JPH05344896A

JPH05344896A - 固定化微生物によるエステル合成方法

Info

Publication number: JPH05344896A
Application number: JP18041092A
Authority: JP
Inventors: Shinobu Oda; 忍小田
Original assignee: Kansai Paint Co Ltd
Current assignee: Kansai Paint Co Ltd
Priority date: 1992-06-15
Filing date: 1992-06-15
Publication date: 1993-12-27

Abstract

(57)【要約】【目的】エステル合成反応の触媒能を有する微生物の
固定化増殖菌体を用いて、反応速度と収率の高い微生物
的エステル合成方法を提供する。【構成】親水性固定化担体にカルボン酸類とアルコー
ル類とのエステル合成反応を触媒する能力を有する微生
物を付着固定化し、該微生物の栄養源を含む水性媒体の
存在下に、カルボン酸類およびアルコール類を含む実質
的に水に不溶性ないし難溶性の有機溶媒を該担体上の固
定化菌体相と接触せしめるエステル合成方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は固定化微生物を用いるカ
ルボン酸類およびアルコール類からのエステル合成方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術とその課題】従来より、工業上重要な各種
エステル類が酸触媒下での加熱によるカルボン酸類とア
ルコール類との縮合反応、酸塩化物または酸無水物とア
ルコール類との反応、エステル交換反応による合成など
の化学的合成方法により大量に製造されている。しかし
これら化学的方法は、厳しい反応条件下での副反応の進
行による収率の低下や副生物の生成、大きなエネルギー
消費、立体選択性および位置選択性の欠如など多くの問
題点を抱えている。

【０００３】一方、リパーゼやエステラーゼのような加
水分解酵素あるいはその供給源たる微生物菌体を用いた
エステル類の合成方法も、特に立体選択的エステル合成
による工学分割の領域で活用されている［太田博道「バ
イオサイエンスとインダストリー」４９巻、８２３（１
９９１）参照］。

【０００４】しかしながら、これら酵素的あるいは微生
物的エステル合成反応では、反応平衡を合成方向へ傾け
るために反応系を有機溶媒系にしなければならないた
め、場合によっては酵素や菌体が失活してしまうこと、
合成反応の進行とともに生じてくる生成水を除去しなけ
ればならないこと、生体触媒の分散性が悪く反応後の触
媒の分離が困難であること等の多くの問題点がある。

【０００５】したがって、上述のエステル類の化学的合
成法の欠点を克服し、なおかつ既存の生物的エステル合
成反応の欠陥を補うような新規なエステル類の生物的合
成方法の開発が強く望まれている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者は、上
記したような微生物菌体を用いた有機溶媒中でのエステ
ル合成反応において、有機溶媒中で微生物を増殖させ、
その生命活動を維持させつつエステル合成反応を行なわ
せる技術について鋭意検討を重ねた結果、栄養源および
水を含む親水性固定化担体に微生物を植菌し、これに微
生物に対して毒性を発現しない有機溶媒を接触させる
と、有機溶媒と固定化担体との界面で微生物菌体が旺盛
に増殖して担体上に菌体相を形成し、この菌体相が有機
溶媒中に添加したカルボン酸類およびアルコール類を高
い反応速度と収量でエステル化することを見出し、本発
明を完成するに至った。

【０００７】かくして、本発明に従えば、親水性固定化
担体にカルボン酸類とアルコール類からのエステル合成
反応を触媒する能力を有する微生物を付着固定化し、該
微生物の栄養源を含む水性媒体の存在下に、カルボン酸
類およびアルコール類を含む実質的に水に不溶性ないし
難溶性の有機溶媒を該担体上の固定化菌体相と接触せし
めることを特徴とするエステル合成方法が提供される。

【０００８】本発明の１つの特徴は、脂肪族炭化水素に
代表される有機溶媒と親水性固定化担体との界面で、微
生物の栄養源を含む水性媒体を供給しつつ微生物を増殖
させて形成された菌体相を触媒として利用できる点にあ
る。これにより、カルボン酸類およびアルコール類を実
質的に水不溶性もしくは難溶性の有機溶媒に溶解した形
で該菌体相に接触させてエステル合成反応を行なわせる
ことが可能になり、その結果、高い反応速度と触媒の長
期安定性が達成され、撹拌動力が事実上不要である等の
利点が得られる。

【０００９】また、本発明のもう１つの特徴は、基質で
あるカルボン酸類あるいはアルコール類は微生物に対し
て強い毒性を示すにもかかわらず、これらを非常に高い
濃度で有機溶媒に添加することができ、菌体相に接触し
得る点にある。例えば、オクタン酸やデカン酸などの中
鎖脂肪酸は、有機溶媒中の濃度が３０％以上であっても
菌体相に接触可能であり、オクタノールやデカノールな
どの中鎖アルカノールは１０〜２０％の濃度で接触可能
である。このように本発明の方法によれば、微生物菌体
相に対して高濃度のカルボン酸類あるいはアルコール類
を接触することが可能であり、その結果、高い反応速度
と高い収量が得られ、エステル類を低いコストで合成す
ることができる。

【００１０】さらに、本発明のさらにもう１つの特徴
は、エステル合成反応の際に生じてくる生成水が自動的
に水側すなわち親水性固定化担体側へ除去されるため、
反応の場である固定化菌体相と有機溶媒との界面からの
生成水の除去によって、反応平衡が合成側にシフトする
点にある。このことにより、加水分解とエステル化の反
応平衡は大きくエステル化の方向へ傾くことになり、結
果として反応収率が著しく向上する。

【００１１】以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。

【００１２】なお、上記固定化菌体相に接触させる有機
溶媒又は基質であるカルボン酸類およびアルコール類の
有機溶媒溶液を、以下、有機液相ということがある。

【００１３】本発明で使用可能な固定化担体は、親水性
のものであれば特に制約はなく、栄養源を含む水溶液を
含浸もしくは接触させて有機溶媒との界面に存在する微
生物にこれを供給することができるものであれば、いか
なる素材であっても使用可能であり、具体的には例え
ば、アルギン酸、カラギーナン、デンプンマトリック
ス、寒天、濾紙のようなセルロース材などの天然高分
子：ポリビニルアルコール、ウレタンポリマー、ポリア
クリルアミド、ポリアクリル酸などの合成高分子：泡ガ
ラス、シリカゲルなどの無機物などが挙げられる。

【００１４】これら固定化用担体の形状には特に制限は
なく、繊維状、膜状、粒状等の任意の形状に成形されて
いることができ、また布、不織布、紙、ボール紙等の形
態に成形されたものであってもよい。

【００１５】一方、上記固定化菌体相に接触する有機液
相における有機溶媒又は基質のカルボン酸類およびアル
コール類の有機溶媒溶液調製用の有機溶媒は、付着微生
物菌体に対して実質的に毒性を示さないものが好まし
く、具体的には、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナ
ン、デカン等の炭素数６〜２０のメタン系炭化水素に代
表されるノルマルパラフィン類又は流動パラフィン類：
イソオクタン等のイソパラフィン類：ペンチルベンゼ
ン、ヘキシルベンゼン、ヘプチルベンゼン、オクチルベ
ンゼン等の脂肪族鎖の炭素数が５〜１５のノルマルアル
キルベンゼン類：キユメン等のイソアルキルベンゼン
類：シクロヘキサン等の脂環式炭化水素類：ジエチルエ
ーテル等のエーテル類などを例示することができる。

【００１６】上記固定化担体に付着させ、担体と有機液
体との界面で増殖させて使用するエステル合成能を有す
る微生物は、細菌類、カビ類、酵母、放線菌類等のいず
れの微生物であってもよく、また、好気性、嫌気性のい
ずれでもよい。具体的には例えば、シユードモナル（Ps
eudomonas）属、クロモバクテリウム（Chromobacteriu
m）属、マイクロバクテリウム（Microbacterium）属、
マイクロコツカス（Micrococcus）属、スタフイロコツ
カス（Staphylococcus）属、エシエリシア（Escherichi
a）属、バチルス（Bacillus）属、アリスロバクター（A
rthrobacter）属、マイコバクテリウム（Mycobacteriu
m）属等の細菌類；カンジダ（Candida）属等の酵母類；
フイコマイセス（Phycomyces）属、ムコール（Mucor）
属、ペニシリウム（Penicillium）属、リゾプス（Rhizo
pus）属、タミデイウム（Tammidium）属、ケトステイラ
ム（Chaetostylum）属、アスペルギルス（Aspergillu
s）属、ジオトリカム（Geotrichum）属等のカビ類に属
する微生物が挙げられる。さらに具体的には、シユード
モナス・フラジ（Ps．fragi）、シユードモナス・フル
オレツセンス（Ps．fluorescens）、クロモバクテリウ
ム・チヨコラチウム（Ch．chocolatum）、マイクロバク
テリウム・アルボレセンス（Mb．arborescens）、マイ
クロコツカス・バリアンス（Mc．varians）、スタフイ
ロコツカス・オーレウム（Sc．aureus）、エシエリシア
・コリー（Es．coli）、バチルス・サブチリス・サブス
ピーシス・ニーガー（Ba．subtilis subsp．niger）、
カンジダ・リポリテイカ（Ca．lipolytica）、フイコマ
イセス・ニテンス（Ph．nitens）、ムコール・スフ（M
u．sufu）、ペニシリウム・ロクエフオルテイ（Pe．roq
ueforti）、リゾプス・オリゴスポラス（Rh．oligospor
us）、タミデイウム・エレガンス（Ta．elegans）、ケ
トステイラム・フレスネイ（Ch．fresnei）、アスペル
ギルス・フラバス（As．flavus）、ジオトリカム・キヤ
ンデイダム（Ge．candidum）等を挙げることができる。

【００１７】かかる微生物の担体への付着固定化は、例
えば、菌体分散液をあらかじめ栄養源を含む水性媒体を
含ませた担体に塗布または散布するか、担体を菌体培養
液中に浸漬するか、微生物菌体を適当な方法で担体に付
着させた後、担体に栄養源を含む水性媒体を供給する等
の方法で担体上に微生物菌体を付着させた後、その担体
をあらかじめ栄養源を含む水性媒体中で培養することも
できるが、通常、基質としてのカルボン酸類およびアル
コール類を含むか含まない有機溶媒と接触させた状態で
培養し、付着した微生物菌体を担体と有機溶媒との界面
で増殖させて担体上に固定化菌体相を形成させることに
より行うのが適当である。この培養により、微生物は担
体表面に強固に付着し、固定化菌体相が担体から剥離す
るようなことはほとんどない。

【００１８】上記培養において使用し得る微生物の栄養
源は、使用菌体の種類に応じて、その菌体に最適のもの
を選択することができ、例えば、グルコース等の炭素
源、尿素等の窒素源、硫酸マグネシウム等の微量金属
塩、酵母エキス等の微量栄養源からなる一般的なもので
よい。

【００１９】固定化菌体への栄養源を含む水性媒体すな
わち培養液の供給は、担体が例えば寒天のように培養液
を充分に含有保持しうるものであれば、担体に予め含ま
せておくことにより行うことができ、及び／又は例え
ば、上記有機液相に培養液を加え、形成される有機液相
と培養液相の界面に微生物固定化担体を介在させること
により行うこともできる。

【００２０】培養は一般に、恒温槽、インキュベーター
等の培養装置中で行うことができ、あるいは担体を含む
か含まない有機溶媒中に浸漬し、場合によっては更に栄
養源を含む水性媒体を加えた反応容器中で温度調節しな
がら行ってもよい。培養温度、培養時間等の培養条件は
使用微生物の種類に応じて、最適の条件を選択すること
ができる。

【００２１】増殖に酸素を必要とする場合は、有機溶媒
中に通気すればよいが、一般には有機溶媒は水にくらべ
て数倍から十数倍の酸素溶解度を有しているため、必ず
しも通気する必要はない。また、培養中の撹拌について
も、基質であるカルボン酸類又はアルコール類は有機溶
媒に溶解して存在しているため、エマルジョン系のよう
な強烈な撹拌は不要であり、また、撹拌が全く不要であ
る場合も少なくない。基質としてのカルボン酸類又はア
ルコール類は、上記培養の初期から添加してもよく、又
は微生物が十分に増殖して菌体相を形成した後に添加し
てもよい。あるいは培養初期から固定化菌体相形成まで
の任意の時点で加えてもよい。カルボン酸類又はアルコ
ール類は微生物に対して少なからず毒性を発現する場合
が多いため、一般には、菌体相が十分に成長してから添
加する方が高い成績が達成される。

【００２２】かくして、担体上の固定化菌体相を、基質
としてのカルボン酸類およびアルコール類の有機溶媒溶
液からなる有機液相との接触状態で培養をつづけること
により、エステル合成反応を行なわせることができる。

【００２３】この固定化微生物によるエステル合成反応
に基質として供しうるカルボン酸類およびアルコール類
としては特に制限はなく、固定化微生物のエステル合成
能に応じて各種のものが使用できる。

【００２４】基質として供しうるカルボン酸類として
は、例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプ
ロン酸、オクタン酸、デカン酸等の低級脂肪酸；ラウリ
ン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オ
レイン酸、リノール酸、リノレン酸等の高級脂肪酸；安
息香酸、メチル安息香酸、サリチル酸等の芳香族モノカ
ルボン酸；コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイ
ン酸、フマル酸、イタコン酸等の脂肪族ジカルボン酸；
フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸、トリメリツト
酸、ピロメリツト酸等の芳香族多価カルボン酸；テトラ
ヒドロフタル酸、ヘキサヒドロフタル酸、エンドメチレ
ンテトラヒドロフタル酸等の脂環式多価カルボン酸等が
挙げられる。

【００２５】一方、基質として供しうるアルコール類と
しては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノー
ル、ブタノール、アミルアルコール、オクタノール、デ
カノール等の低級アルコール；ラウリルアルコール、ミ
リスチルアルコール、セチルアルコール、ステアリルア
ルコール、オレイルアルコール等の高級アルコール；エ
チレングリコール、プロピレングリコール、ブタンジオ
ール、ヘキサンジオール、グリセリン、トリメチロール
プロパン、ペンタエリスリトール、ソルビトール、マン
ニツト等の脂肪族多価アルコール；ベンジルアルコール
等の芳香族アルコール；シクロヘキサノール等の脂環式
アルコール等が挙げられる。

【００２６】有機溶媒中のカルボン酸類およびアルコー
ル類の濃度は特に制限されるものではなく、菌体に対す
る毒性に応じて決めることができる。カルボン酸類およ
びアルコール類が実質的に水不溶性ないしは難溶性の場
合には、これらが水相すなわち親水性固定化担体側へ移
行しないため、その菌体に対する毒性を大幅に減じるこ
とができ、多くの微生物に対して１０〜２０％以上の濃
度、あるいは菌株によっては１００％濃度、すなわちカ
ルボン酸類およびアルコール自体を有機液相とすること
も可能である。一方、酢酸、プロピオン酸等の低級カル
ボン酸やエタノール、プロパノール等の低級アルコール
のような水溶性の基質の場合には、これらが水相側に移
行して菌体に対して毒性を発現する場合があるので、菌
株の耐性に応じて濃度を決める必要がある。

【００２７】本発明の方法によれば、生成する副生水は
水側に連続的に移行し、生産物のエステル類は多くの場
合水に不溶であるため、有機液相側に蓄積する。その結
果、生成エステル類の微生物に対する毒性も大幅に減少
する。例えば、オクタン酸エチルやカプロン酸エチルの
ような中鎖脂肪族エステル類は、多くの微生物に対して
実質的に１００％の濃度で接触可能であり、その場合で
も生産物阻害作用は実質的に全く問題とならない。

【００２８】以上に述べた本発明の方法によれば、脂肪
族、芳香族、脂環式等のエステル類の合成反応を固定化
微生物の増殖菌体相を用いて極めて効率的に行なうこと
ができる。その際、カルボン酸のβ−酸化等の増殖菌体
にもとずく副反応が生ずる可能性がある場合には、適当
な代謝又は変換阻害剤の添加によってそれを阻害するか
又はそのような副反応が生じないように育種改良した代
謝欠損株を用いることができる。

【００２９】本発明の方法によれば、前述したように、
生産物のエステル類は、有機液相に高濃度に蓄積され
る。従って、有機液相に蓄積されるエステル類を回収
し、基質のカルボン酸類及びアルコール類を補充する等
の方法を行なうことにより、固定化菌体相と基質との接
触頻度を飛躍的に増加せしめることができ、反応速度と
収率、収量を大幅に向上させることが可能となり、連続
操業も可能となる。

【００３０】かくして、本発明の方法を、例えば工業薬
品、医薬品、化粧品、香料、洗剤、界面活性剤、繊維処
理剤、油脂、染料、塗料、印刷材料等の分野における工
業上重要な各種エステル類の製造工程に適用することに
より、生産コストの低下、工程の省エネルギー化、省力
化等、工業的に有利な種々の利点を得ることができる。

【００３１】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。なお、部及び％は重量基準である。

【００３２】実施例１表１に示す細菌類についてはポリペプトン１．０％、酵
母エキス０．２％、硫酸マグネシウム０．１％、寒天
１．５％よりなる寒天培地（ｐＨ７．０）を、カビ類に
ついてはペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽
エキス０．３％、グルコース１．０％、寒天１．５％よ
りなる寒天培地（ｐＨ６．０）を用いて、ガラスシャー
レ中に寒天平板を作成した（表面積３８．５ｃｍ²）。
これに各種微生物懸濁液１００μｌをコンラージ棒を用
いて塗沫し、１％オクタン酸と０．５％ｎ−ブタノール
を含むｎ−パラフィン（炭素数１１〜１５）１０ｍｌを
重層して、３０℃、５日間静置培養して菌体相を形成さ
せた。培養後、溶媒相１μｌをガスクロマトグラフィー
によって分析し、生成オクチル酸ｎ−ブチルエステル濃
度を測定した。その結果を表１に示す。

【００３３】

【表１】表１オクチル酸ｎ−ブチル供試微生物生成濃度(g/l) シュードモナス・フラジ IFO 12049 9.7 シュードモナス・フルオレツセンス IFO 3903 11.3 クロモバクテリウム・チヨコラチウム IFO 3758 8.6 バチルス・サブチリス・サブスピーシス・ニーガー IFO 3108 16.2 エツシエリシア・コリ IFO 13168 9.9 マイクロバクテリウム・アーボレセンス IFO 3750 11.1 ミクロコツカス・バリアンス IFO 3765 9.8 アスペルギルス・ソイヤエ IMA 2703 7.5 ジオトリカム・キヤンデイダム JCM 01747 12.4実施例２実施例１で用いた寒天培地１００ｍｌを内容量４８０ｍ
ｌの密栓可能なガラス容器に注いで寒天平板を調製し
た。これに実施例１で用いた標準株の懸濁液１００μｌ
をコンラージ棒を用いて植菌し、３０℃で１日間静置培
養して菌体相を形成させた。これに５％コレステロール
を溶解させたｎ−オクタン酸溶液を１０ｍｌ重層し、３
０℃、１００ｒｐｍの振盪下で７日間培養した。培養
後、溶媒相１μｌをガスクロマトグラフィーで分析し、
生成オクチル酸コレステロールエステル濃度を測定し
た。その結果を表２に示す。

【００３４】

【表２】表２オクチル酸コレステロール供試微生物生成濃度(g/l) シュードモナス・フラジ IFO 12049 6.9 シュードモナス・フルオレツセンス IFO 3903 12.8 クロモバクテリウム・チヨコラチウム IFO 3758 5.4 バチルス・サブチリス・サブスピーシス・ニーガー IFO 3108 15.5 エツシエリシア・コリ IFO 13168 11.0 マイクロバクテリウム・アーボレセンス IFO 3750 7.6 ミクロコツカス・バリアンス IFO 3765 7.0 アスペルギルス・ソイヤエ IMA 2703 8.3 ジオトリカム・キヤンデイダム JCM 01747 10.2実施例３既知の方法によって調製したアルギン酸カルシウムビー
ズをポリプペトン１．０％、酵母エキス０．２％、硫酸
マグネシウム０．１％、塩化カルシウム１．０％よりな
る培地中に浸漬し高圧蒸気減菌後冷却することにより、
ビーズ内部を上記培地で置換した。このビーズをバチル
ス・サブチリス・サブスピーシス・ニーガーＩＦＯ
３１０８の１日培養液中に３０分間浸漬した後培養液を
除去した。このようにして得られた菌体付着アルギン酸
カルシウムビーズ３０ｇをデカン酸５．０％、ｎ−ヘキ
サノール０．５％を含むｎ−ヘキサデカン溶液２０ｍｌ
に投入し３０℃で７日間静置培養した。培養後、溶媒相
１μｌをガスクロマトグラフィーによって分析し、生成
デカン酸ｎ−ヘキサノールエステル濃度を測定した。そ
の結果、１６．７ｇ／ｌのエステルを蓄積していること
が確認された。

【００３５】実施例４ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．２％、硫酸マグ
ネシウム１．０％よりなる液体培地を含浸させたシリカ
ゲルプレート（厚さ３ｍｍ、表面積２５ｃｍ²）をシュ
ードモナス・フラジＩＦＯ１２０４９の１日培養液
中に１分間浸漬し、菌体が付着したシリカゲルプレート
を調製した。これをデカン酸５．０％、ｎ−ブタノール
０．５％を含むｎ−パラフィン溶液２０ｍｌに浸漬し、
３０℃、７日間静置培養した。培養後、溶媒相１μｌを
ガスクロマトグラフィーによって分析し、生成デカン酸
ｎ−ブチルエステル濃度を測定した。その結果、２．３
ｇ／ｌのエステルの蓄積が確認された。

【００３６】比較例リパーゼＡＭＡＮＯ−ＰＳ（天野製薬製）５ｇをデカ
ン酸５．０％、ｎ−ヘキサノール０．５％を含むｎ−ヘ
キサデカン２０ｍｌ中に投入し、３０℃、１５０ｒｐｍ
の振盪下７日間反応させた。反応後、ジエチルエーテル
で３回抽出し、乾燥、希釈後、ガスクロマトグラフィー
によって生成デカン酸ｎ−ヘキシルエステル濃度を測定
した。その結果、７．７ｇ／ｌのエステルの蓄積を確認
した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:39） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:265） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】親水性固定化担体にカルボン酸類とアル
コール類からのエステル合成反応を触媒する能力を有す
る微生物を付着固定化し、該微生物の栄養源を含む水性
媒体の存在下に、カルボン酸類およびアルコール類を含
む実質的に水に不溶性ないし難溶性の有機溶媒を該担体
上の固定化菌体相と接触せしめることを特徴とするエス
テル合成方法。