繰り返された。

ドナーの充積受体か初期の固体発生時期に本来的に採取された。これにおいて充 積受体は網膜（生後７〜８成熟の未分化の神経組織はより成体となった分化され た組織よりも良好に移植生存できると一般に信じられているからである。充積受 体の生存に対する成長年齢の影響およびホストの網膜との一体化の可能性を決定 するために、充積受体は次に生後８．９．１２．１５および３０日のネズミから 光の損傷を受けた成体へと移植された。

これらは成体の外側節（生後１５および３０日における）を含む充積受体の徐々 の発育および成体化を示す。

例１におけるのと同じ基準を使用して、テストされた全ての年齢に関して移植組 織は試験期間（２力月）にわたって生存し、ホストの網膜と一体化した。第２６ 図のパネルＡは光の損傷を受けた成体ホストに対して成長した充積受体（生後３ ０日のドナー）を移植した写真である。（Ｔは移植を示す）。１２０倍である。

これらの観察によれば、充積受体が他の神経組織とは異なる特徴を有し、それら が本質的に成体である場合に移植できるようになす一方、他の神経組織は移植の 成功を得るためには非常な未熟期にて移植されねばならない、ということが示唆 される。

例　４ 例１の手順が説明箇所を除いて繰り返された。充積受体は提供された人間の眼（ ＭＯライオンズおよびセント・ルイス・アイ・バンクから得られた）の網膜から 取り出され、次に角膜が除去された。網膜の一部はトリパン・ブルーおよびダイ ダンツル・シスタイン染色による染料排除によって活力を調査された。充積受体 は染料を排除し、良好な状態にあるように見えた。ホストは成体のアルビーノネ ズミ（シクロスポリンＡで免疫を抑制されるか、または免疫能力のある）であり 、一定の照明に曝された。

免疫抑制によって成功した移植組織（ｌおよび２週間、９例のうち５例）はこれ までテストされた生存期間の全てにおいて、ホストの網膜およとの物理的な明か な一体化、および第２６Ｂ図に示すように外側核層の形態学上の特徴の保持を示 すように見えた。第２８Ｂ図は人間の成人ドナーから充積受体を成人の光による 損傷のあるネズミのホストへの移植を示す。（Ｔは移植組織である）。

１２０倍である。

移植組織はアンティオスビン抗体ＲＰＥ−Ｐ　１に対して積極的に染色され、そ の移植された細胞を充積受体として識別し、また更にそれらか依然として視覚色 素を作り出すことができることを示した。対比として、免疫能力のあるホストに 対する移植は、移植の１週間以内に拒絶の兆候を示した。虚偽の手術を受けた動 物は充積受体を存するホストの網膜の再集団化をまったく示さなかった。

例　５ 例１の手順か説明箇所を除いて繰り返された。

ソコロフ民地、シュユニ二二一口ケム、（Ｊ。

Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、）　２８　：　８９７〜９１６　（１９７７）によって開 発された２ＤＧの機能的なマツピング技術は、与えられた刺激状態に係わる神経 の活動度の相対レベルの測定を可能にする。この理由のために、この２ＤＧ技術 は、移植組織の機能的特徴の査定および光の損傷を受けた網膜を活性化させる能 力を査定する適当な方法であるとみなされた。

従って、正常な網膜における２ＤＧの吸収（ｕｐｔａｋｅ）のパターンか光の損 傷を受けた網膜に見られるパターンと比較された。網膜は充積受体の移植組織を 存するものおよび有さないものとされた。これらの比較は２つの異なる視覚の刺 激状態、すなわち１）暗、そして２）１０Ｈｚでのストロボフリッカ−１を使用 して行われた。第２７図はこれらの比較の結果を示している。Ｈ＆Ｅは網膜を対 応する２−デオキシグルコース自動放射線写真で染色した。ＡおよびＢは正常の 網膜である。断面は網膜層を広げるために僅かに接線方向へ切断された。Ｃは異 常（光の損傷）な網膜と充積受体との移植組織（Ｔ）であり、矢印の左側である 。２ＤＧの自動放射線写真ブラケット上の左側に位置されている黒白ラインは内 側叢状層および神経細胞層における２ＤＣの吸収を低下させている。Ｄは異常な 網膜と充積受体との移植組織であり、矢印の左側である。（ＯＮＬ）は外側核層 、（Ｔ）は移植組織、ＤＹＳＴは異常、Ｂａｒ＝０．５ｍｍである。

第２７Ａ図のパネルに示されるように、暗において２ＤＧは正常な網膜（充積受 体および恐らく内側核層）の外側部分に吸収されるのが好ましい。第２７Ｂ図の パネルに示されるように、ストロボフリッカ−の刺激によって２ＤＧの吸収は正 常な網膜の厚さを通して延長される。２ＤＣの吸収のこのパターンは網膜の知ら れている生理学的特徴と良好に調和する。

外側網膜は暗において高い２ＤＧの吸収を示すと予測される。何故ならば充積受 体の水平且つ幾らか２極となされた細胞かこの状況の下で最大限に分極されるか らである。ストロボフリッカ−が無軸索および網膜神経節細胞を含む網膜に対し て強力な刺激であるならば、網膜全体を横断する２ＤＧの吸収もまた予測される 。それ故に正常な網膜における２ＤＧ吸収パターンは神経の活動度もしくは神経 の分極の相対的な度合いを反映する。それ故に神経系統の他の部分にあるときに 網膜の神経の活動度の可動な指針となる。

充積受体の移植組織を受け取った光損傷された網膜において、２ＤＧ吸収のパタ ーンはまた刺激の状態に応して変化する。暗においては、２ＤＧの好ましい吸収 は充積受体の移植組織および隣接のホストの内側核層に対して制限される一方、 比較的低い吸収はホストの内側叢状層および神経節細胞層に存在する。しかしな がらストロボフリッカ−の状況の下では、高い２ＤＧの吸収が移植組織に存在し 、更にホストの網膜の厚さを通して広がる。

しかし、充積受体の移植組織の面積部分内においてのみである（第２７Ｄ図）。

充積受体の移植組織を受け取らないホストの隣接網膜は比較的低い２ＤＧの吸収 を示している。

暗において、正常な網膜と充積受体の移植組織を受け取る光損傷した網膜との両 方は充積受体および内側核層において比較的高い２ＤＧの吸収を示す。これらの 場合の間における相対的な吸収パターンの類似性は、移植された充積受体か正常 な充積受体と同じ機能的な特徴を存することになるであろうと示唆する（すなわ ち、それらは暗において分極し、ホストの内側核層において幾つかの細胞の持続 した分極を含むことができる）。

ストロボフリツカ−において、充積受体の移植組織を受け取る光損傷した網膜は 、同じ刺激状態の下で正常な網膜に見られるのとたいへんよく似て網膜の全厚さ を通じて高い２ＤＧの吸収を示す。充積受体の移植組織を受け取らなかった隣接 の光損傷網膜は比較的低い２ＤＧ吸収を示した。これらの比較は、充積受体の移 植組織を受け取ったホストの網膜の面積部分のみにおける正常な網膜に見られる のとほぼ同じ光損傷網膜での２ＤＧ吸収のパターンを示す。ホストの網膜の隣接 面積部分は何れの刺激状態においても比較的低い２ＤＧ吸収を示す。何れの刺激 状態において光損傷網膜か受ける充積受体の移植組織と正常な網膜との間の２Ｄ Ｇの吸収パターンにおける類似性は、充積受体の移植組織か光損傷網膜の光に応 答する活動を可能にする。

例　６ 例１の手順が説明箇所を除いて繰り返された。

移植された充積受体によるホストの網膜の活動かデオキシグルコースによって見 られたが、この活動の特性のマツピングは明確ではなかった。特に、このような 活動は移植された充積受体によって解放された神経トランスミツターの非神経筋 変調を与えるのか、或いは移植それた細胞はホストの網膜の要素とともに神経筋 連接を形成するのであろうか。

この問題を処理するために、再構成された網膜のウルトラ構造か調査された。適 当な生存期間の後、動物は過剰投与によって安楽死させ、直ちに摘出か行われた 。対照および実験用の眼か光学顕微鏡検査のために一晩ボウィン溶液中に固定さ れた。脱水および洗浄の後、この組織はパラフィン中に埋め込まれた。回転マイ クロドーム上で部片に切断された。プラスチックエンベットメントのために予定 された眼は緩衝された２、５％グルタ−アルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙ ｄｅ）の中に２時間にわたって固定された。アゾハイド（ａｄｅｈｙｄｅ　）固 定の１／２時間経過後、前眼部および水晶体か除去され、固定液の浸透を容易に させた。初期固定に続いて、光学顕微鏡検査のために眼はメタクリル酸エステル の包埋処理を更に施された。ガラス“ラルファ″　（Ｒａｌｐｈ　）ナイフを使 用して２〜５μｍの部片か回転マイクロドーム上で切断された。

ウルトラ構造の解析のために眼においては、移植組織を受け取った面積部分はｄ ｉｌラベルを使用して位置を定められ、過剰組織はオスミウムのポストフイクセ ーシコンに先だって調整された。脱水且つ洗浄後、この組織はエポン／アラルダ イト（εｐａｎ／Ａｒａｌｄｉｔｅ　）　（モーレンツ＼ウワー、１９６４）に 包埋された。ブロックがトルイダイン・ブルー（ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ　ｂｌｕｅ ）によって中間厚さの部分を染色して探査された。移植組織が存在すると、この 厚い部片は切断され、ウラニル（ｕｒａｎｕｌ）アセテートおよびリート・シト レート（ｃｉｔｒａｔｅ　）によってＥＭ上絵で試験のために染色された。

新しい外側叢状層か移植された（ＯＮＬ）およびホストの外側核層の境界面にて 視認できた。リボン神経筋力＼この（ＯＰＬ）の中で明白であった。この神経筋 は口・ノド光摂受体によって形成されたこれらを特徴とし、電子密集リボンか小 胞集団によって取り囲まれていた。ＩＪホン神経筋は対照の光損傷網膜ではほん の希にし力・み（、ｚたされなかった。リボン神経筋に加えて、移植された充積 受体はまた繊毛に連結した内側節および外側節膜を表していた。これらの結果は 移植された充積受体とホスト細胞との間の神経筋の連結は作られており、光応答 （こよる活動が少なくとも部分的に神経筋連接によって伝えて０ることを示唆し ている。

例　７ 例１の手順が説明箇所を除いて繰り返された。

移植された充積受体および再構成された網膜の機能的な能力は、視覚的に引き起 こされた皮質性の電位（“ＶＥＰ”）を記録することで確認できる。ＶＥＰを記 録するために、動物がステンレススチールのスクリュー電極を頭蓋内に包埋され る。実際の電極はラムダ（二対して前方２ｍｍに配置された（両側方向）。また 、前項に対して前方に配置された第２の電極が参照された。りほの電極は中央線 に対して２ｍｍ横方向に配置され、硬膜上に位置決めされた。第３のスクリュー か鼻腔上方（こ配置されて接地電極として働くようになされた。

ＶＥＰの応答は、グラスＰＳ−２光刺激装置によって発生されたストロボフラッ シュ試験の刺激によって引き出された。この光刺激装置は一方の眼へ照射し、他 方の眼は眼帯で覆われていた。反応は差分を増幅され（グラスＰ−１５Ｄブリー ム）、チクトロニック＃５６４オシロスコープに表示され、そして次にマツキン トラシュＩ［ｘコンピューターによってラブヴイユー（ＬａｂＶｉｅｗ　）を使 用して平均された。

再構成された網膜は湾曲した視覚皮質における光誘導電気応答を生しることかで き、これに対して再構成されていない同類の眼は同じ光の刺激に対して殆どもし くはまったく応答を示さないことか見いだされた。

例　８ 例１の手順が説明箇所を除いて繰り返された。

神経活動が充積受体の移植組織および再構成された網膜によって中央神経系統に 発生されたことが指示されると、この神経活動は中央神経系統によって適当に処 理されて、感覚的刺激に反応する適当な行動の応答を生み出すかという疑問が生 じてくる。既に学んだことが、脳に対する神経の移植か適当な行動活動性を回復 でることを示した（ブジョークランド民地、ニューラル　グラフティング　イン 　ザ　ママリアン　カンス、エルスエヴイール、アムステルダム、（Ｎｅｕｒａ ｌ　Ｇｒａｆｔｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅＮａｍｍａｌｉａｎ　ＣＮＳ、Ｅｌｓｅｖ ｉｅｒ、Ａｍｕｓｔｅｒｄａｍ　）　１９８５　）　ｏクララセン氏およびラン ド氏のブロック、ナトル、チカド。

”ｊ−イ、　ニーニスｘ　−（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ）　８４　：６９５８〜６９６０．１９８７およびエクスブ、ニュ−ロル、（Ｅ ｘｐ、Ｎｅｕｒｏｌ、　）　１０２　：　１０２〜Ｉ０８．１９８８は、胎児の 脳の頭蓋内移植によって伝えられた瞳孔の反射を神経移植組織が復元できること か示されており、これにより感覚組織を含んでなる神経移植は感覚的刺激に対す る適当な行動応答を伝えることのできることが示されるのである。

異常網膜を有するネズミが例１に説明したように充積受体の移植組織を受け入れ た。さまざまな外科処理後の時間間隔（例えば、４および８週間、その他）にお いて、動物は麻酔をかけられて走置性装置（５ｔｅｒｅｏｔａｘｉｃｄｅｖｉｃ ｅ）に保持された。赤外線ビデオカメラか使用される顕微鏡を通して眼に焦点を 合わされ、眼は赤外線を照射される。瞳孔反射のテストのために、使用される顕 微鏡の中のカメラシャッターによって光ビームか制御される。この光は眼の上に 焦点を合わされる。段階付けした強度（光の強度は中立密度フィルターによって 制御された）の光に対する瞳孔反応かビデオカメラによって記録された。このカ メラはフレームグラバ−装置（ｆ　ｌａｍｅｇｌａｂｂｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ）に 連結されていた。瞳孔反射は次に自動画像処理ソフトウェア−（アルテイメージ 、ＧＴＦＳ。

インコーホレーテッド）を使用して解析された。

充積受体の移植組織によって再構成された網膜は実際に光に対して比較的正常な 瞳孔反射（瞳孔緊縮）を示し、これに対して同種の異常のある眼は形態において 変形した最小限の反射（瞳孔拡張）しか示さないことが見いだされた。この結果 は第２８図に示されている。パネルａおよびｂは再構成された網膜である。パネ ルａは光が当たったときの虹彩を示し、これに対してパネルｂは光か当たった後 に５秒経過した時点の同じ眼を示している。

パネルａとパネルｂとの比較により、光によって反応される正常な瞳孔の構造か 示される。パルスＣおよびパネルｄは失明した同種の眼を示し、これらは虚偽の 外科手術を受けており、パネルＣにより光か当たった虹彩を、またパネルｄによ りその後５秒経過した虹彩を示している。パネルＣおよびパネルｄの比較により 、光によって瞳孔が拡張するのか示される。この反応は形態的に変形しており、 充積受体の網膜異常の形式に対して個々に厳しく影響を受けることを特徴とする 。

これらの結果は神経移植がホスト自身の感覚末端器官、この場合には眼であるが 、を再構成できることを示し、これにより感覚的刺激に対して適当な行動応答（ すなわち瞳孔反射）を回復させることを示している。これらの結果は充積受体の 移植によって視覚の回復ができるということに関して十分に意味深いのである。

例　９ 例１の手順が説明箇所を除いて繰り返された。

充積受体は成体の赤毛猿（他の研究で犠牲になった）の網膜、もしくは提供者の 人間の眼の網膜（セントルイスアイバンクから得た）から、無傷な外側核層を分 離するために平たくされて取り付けられたビブラトーム部分を使用して採取され た。ホストは成体の赤毛猿であり、ヨードアセチック酸（３０ｍｇ／ｋｇ、連続 ３日与えられた）で処理された。これはホストの網膜のマキュラー斑でない面積 部分の充積受体を選択的に排除する一方、残りの網膜は無傷に残す。この処理は 中央視覚を含まず、それ故に行動および生理学的に重要な機能（例えば食物や水 を置くこと、視覚で案内される歩行、ブルーミング、サー力ディアン（ｃｉｒｃ ａｄｉａｎ　）リズムの持続）に関して必要な視野は維持される。

分離された外側核層は移植され、これに続いて網膜下側空間に対してきよう膜を 通る進入方法を使用して平坦部分（ｐａｒｓ　ｐｌａｎａ、）のヴイトレクトミ ー（ｖｉｔｒｅｃｔｏｍｙ）（標準的な外科技術）か施される。充積受体は病巣 のある網膜の下側に挿入され、網膜下側に小胞を形成して導入されることでこれ を剥離する。小胞は眼にバランスされたの塩溶液を射出して作られる。再構成さ れた網膜は粉砕錆眼の後部に対して流体的に栓塞されて固定される。

移植された充積受体は網膜とその下側の色素じひとの間に介在サレル。シクロス ポリンＡおよびデキサメタシンの毎日の注入が何れかの移植拒絶を抑制するため に行われる。

人間の充積受体が人間以外の霊長類の眼に移植されてテストの間（２週間）生存 することが見いだされた。これらの結果は成人の人間の充積受体が人間以外の霊 長類の眼に移植できることを示している。人間でない霊長類の眼は人間の眼と殆 ど同じであるから、人間の充積受体が人間の眼に次々と移植されることか期待さ れる。

上述の説明から、この分野に熟知した者には、本発明の全ての概念が実現てきる ことが明白となろう。本発明は改良した外科用器具を提供するのであって、この 器具は充積受体の移植に際して細胞構造体を与えるようなされている。本発明の 外科用器具によれば細胞構造体は、充積受体、ＲＰＥおよび脈絡膜の移植に際し て維持され、移植された組織、はすとの眼および網膜に対する損傷を最小限にす る。網膜の再結合およびこれによる再構成された網膜の実質的に正常な機能は、 移植の観点から、容易に行われることになることが確信される。本発明は改良さ れた外科用器具を提供する。この器具は、比較的大きな広がりのＲＰＥ、脈絡膜 および充積受体の混合体もしくは柱状体が網膜下側空間の中に移植されるように なす。充積受体、ＲＰＥおよび脈絡膜の正常な層状構造の維持がこれらの組織の 眼の中の適当な位置に移植できるようにしている。従って移植された充積受体、 ＲＰＥおよび脈絡膜が失明した網膜と一体化することは、失明した網膜の再構成 を容易にする。本発明は改良した外科用器具を提供する。この器具は適当な網膜 の位置決めを可能にする。本発明は改良した外科用器具を提供する。この器具は それが眼の中に位置されている間に充積受体を損傷から保護する。本発明は充積 受体または網膜色素上皮の分離固相移植方法を提供する。この方法は、外側核層 の正常な組織化およびその他の組織の組織化を広く可能に維持する。本発明は細 胞および組織の分離方法を提供する。この方法により、細胞は細胞間の組織化を 崩さずに分離されることができる。本発明の方法によれば、網膜の充積受体のよ うな網膜細胞は、外側核層や、網膜、ＲＰＥおよび脈絡膜の外側層の細胞間の組 織化を破壊せずに分離することができる。

移植された細胞の多くの特徴は、それらか生存して維持し続け、光変換に重要と されるオプシンを作りだし、機能しくすなわち光で活動し）、移植された充積受 体か既に失明した網膜を光に応答する形態で活動させる、ということである。

網膜組織のゼラチン基体に対する取付は、網膜組織のガラス器（ｖｉｔｒｏ　） による培養に時間をかけられるようにし、培養中の組織の組織化を維持し、そし て培養した組組織の良好な育成を可能にする。

多くの実施例か示され説明されたか、多くの変更か可能である。充積受体は、ホ ストまたは受容体の充積受体が環境により（一定照明）または遺伝的な欠陥によ って失われた場合の網膜に対して移植することかできる。

（イス、イー、ヒユージスおよびエム、ニス、シルバーマン（＋９８８）の“異 常網膜に対する網膜の充積受体の移植”、ソック　ニューロサイ、アブストラ、 １８：１２７８、を参照されたい）。更に、移植された充積受体細胞はオプシン を作り出すこと、細胞間の組織化および正常の外側核層に見られるのと同様なホ ストの網膜に対する並置を維持すること、によって正常な充積受体の基本的な特 徴を保持する。外科用器具は人間に対して更に広く使用できる。網膜下側空間に 対する他のアクセス方法も使用でき、例えばきょう膜、脈絡膜を通して行える。

ゼラチン以外の他の適当な基体が使用でき、例えばオーガー、オーガローゼを使 用できる。事実、改善された基体はゼラチンと一体化できる要素、例えば向神経 正要素、を含むことかできる。ゼラチンや同様基体に対する取り付けはガラス器 具での培養、低温冷凍、および同様な保存を長くできるようになし、これは組織 の組織化および育成の維持を可能にすると確信する。最後に、網膜を基体に取り 付ける他の方法も使用でき、例えばレクチンや、光活動性の橋かけ剤か使用でき る。

本発明は無傷な光摂受体層を分離する方法を提供する。

これは、コヒーレント視覚が充積受体の損失して構成された網膜を回復させるの 必要ならば、緊密な母材の組織化を維持するのに必要とされるので、重要である 。外科的方法は開示され、これは眼に対する傷を最小限に抑え、移植された充積 受体を眼の中で同位置とするための制御された位置決めを可能にする。更に、充 積受体の移植および分離に関するこれらの方法は他の網膜層を準備し移植するの に使用でき、選択された網膜集団がその他の神経生物学的研究および臨床手順に 使用できる。これらのその他の網膜層は一度平たくされ、適当に切断され、そし て安定化基体もしくはベースに適当に取り付けられ、移植、保存（例えばガラス 器具、低温）の準備かなされ、または充積受体に関してここに説明した方法と同 様に培養できると確信する。

迅速な再血管再生か必要であることは典型的に移植の可能性を主に神経組織に制 限するか、充積受体には制限しない。網膜および（“ＲＰＴ″）の光摂受体層は 血管再生されるものではない。血管再生されるものではない組織は組織拒絶の程 度か小さい。従って遺伝子に似ていない充積受体細胞は本発明によって移植でき るのである。

ホストとドナーの調和のとれた抗原の相性は、網膜色素上皮および脈絡膜の移植 に関して恐らく必要とされよう。

充積受体は成長過程もしくは成体にて移植できる。成体ネズミの充積受体が移植 できるだけでなく、人間のドナーからの成体の充積受体も同様に移植できる。こ れは神経の場合と大きく異なる。神経は移植するには未成熟でなければならない 。現在この相違の理由は分からないが、一般に網膜および神経の移植の調査に関 しては明らかに重要である。

最後に、移植された充積受体はホストまたは受容体の異常のある網膜を光に応答 させる方法で活動させる。これは正常の網膜に見られる活動パターンに密に近く 似ている。

以上に鑑みて、本発明の幾つかの目的が達成されるのであり、その他の利点も得 られるのである。

様々な変化が上述した外科用器具、物質の成分、そして方法に行える。本発明の 範囲から逸脱せずに、上述した説明および添付図面に示した全ての内容は説明の ためのものであって制限する考えのないことを意図するのである。

ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、２１ ＦＩＧ、２２ ＦＩＧ、２３ ＦＩＧ、２４ ＦＩＧ、２５Ｄ　ＦＩＧ、２５ｂ　ＦＩＧ、２５ｃＦＩＧ、２６ａ　ＦＩＧ、２ ６ｂ 手続補正書（嶋） １．事件の表示 外科器具および細胞分離および移植術 セントラル　インスチチュート　フォア　ザ　デフ４−代理人 ６−補正により増加する請求項の数 ７−補正の対象 明細書及び請求の範囲翻訳文 明細書及び請求の範囲翻訳文の浄書（内容に変更なし９国際調査報告 ■−−−＾ゝｇｋ１１０１１綽・■勇ｆ’Ｔ／電丁ζ；Ｑｎｌｎ＆へｒｎ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ホストの眼の網膜下側部分に移植する移植組織を準備する方法であって、 ドナー組織を準備し、 前記組織から、網膜細胞と、上皮組織と、脈絡膜組織とから選択した細胞集団を 、その細胞集団がその種類の正常な組織において存在するのと同様な組織性およ び細胞極性の状態に維持されるようにして、採取し、無毒で柔軟な、体温で実質 的に分解するような成分に対して前記細胞集団を積層する、 ことを含む方法。 ２．請求の範囲第１項に記載された方法であって、前記積層体が１平方ミリメー トルより大きな面積部分の表面を有する方法。 ３．請求の範囲第１項に記載された方法であって、前記成分がゼラチン、アガロ ーゼ、またはアガーである方法。 ４．ホストの眼の網膜下側部分に移植するための光摂受体細胞体部を含んでなる 移植組織を準備する方法であって、 光摂受体の細胞体部の層を含んでなるドナーの網膜を準備し、 前記ドナーの細胞の少なくとも１つの他の層からから、光摂受体の細胞体部の層 を、その光摂受体の細胞体部がその種類の正常な組織において存在するのと同様 な組織性および細胞極性の状態に維持されるようにして、分離する、 ことを含む方法。 ５．請求の範囲第４項に記載された方法であって、無毒で柔軟な、体温で実質的 に分解するような成分に対して、前記分離段階の前に、前記ドナー網膜を積層す る段階を更に含む方法。 ６．請求の範囲第５項に記載された方法であって、前記成分が栄養要素、免疫抑 制要素、抗炎症剤、抗脈管形成要素、抗角膜斑剤、または抗有糸分裂要素を付加 的に含む方法。 ７．請求の範囲第５項に記載された方法であって、前記成分がゼラチン、アガロ ーゼ、またはアガーである方法。 ８．請求の範囲第４項に記載された方法であって、前記段階によって作られた移 植組織が１平方ミリメートルより大きな面積部分の表面を有する方法。 ９．請求の範囲第４項に記載された方法であって、前記段階によって作られた移 植組織が４平方ミリメートルより大きな面積部分の表面を有する方法。 １０．ホストの眼の網膜下側部分に移植する移植組織であって、無毒で柔軟な、 体温で実質的に分解するような成分と、前記ドナー組織から採取した細胞集団と による積層体を含み、前記細胞集団が網膜細胞、上皮組織、および脈絡膜とされ 、この細胞集団はその種類の正常な組織に存在するのと同様な組織性および細胞 極性を有している、移植組織。 １１．請求の範囲第１０項に記載された移植組織であって、平方ミリメートルよ り大きな面積部分の表面を有する移植組織。 １２．請求の範囲第１１項に記載された移植組織であって、前記成分がゼラチン 、オーガーまたはアガローゼである移植組織。 １３．請求の範囲第１０項に記載された移植組織であって、前記細胞集団が光摂 受体細胞を含んでなる移植組織。 １４．ホストの眼の網膜下側部分に移植する移植組織であって、ドナー網膜から 採取した光摂受体細胞体部の集団を含み、光摂受体の細胞体部の前記細胞集団が 、その種類の正常な組織に存在するのと同様な組織および細胞極性を有しており 、移植組織は本質的に正常な網膜に存在する細胞層の少なくとも１つの層がない 、移植組織。 １５．請求の範囲第１４項に記載された移植組織であって、光摂受体の細胞体部 の集団と、無毒で柔軟な、体温で実質的に分解するような成分と、を含む積層体 を含んでなる移植組織。 １６．請求の範囲第１５項に記載された移植組織であって、前記成分が栄養要素 、免疫抑制要素、抗炎症剤、抗脈管形成要素、抗角膜斑剤、または抗有糸分裂要 素を付加的に含む移植組織。 １７．請求の範囲第１４項に記載された移植組織であって、１平方ミリメートル より大きな面積部分の表面を有する移植組織。 １８．請求の範囲第１５項に記載された移植組織であって、前記成分がゼラチン 、オーガーまたはアガローゼである移植組織。 １９．請求の範囲第１４項に記載された移植組織であって、４平方ミリメートル より大きな面積部分の表面を有する移植組織。 ２０．ホストの眼の網膜下側部分に移植する方法であって、 ドナー組織と、上皮組織と、脈絡膜組織との中の細胞の少なくとも１つの他の層 から分離された網膜細胞から選択されたドナー組織から採取された細胞集団を含 み、この細胞集団が、その種類の正常な組織において存在するのと同様な組織性 および細胞極性の状態に維持されるように維持されているような移植組織を準備 し、ホストの眼を通して切開し、 網膜下側部分にアクセスできるようにするために網膜を少なくとも一部剥離させ 、 アクセスした網膜下側部分に移植組織を位置決めする、ことを含む方法。 ２１．請求の範囲第２０項に記載された方法であって、１平方ミリメートルより 大きな面積部分の表面を有する移植組織。 ２２．請求の範囲第２０項に記載された方法であって、前記トランスミッター組 織が網膜組織であり、また、ドナー網膜の中の神経筋細胞の層から分離された光 摂受体細胞の集団を含む移植組織。 ２３．眼の中の網膜と支持組織との間に無傷の平たくされた細胞構造体を移植す る器具であって、この器具が、平たくされた細胞構造体を保持するための細長い 支持プラットフォームであって、眼の中に挿入される先端と基端とを有しており 、ラットフォームの先端縁は凸状に湾曲されて眼の中へのプラットフォームの挿 入および網膜と支持組織との間でのプラットフォームの進入を容易にするように なされており、また、プラットフォームの各側にはサイドレールが備えられてプ ラットフォーム上の平たくされた細胞構造体を保持するようになされており、サ イドレールの先端は丸められ、サイドレールの基端はプラットフォームの先端へ 向けてテーパーを付形されて器具を網膜と支持組織との間に挿入し易くなされて いるようなプラットフォーム、 を含む器具。 ２４．　請求の範囲第２３項に記載された器具であって、プラットフォームが先 端から基端へ向けて長手方向軸線に沿って湾曲されている器具。 ２５．眼の中の網膜と支持組織との間に無傷の平たくされた細胞構造体を移植す る器具であって、この器具が、細長いチューブであって、平たく幅広な横断面を 有し、頂部と、平たい細胞構造体を支持する底部と、両側の側部とが備えられて おり、傾斜された先端を有してチューブの眼の中への挿入およびチューブの網膜 と支持組織との間での進入を容易にしているような細長いチューブと、チューブ の先端から平たい細胞構造体を排出させるためのプランジャー手段と、 を包含する器具。 ２６．請求の範囲第２５項に記載された器具であって、プランジャー手段がチュ ーブの基端から延在する流体ラインと、この流体ラインの基端を加圧された流体 供給源に接続して、平たい細胞構造体をチューブの先端から押し出すようになす ための手段と、を含む器具。 ２７．請求の範囲第２６項に記載された器具であって、更に、チューブ内で大体 基端付近に配置されたプラグであって、流体ラインによってチューブの基端に供 給された流体から平たい細胞構造体を隔離するようになされており、このプラグ が流体ラインからの流体圧力に応答してスライドして、平たい細胞構造体をチュ ーブの先端から押し出すことができるようになされているようなプラグを含む器 具。 ２８．請求の範囲第２５項に記載された器具であって、プランジャー手段がチュ ーブの基端から突出している平たいプランジャーを含み、プラグはチューブの中 にスライド可能に取り付けられ、チューブとプランジャーとの相対的なスライド 動作が平たい細胞構造体を先端から押し出すようになす、器具。 ２９．請求の範囲第２８項に記載された器具であって、チューブの先端が傾斜し てチューブを横方向へ横断して基端方向へ向かっている器具。 ３０．請求の範囲第２８項に記載された器具であって、更にルーメンを含み、こ のルーメンはチューブとほぼ平行に延在され、器具の先端にて流体を噴出して網 膜を支持組織から分離するようになされている器具。 ３１．請求の範囲第３０項に記載された器具であって、ルーメンの先端はチュー ブの先端を超えて延在する器具。 ３２．請求の範囲第３０項に記載された器具であって、ルーメンの先端が傾斜さ れている器具。 ３３．請求の範囲第２８項に記載された器具であって、更に、ルーメンとほぼ平 行に根回とチューブとの間を延在する繊維光学フィラメントを含む器具。 ３４．請求の範囲第３３項に記載された器具であって、更に、繊維光学フィラメ ントの基端に光源を含む器具。 ３５．請求の範囲第２８項に記載された器具であって、チューが先端から基端へ 向けて長手方向軸線に沿って湾曲されており、チューブの頂部が湾曲の内側に位 置され、頂部の底部が湾曲の外側に位置されている器具。 ３６．請求の範囲第２８項に記載された器具であって、チューブとほぼ平行に延 在するルーメンと、ルーメンの基端を吸引源に接続して器具の先端における流体 および破片を吸入するようになされているする手段と、を更に含む器具。 ３７．請求の範囲第２２項に記載された器具であって、チューブのほぼ先端付近 に配置された焼灼電極と、この電極から延在する一対のリード線と、このリード 線を電源に接続して器具が破損血管を焼灼するようにするための手段と、を更に 含む器員。 ３８．眼の中の網膜と支持組織との間に無傷の平たくされた細胞構造体を移植す る器具であって、この器具が、細長いチューブであって、平たく幅広な横断面を 有し、頂部と、平たい細胞構造体を支持する底部と、両側の側部とが備えられて おり、傾斜された先端を有してチューブの眼の中への挿入およびチューブの網膜 と支持組織との間での進入を容易にしているような細長いチューブと、チューブ の基端から突出する平たいプランジャー手段であって、チューブの中にスライド 可能に受け入れられ、チューブとプランジャーとの相対的なスライド運動で先端 から平たい細胞構造体を排出させるプランジャー手段と、 チューブとほぼ平行に延在し、器具の先端にて流体を墳出して、支持組織から網 膜を引き離すようになすルーメンと、 を包含する器具。 ３９．請求の範囲第３８項に記載された器具であって、チューブの先端が傾斜し てチューブを横方向へ横断して基端方向へ向かっている器具。 ４０．請求の範囲３８項に記載された器具であって、ルーメンの先端がチューブ の先端に対して先端となっている器具。 ４１．請求の範囲３８項に記載された器員であって、更に、ルーメンとほぼ平行 にルーメンおよびチューブの間を延在する繊維光学フィラメントを含む器具。 ４２．請求の範囲３８項に記載された器具であって、チューブが先端から基端へ 向けて長手方向軸線に沿って湾曲されており、チューブの頂部が湾曲の内側に位 置され、頂部の底部が湾曲の外側に位置されている器具。 ４３．網膜細胞、網膜色素上皮または脈絡膜の中から選択された細胞集団のシー トをホストの眼の網膜下側部分に移植するキットであって、 細長いチューブであって、平たく幅広な横断面を有し、頂部と、平たい細胞構造 体を支持する底部と、両側の側部とが備えられており、傾斜された先端を有して チューブの眼の中への挿入およびチューブの網膜と支持組織との間での進入を容 易にしているような細長いチューブと、チューブの先端から平たい細胞構造体を 排出させるためのプランジャー手段と、を含んでなる外科用器具、および 網膜細胞、上皮組織、および脈絡膜前記ドナー組織から選択された細胞の集団を 含み、この細胞集団はその種類の正常な組織に存在するのと同様な組織性および 細胞極性を有してなる移植組織、 を含むキット。