JPH0541999A - メタノールの定量法 - Google Patents
メタノールの定量法Info
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- JPH0541999A JPH0541999A JP3259544A JP25954491A JPH0541999A JP H0541999 A JPH0541999 A JP H0541999A JP 3259544 A JP3259544 A JP 3259544A JP 25954491 A JP25954491 A JP 25954491A JP H0541999 A JPH0541999 A JP H0541999A
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、メタノールを順次、アルコールオ
キシダーゼ、カタラーゼ及びホルムアルデヒド脱水酵素
により蟻酸まで酸化し、そのとき生成する還元型ニコチ
ンアデニンジヌクレオチドを測定することを特徴とする
メタノールの選択的定量法である。 【効果】 酵素を用いてメタノールの定量を選択的に行
うことができ、測定時間が短くその感度や精度を向上さ
せたメタノール定量法を提供する。
キシダーゼ、カタラーゼ及びホルムアルデヒド脱水酵素
により蟻酸まで酸化し、そのとき生成する還元型ニコチ
ンアデニンジヌクレオチドを測定することを特徴とする
メタノールの選択的定量法である。 【効果】 酵素を用いてメタノールの定量を選択的に行
うことができ、測定時間が短くその感度や精度を向上さ
せたメタノール定量法を提供する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素を用いてメタノー
ルの測定を選択的に行うことを特徴とするメタノール選
択的定量法に関する。
ルの測定を選択的に行うことを特徴とするメタノール選
択的定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術と発明が解決しようとする課題】メタノー
ル測定法としては、ガスクロマトグラフ法、メタノ
ール資化細菌を用いた微生物センサー、日本薬局方に
収載されている比色法のメタノール試験法などがある。
しかし、は測定精度に関して信頼できるが、測定試料
中の爽雑物がカラムから溶出しきらないと次の試料が分
析できないので、測定時間がかかり、高圧ガスを必要と
するため安全面からも問題点があった。また、は測定
時間がかかるほかに、測定できる範囲が５〜20ppm と小
さく、は測定感度、測定精度等に問題点があった。
ル測定法としては、ガスクロマトグラフ法、メタノ
ール資化細菌を用いた微生物センサー、日本薬局方に
収載されている比色法のメタノール試験法などがある。
しかし、は測定精度に関して信頼できるが、測定試料
中の爽雑物がカラムから溶出しきらないと次の試料が分
析できないので、測定時間がかかり、高圧ガスを必要と
するため安全面からも問題点があった。また、は測定
時間がかかるほかに、測定できる範囲が５〜20ppm と小
さく、は測定感度、測定精度等に問題点があった。
【０００３】本発明は、これらの問題点を解決し、測定
時間が短く、その感度や精度を向上させたメタノール定
量法を提供することを目的とする。
時間が短く、その感度や精度を向上させたメタノール定
量法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明のメタノール定量
法は、メタノールを順次、アルコールオキシダーゼ、カ
タラーゼ及びホルムアルデヒド脱水酵素により蟻酸まで
酸化し、そのとき生成する還元型ニコチンアデニンジヌ
クレオチドを測定することを特徴とする。さらに、酵素
反応時に発生する還元型ニコチンアデニンジヌクレオチ
ドを還元性色素である１−メトキシ−５−メチルフェナ
チニウムメチルサルフェート、あるいは還元型ニコチン
アデニンジヌクレオチドオキシダーゼを用いて過酸化水
素を発生させ、ルミノールとの化学発光により高感度に
定量する。
法は、メタノールを順次、アルコールオキシダーゼ、カ
タラーゼ及びホルムアルデヒド脱水酵素により蟻酸まで
酸化し、そのとき生成する還元型ニコチンアデニンジヌ
クレオチドを測定することを特徴とする。さらに、酵素
反応時に発生する還元型ニコチンアデニンジヌクレオチ
ドを還元性色素である１−メトキシ−５−メチルフェナ
チニウムメチルサルフェート、あるいは還元型ニコチン
アデニンジヌクレオチドオキシダーゼを用いて過酸化水
素を発生させ、ルミノールとの化学発光により高感度に
定量する。
【０００５】本発明による一連の反応式を図式化すると
化１の通りである。
化１の通りである。
【０００６】
【化１】
【０００７】ＡＯＤ：アルコールオキシダーゼ、ＦＤ
Ｈ：ホルムアルデヒド脱水素酵素、ＮＡＤ+ ：酸化型ニ
コチンアデニンジヌクレオチド、ＮＡＤＨ：還元型ニコ
チンアデニンジヌクレオチド、１−ＭＰＭＳ：１−メト
キシ−５−メチルフェナチニウムメチルサルフェート、
ＮＯＤ：ＮＡＤＨオキシダーゼ。
Ｈ：ホルムアルデヒド脱水素酵素、ＮＡＤ+ ：酸化型ニ
コチンアデニンジヌクレオチド、ＮＡＤＨ：還元型ニコ
チンアデニンジヌクレオチド、１−ＭＰＭＳ：１−メト
キシ−５−メチルフェナチニウムメチルサルフェート、
ＮＯＤ：ＮＡＤＨオキシダーゼ。
【０００８】すなわち、Ｉ、III 式の反応のように、ア
ルコールオキシダーゼとホルムアルデヒド脱水素酵素の
連続した酵素反応によりメタノールを蟻酸に酸化する
と、メタノール量に比例した還元型ニコチンアデニンジ
ヌクレオチドが生成する。同時に生成する過酸化水素
は、電極反応、化学発光、比色法により、測定可能であ
るが、これを測定しても、メタノールに対して選択性の
低い信号しか得られないので、カタラーゼを作用させ測
定系中より消去する。次に、III 式で生成した還元型ニ
コチンアデニンジヌクレオチドをIV、あるいはＶ式の反
応により過酸化水素を生成させ、この過酸化水素を電極
反応、化学発光、比色法を用いて測定することを研究し
た結果、メタノールに対して選択性の高い信号を得るこ
とが可能であると判った。これら一連の反応は溶液状態
でも測定可能であるが、望ましくは測定操作を簡単にす
るために、このとき用いる酵素試薬は固定化操作を行
い、酵素固定化カラムを用いて連続反応を行うフローイ
ンジェクション分析法システムとして測定する方がよ
い。しかし、この操作に関しては何ら限定せしめるもの
ではない。
ルコールオキシダーゼとホルムアルデヒド脱水素酵素の
連続した酵素反応によりメタノールを蟻酸に酸化する
と、メタノール量に比例した還元型ニコチンアデニンジ
ヌクレオチドが生成する。同時に生成する過酸化水素
は、電極反応、化学発光、比色法により、測定可能であ
るが、これを測定しても、メタノールに対して選択性の
低い信号しか得られないので、カタラーゼを作用させ測
定系中より消去する。次に、III 式で生成した還元型ニ
コチンアデニンジヌクレオチドをIV、あるいはＶ式の反
応により過酸化水素を生成させ、この過酸化水素を電極
反応、化学発光、比色法を用いて測定することを研究し
た結果、メタノールに対して選択性の高い信号を得るこ
とが可能であると判った。これら一連の反応は溶液状態
でも測定可能であるが、望ましくは測定操作を簡単にす
るために、このとき用いる酵素試薬は固定化操作を行
い、酵素固定化カラムを用いて連続反応を行うフローイ
ンジェクション分析法システムとして測定する方がよ
い。しかし、この操作に関しては何ら限定せしめるもの
ではない。
【０００９】
【実施例】次に実施例を用い、本発明を具体的に説明す
る。 実施例１ アルコールオキシダーゼ、カタラーゼ、ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素の固定カラムと１−メトキシ−５−メチル
フェナチニウムメチルサルフェートを用いた場合の実施
例を以下に示す。 (1) 試薬の調整 ａ）試薬Ｉ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを37.2mg、１−メ
トキシ−５−メチルフェナジニウム メチルサルフェー
トを２mg、酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチドを2
8.7mg量り採り、50mMリン酸緩衝液(pH7.0) を用いて200
ml に定容した。
る。 実施例１ アルコールオキシダーゼ、カタラーゼ、ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素の固定カラムと１−メトキシ−５−メチル
フェナチニウムメチルサルフェートを用いた場合の実施
例を以下に示す。 (1) 試薬の調整 ａ）試薬Ｉ エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを37.2mg、１−メ
トキシ−５−メチルフェナジニウム メチルサルフェー
トを２mg、酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチドを2
8.7mg量り採り、50mMリン酸緩衝液(pH7.0) を用いて200
ml に定容した。
【００１０】ｂ）試薬II エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを37.2mg、ルミノ
ールを0.2mg 、ペルオキシダーゼを0.2mg 量り採り、0.
2Mホウ酸緩衝液(pH9.5) を用いて200ml に定容した。 ｃ）試薬III アミノプロピル化処理した多孔質のガラスビーズ（粒径
200 〜400mメッシュ、孔径約500 オングストローム）10
0mg と2.5 ％グルタルアルデヒド溶液を、緩やかに攪拌
しながら室温で１時間反応させた。水洗後、グルタルア
ルデヒド処理後のガラスビーズと10Ｕのアルコールオキ
シダーゼとを混合し、４℃で20時間反応させてアルコー
ルオキシダーゼの固定化酵素を得た。
ールを0.2mg 、ペルオキシダーゼを0.2mg 量り採り、0.
2Mホウ酸緩衝液(pH9.5) を用いて200ml に定容した。 ｃ）試薬III アミノプロピル化処理した多孔質のガラスビーズ（粒径
200 〜400mメッシュ、孔径約500 オングストローム）10
0mg と2.5 ％グルタルアルデヒド溶液を、緩やかに攪拌
しながら室温で１時間反応させた。水洗後、グルタルア
ルデヒド処理後のガラスビーズと10Ｕのアルコールオキ
シダーゼとを混合し、４℃で20時間反応させてアルコー
ルオキシダーゼの固定化酵素を得た。
【００１１】ｄ）試薬IV 試薬III と同様の操作を行い、５mgのカタラーゼを用い
てカタラーゼの固定化酵素を得た。 ｅ）試薬Ｖ 試薬III と同様の操作を行い、５mgのホルムアルデヒド
脱水素酵素を用いてホルムアルデヒド脱水素酵素の固定
化酵素を得た。
てカタラーゼの固定化酵素を得た。 ｅ）試薬Ｖ 試薬III と同様の操作を行い、５mgのホルムアルデヒド
脱水素酵素を用いてホルムアルデヒド脱水素酵素の固定
化酵素を得た。
【００１２】ｆ）試薬VI 試薬III 、IV、Ｖを30mm×２mm i.d. のカラムに、カラ
ムの上流から１cmずつ詰め、酵素固定化カラムを得た。 (3)測定操作 試薬Ｉ、II、VIを用いて図１に示すような測定システム
を組み測定を行った。試薬Ｉを酵素固定化カラム１の試
薬VIに注入し、これを混合機２を用いて試薬IIと混合
し、化学発光検出器３で測定し記録計４で読み取った。
化学発光の検出は、極大波長が約450nm で行い、検出器
は825-CL (日本分光株式会社製) を用いた。この測定シ
ステムにより求めたメタノールに対する検量線を図２に
示した。縦軸は相対発光強度、横軸は濃度である。
ムの上流から１cmずつ詰め、酵素固定化カラムを得た。 (3)測定操作 試薬Ｉ、II、VIを用いて図１に示すような測定システム
を組み測定を行った。試薬Ｉを酵素固定化カラム１の試
薬VIに注入し、これを混合機２を用いて試薬IIと混合
し、化学発光検出器３で測定し記録計４で読み取った。
化学発光の検出は、極大波長が約450nm で行い、検出器
は825-CL (日本分光株式会社製) を用いた。この測定シ
ステムにより求めたメタノールに対する検量線を図２に
示した。縦軸は相対発光強度、横軸は濃度である。
【００１３】このとき、この検量線は以下のように作成
した。すなわち、メタノールを用い0.1 〜100ppm濃度に
50mMリン酸緩衝液を用いて調製した溶液を20μl インジ
ェクターにより注入し、記録計に出力された信号の高さ
をそれぞれの濃度に対してプロットすることにより作成
した。このとき、記録計に出力されるシグナルは図３の
ようになり、この図中、Ａの高さを計測することにより
検量線を作成した。この結果、図２よりメタノールは0.
1 〜100ppmまで測定可能であることが判り、10ppm のメ
タノールを10回繰り返し測定した際の変動係数は4.98％
と良好な結果が得られた。
した。すなわち、メタノールを用い0.1 〜100ppm濃度に
50mMリン酸緩衝液を用いて調製した溶液を20μl インジ
ェクターにより注入し、記録計に出力された信号の高さ
をそれぞれの濃度に対してプロットすることにより作成
した。このとき、記録計に出力されるシグナルは図３の
ようになり、この図中、Ａの高さを計測することにより
検量線を作成した。この結果、図２よりメタノールは0.
1 〜100ppmまで測定可能であることが判り、10ppm のメ
タノールを10回繰り返し測定した際の変動係数は4.98％
と良好な結果が得られた。
【００１４】実施例２ アルコールオキシダーゼ、カタラーゼ、ホルムアルデヒ
ド脱水素酵素、還元型ニコチンアデニンジヌクレオチド
オキシダーゼの固定化カラムを用いた場合の実施例を以
下に示す。 (1)試薬の調整 ａ）試薬VII エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを37.2mg、酸化型
ニコチンアデニンジヌクレオチドを28.7mg量り採り、50
mMリン酸緩衝液(pH7.0) を用いて200ml に定容した。 ｂ）試薬II 実施例１の試薬IIと同様に調製した。
ド脱水素酵素、還元型ニコチンアデニンジヌクレオチド
オキシダーゼの固定化カラムを用いた場合の実施例を以
下に示す。 (1)試薬の調整 ａ）試薬VII エチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを37.2mg、酸化型
ニコチンアデニンジヌクレオチドを28.7mg量り採り、50
mMリン酸緩衝液(pH7.0) を用いて200ml に定容した。 ｂ）試薬II 実施例１の試薬IIと同様に調製した。
【００１５】ｃ）試薬III 実施例１の試薬III と同様に調製した。 ｄ）実施例IV 実施例１の試薬IVと同様に調製した。 ｅ）試薬Ｖ 実施例１の試薬Ｖと同様に調製した。
【００１６】ｆ）試薬VIII 試薬III と同様の操作を行い、５mgの還元型ニコチンア
デニンジヌクレオチドオキシダーゼを用いて還元型ニコ
チンアデニンジヌクレオチドオキシダーゼの固定化酵素
を得た。
デニンジヌクレオチドオキシダーゼを用いて還元型ニコ
チンアデニンジヌクレオチドオキシダーゼの固定化酵素
を得た。
【００１７】ｇ）試薬IX 試薬III 、IV、Ｖ、VIIIを40×mm×２mm i.d. のカラム
に、カラムの上流から順次１cmずつ詰め、酵素固定化カ
ラムを得た。 (2)測定操作 試薬II、VII 、IXを用いて図４に示すような測定システ
ムを組み、測定を行った。この測定システムにより求め
たメタノールに対する検量線を図５に示した。このとき
の検量線は実施例１と同様に作成した。すなわち、メタ
ノールの純品を用い、0.1 〜100ppn濃度に50mMリン酸イ
ンジェクターより注入し、記録計に出力された信号の高
さをそれぞれの濃度に対してプロットすることにより作
成した。図５よりメタノールは0.1 〜100ppmまで測定可
能であることが判り、10ppm のメタノールを10回繰り返
し測定した際の変動係数は4.94％であり、実施例１とほ
ぼ同様の結果を得た。
に、カラムの上流から順次１cmずつ詰め、酵素固定化カ
ラムを得た。 (2)測定操作 試薬II、VII 、IXを用いて図４に示すような測定システ
ムを組み、測定を行った。この測定システムにより求め
たメタノールに対する検量線を図５に示した。このとき
の検量線は実施例１と同様に作成した。すなわち、メタ
ノールの純品を用い、0.1 〜100ppn濃度に50mMリン酸イ
ンジェクターより注入し、記録計に出力された信号の高
さをそれぞれの濃度に対してプロットすることにより作
成した。図５よりメタノールは0.1 〜100ppmまで測定可
能であることが判り、10ppm のメタノールを10回繰り返
し測定した際の変動係数は4.94％であり、実施例１とほ
ぼ同様の結果を得た。
【００１８】実施例３ 液状試料として市販の白ワイン、ロゼワイン、赤ワイン
および米酢について、実施例１の測定システムを用いて
測定した。測定試料の調製は、50mMりん酸緩衝液(pH7.
0) で20倍に希釈し、これを20μl インジェクターより
注入することにより測定を行った。このとき、実施例１
で作成したメタノールに対する検量線を用い、これによ
り試料中のメタノール濃度を計算した。本実施例では、
実施例１の測定システムを用いたが、実施例２の測定シ
ステムを用いても、同様の結果が得られた。次表に、本
発明による測定法とガスクロマトグラフ法を比較した結
果を示した。従来法としてガスクロマトグラフ法を用い
たが、この時のガスクロマトグラフィー条件は、装置本
体にＨＰ５８９０Ａ（ヒューレットパッカード社製)
を、カラムにはＤＢ−ＷＡＸ (Ｊ＆Ｗ社製：30m × 0.5
3mm i.d.) を用い、カラム温度は初期温度40℃で３分間
保持した後、最終温度120 ℃まで５℃／分で昇温をかけ
測定を行った。。表から明らかなように、ほぼ同様の結
果が得られた。しかも、本実施例では測定時間が２分
と、従来の１／20の短い時間で測定可能であった。
および米酢について、実施例１の測定システムを用いて
測定した。測定試料の調製は、50mMりん酸緩衝液(pH7.
0) で20倍に希釈し、これを20μl インジェクターより
注入することにより測定を行った。このとき、実施例１
で作成したメタノールに対する検量線を用い、これによ
り試料中のメタノール濃度を計算した。本実施例では、
実施例１の測定システムを用いたが、実施例２の測定シ
ステムを用いても、同様の結果が得られた。次表に、本
発明による測定法とガスクロマトグラフ法を比較した結
果を示した。従来法としてガスクロマトグラフ法を用い
たが、この時のガスクロマトグラフィー条件は、装置本
体にＨＰ５８９０Ａ（ヒューレットパッカード社製)
を、カラムにはＤＢ−ＷＡＸ (Ｊ＆Ｗ社製：30m × 0.5
3mm i.d.) を用い、カラム温度は初期温度40℃で３分間
保持した後、最終温度120 ℃まで５℃／分で昇温をかけ
測定を行った。。表から明らかなように、ほぼ同様の結
果が得られた。しかも、本実施例では測定時間が２分
と、従来の１／20の短い時間で測定可能であった。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【発明の効果】本発明によれば、酵素を用いてメタノー
ルの定量を選択的に行うことができ、測定時間が短くそ
の感度や精度を向上させたメタノール定量法を提供す
る。しかも、従来法に比較して高圧ガス等を必要とせず
安全に操作を行うことができる。また、測定範囲が 0.1
〜100ppmと幅広く、種々の試料を測定することができ
る。
ルの定量を選択的に行うことができ、測定時間が短くそ
の感度や精度を向上させたメタノール定量法を提供す
る。しかも、従来法に比較して高圧ガス等を必要とせず
安全に操作を行うことができる。また、測定範囲が 0.1
〜100ppmと幅広く、種々の試料を測定することができ
る。
【図１】実施例１による測定システムの概略図。
【図２】実施例１におけるメタノールに対する検量線を
示したグラフ。縦軸は相対発光強度、横軸は濃度であ
る。
示したグラフ。縦軸は相対発光強度、横軸は濃度であ
る。
【図３】実施例１における記録計に出力されるシグナル
を示す図。
を示す図。
【図４】実施例２による測定システムの概略図。
【図５】実施例２におけるメタノールに対する検量線を
示したグラフ。縦軸は相対発光強度、横軸は濃度であ
る。
示したグラフ。縦軸は相対発光強度、横軸は濃度であ
る。
１：酵素固定化カラム ２：混合機 ３：化学発光検出器 ４：記録計 ５：インシェクター ６：ポンプ
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年１０月１８日
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】 メタノールの定量法
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
Claims (6)
- 【請求項１】 メタノールを順次、アルコールオキシダ
ーゼ、カタラーゼ及びホルムアルデヒド脱水酵素により
蟻酸まで酸化し、そのとき生成する還元型ニコチンアデ
ニンジヌクレオチドを測定することを特徴とするメタノ
ールの選択的定量法。 - 【請求項２】 酵素反応により生成した還元型ニコチン
アデニンジヌクレオチドの測定を、還元性色素を用いて
酸化し、このとき生成する過酸化水素を定量することに
より行う請求項１記載の定量法。 - 【請求項３】 還元性色素が１−メトキシ−５−メチル
フェナジニウムメチルサルフェートであり、これを用い
て酸化し、このとき生成する過酸化水素を定量すること
により行う請求項１または２記載の定量法。 - 【請求項４】 酵素反応により生成した還元型ニコチン
アデニンジヌクレオチドの測定を、還元型ニコチンアデ
ニンジヌクレオチドオキシダーゼにより酸化し、このと
き生成する過酸化水素を定量することにより行う請求項
１記載の定量法。 - 【請求項５】 最終生成物の過酸化水素の定量をルミノ
ールを用いた化学発光測定法により行う請求項２、３ま
たは４記載の定量法。 - 【請求項６】 アルコールオキシダーゼ、ホルムアルデ
ヒド脱水素酵素を固定化した反応カラムを用いてフロー
インジェクション分析法により定量する請求項４または
５記載の定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3259544A JPH0541999A (ja) | 1991-08-09 | 1991-08-09 | メタノールの定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3259544A JPH0541999A (ja) | 1991-08-09 | 1991-08-09 | メタノールの定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0541999A true JPH0541999A (ja) | 1993-02-23 |
Family
ID=17335586
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3259544A Pending JPH0541999A (ja) | 1991-08-09 | 1991-08-09 | メタノールの定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0541999A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111579548A (zh) * | 2020-05-20 | 2020-08-25 | 重庆师范大学 | 一种鲁米诺-镓纳米组装体及其制备方法和应用 |
-
1991
- 1991-08-09 JP JP3259544A patent/JPH0541999A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111579548A (zh) * | 2020-05-20 | 2020-08-25 | 重庆师范大学 | 一种鲁米诺-镓纳米组装体及其制备方法和应用 |
| CN111579548B (zh) * | 2020-05-20 | 2022-03-18 | 重庆师范大学 | 一种鲁米诺-镓纳米组装体及其制备方法和应用 |
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