JPH0544623B2 - - Google Patents
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- JPH0544623B2 JPH0544623B2 JP58157254A JP15725483A JPH0544623B2 JP H0544623 B2 JPH0544623 B2 JP H0544623B2 JP 58157254 A JP58157254 A JP 58157254A JP 15725483 A JP15725483 A JP 15725483A JP H0544623 B2 JPH0544623 B2 JP H0544623B2
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/74—Optical detectors
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、動植物組織中又は生体体液中に見出
されるアデニン誘導体類及び合成アデニン誘導体
類を高速液体クロマトグラフで分離して分析する
方法に関し、特に蛍光試薬としてブロモアセトア
ルデヒドを用いてアデニン類と蛍光反応させ、高
感度にアデニン類をオンラインで自動分析する方
法に関するもので、動植物等の天然物、生体体液
中に非常に多種類にわたつて見い出される微量ア
デニン類の定量、合成アデニン類の定量、更にそ
の応用として魚、臓器等の鮮度測定のための分
析、又核酸の構造解析（DNAのシーケンス分析）
等に広く利用され得るものである。
されるアデニン誘導体類及び合成アデニン誘導体
類を高速液体クロマトグラフで分離して分析する
方法に関し、特に蛍光試薬としてブロモアセトア
ルデヒドを用いてアデニン類と蛍光反応させ、高
感度にアデニン類をオンラインで自動分析する方
法に関するもので、動植物等の天然物、生体体液
中に非常に多種類にわたつて見い出される微量ア
デニン類の定量、合成アデニン類の定量、更にそ
の応用として魚、臓器等の鮮度測定のための分
析、又核酸の構造解析（DNAのシーケンス分析）
等に広く利用され得るものである。
従来技術
生体内、あるいは天然物中に見い出されている
多種類のアデニン誘導体は微量に存在するため、
特異的な高感度分析が必要とされている。
多種類のアデニン誘導体は微量に存在するため、
特異的な高感度分析が必要とされている。
従来より、アデニン類の紫外線吸収による分析
法は多数行われているが、紫外線を吸収する物質
が多数存在するため特異的選択的でなく、又感度
も吸光度で測定するため限度があり充分でない。
法は多数行われているが、紫外線を吸収する物質
が多数存在するため特異的選択的でなく、又感度
も吸光度で測定するため限度があり充分でない。
最近になつてクロルアセトアルデヒドを用いて
蛍光反応させ、高速液体クロマトグラフで分析す
る方法（J.Chromatogr. 123、220、1976）が提
案されているが、これらの反応に使われているク
ロルアセトアルデヒドは反応性が悪く、特に反応
に高温と長時間を要し、しかも反応率が充分でな
いなど種々の欠点を有していた。
蛍光反応させ、高速液体クロマトグラフで分析す
る方法（J.Chromatogr. 123、220、1976）が提
案されているが、これらの反応に使われているク
ロルアセトアルデヒドは反応性が悪く、特に反応
に高温と長時間を要し、しかも反応率が充分でな
いなど種々の欠点を有していた。
これらの欠点を克服して、蛍光反応性が高く従
つて高感度でかつ優れた選択性を備えたアデニン
類の発蛍光分析法として、ブロモアセトアルデヒ
ドをアデニン類と反応させ、生成する蛍光物質の
蛍光を検出する分析方法が特開昭54−115291号
（特公昭56−54585号公報参照）として出願されて
いる。しかし、この方法は感度の点では優れてい
るものの操作の上で種々問題があつた。すなわ
ち、高速液体クロマトグラフでアデニン類を分離
検出する前にブロモアセトアルデヒド試薬とアデ
ニン類及び緩衝液を反応させるプレラベル法を行
つているため、プレラベル化の面倒な操作のため
オンラインの自動化ができず、又ラベル化された
成分に経時変化があり、検出誤差を生じ、ブロモ
アセトアルデヒド試薬は刺激性のある試薬のため
プレラベル処理に注意を要するなど種々の問題を
抱えていた。
つて高感度でかつ優れた選択性を備えたアデニン
類の発蛍光分析法として、ブロモアセトアルデヒ
ドをアデニン類と反応させ、生成する蛍光物質の
蛍光を検出する分析方法が特開昭54−115291号
（特公昭56−54585号公報参照）として出願されて
いる。しかし、この方法は感度の点では優れてい
るものの操作の上で種々問題があつた。すなわ
ち、高速液体クロマトグラフでアデニン類を分離
検出する前にブロモアセトアルデヒド試薬とアデ
ニン類及び緩衝液を反応させるプレラベル法を行
つているため、プレラベル化の面倒な操作のため
オンラインの自動化ができず、又ラベル化された
成分に経時変化があり、検出誤差を生じ、ブロモ
アセトアルデヒド試薬は刺激性のある試薬のため
プレラベル処理に注意を要するなど種々の問題を
抱えていた。
発明が解決しようとする課題
本発明は、かかる実状に基いてなされたもので
あり、ブロモアセトアルデヒドをアデニン類と反
応させると高感度蛍光発色が得られ高感度検出が
できる利点を生かし、液体クロマトグラフで分離
分析する前に行なう繁雑な前処理を不要とし、反
応をオンラインで行なつて自動分析を可能とする
アデニン類自動分析方法を提供することにある。
あり、ブロモアセトアルデヒドをアデニン類と反
応させると高感度蛍光発色が得られ高感度検出が
できる利点を生かし、液体クロマトグラフで分離
分析する前に行なう繁雑な前処理を不要とし、反
応をオンラインで行なつて自動分析を可能とする
アデニン類自動分析方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
本発明の目的を達成するため、本発明の方法に
おいては異なる二つの混入方法を採用することに
より蛍光試薬ブロモアセトアルデヒドによるアデ
ニン類の分析を行なうものである。
おいては異なる二つの混入方法を採用することに
より蛍光試薬ブロモアセトアルデヒドによるアデ
ニン類の分析を行なうものである。
本発明の構成の一つは、アデニン類を高速液体
クロマトグラフのカラムで分離後、別の反応試薬
送液ポンプにより蛍光試薬ブロモアセトアルデヒ
ドをカラム溶液中に混入して送液し該カラム溶出
液を加熱反応槽を通過させ生成された蛍光物質を
蛍光検出器により検出して分析を行なうものであ
る。
クロマトグラフのカラムで分離後、別の反応試薬
送液ポンプにより蛍光試薬ブロモアセトアルデヒ
ドをカラム溶液中に混入して送液し該カラム溶出
液を加熱反応槽を通過させ生成された蛍光物質を
蛍光検出器により検出して分析を行なうものであ
る。
他の構成は、蛍光試薬ブロモアセトアルデヒド
を高速液体クロマトグラフのカラムでアデニン類
を分離する前の溶離液中に含有させ、カラム溶出
液を加熱反応槽を通過させ生成された蛍光物質を
蛍光検出器により検出して分析を行うものであ
る。
を高速液体クロマトグラフのカラムでアデニン類
を分離する前の溶離液中に含有させ、カラム溶出
液を加熱反応槽を通過させ生成された蛍光物質を
蛍光検出器により検出して分析を行うものであ
る。
これらの二つの構成は、どちらを用いても同じ
くアデニン類の分析が可能であり、とちらを用い
ても良い。
くアデニン類の分析が可能であり、とちらを用い
ても良い。
実施例
以下に本発明の実施例を示す。
第１図、第２図に本発明の実施例をブロツク図
で示す。図中同じ番号は同じものを示す。第１図
は、カラムで分離されたカラム溶出液中に蛍光試
薬ブロモアセトアルデヒドを試薬ポンプで送液混
入する方法の実施例を示す。１は溶離液送液用ポ
ンプ、５は反応試薬送液用ポンプ、２は溶媒、４
はカラム、４′は恒温槽、３は試料注入部、６は
蛍光試薬ブロモアセトアルデヒド溶液、７は反応
槽、７′は恒温槽、８は冷却パイプ、９は蛍光検
出器、１０は記録計、１１は排液、４′はカラム
の分離を最適温度条件に、７′は反応槽を最適温
度条件にするための恒温槽である。
で示す。図中同じ番号は同じものを示す。第１図
は、カラムで分離されたカラム溶出液中に蛍光試
薬ブロモアセトアルデヒドを試薬ポンプで送液混
入する方法の実施例を示す。１は溶離液送液用ポ
ンプ、５は反応試薬送液用ポンプ、２は溶媒、４
はカラム、４′は恒温槽、３は試料注入部、６は
蛍光試薬ブロモアセトアルデヒド溶液、７は反応
槽、７′は恒温槽、８は冷却パイプ、９は蛍光検
出器、１０は記録計、１１は排液、４′はカラム
の分離を最適温度条件に、７′は反応槽を最適温
度条件にするための恒温槽である。
第２図はブロモアセトアルデヒドを溶離液と共
に送液する実施例を示す。蛍光試薬ブロモアセト
アルデヒドを、カラムを通過させる前の溶媒２に
入れて試料を試料注入口３より注入して分析す
る。カラム４、恒温槽４′、反応槽７、恒温槽
７′、冷却パイプ８、検出器９、記録計１０は第
１図と同様である。アデニン類は蛍光試薬ブロモ
アセトアルデヒド（BrCH2CHO）と反応して蛍
光物質の1N6−エテノ誘導体を生成し、240〜
320nmの光を照射して380〜500nmの蛍光を検出
することにより分析される。
に送液する実施例を示す。蛍光試薬ブロモアセト
アルデヒドを、カラムを通過させる前の溶媒２に
入れて試料を試料注入口３より注入して分析す
る。カラム４、恒温槽４′、反応槽７、恒温槽
７′、冷却パイプ８、検出器９、記録計１０は第
１図と同様である。アデニン類は蛍光試薬ブロモ
アセトアルデヒド（BrCH2CHO）と反応して蛍
光物質の1N6−エテノ誘導体を生成し、240〜
320nmの光を照射して380〜500nmの蛍光を検出
することにより分析される。
本発明を第２図の構成によつて分離分析した測
定結果を第３図以下に示す。
定結果を第３図以下に示す。
測定条件は以下の通りである。
溶媒：0.025Mクエン酸−0.05Mリン酸水素ナト
リウム−0.3M食塩バツフア−溶液（PH5.0）： アセトニトリル（４：1V／Ｖ）0.1Mブロモア
セトアルデヒド 流速：0.1ml／分 カラム：日立ゲル3012N（4.6mmID×35mmＬ） 温度45℃ 反応コイル：0.1mmID×30ｍＬ 温度100℃ 検出：日本分光FP−110 励起 253.7nm エミツシヨン 400nm 第３図に、溶離液中のアセトニトリル濃度のキ
ヤパシテイーフアクターに対する効果を示す。横
軸はアセトニトリルの濃度、縦軸はキヤパシテイ
ーフアクターK′の対数logK′、ここでK′はK′＝
（tr−tp）／tpと定義される。ここでtpはアデノシ
ンの保持時間、trは他の成分の保持時間である。
一般にtpはサンプル溶媒等の成分の保持時間でカ
ラムに保持されずに溶出する。
リウム−0.3M食塩バツフア−溶液（PH5.0）： アセトニトリル（４：1V／Ｖ）0.1Mブロモア
セトアルデヒド 流速：0.1ml／分 カラム：日立ゲル3012N（4.6mmID×35mmＬ） 温度45℃ 反応コイル：0.1mmID×30ｍＬ 温度100℃ 検出：日本分光FP−110 励起 253.7nm エミツシヨン 400nm 第３図に、溶離液中のアセトニトリル濃度のキ
ヤパシテイーフアクターに対する効果を示す。横
軸はアセトニトリルの濃度、縦軸はキヤパシテイ
ーフアクターK′の対数logK′、ここでK′はK′＝
（tr−tp）／tpと定義される。ここでtpはアデノシ
ンの保持時間、trは他の成分の保持時間である。
一般にtpはサンプル溶媒等の成分の保持時間でカ
ラムに保持されずに溶出する。
図中□はAMP（アデノシンモノホストフエイ
ト） ×はcAMP（アデノシンサイクリツクモノホス
フエイト） ○はADP（アデノシンデイホスフエイト） ●はATP（アデノシントリホスフエイト） を示す。アデニンは保持されずに溶出すると考え
られる。第３図より、アセトニトリル濃度を選ん
で分離すれば、保持時間が別々となり分離される
ことが判る。
ト） ×はcAMP（アデノシンサイクリツクモノホス
フエイト） ○はADP（アデノシンデイホスフエイト） ●はATP（アデノシントリホスフエイト） を示す。アデニンは保持されずに溶出すると考え
られる。第３図より、アセトニトリル濃度を選ん
で分離すれば、保持時間が別々となり分離される
ことが判る。
第４図はアデニンとブロモアセトアルデヒドの
プレカラム反応（カラムで分離前に反応）とポス
トカラム反応（カラムで分離後の反応）によるク
ロマトグラフを示す。
プレカラム反応（カラムで分離前に反応）とポス
トカラム反応（カラムで分離後の反応）によるク
ロマトグラフを示す。
Ａ： アデニン類1pmol、プレカラム反応により
ラベル化した成分のブロモアセトアルデヒドを
溶離液と共に反応コイル100℃を通した時の分
離分析例 Ｂ： アデニン類1pmolをプレカラム反応により
ラベル化した成分をブロモアセトアルデヒドな
しで100℃反応コイルを通した分析例 Ｃ：プレカラム反応を行なつていないアデニン類
1pmolを100℃の反応コイルを通してブロモア
セトアルデヒドを溶離液と共に送液し分離分析
した例 Ｄ： Ｃと同様であるが反応コイルを20℃に恒温
化した時の分析例 第５図には反応コイルの温度効果を示す。図中
の曲線はそれぞれ3pmolのアデニンをブロモアセ
トアルデヒドを加えた溶離液で分離し種々の温度
の反応コイルを通したときの反応収率であり、
□、×、○、●の成分は第３図と同様である。高
温にする程ピーク値は高くなつている。
ラベル化した成分のブロモアセトアルデヒドを
溶離液と共に反応コイル100℃を通した時の分
離分析例 Ｂ： アデニン類1pmolをプレカラム反応により
ラベル化した成分をブロモアセトアルデヒドな
しで100℃反応コイルを通した分析例 Ｃ：プレカラム反応を行なつていないアデニン類
1pmolを100℃の反応コイルを通してブロモア
セトアルデヒドを溶離液と共に送液し分離分析
した例 Ｄ： Ｃと同様であるが反応コイルを20℃に恒温
化した時の分析例 第５図には反応コイルの温度効果を示す。図中
の曲線はそれぞれ3pmolのアデニンをブロモアセ
トアルデヒドを加えた溶離液で分離し種々の温度
の反応コイルを通したときの反応収率であり、
□、×、○、●の成分は第３図と同様である。高
温にする程ピーク値は高くなつている。
第６図でアデニン類の検量線を示す。横軸は注
入量で縦軸はピーク値である。□、×、○、●の
成分は第３図と同様である。
入量で縦軸はピーク値である。□、×、○、●の
成分は第３図と同様である。
第７図は、ATPのクロマトグラムを示すもの
で、5pmolのATPを分析した例である。
で、5pmolのATPを分析した例である。
第８図は脳抽出液のクロマトグラムを示すもの
で、ラツト（male Wister 210ｇ重量）の新鮮な
脳を3mlの0.4M HClO4中でホモジナイズし遠心
分離した上澄の１部を溶離液で50倍に希釈、希釈
した溶液1μlを注入し分離分析したクロマトグラ
ムである。
で、ラツト（male Wister 210ｇ重量）の新鮮な
脳を3mlの0.4M HClO4中でホモジナイズし遠心
分離した上澄の１部を溶離液で50倍に希釈、希釈
した溶液1μlを注入し分離分析したクロマトグラ
ムである。
発明の効果
ブロモアセトアルデヒドをアデニン類と反応さ
せると高感度蛍光発色が得られ高感度検出が出来
ることが実施例による測定結果より明らかであ
る。更に、ブロモアセトアルデヒド試薬とアデニ
ン類及び緩衝液を反応させるプレラベルの面倒な
操作を省略した構成によつてオンラインの自動分
析が可能となつた。
せると高感度蛍光発色が得られ高感度検出が出来
ることが実施例による測定結果より明らかであ
る。更に、ブロモアセトアルデヒド試薬とアデニ
ン類及び緩衝液を反応させるプレラベルの面倒な
操作を省略した構成によつてオンラインの自動分
析が可能となつた。
本発明による高感度自動分析によるアデニン類
の分離分析方法は、動植物の生体体液のアデニン
類の定量、核酸の構造解析等多方面の利用が可能
であり、核酸成分を高速クロマトグラフで分離分
析する方法として産業上の貢献多大である。
の分離分析方法は、動植物の生体体液のアデニン
類の定量、核酸の構造解析等多方面の利用が可能
であり、核酸成分を高速クロマトグラフで分離分
析する方法として産業上の貢献多大である。
第１図、第２図は本発明のアデニン類自動分析
方法を示すブロツクダイアグラムであつて、第１
図はブロモアセトアルデヒドを試薬ポンプで送液
する実施例、第２図はブロモアセトアルデヒド溶
離液と共に送液する実施例、第３図は溶離液中の
アセトニトリル濃度のキヤパシテイーフアクター
に対する効果を示す測定例、第４図はアデニン類
とブロモアセトアルデヒドのプレカラム反応とポ
ストカラム反応によるクロマトグラム、第５図
は、分離ピーク値に対する反応コイルの温度効
果、第６図はアデニン類の検量線、第７図は
ATPのクロマトグラム、第８図は脳抽出液のク
ロマトグラム。 １……ポンプ、２……溶離液、３……試料注入
口、４……カラム、５……試薬ポンプ、６……反
応液、７……反応コイル、８……冷却パイプ、９
……蛍光検出器、１０……記録、１１……排液。
方法を示すブロツクダイアグラムであつて、第１
図はブロモアセトアルデヒドを試薬ポンプで送液
する実施例、第２図はブロモアセトアルデヒド溶
離液と共に送液する実施例、第３図は溶離液中の
アセトニトリル濃度のキヤパシテイーフアクター
に対する効果を示す測定例、第４図はアデニン類
とブロモアセトアルデヒドのプレカラム反応とポ
ストカラム反応によるクロマトグラム、第５図
は、分離ピーク値に対する反応コイルの温度効
果、第６図はアデニン類の検量線、第７図は
ATPのクロマトグラム、第８図は脳抽出液のク
ロマトグラム。 １……ポンプ、２……溶離液、３……試料注入
口、４……カラム、５……試薬ポンプ、６……反
応液、７……反応コイル、８……冷却パイプ、９
……蛍光検出器、１０……記録、１１……排液。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 高速液体クロマトグラフのカラムでアデニン
類を分離後、別の反応試薬送液ポンプによりカラ
ム溶出液中に蛍光試薬ブロモアセアルデヒドを混
入して送液し、該混合したカラム溶出液を加熱反
応槽を通過させ生成された蛍光物質を蛍光検出器
により検出分析することを特徴とするアデニン類
自動分析方法。 ２ 高速液体クロマトグラフのカラムでアデニン
類を分離する前の溶離液中にブロモアセトアルデ
ヒドを含有させ、カラム溶出液を加熱反応槽を通
過させ生成された蛍光物質を蛍光検出器により検
出分析することを特徴とするアデニン類自動分析
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15725483A JPS6049262A (ja) | 1983-08-30 | 1983-08-30 | アデニン自動分析装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15725483A JPS6049262A (ja) | 1983-08-30 | 1983-08-30 | アデニン自動分析装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6049262A JPS6049262A (ja) | 1985-03-18 |
| JPH0544623B2 true JPH0544623B2 (ja) | 1993-07-06 |
Family
ID=15645626
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15725483A Granted JPS6049262A (ja) | 1983-08-30 | 1983-08-30 | アデニン自動分析装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6049262A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61254852A (ja) * | 1985-05-08 | 1986-11-12 | Shimadzu Corp | ヒスタミンの分析方法及び装置 |
| JPS6438636A (en) * | 1987-08-05 | 1989-02-08 | Ajinomoto Kk | Fluorescent analyzer |
| JP2564013B2 (ja) * | 1989-12-04 | 1996-12-18 | 新技術事業団 | 核酸構成成分過酸化物による核酸損傷程度測定方法および測定装置 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5529791A (en) * | 1978-06-14 | 1980-03-03 | Bifok Ab | Method of continuous measuring |
-
1983
- 1983-08-30 JP JP15725483A patent/JPS6049262A/ja active Granted
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5529791A (en) * | 1978-06-14 | 1980-03-03 | Bifok Ab | Method of continuous measuring |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6049262A (ja) | 1985-03-18 |
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