JPH0538299A - 核酸の塩基配列の決定法 - Google Patents
核酸の塩基配列の決定法Info
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- JPH0538299A JPH0538299A JP19692391A JP19692391A JPH0538299A JP H0538299 A JPH0538299 A JP H0538299A JP 19692391 A JP19692391 A JP 19692391A JP 19692391 A JP19692391 A JP 19692391A JP H0538299 A JPH0538299 A JP H0538299A
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- dna
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Abstract
(57)【要約】
【目的】サンガー法における精度と解析密度を向上させ
る。 【構成】サンガー法におけるプライマを２種類設定し、
デオキシヌクレオチドトリフォスフェートのダイマーを
基質として用いるとともに、標識されたターミネータを
加えて伸長反応を行う。そして、上記２種類のプライマ
に基づいて生成する第一生成物と第二生成物を同一の条
件下で鎖長に応じて同時に分離することによって生成す
る互い違いの梯子状のバンドを、読み取り分析すること
によってＤＮＡの塩基配列を決定する。
る。 【構成】サンガー法におけるプライマを２種類設定し、
デオキシヌクレオチドトリフォスフェートのダイマーを
基質として用いるとともに、標識されたターミネータを
加えて伸長反応を行う。そして、上記２種類のプライマ
に基づいて生成する第一生成物と第二生成物を同一の条
件下で鎖長に応じて同時に分離することによって生成す
る互い違いの梯子状のバンドを、読み取り分析すること
によってＤＮＡの塩基配列を決定する。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子の塩基配列解析
の研究機関や遺伝子治療の分野で行われているＤＮＡの
未知の塩基配列を決定するための塩基配列決定法に関す
るものである。
の研究機関や遺伝子治療の分野で行われているＤＮＡの
未知の塩基配列を決定するための塩基配列決定法に関す
るものである。
【０００２】
【従来の技術】従来からＤＮＡの未知の核酸の塩基配列
を決定するためには、マキサムギルバート法やサンガー
法が用いられているわけであるが、マキサムギルバート
法がＤＮＡを分解することによって核酸の塩基配列を決
定するのに対し、サンガー法はＤＮＡを伸長することに
よって核酸の塩基配列の決定を行う。
を決定するためには、マキサムギルバート法やサンガー
法が用いられているわけであるが、マキサムギルバート
法がＤＮＡを分解することによって核酸の塩基配列を決
定するのに対し、サンガー法はＤＮＡを伸長することに
よって核酸の塩基配列の決定を行う。
【０００３】サンガー法は、ＤＮＡポリメラーゼの修復
反応を利用して行うので酵素法とも呼ばれている。この
方法の原理がサンガーやコルソンらによって発表された
のは１９７５年であるが、Ｍ１３ファージによって１本
鎖ＤＮＡが容易にしかも大量に調整できる方法が１９７
７年に見出だされたおかげで、ＤＮＡ塩基配列分析の主
流となり、以来種々の改良が加えられて現在に至ってい
る。
反応を利用して行うので酵素法とも呼ばれている。この
方法の原理がサンガーやコルソンらによって発表された
のは１９７５年であるが、Ｍ１３ファージによって１本
鎖ＤＮＡが容易にしかも大量に調整できる方法が１９７
７年に見出だされたおかげで、ＤＮＡ塩基配列分析の主
流となり、以来種々の改良が加えられて現在に至ってい
る。
【０００４】サンガー法においては、まず一本鎖ＤＮＡ
にプライマとなる短い相補鎖が加えられてヘテロ二本鎖
が作成され、次にこのヘテロ二本鎖にＤＮＡポリメラー
ゼと４種のデオキシヌクレオチドトリフォスフェートが
加えられて、プライマの３´末端からＤＮＡ合成を行わ
せる。このときに、ＤＮＡ合成の伸長阻害剤であるジデ
オキシヌクレオチドトリフォスフェートを少量加えてお
くと、これが取り込まれたところでＤＮＡ鎖の伸長が停
止する。
にプライマとなる短い相補鎖が加えられてヘテロ二本鎖
が作成され、次にこのヘテロ二本鎖にＤＮＡポリメラー
ゼと４種のデオキシヌクレオチドトリフォスフェートが
加えられて、プライマの３´末端からＤＮＡ合成を行わ
せる。このときに、ＤＮＡ合成の伸長阻害剤であるジデ
オキシヌクレオチドトリフォスフェートを少量加えてお
くと、これが取り込まれたところでＤＮＡ鎖の伸長が停
止する。
【０００５】ところで、ジデオキシヌクレオチドはラン
ダムに取り込まれるので、プライマから色々な長さのＤ
ＮＡ鎖が生成することになる。このように、４種のジデ
オキシヌクレオチドを個別に加えて合成させた反応生成
物をポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって鎖長に
応じて分離すると、合成されたＤＮＡ鎖の長さに応じた
梯子状のバンドが生成する。そして、このようにして生
成した梯子状のバンドを分析することによって塩基配列
を決定することができる。この方法によって何個の塩基
配列が一枚のゲルから読み取れるかはゲル電気泳動の分
解能に依存するが、標準的な条件では２００塩基ぐらい
の配列を決定することが可能である。
ダムに取り込まれるので、プライマから色々な長さのＤ
ＮＡ鎖が生成することになる。このように、４種のジデ
オキシヌクレオチドを個別に加えて合成させた反応生成
物をポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって鎖長に
応じて分離すると、合成されたＤＮＡ鎖の長さに応じた
梯子状のバンドが生成する。そして、このようにして生
成した梯子状のバンドを分析することによって塩基配列
を決定することができる。この方法によって何個の塩基
配列が一枚のゲルから読み取れるかはゲル電気泳動の分
解能に依存するが、標準的な条件では２００塩基ぐらい
の配列を決定することが可能である。
【０００６】以下、図４をもとにして、サンガー法の一
手法であるターミネータ標識法による解析方法について
詳細な説明をしていく。
手法であるターミネータ標識法による解析方法について
詳細な説明をしていく。
【０００７】このサンガー法においては、図４に示され
ているように、デオキシヌクレオチドトリフォスフェー
ト（ｄＮＴＰ）とジデオキシヌクレオチドトリフォスフ
ェート（ｄｄＮＴＰ）の競争反応を行わせることによっ
て種々の長さのＤＮＡ鎖を作成し、それを電気泳動を用
いて分離することによって、ＤＮＡの塩基配列の解析を
行っている。ここで、ジデオキシヌクレオチドトリフォ
スフェート（ｄｄＮＴＰ）は、デオキシヌクレオチドト
リフォスフェート（ｄＮＴＰ）の３位の水酸基が水素に
置換されているものであり、ＤＮＡの伸長反応はｄｄＮ
ＴＰによって停止させられる。これにより、前記ｄｄＮ
ＴＰはＤＮＡ鎖の長さを規定するターミネータとして用
いることができる。そして、分析に有効なターミネータ
として用いるために、蛍光標識されたジデオキシヌクレ
オチドトリフォスフェート（ｄｄＮＴＰ* ）が用いられ
ている。
ているように、デオキシヌクレオチドトリフォスフェー
ト（ｄＮＴＰ）とジデオキシヌクレオチドトリフォスフ
ェート（ｄｄＮＴＰ）の競争反応を行わせることによっ
て種々の長さのＤＮＡ鎖を作成し、それを電気泳動を用
いて分離することによって、ＤＮＡの塩基配列の解析を
行っている。ここで、ジデオキシヌクレオチドトリフォ
スフェート（ｄｄＮＴＰ）は、デオキシヌクレオチドト
リフォスフェート（ｄＮＴＰ）の３位の水酸基が水素に
置換されているものであり、ＤＮＡの伸長反応はｄｄＮ
ＴＰによって停止させられる。これにより、前記ｄｄＮ
ＴＰはＤＮＡ鎖の長さを規定するターミネータとして用
いることができる。そして、分析に有効なターミネータ
として用いるために、蛍光標識されたジデオキシヌクレ
オチドトリフォスフェート（ｄｄＮＴＰ* ）が用いられ
ている。
【０００８】ところで、ＤＮＡを構成する塩基には、ア
デニン（Ａ），チミン（Ｔ），シトシン（Ｃ），グアニ
ン（Ｇ）の４種類があるため、対応するデオキシヌクレ
オチドトリフォスフェート（ｄＮＴＰ）にはｄＡＴＰ，
ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰの４種類が存在し、ま
た、対応するジデオキシヌクレオチドトリフォスフェー
ト（ｄｄＮＴＰ）にはｄｄＡＴＰ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＣ
ＴＰ，ｄｄＧＴＰの４種類が同様にして存在する。そし
て、ＤＮＡの伸長反応の阻害剤であるこれらｄｄＡＴ
Ｐ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰには、それぞ
れ異なった蛍光標識が施されており、これにより、ター
ミネータはｄｄＡＴＰ* ，ｄｄＴＴＰ* ，ｄｄＣＴ
Ｐ* ，ｄｄＧＴＰ* の４種類が存在していることにな
る。
デニン（Ａ），チミン（Ｔ），シトシン（Ｃ），グアニ
ン（Ｇ）の４種類があるため、対応するデオキシヌクレ
オチドトリフォスフェート（ｄＮＴＰ）にはｄＡＴＰ，
ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰの４種類が存在し、ま
た、対応するジデオキシヌクレオチドトリフォスフェー
ト（ｄｄＮＴＰ）にはｄｄＡＴＰ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＣ
ＴＰ，ｄｄＧＴＰの４種類が同様にして存在する。そし
て、ＤＮＡの伸長反応の阻害剤であるこれらｄｄＡＴ
Ｐ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰには、それぞ
れ異なった蛍光標識が施されており、これにより、ター
ミネータはｄｄＡＴＰ* ，ｄｄＴＴＰ* ，ｄｄＣＴ
Ｐ* ，ｄｄＧＴＰ* の４種類が存在していることにな
る。
【０００９】このサンガー法による解析方法では、ま
ず、配列決定の対象となるＤＮＡにプライマがアニーリ
ングされてヘテロ二本鎖が作成される。次に、ｄＮＴＰ
（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ）と、ｄｄ
ＮＴＰ* （ｄｄＡＴＰ* ，ｄｄＴＴＰ* ，ｄｄＣＴ
Ｐ* ，ｄｄＧＴＰ* ）と、ＤＮＡポリメラーゼが添加さ
れて所定の条件下で伸長反応が行われる。この場合にお
いて、前記ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰ* が互いに競争反応を
起こし、ｄｄＮＴＰ* が結合した場合には、伸長反応は
そこで終了して、相補性の原理により、解析されるＤＮ
Ａ鎖と相補関係にある種々の長さのＤＮＡ断片が生成す
ることになる。
ず、配列決定の対象となるＤＮＡにプライマがアニーリ
ングされてヘテロ二本鎖が作成される。次に、ｄＮＴＰ
（ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ）と、ｄｄ
ＮＴＰ* （ｄｄＡＴＰ* ，ｄｄＴＴＰ* ，ｄｄＣＴ
Ｐ* ，ｄｄＧＴＰ* ）と、ＤＮＡポリメラーゼが添加さ
れて所定の条件下で伸長反応が行われる。この場合にお
いて、前記ｄＮＴＰとｄｄＮＴＰ* が互いに競争反応を
起こし、ｄｄＮＴＰ* が結合した場合には、伸長反応は
そこで終了して、相補性の原理により、解析されるＤＮ
Ａ鎖と相補関係にある種々の長さのＤＮＡ断片が生成す
ることになる。
【００１０】そして、このようにして生成したＤＮＡ鎖
を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって、ＤＮ
Ａ鎖の長さごとに分離することによりＤＮＡの塩基配列
の決定を行うことができる。すなわち、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法によって生成した梯子状のバンドの
位置と蛍光の種類とを分析することによって、ＤＮＡの
塩基配列を決定することが可能となる。
を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって、ＤＮ
Ａ鎖の長さごとに分離することによりＤＮＡの塩基配列
の決定を行うことができる。すなわち、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法によって生成した梯子状のバンドの
位置と蛍光の種類とを分析することによって、ＤＮＡの
塩基配列を決定することが可能となる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来に
おいては上記のような反応によって生成した反応物をポ
リアクリルアミド電気泳動にかけると、その分解能によ
って、最大でも大体４００フラグメント程度の解析しか
行うことができないという問題があった。
おいては上記のような反応によって生成した反応物をポ
リアクリルアミド電気泳動にかけると、その分解能によ
って、最大でも大体４００フラグメント程度の解析しか
行うことができないという問題があった。
【００１２】ところが、ヒューマンゲノムの解析等にも
代表されるように、膨大な量の塩基配列を決定する必要
がある場合には、一枚のゲルで読み取れる塩基配列の量
と精度を増加させることによって、一度により多くの塩
基配列を正確にかつ一回の操作で多くの塩基配列を解析
することが要求される。
代表されるように、膨大な量の塩基配列を決定する必要
がある場合には、一枚のゲルで読み取れる塩基配列の量
と精度を増加させることによって、一度により多くの塩
基配列を正確にかつ一回の操作で多くの塩基配列を解析
することが要求される。
【００１３】本発明は以上のような課題に鑑みてなされ
たものであり、その目的は、サンガー法を改良すること
によってＤＮＡの塩基配列決定法の解析密度と解析精度
を向上させることにある。
たものであり、その目的は、サンガー法を改良すること
によってＤＮＡの塩基配列決定法の解析密度と解析精度
を向上させることにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】以上のような課題を解決
するために、本発明に係る核酸の塩基配列決定法におい
ては、核酸の塩基配列を決定するサンガー法の伸長反応
における反応基質にデオキシヌクレオチドダイマートリ
フォスフェートを用いることを特徴とする。
するために、本発明に係る核酸の塩基配列決定法におい
ては、核酸の塩基配列を決定するサンガー法の伸長反応
における反応基質にデオキシヌクレオチドダイマートリ
フォスフェートを用いることを特徴とする。
【００１５】すなわち、核酸の塩基配列を決定するサン
ガー法において、塩基配列決定の対象となるＤＮＡに第
一プライマとなる相補鎖を加えて第一ヘテロ二本鎖を作
成する第一アニーリング工程と、反応基質たるデオキシ
ヌクレオチドダイマートリフォスフェートと伸長反応阻
害剤を用いて前記第一ヘテロ二本鎖の伸長反応を行う第
一伸長工程と、前記塩基配列決定の対象となるＤＮＡに
前記第一プライマよりも３´方向に１塩基分だけ長い相
補鎖を第二プライマとして用いて第二ヘテロ二本鎖を作
成する第二アニーリング工程と、反応基質たるデオキシ
ヌクレオチドダイマートリフォスフェートと伸長反応阻
害剤を用いて前記第二ヘテロ二本鎖の伸長反応を行う第
二伸長工程と、前記第一伸長工程で得られた第一反応生
成物と前記第二伸長工程で得られた第二反応生成物と
を、同一の条件下で鎖長に応じて分離する同時分離工程
と、を含み、前記同時分離工程において生成した梯子状
のバンドを分析することによってＤＮＡの塩基配列を決
定することを特徴とする。
ガー法において、塩基配列決定の対象となるＤＮＡに第
一プライマとなる相補鎖を加えて第一ヘテロ二本鎖を作
成する第一アニーリング工程と、反応基質たるデオキシ
ヌクレオチドダイマートリフォスフェートと伸長反応阻
害剤を用いて前記第一ヘテロ二本鎖の伸長反応を行う第
一伸長工程と、前記塩基配列決定の対象となるＤＮＡに
前記第一プライマよりも３´方向に１塩基分だけ長い相
補鎖を第二プライマとして用いて第二ヘテロ二本鎖を作
成する第二アニーリング工程と、反応基質たるデオキシ
ヌクレオチドダイマートリフォスフェートと伸長反応阻
害剤を用いて前記第二ヘテロ二本鎖の伸長反応を行う第
二伸長工程と、前記第一伸長工程で得られた第一反応生
成物と前記第二伸長工程で得られた第二反応生成物と
を、同一の条件下で鎖長に応じて分離する同時分離工程
と、を含み、前記同時分離工程において生成した梯子状
のバンドを分析することによってＤＮＡの塩基配列を決
定することを特徴とする。
【００１６】なお、前記第一及び第二伸長工程において
用いられる伸長反応阻害剤としては、標識された伸長反
応阻害剤、例えば標識されたジデオキシヌクレオチドト
リフォスフェートをターミネータとして用いることが好
適である。
用いられる伸長反応阻害剤としては、標識された伸長反
応阻害剤、例えば標識されたジデオキシヌクレオチドト
リフォスフェートをターミネータとして用いることが好
適である。
【００１７】
【作用】以上のようにして構成された本発明に係る核酸
の塩基配列決定法においては、第一アニーリング工程に
おいて、塩基配列決定の対象となるＤＮＡに第一プライ
マとなる相補鎖が反応して第一ヘテロ二本鎖が作成され
る。そして、第一伸長工程において、反応基質であるデ
オキシヌクレオチドダイマートリフォスフェートとター
ミネータである伸長反応阻害剤とが、前記第一アニーリ
ング工程において作成された前記第一ヘテロ二本鎖に対
して互いに競争的に反応する。
の塩基配列決定法においては、第一アニーリング工程に
おいて、塩基配列決定の対象となるＤＮＡに第一プライ
マとなる相補鎖が反応して第一ヘテロ二本鎖が作成され
る。そして、第一伸長工程において、反応基質であるデ
オキシヌクレオチドダイマートリフォスフェートとター
ミネータである伸長反応阻害剤とが、前記第一アニーリ
ング工程において作成された前記第一ヘテロ二本鎖に対
して互いに競争的に反応する。
【００１８】ここで、前記反応基質が前記第一ヘテロ二
本鎖と反応した場合には、伸長反応はそのまま継続して
いくことになるが、前記ターミネータが前記第一ヘテロ
二本鎖と反応した場合には、伸長反応は停止してしま
う。したがって、この第一伸長工程において得られた第
一反応生成物には、前記第一ヘテロ二本鎖と相補性を有
する種々の長さのＤＮＡ断片が含まれていることになる
が、第一伸長工程において第一ヘテロ二本鎖に取り込ま
れる基質がデオキシヌクレオチドダイマートリフォスフ
ェートであるため、第一反応生成物に含まれている相補
性を有する種々の長さのＤＮＡ断片はひとつ飛びの塩基
配列を有していることとなる。すなわち、このようにし
て生成した相補性を有する種々の長さのＤＮＡ断片は、
常に２塩基を単位とした長さの新たな相補鎖を有してい
ることになる（下の１式）。
本鎖と反応した場合には、伸長反応はそのまま継続して
いくことになるが、前記ターミネータが前記第一ヘテロ
二本鎖と反応した場合には、伸長反応は停止してしま
う。したがって、この第一伸長工程において得られた第
一反応生成物には、前記第一ヘテロ二本鎖と相補性を有
する種々の長さのＤＮＡ断片が含まれていることになる
が、第一伸長工程において第一ヘテロ二本鎖に取り込ま
れる基質がデオキシヌクレオチドダイマートリフォスフ
ェートであるため、第一反応生成物に含まれている相補
性を有する種々の長さのＤＮＡ断片はひとつ飛びの塩基
配列を有していることとなる。すなわち、このようにし
て生成した相補性を有する種々の長さのＤＮＡ断片は、
常に２塩基を単位とした長さの新たな相補鎖を有してい
ることになる（下の１式）。
【００１９】 第一プライマ＋２＋２＋２＋２＋２＋２＋… −（１） 一方、第二伸長工程において得られる第二反応生成物
も、前記第一反応生成物と同様、前記第二ヘテロ二本鎖
と相補性を有する種々の長さのＤＮＡ断片の混合物であ
る。ところが、第二ヘテロ二本鎖が作成される第二アニ
ーリング工程において塩基配列決定の対象となるＤＮＡ
と反応させられる第二プライマは、前記第一プライマよ
りも３´方向に１塩基分だけ長い相補鎖である（下の２
式）。
も、前記第一反応生成物と同様、前記第二ヘテロ二本鎖
と相補性を有する種々の長さのＤＮＡ断片の混合物であ
る。ところが、第二ヘテロ二本鎖が作成される第二アニ
ーリング工程において塩基配列決定の対象となるＤＮＡ
と反応させられる第二プライマは、前記第一プライマよ
りも３´方向に１塩基分だけ長い相補鎖である（下の２
式）。
【００２０】 第二プライマ＝第一プライマ＋１ −（２） また、第二伸長工程において第二ヘテロ二本鎖に取り込
まれる基質は、第一伸長工程と同様にデオキシヌクレオ
チドダイマートリフォスフェートであるため、第二反応
生成物に含まれている相補性を有する種々の長さのＤＮ
Ａ断片は、第一反応生成物と同様に、２塩基を単位とし
た長さの新たな塩基配列を有していることとなる（下の
３式）。
まれる基質は、第一伸長工程と同様にデオキシヌクレオ
チドダイマートリフォスフェートであるため、第二反応
生成物に含まれている相補性を有する種々の長さのＤＮ
Ａ断片は、第一反応生成物と同様に、２塩基を単位とし
た長さの新たな塩基配列を有していることとなる（下の
３式）。
【００２１】 第二プライマ＋２＋２＋２＋２＋２＋… −（３） ここで、第二プライマは、前記第一プライマよりも３´
方向に１塩基分だけ長い相補鎖であり、しかもプライマ
に取り込まれるのはいずれもダイマーであるため、第二
伸長工程において得られる第二反応生成物に含まれてい
るＤＮＡ鎖と第一伸長工程において得られる第一反応生
成物に含まれているＤＮＡ鎖は、例えばポリアクリルア
ミドゲル上にて互い違いな梯子状に展開されるようにな
る（下の４式）。
方向に１塩基分だけ長い相補鎖であり、しかもプライマ
に取り込まれるのはいずれもダイマーであるため、第二
伸長工程において得られる第二反応生成物に含まれてい
るＤＮＡ鎖と第一伸長工程において得られる第一反応生
成物に含まれているＤＮＡ鎖は、例えばポリアクリルア
ミドゲル上にて互い違いな梯子状に展開されるようにな
る（下の４式）。
【００２２】 第一プライマ＋２＋２＋２＋２＋２＋… 第二プライマ＋２＋２＋２＋２＋２＋… −（４） ところで、上記のように、ポリアクリルアミドゲル上に
互い違いな梯子状に展開されるようにするためには、第
一反応生成物が展開されるポリアクリルアミドゲルのコ
ンディション及び展開条件と、第二反応生成物が展開さ
れるポリアクリルアミドゲルのコンディション及び展開
条件が一致していなければならない。しかしながら、こ
れは同時分離工程において、同一の条件下でポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法によって反応生成物は鎖長に応
じて分離されるので、前記同時分離工程において生成し
た互い違いの梯子状のバンドを読み取り分析することに
よりＤＮＡの塩基配列を決定することが可能となる。
互い違いな梯子状に展開されるようにするためには、第
一反応生成物が展開されるポリアクリルアミドゲルのコ
ンディション及び展開条件と、第二反応生成物が展開さ
れるポリアクリルアミドゲルのコンディション及び展開
条件が一致していなければならない。しかしながら、こ
れは同時分離工程において、同一の条件下でポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法によって反応生成物は鎖長に応
じて分離されるので、前記同時分離工程において生成し
た互い違いの梯子状のバンドを読み取り分析することに
よりＤＮＡの塩基配列を決定することが可能となる。
【００２３】
【実施例】以下、本発明の好適な一実施例について図に
基づいて説明していく。
基づいて説明していく。
【００２４】本実施例において特徴的なことは、サンガ
ー法において、アニーリング段階では２種類のプライマ
を用い、ＤＮＡの伸長段階ではデオキシヌクレオチドダ
イマートリフォスフェート（D-ｄＮＴＰ）を基質として
用いることである。また、本実施例においては、サンガ
ー法の内のターミネータ標識法について特に説明を進め
ていくため、伸長反応阻害剤として標識されたジデオキ
シヌクレオチドトリフォスフェート（ｄｄＮＴＰ* ）を
用い、同時にこれをターミネータとしている。ところ
で、デオキシヌクレオチド（ｄＮ）はデオキシヌクレオ
シドモノフォスフェート（ｄＮＭＰ）であり、このｄＮ
ＭＰにはアデニン（Ａ）由来のもの（ｄＡＭＰ），及び
チミン（Ｔ）由来のもの（ｄＴＭＰ），及びシトシン
（Ｃ）由来のもの（ｄＣＭＰ），及びグアニン（Ｇ）由
来のもの（ｄＧＭＰ）が存在するので、これに対応して
ｄＮＴＰにはｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ
の４種類が存在する。そして、前記D-ｄＮＴＰはｄＮＭ
ＰとｄＮＴＰの縮合体であるので、図１に示されている
ように、１６種類のダイマーを設定することが可能であ
る。
ー法において、アニーリング段階では２種類のプライマ
を用い、ＤＮＡの伸長段階ではデオキシヌクレオチドダ
イマートリフォスフェート（D-ｄＮＴＰ）を基質として
用いることである。また、本実施例においては、サンガ
ー法の内のターミネータ標識法について特に説明を進め
ていくため、伸長反応阻害剤として標識されたジデオキ
シヌクレオチドトリフォスフェート（ｄｄＮＴＰ* ）を
用い、同時にこれをターミネータとしている。ところ
で、デオキシヌクレオチド（ｄＮ）はデオキシヌクレオ
シドモノフォスフェート（ｄＮＭＰ）であり、このｄＮ
ＭＰにはアデニン（Ａ）由来のもの（ｄＡＭＰ），及び
チミン（Ｔ）由来のもの（ｄＴＭＰ），及びシトシン
（Ｃ）由来のもの（ｄＣＭＰ），及びグアニン（Ｇ）由
来のもの（ｄＧＭＰ）が存在するので、これに対応して
ｄＮＴＰにはｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ
の４種類が存在する。そして、前記D-ｄＮＴＰはｄＮＭ
ＰとｄＮＴＰの縮合体であるので、図１に示されている
ように、１６種類のダイマーを設定することが可能であ
る。
【００２５】また、図２に示されているように、テンプ
レートに備えられたＤＮＡ断片にアニーリングされるプ
ライマは、第一プライマと第二プライマの２種類が設定
されており、第二プライマは第一プライマよりも３´方
向に１塩基だけ長い相補鎖を有している。したがって、
第一プライマの伸長反応によって生成するＤＮＡ鎖と第
二プライマの伸長反応によって生成するＤＮＡ鎖の塩基
配列は互いにひとつづつずれていることとなる。
レートに備えられたＤＮＡ断片にアニーリングされるプ
ライマは、第一プライマと第二プライマの２種類が設定
されており、第二プライマは第一プライマよりも３´方
向に１塩基だけ長い相補鎖を有している。したがって、
第一プライマの伸長反応によって生成するＤＮＡ鎖と第
二プライマの伸長反応によって生成するＤＮＡ鎖の塩基
配列は互いにひとつづつずれていることとなる。
【００２６】そして、本実施例においては、第一プライ
マからの伸長反応によって生成する第一反応生成物と第
二プライマからの伸長反応によって生成する第二反応生
成物は、同一ゲル上にチャージされて電気泳動による分
離が行われる。このときゲル上に生成するバンドの状態
を示したものが図２に示されており、このように互い違
いに生じるバンドを交互に読むことによって、核酸の連
続した塩基配列を解読することが可能となっている。な
お、この場合においては、６％ポリアクリルアミドゲル
の電気泳動によって反応生成物を分離することが好適で
ある。
マからの伸長反応によって生成する第一反応生成物と第
二プライマからの伸長反応によって生成する第二反応生
成物は、同一ゲル上にチャージされて電気泳動による分
離が行われる。このときゲル上に生成するバンドの状態
を示したものが図２に示されており、このように互い違
いに生じるバンドを交互に読むことによって、核酸の連
続した塩基配列を解読することが可能となっている。な
お、この場合においては、６％ポリアクリルアミドゲル
の電気泳動によって反応生成物を分離することが好適で
ある。
【００２７】このようにして、本実施例においては、異
なった反応生成物（第一反応生成物に対する第二反応生
成物、または第二反応生成物に対する第一反応生成物）
において生成する前後の各バンドどうしは互いに１塩基
差を有しているが、同一反応生成物（第一反応生成物内
または第二反応生成物内）において生成する前後の各バ
ンドどうしは互いに２塩基差を有していることになる。
このため、従来の１塩基差に比べて、同一反応生成物内
におけるバンド間隔が広くなり、全体的なレゾリューシ
ョンが良くなるので、ＤＮＡの塩基配列決定の正確性を
向上させることが可能になる。また、ゲル濃度を下げ
る、電気泳動条件を変える、等の処置をすることによっ
てフラグメントの移動速度を早くすることができるの
で、より多くの塩基配列を読むことが可能となる。従っ
て、一回当たりの処理操作で多くの塩基配列の解析を行
うことができるので、結果的にはＤＮＡの塩基配列決定
法の解析密度と解析精度を向上させることが可能とな
る。
なった反応生成物（第一反応生成物に対する第二反応生
成物、または第二反応生成物に対する第一反応生成物）
において生成する前後の各バンドどうしは互いに１塩基
差を有しているが、同一反応生成物（第一反応生成物内
または第二反応生成物内）において生成する前後の各バ
ンドどうしは互いに２塩基差を有していることになる。
このため、従来の１塩基差に比べて、同一反応生成物内
におけるバンド間隔が広くなり、全体的なレゾリューシ
ョンが良くなるので、ＤＮＡの塩基配列決定の正確性を
向上させることが可能になる。また、ゲル濃度を下げ
る、電気泳動条件を変える、等の処置をすることによっ
てフラグメントの移動速度を早くすることができるの
で、より多くの塩基配列を読むことが可能となる。従っ
て、一回当たりの処理操作で多くの塩基配列の解析を行
うことができるので、結果的にはＤＮＡの塩基配列決定
法の解析密度と解析精度を向上させることが可能とな
る。
【００２８】ここで図３は、本実施例に係るＤＮＡ塩基
配列決定装置の操作の流れを示したフローチャートであ
る。
配列決定装置の操作の流れを示したフローチャートであ
る。
【００２９】まず、第一アニーリング工程Ｓ１０１にお
いて、以下に示されるような処理が施される。
いて、以下に示されるような処理が施される。
【００３０】（α１）テンプレートとなるｓｓ−ＤＮＡ
と約２倍量のプライマ、緩衝液を混合し、攪拌する。
と約２倍量のプライマ、緩衝液を混合し、攪拌する。
【００３１】（α２）（α１）で得られた溶液を９５℃
で２分間加熱した後、３７℃で１０分間以上放置して、
十分にアニールする。
で２分間加熱した後、３７℃で１０分間以上放置して、
十分にアニールする。
【００３２】次に、第一伸長工程Ｓ１０２において、以
下のような処理が施される。
下のような処理が施される。
【００３３】（β１）ＤＴＴ，D-ｄＮＴＰ，ｄｄＮＴ
Ｐ，ｄｄＮＴＰ* の混合溶液を調整する。
Ｐ，ｄｄＮＴＰ* の混合溶液を調整する。
【００３４】（β２）（β１）の混合溶液にＤＮＡポリ
メラーゼ、例えばセキュエンス（Ｓｅｑｕｅｎａｓ
ｅTM；商品名）を加えて調整する。
メラーゼ、例えばセキュエンス（Ｓｅｑｕｅｎａｓ
ｅTM；商品名）を加えて調整する。
【００３５】（β３）前記アニーリング手段（α２）の
反応溶液に（β２）の調整液を加え、３７℃で５分間イ
ンキュベートする。
反応溶液に（β２）の調整液を加え、３７℃で５分間イ
ンキュベートする。
【００３６】ここで、第二アニーリング工程Ｓ２０１に
おいては、第一プライマが第二プライマに置き換わった
だけで、他は第一アニーリング工程Ｓ１０１と同じ処理
が施される。同様にして、第二伸長工程Ｓ２０２におい
ても、第二アニーリング工程Ｓ２０１で得られる反応溶
液を用いるだけで、処理操作は第一伸長工程Ｓ１０２と
同じである。
おいては、第一プライマが第二プライマに置き換わった
だけで、他は第一アニーリング工程Ｓ１０１と同じ処理
が施される。同様にして、第二伸長工程Ｓ２０２におい
ても、第二アニーリング工程Ｓ２０１で得られる反応溶
液を用いるだけで、処理操作は第一伸長工程Ｓ１０２と
同じである。
【００３７】さらに、同時分離工程Ｓ３０１において
は、前記（β３）の溶液に所定の条件下で通常のエタノ
ール沈殿法が施されることによって、反応物の精製が行
われ、その後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
ってＤＮＡ鎖の長さに応じて分離が行われる。
は、前記（β３）の溶液に所定の条件下で通常のエタノ
ール沈殿法が施されることによって、反応物の精製が行
われ、その後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によ
ってＤＮＡ鎖の長さに応じて分離が行われる。
【００３８】そして、解析工程Ｓ３０２において、前記
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって得られるゲ
ル上のバンドの同定が行われて、最終的にＤＮＡの未知
の塩基配列が決定される。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によって得られるゲ
ル上のバンドの同定が行われて、最終的にＤＮＡの未知
の塩基配列が決定される。
【００３９】なお、本実施例において用いられるD-ｄＮ
ＴＰ（デオキシヌクレオチドダイマートリフォスフェー
ト）は、原料をセキュエンス（ＳｅｑｕｅｎａｓｅTM；
商品名）やタック（Ｔａｑ；商品名）等を初めとするＤ
ＮＡポリメラーゼやリガーゼを用いてこれらの酵素に特
有の条件で反応させて縮合させる等、公知の方法によっ
て容易に合成することが可能である。しかしながら、リ
ガーゼを用いて反応させた場合には、多少の誤差が生じ
ることがあるので注意を必要とする。
ＴＰ（デオキシヌクレオチドダイマートリフォスフェー
ト）は、原料をセキュエンス（ＳｅｑｕｅｎａｓｅTM；
商品名）やタック（Ｔａｑ；商品名）等を初めとするＤ
ＮＡポリメラーゼやリガーゼを用いてこれらの酵素に特
有の条件で反応させて縮合させる等、公知の方法によっ
て容易に合成することが可能である。しかしながら、リ
ガーゼを用いて反応させた場合には、多少の誤差が生じ
ることがあるので注意を必要とする。
【００４０】また、セキュエンス（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ
TM；商品名）を用いてＤＮＡの伸長を行っているが、本
実施例に係る基質を用いてＤＮＡの伸長を行う場合の酵
素はこれに限られるものではなく、この他にもリバース
トランスクリプターゼ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔａｓｅ；商品名）やタック（Ｔａｑ；商品名）
等を初めとしてあらゆるＤＮＡポリメラーゼを用いるこ
とが可能である。
TM；商品名）を用いてＤＮＡの伸長を行っているが、本
実施例に係る基質を用いてＤＮＡの伸長を行う場合の酵
素はこれに限られるものではなく、この他にもリバース
トランスクリプターゼ（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔａｓｅ；商品名）やタック（Ｔａｑ；商品名）
等を初めとしてあらゆるＤＮＡポリメラーゼを用いるこ
とが可能である。
【００４１】更に、伸長反応阻害剤に施す標識も蛍光標
識に限られるものではなく、ラジオアイソトープによる
標識等を初めとしてあらゆる標識を施すことが可能であ
る。すなわち、本実施例においては、サンガー法の内の
ターミネータ標識法について説明をしたが、本発明の核
酸の塩基配列決定方法はこれに限られるものではなく、
プライマ標識法やＲＩ標識法等のあらゆるサンガー法に
ついて適用できるものである。
識に限られるものではなく、ラジオアイソトープによる
標識等を初めとしてあらゆる標識を施すことが可能であ
る。すなわち、本実施例においては、サンガー法の内の
ターミネータ標識法について説明をしたが、本発明の核
酸の塩基配列決定方法はこれに限られるものではなく、
プライマ標識法やＲＩ標識法等のあらゆるサンガー法に
ついて適用できるものである。
【００４２】
【発明の効果】以上のように構成された本発明に係る核
酸の塩基配列決定方法及び決定装置においては、ＤＮＡ
の塩基配列決定におけるレゾリューションを向上させる
ことによって塩基配列決定の正確性を向上させることが
できるともに、一回の電気泳動法で解析できる塩基の数
を増加させることによって解析密度、ひいては処理速度
を向上させることが可能となっている。
酸の塩基配列決定方法及び決定装置においては、ＤＮＡ
の塩基配列決定におけるレゾリューションを向上させる
ことによって塩基配列決定の正確性を向上させることが
できるともに、一回の電気泳動法で解析できる塩基の数
を増加させることによって解析密度、ひいては処理速度
を向上させることが可能となっている。
【図１】本実施例におけるジデオキシヌクレオチドトリ
フォスフェートのダイマーの組み合わせを示した図であ
る。
フォスフェートのダイマーの組み合わせを示した図であ
る。
【図２】本実施例に係るＤＮＡの塩基配列決定法を説明
する説明図である。
する説明図である。
【図３】本実施例の操作の流れを示したフローチャート
である。
である。
【図４】サンガー法（ターミネータ標識法）によるＤＮ
Ａの塩基配列決定法を説明する説明図である。
Ａの塩基配列決定法を説明する説明図である。
D-ｄＮＴＰ デオキシヌクレオチドダイマートリフォス
フェート Ｓ１０１ 第一アニーリング工程 Ｓ１０２ 第一伸長工程 Ｓ２０１ 第二アニーリング工程 Ｓ２０２ 第二伸長工程 Ｓ３０１ 同時分離工程 Ｓ３０２ 解析工程
フェート Ｓ１０１ 第一アニーリング工程 Ｓ１０２ 第一伸長工程 Ｓ２０１ 第二アニーリング工程 Ｓ２０２ 第二伸長工程 Ｓ３０１ 同時分離工程 Ｓ３０２ 解析工程
Claims (2)
- 【請求項１】核酸の塩基配列を決定するサンガー法にお
いて、 塩基配列決定の対象となるＤＮＡに、第一プライマとな
る相補鎖を加えて第一ヘテロ二本鎖を作成する第一アニ
ーリング工程と、 デオキシヌクレオチドダイマートリフォスフェートを反
応基質として用い、これとともに伸長反応阻害剤を添加
して前記第一ヘテロ二本鎖の伸長反応を行う第一伸長工
程と、 前記塩基配列決定の対象となるＤＮＡに、前記第一プラ
イマよりも１塩基分だけ長い相補鎖を第二プライマとし
て用いて第二ヘテロ二本鎖を作成する第二アニーリング
工程と、 デオキシヌクレオチドダイマートリフォスフェートを反
応基質として用い、これとともに伸長反応阻害剤を添加
して前記第二ヘテロ二本鎖の伸長反応を行う第二伸長工
程と、 前記第一伸長工程で得られた第一反応生成物と前記第二
伸長工程で得られた第二反応生成物とを同一の条件下で
鎖長に応じて分離する同時分離工程と、 を含み、 前記同時分離工程において生成した梯子状のバンドを分
析することによってＤＮＡの塩基配列を決定することを
特徴とする核酸の塩基配列決定法。 - 【請求項２】核酸の塩基配列を決定するサンガー法にお
いて、 塩基配列決定の対象となるＤＮＡに、第一プライマとな
る相補鎖を加えて第一ヘテロ二本鎖を作成する第一アニ
ーリング工程と、 デオキシヌクレオチドダイマートリフォスフェートを反
応基質として用いるとともに、標識された伸長反応阻害
剤をターミネータとして用いて前記第一ヘテロ二本鎖の
伸長反応を行う第一伸長工程と、 前記塩基配列決定の対象となるＤＮＡに、前記第一プラ
イマよりも１塩基分だけ長い相補鎖を第二プライマとし
て用いて第二ヘテロ二本鎖を作成する第二アニーリング
工程と、 デオキシヌクレオチドダイマートリフォスフェートを反
応基質として用いるとともに、標識された伸長反応阻害
剤をターミネータとして用いて前記第二ヘテロ二本鎖の
伸長反応を行う第二伸長工程と、 前記第一伸長工程で得られた第一反応生成物と前記第二
伸長工程で得られた第二反応生成物とを同一の条件下で
鎖長に応じて分離する同時分離工程と、 を含み、 前記同時分離工程において生成した梯子状のバンドを分
析することによってＤＮＡの塩基配列を決定することを
特徴とする核酸の塩基配列決定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19692391A JPH0538299A (ja) | 1991-08-07 | 1991-08-07 | 核酸の塩基配列の決定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19692391A JPH0538299A (ja) | 1991-08-07 | 1991-08-07 | 核酸の塩基配列の決定法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0538299A true JPH0538299A (ja) | 1993-02-19 |
Family
ID=16365921
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19692391A Pending JPH0538299A (ja) | 1991-08-07 | 1991-08-07 | 核酸の塩基配列の決定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0538299A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009222390A (ja) * | 2008-03-13 | 2009-10-01 | Shimadzu Corp | 核酸塩基種を識別する方法と塩基配列決定方法 |
-
1991
- 1991-08-07 JP JP19692391A patent/JPH0538299A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009222390A (ja) * | 2008-03-13 | 2009-10-01 | Shimadzu Corp | 核酸塩基種を識別する方法と塩基配列決定方法 |
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