JPH0533981B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明は、動物の遊離細胞のアルギン酸カルシ
ウムによるカプセル化に関するものであり、より
詳しくは、動物細胞の培養に適した液状培地に、
アルギン酸ソーダを溶解せしめ、これら細胞の活
性維持のため仔ウシなどの血清及び／又はホルモ
ンを添加してなる水溶液に対して、動物の遊離細
胞を混合比１：0.01〜１：１で混合・懸濁し、そ
の粘度を１〜100ps（37℃）としたものをカルシウ
ムイオン水溶液中に滴下、凝固せしめることを特
徴とする動物細胞のカプセル化方法に関するもの
であり、生理活性物質の製造、人工臓器などの分
野で利用価値の高いものである。 〔従来技術〕 従来から各種の細胞や微生物を固定化するため
の方法の１つとしてカプセル化が行なわれ、主と
して実験室的に利用されて来たが、その主な方法
は細胞や微生物を懸濁せしめたモノマー溶液を低
温重合により、該細胞や微生物をポリアクリルア
ミド系ゲル中に分散、固定化せしめ、これを破砕
（例えばAppl，Microbiol.，27，878（1974））、ま
たは網目からの押出し（例えばBiotechnol.
Bioeng.，18，217（1976））によつて粒状または
棒状物とするものである。 しかしこれらの方法によつて成形した粒状また
は棒状物表面の細胞または微生物の多くは、成形
の際に大なり小なりの損傷を受け、特に細胞の場
合は殆どのものが死滅するし、微生物の場合は剥
脱するものやカプセル化剤を被らずむき出しにな
るものも生じる。また、破砕して製造した粒状物
においては、形状およびサイズが著しく不揃いと
なることが避けられず、この２つの理由から、得
られる粒状物または棒状物の表面における細胞や
微生物の生物学的活性は、部分的に低下して不均
一性を生じ、さらにそれら粒状物や棒状物の表面
で死滅した細胞や微生物による培地や粒状物など
の汚染を防止することも困難である。 これらの点を改良する目的で蒸留水にアルギン
酸ソーダを溶かした水溶液に細胞や微生物を混合
し、その懸濁液を塩化カルシウム水溶液中に滴下
して球形のカプセル化物を得るとか、さらにこの
表面をポリアミドなどでコーテイングし、中のア
ルギン酸カルシウムから成るゲル化物層を薬液に
より再溶解し、この外側に形成した該ポリアミド
などから成るコーテイング層内において封入した
細胞や微生物を流動状態にする方法（例えば
Science，210，908（1980））などが提案されてい
る。しかし蒸留水又は生理食塩水にアルギン酸ソ
ーダのみを溶解した水溶液に細胞や微生物を懸濁
せしめ、塩化カルシウム水溶液中に滴下してカプ
セル化した場合は、該細胞や微生物の生存時間が
著しく短くなるという欠点があつた。 〔発明の目的〕 本発明の目的とするところは、均一な粒径と、
均一、緻密で滑らかな半硬質表面を有する球形で
あり、被カプセル化動物細胞がカプセル化の際に
損傷されたり、未コート状のままでカプセル表面
に残留することが無く、該カプセルを液状培地中
にて攪拌し、又はカラムに充填して代謝を行なわ
せた場合にも、カプセルの形状が安定しており、
細胞の生存率の維持と高い代謝活性の保持が容易
な動物細胞のカプセル化方法を提供するにある。 本発明者らはこれらの点を改良すべく鋭意研究
を行なつた結果、動物細胞の培養に適した液状培
地をベースにし、アルギン酸ソーダを溶かした後
滅菌し、これの1/100〜1/2容の別に滅菌したウマ
血清、ウシ血清、仔ウシ血清、ウシ胎児血清、
10^-7〜10^-10mol／のインスリン、及び10^-4〜
10^-7mol／のデキサメサゾンの一種又は二種以
上を添加し、この水溶液の１：0.01〜１：１容の
動物細胞を混合し、この懸濁液の粘度を１〜
100ps（37℃）とした上でカルシウムイオン水溶液
中に滴下することにより、緻密で半硬質の表面と
均一な粒径を有する球型のカプセル化物とするこ
とができ、且つカプセル化した細胞の生存率及び
代謝能の維持にも最適であることを発見して、こ
の発明を完成するに至つたものである。 〔発明の構成〕 即ち本発明は、細胞又は微生物をアルギン酸ソ
ーダ水溶液に懸濁せしめ、これをカルシウムイオ
ン水溶液中に滴下し凝固せしめることによつて、
細胞又は微生物をカプセル化する方法において、
細胞は動物の遊離細胞であり、アルギン酸水溶液
はMEM，WE，HamのＦ−12もしくはＦ−199，
Leiboviz−15、又はWaymouth's MB751/2の群
から選んだ一種の液状培地にアルギン酸ソーダを
溶解せしめた溶液100部に、１〜50部のウマ血清、
ウシ血清、仔ウシ血清、ウシ胎児血清、10^-7〜
10^-10mol／のインスリン、及び10^-4〜10^-7
mol／のデキサメサゾンの一種又は二種以上を
添加して成り、これに対する動物の遊離細胞の混
合比が１：0.01〜１：１であり、アルギン酸ソー
ダ水溶液に動物の細胞を混合して成る懸濁液の粘
度を１〜100ps（37℃）としたことを特徴とする、
動物遊離細胞のカプセル化方法である。 本発明で言うところの動物遊離細胞とは、動物
の肝臓を酵素で処理して得られる遊離肝細胞、動
物の膵臓を酵素で処理して得られるランゲルハン
ス島細胞（Langerhans−）等である。 本発明において用いられる遊離肝細胞は、公知
の方法（例えばMethods Cell，Biol.，13，29
（1976））に従つて、蛋白質分解酵素を動物肝臓に
インシチユー（in situ）に灌流して取出した後、
Hanks液を用いて洗浄したものを使用すること
ができ、このようにして得た遊離肝細胞は直ちに
カプセル化してもよいし、特許請求範囲の項に記
した各種の液状培地を用いて数時間〜数日間初代
培養した上でカプセル化してもよく、何れの場合
も同様に活性な細胞のカプセル化物を得ることが
できる。 本発明において用いられるMEM，WE，Ham
のＦ−12もしくはＦ−199，Leibovitz−15，
Waymuoth's MB 751/2の液状培地は、組織培
養に用いる液状培地のうちで細胞の生存率及び代
謝活性の維持、及び本発明によるカプセル化の工
程に最適のものであるが、これらは何れも単独で
用いた場合、カプセル化した肝細胞の生存率及び
代謝活性の維持能はなお不充分であるため、種々
検討を行なつた結果、この性能を向上させるため
ウマ、ウシ、仔ウシ又はウシ胎児の血清の新鮮な
ものもしくは凍結保存したものの他、インスリン
もしくはデキサメサゾンのホルモンから選んだ一
種又は二種以上を併用することによつて、良好な
結果が得られることを見出したものである。これ
ら血清の添加量は、何れも１部以下では効果が極
めて小さく、50部以上では効果が飽和するため、
この添加量は１〜50部とすることが必要であり、
ホルモンの添加量としては同様の理由から、イン
スリンは10^-7〜10^-10mol／、デキサメサゾンは
10^-4〜10^-7mol／とする必要がある。 これらの液状培地を含有するアルギン酸ソーダ
水溶液に対する動物遊離肝細胞の混合比は１：
0.01〜１：１として、両者を混合して成る懸濁液
の粘度を特に１〜100ps（37℃）とする。この組成
物の粘度を100psより高くすると、ノズルを通し
て凝固浴中に滴下せしめることにより生成するカ
プセル化物の粒径を２mm以下とすることが極めて
困難となり、また、粘度を1ps（37℃）以下にする
と、凝固浴中に滴下した瞬間にゲル化物は無定形
となり、球型のカプセルを得ることが困難となる
ほか、これを液状培地中で攪拌し、培養を続ける
と溶失し易くなるため、この懸濁液の粘度は１〜
100ps（37℃）とすることが必要である。 〔発明の効果〕 以上述べたように、本発明は動物の遊離細胞
を、均一且つ緻密な表面を有し、均一な粒径を有
する真球に近い形状のカプセルに封入する方法を
提供するもので、該細胞を損傷することなくカプ
セル化することを可能にしたものであり、更に生
成したカプセルはカラムへの充填に甚える硬さを
有すると同時に、内部の動物細胞の長時間の生存
率及び高い代謝活性の維持を実現したもので、産
業及び医療面への応用性が極めて高いものであ
る。 〔実施例〕 実施例 １ MEMにアルギン酸ソーダ粉末を添加して磁気
攪拌機により攪拌して均一に溶解してからオート
クレーブ滅菌し、ペニシリン100U／ml、ストレ
プトマイシン100μｇ／mlを加えた粘稠溶液100部
に対し、孔径0.22μmのフイルターで過した仔
ウシ血清30部を混合し、PHを7.2に調整したアル
ギン酸ソーダ水溶液100部に対し、常法に従つて
調製したラット遊離肝細胞をHanks液を用いて
低速遠心法で精製したものを４部の割合で混合し
た。懸濁液の、Ｂ型粘度計により37℃で測定した
粘度は3.3psであつた。別に100mlの蒸留水に1.5
ｇの塩化カルシウムを溶解し、100U／mlのペニ
シリンと100μｇ／mlのストレプトマイシンを添
加した後、0.22μｍのフイルターで過した凝固
液に対して、18Gの注射針から加圧下に滴下して
造粒し、半硬質で緻密な表面を有する粒径1.5mm
の球型カプセル化物を得た。 100mlのMEMに10mlの仔ウシ血清及び100U／
mlのペニシリンと100μｇ／mlのストレプトマイ
シンを添加後、孔径0.22μｍのフイルターで過
し、Po₂を100mmHgとした液状培地中37℃で、こ
のカプセル化物20mlを磁気攪拌機により攪拌しな
がら加え、更に塩化アンモニウムの濃厚水溶液を
加え、10^-3mol／の塩化アンモニウム水溶液と
してアンモニア代謝能を調べると共に、カプセル
をクエン酸ソーダ水溶液で溶解して細胞の生存率
変化を追跡し、結果をまとめて第１表に示した。 実施例2.3 比較例1.2 実施例１と全く同様の方法で実施した実施例及
び比較例について、その詳細と試験結果を第１表
にまとめた。

【表】 本発明を実施した実施例１〜３においては、半
硬質の緻密な表面を有する球型カプセル化物が得
られ、実施例１の培養条件で試験した結果、良好
な細胞生存率及び代謝能の維持が可能であり、浮
遊培養のほか充填塔の形でも使用可能であつたの
に対して、比較例においては何れも致命的な欠陥
を有することが明らかになつた。これらの結果か
ら判断して、本発明は極めて有意義な発明である
ということができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 細胞又は微生物をアルギン酸ソーダ水溶液に
   懸濁せしめ、これをカルシウムイオン水溶液中に
   滴下し凝固せしめることによつて、細胞又は微生
   物をカプセル化する方法において、細胞は動物の
   遊離細胞であり、アルギン酸ソーダ水溶液は最小
   栄養培地（Minimum Essential Medium、以下
   MEMと略記）、Williams Ｅ（以下WEと略記）、
   HamのＦ−12もしくは−199，Leiboviz−15、又
   はWaymouth's MB751/2の群から選んだ一種の
   液状培地にアルギン酸ソーダを溶解せしめた溶液
   100部（容量部、以下同じ）に、１〜50部のウマ
   血清、ウシ血清、仔ウシ血清、ウシ胎児血清、
   10^-7〜10^-10mol／のインスリン、及び10^-4〜
   10^-7mol／のデキサメサゾンの一種又は二種以
   上を添加してなり、これに対する動物の遊離細胞
   の混合比（容量比、以下同じ）が１：0.01〜１：
   １であり、アルギン酸ソーダ水溶液に動物の細胞
   を混合してなる懸濁液の粘度を１〜100ps（37℃）
   としたことを特徴とする、動物遊離細胞のカプセ
   ル化方法。