JPH05286859A - チロシンプロテインキナーゼインヒビター含有癌治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 新規な癌の予防、安定化および緩解用組成物
を提供する。 【構成】 下記式に示す治療学的有効量のチロシンプロ
テインキナーゼインヒビターを含有する癌の予防、安定
化および緩解用組成物。 （式中、Ｒ_１は水素またはメチル、Ｒ_２は水素、メチル
またはｎ−ヘキシル、Ｒ_３は水素またはメチル、Ｒ_４は
水素または−ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３を示す）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、治療学的有効量のチロ
シンプロテインキナーゼインヒビターを含有することを
特徴とする癌の予防、安定化および緩解用組成物に関す
る。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】現在
のところ、多くのヒト疾患は、少なくともその一部は、
その疾患にかかっている個人の細胞中に存在するタンパ
ク質によってひきおこされることがわかっている。たと
えば、ヒトにおける癌の産生は、癌遺伝子によってコー
ドされるある種のタンパク質にその原因がある。

【０００３】これら癌遺伝子のうちには、ｔｒｋとして
示される癌遺伝子がある。このｔｒｋ座は、もともと、
種々のヒト腫瘍中での癌遺伝子としてのその活性化によ
って同定された(マーチン−ザンカ(Ｍartin−Ｚanca,
Ｄ.)ら(１９８６)、Ｎature、３１９、７４３〜７４
８)。その後の研究により、対応する正常遺伝子である
ｔｒｋ癌原遺伝子は内在性チロシンプロテインキナーゼ
活性を有する７９０アミノ酸長の細胞表面レセプターを
コードすることが明らかになった(マーチン−ザンカら
(１９８９)、Ｍol.Ｃell.Ｂiol.,９、２４〜３３)。こ
のｇｐ１４０^trkと称されるタンパク質は、それ自身か
(クライン(Ｋlein,Ｒ.)ら(１９９１)、Ｃell、６５、１
８９〜１９７)または第二の神経生長因子(ＮＧＦ)レセ
プターであるｐ７５^LNGFRとの組合せで(ヘンプステッド
(Ｈempstead,Ｂ.Ｌ.)ら(１９９１)、Ｎature、３５０、
６７８〜６８３)、ＮＧＦと高親和性で結合する。

【０００４】累積的な証拠により、ｇｐ１４０^trkはＮ
ＧＦの機能的作用を媒体することが示された。ＮＧＦ
は、レセプターを活性化しシグナル変換(signal transd
uction)の流れを開始するのに必要な過程である、チロ
シン残基上でのｇｐ１４０^trkの迅速な自己リン酸化(au
tophosphorylation)を誘発する(カプラン(Ｋaplan,Ｄ.
Ｒ.)ら(１９９１)、Ｎature、３５０、１５８〜１６
０；カプランら(１９９１)、Ｓcience、２５２、５５４
〜５５８；クラインら(１９９１)、Ｃell、６５、１８
９〜１９７)。さらに、ｇｐ１４０^trkレセプターを異所
的に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞にＮＧＦを添加すると、
ｃ−Ｆｏｓタンパク質の一過性発現、ＤＮＡ合成および
形態的トランスフォーメーションが誘発される(コード
ン−カード(Ｃordon−Ｃardo,Ｃ.)ら(１９９１)、Ｃel
l、６６、１７３〜１８３)。同様に、ｔｒｋ癌原遺伝子
ｍＲＮＡをミクロ注入したツメガエル属(Ｘenopus)卵母
細胞にＮＧＦを添加すると、胚胞の崩壊が誘発される
(ネブレダ(Ｎebreda,Ａ.Ｒ.)ら(１９９１)、Ｓcience、
２５２、５５８〜５６１)。最後に、ＮＧＦ非応答性の
(nonresponsive)ＰＣ１２細胞をｔｒｋ ｃＤＮＡクロー
ンでトランスフェクションすると、ＮＧＦに応答すると
いうこれら変異細胞の能力が回復される(ロエブ(Ｌoeb,
Ｄ.Ｍ.)ら(１９９１)、Ｃell、６６、９６１〜９６
６)。

【０００５】新生組織形成とは、細胞増殖および分化を
制御する制御機構が損なわれる結果、進行性の増殖とな
る過程をいう。新生組織形成においては、細胞の代謝お
よび増殖を制御できないという特徴がある。このように
制御ができなくなることにより、腫瘍が進行的に増殖
し、大きくなり、生体の生きた領域を占領していく。腫
瘍が周囲の組織にも侵潤し、離れた部位にも転移する
と、しばしば個体の死を招く。癌細胞を選択的に殺しな
がら正常細胞に対する有害な作用を最小に抑えること
が、癌治療に望まれる目的である。過去においては、こ
のことは種々の方法を用いて行われてきた。これら方法
には、化学物質の投与(化学療法)、放射線照射(放射線
療法)、および外科手術が含まれる。近年、癌治療の急
速な進展がみられる。新たな治療法が開発されていると
はいうものの、殆どのタイプの癌の治療の改良法に対す
る必要性がなお存在する。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明に従い、治療学的
有効量のチロシンプロテインキナーゼインヒビターを含
有することを特徴とする癌の予防、安定化および緩解用
組成物が開示される。さらに、チロシンプロテインキナ
ーゼにより全体的または部分的に引き起こされた癌の予
防、安定化または緩解のための新規方法も開示される。
該方法は、そのような治療を必要とする哺乳動物種に治
療学的有効量のチロシンプロテインキナーゼインヒビタ
ーを投与することを特徴とする。

【０００７】本明細書において「癌」とは、その最も広い
意味で使用するものであり、腫瘍、新生組織形成、癌
腫、肉腫、白血病、リンパ腫などを包含する。本明細書
において「チロシンプロテインキナーゼインヒビター」と
は、チロシンプロテインキナーゼがリン酸化反応を触媒
するのを抑制したり減少したりすることのできる物質を
意味する。本明細書において癌を「安定化する」とは、新
たな癌性病変の進行を遅らせ、および／またはその生成
を抑制することをいう。本明細書において癌の「緩解」と
は、癌性病変を減少および／または除去することをい
う。

【０００８】図１： ＮＧＦおよびＦＧＦにより誘発さ
れるＰＣ１２細胞のニューロン分化に及ぼすＫ２５２ａ
の特異な効果 神経親和性因子(neurotrophic factor)を添加する前
に、コラーゲンをコーティングしたプレート上でＰＣ１
２細胞を２４時間増殖させた。ついで、種々の濃度のＫ
２５２ａの不存在下または存在下、これら細胞を５０ｎ
ｇ／ｍｌのＮＧＦ(黒丸)かまたは５０ｎｇ／ｍｌの酸性
および塩基性ＦＧＦの混合物(白い三角)とともにインキ
ュベートした。３日後、神経突起の生長の存在について
細胞を視覚で調べた。陽性の神経突起を有する細胞は、
２つの細胞の直径よりも長い神経突起を示す細胞として
定義した。各場合について少なくとも５００の細胞をカ
ウントした。Ｋ２５２ａなしのそれぞれのコントロール
培養中での、ＮＧＦにより誘発された神経突起を有する
細胞(全細胞の４６％)またはＦＧＦにより誘発された神
経突起を有する細胞(全細胞の２９.６％)の比率に対し
て値を標準化した。

【０００９】図２： Ｋ２５２ａは、ＮＧＦにより誘発
されるｇｐ１４０^trkのチロシンリン酸化を抑制する １００ｎＭ Ｋ２５２ａの不存在下(−)または存在下
(＋)、(Ａ)ＰＣ１２細胞および静止状態(quiescent)の
(Ｂ)Ｆ１９−９１細胞および(Ｃ)ＮＩＨ３Ｔ３細胞を１
８時間インキュベートした。ついで、Ｐ−ＴＹＲ緩衝液
(下記材料および方法参照)中で溶解する前に、１００ｎ
ｇ／ｍｌの(Ａ)ＮＧＦ、(Ｂ)ＥＧＦ、または(Ｃ)ＰＤＧ
Ｆの不存在下(−)または存在下(＋)でさらに５分間細胞
をインキュベートした。細胞溶解液を、(Ａ)ｇｐ１４０
^trkに対して産生させた抗血清、(Ｂ)ＥＧＦレセプター
(ＥＧＦ−Ｒ)に対して産生させた抗血清、または(Ｃ)Ｐ
ＤＧＦレセプター(ＰＤＧＦ−Ｒ)に対して産生させた抗
血清とともにインキュベートした。得られた免疫沈降物
を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ニトロセルロー
スフィルターに移し、抗ホスホチロシンモノクローナル
抗体４Ｇ１０を用いてブロッティングした。フィルター
を[¹²⁵Ｉ]−プロテインＡとともにインキュベートし、
増感スクリーンの助けを借りて−７０℃でコダックＸ−
Ｏｍａｔフィルムに２〜１８時間暴露した。ｇｐ１４０
^trk、ＥＧＦ−ＲおよびＰＤＧＦ−Ｒの移動を矢印で示
す。一緒に電気泳動にかけた分子量マーカーには、ミオ
シン(２０００,０００)、ホスホリラーゼｂ(９７,００
０)、ウシ血清アルブミン(６９,０００)および卵アルブ
ミン(４６,０００)が含まれていた。

【００１０】図３： Ｋ２５２ａによるｇｐ１４０^trk
のチロシンプロテインキナーゼ活性の投与量依存性抑制 (Ａ)Ｅ２５−４８細胞をＮＰ−４０溶解緩衝液中で溶解
し、抗ｇｐ１４０^trk抗血清で免疫沈降させた(材料およ
び方法参照)。[γ−³²Ｐ]−ＡＴＰを添加する前に、得
られた免疫複合体を指示濃度のＫ２５２ａとともに５分
間インキュベートした。ＮＰ−４０溶解緩衝液を加えて
反応を停止させ、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。増
感スクリーンの助けを借りて−７０℃にてゲルをコダッ
クＸ−Ｏｍａｔフィルムに１８時間暴露した。(Ｂ)指示
濃度のＫ２５２ａの存在下、静止状態のＥ２５−４２細
胞を１８時間インキュベートした。１００ｎｇ／ｍｌの
ＮＧＦの不存在下(−)または存在下(＋)、細胞をさらに
１０分間インキュベートし、Ｐ−ＴＹＲ緩衝液中で溶解
し、抗ｇｐ^trk抗血清で免疫沈降させた。得られた免疫
沈降物を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ニトロセ
ルロースフィルターに移し、抗ホスホチロシンモノクロ
ーナル抗体４Ｇ１０でブロッティングした。フィルター
を[¹²⁵Ｉ]−プロテインＡとともにインキュベートし、
増感スクリーンの助けを借りて−７０℃でコダックＸ−
Ｏｍａｔフィルムに３０時間暴露した。リン酸化ｇｐ１
４０^trkレセプターの移動を矢印で示す。白い矢印は、
ｇｐ１１０^trk(ｇｐ１４０^trkのリン酸化前駆体)の移動
を示す[マーチン−ザンカら、Ｍol.Ｃell.Ｂiol.９、２
４〜３３(１９８９)]。一緒に電気泳動にかけた分子量
マーカーは図２で説明したものと同じであった。

【００１１】図４： Ｋ２５２ａは、リガンドにより誘
発されるｔｒｋ群レセプターのチロシンリン酸化を抑制
する １００ｎＭ Ｋ２５２ａの不存在下(−)または存在下
(＋)で、(Ａ)ＰＣ−１２細胞、静止状態にある(Ｂ)Ｅ２
５−４２細胞、(Ｃ)Ｚ５２−１７細胞および(Ｄ)Ｒ４−
３１細胞を１８時間インキュベートした。ついで、Ｐ−
ＴＹＲ緩衝液中で溶解する前に、１００ｎｇ／ｍｌの
(Ａ,Ｂ)ＮＧＦ、(Ｃ)ＢＤＮＦまたは(Ｄ)ＮＴ−３とと
もに(＋)またはなしで(−)さらに５分間(ＰＣ−１２細
胞)または１０分間(Ｅ２５−４２細胞、Ｚ５２−１７細
胞およびＲ４−３１細胞)インキュベートした。細胞溶
解物を、ｇｐ１４０^trkのカルボキシ末端に対して産生
させた抗ペプチド抗血清(マーチン−ザンカら、Ｍol.Ｃ
ell.Ｂiol.９、２４〜３３(１９８９))(ｇｐ１４５^trkB
レセプターおよびｇｐ１４５^trkCレセプターをも認識す
る)を用いて免疫沈降させた。得られた免疫沈降物を８
％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ニトロセルロースフ
ィルターに移し、抗ホスホチロシンモノクローナル抗体
４Ｇ１０を用いてブロッティングした。フィルターを[
¹²⁵Ｉ]−プロテインＡとともにインキュベートし、増感
スクリーンの助けを借りて−７０℃にてコダックＸ−Ｏ
ｍａｔフィルムに１２〜４８時間暴露した。ｇｐ１４０
^trk、ｇｐ１４５^trkBおよびｇｐ１４５^trkCの移動を矢
印で示す。おそらく異なる糖付加のためにＰＣ−１２細
胞およびＥ２５−４２細胞ではｇｐ１４０^trkの移動が
わずかに異なることに注意すべきである。一緒に電気泳
動にかけた分子量マーカーは、図２で説明したものと同
じであった。

【００１２】図５： Ｋ２５２ａは、ｔｒｋ群のレセプ
ターの各成員をそれぞれのリガンドとともに共発現する
ことによりトランスフォームしたＮＩＨ３Ｔ３細胞のト
ランスフォーム表現型を元に戻す(reverts) gp140^trkをコードするプラスミドおよびＮＧＦをコード
するプラスミド(Ｚ９９−５４１細胞)、ｇｐ１４５^trkB
をコードするプラスミドおよびＢＤＮＦをコードするプ
ラスミド(Ｚ８２−４３２細胞)、ｇｐ１４５^trkCをコー
ドするプラスミドおよびＮＴ−３をコードするプラスミ
ド(Ｚ８２−７１１細胞)でコトランスフェクションする
ことによりトランスフォームしたＮＩＨ３Ｔ３細胞株の
位相差顕微鏡写真(×２００)。１００ｎＭ Ｋ２５２ａ
の不存在下(−)または存在下(＋)で細胞を２〜４日間増
殖させた。

【００１３】図６： Ｋ２５２ａによるｔｒｋ癌タンパ
ク質のインビトロチロシンプロテインキナーゼ活性の投
与量依存性抑制 (Ａ)ヒト結腸癌腫ｔｒｋ癌遺伝子でトランスフォームし
たＮＩＨ３Ｔ３細胞株(１０６−６３２細胞)、(Ｂ)ｔｒ
ｋ５癌遺伝子でトランスフォームしたＮＩＨ３Ｔ３細胞
株(Ｂ３８−９４１細胞)、および(Ｃ)ｖ−ｓｒｃでトラ
ンスフォームしたＮＩＨ３Ｔ３細胞株(Ｃ７４−３２１
細胞)をＮＰ−４０溶解緩衝液中で溶解し、(Ａ,Ｂ)抗ｇ
ｐ１４０^trk抗血清または(Ｃ)抗ｐｐ６０^v-srcモノクロ
ーナル抗体３２７を用いて免疫沈降させた(下記材料お
よび方法参照)。[γ−³²Ｐ]−ＡＴＰを添加する前に、
免疫複合体を指示濃度のＫ２５２ａとともに５分間イン
キュベートした。ＮＰ−４０溶解緩衝液を添加してイン
ビトロキナーゼ反応を停止させ、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により分析した。増感スクリーンの助けを借りてゲルを
−７０℃にてコダックＸ−Ｏｍａｔフィルムに１〜４時
間暴露した。ｐ７０^trk、ｇｐ１２０^trk5およびｐｐ６
０^v-srcの移動を矢印で示す。白い矢印はｇｐ１２０
^trk5の前駆体の移動を示す。パネルＣに示す高分子量リ
ン酸化種は、共沈降ｐｐ６０^v-src基質を表していると
思われる(レイノルズ(Ｒeynolds,Ａ.)ら、Ｍol.Ｃell.
Ｂiol.９、３９５１〜３９５８(１９８９))。一緒に電
気泳動にかけた分子量マーカーは、図２で説明したもの
と同じであった。

【００１４】図７： Ｋ２５２ａによるｔｒｋ癌タンパ
ク質のインビボチロシンリン酸化の投与量依存性抑制 (Ａ)ヒト結腸癌腫ｔｒｋ癌遺伝子でトランスフォームし
たＮＩＨ３Ｔ３細胞株(１０６−６３２細胞)、(Ｂ)ｔｒ
ｋ５癌遺伝子でトランスフォームしたＮＩＨ３Ｔ３細胞
株(Ｂ３８−９４１細胞)、および(Ｃ)ｖ−ｓｒｃでトラ
ンスフォームしたＮＩＨ３Ｔ３細胞株(Ｃ７４−３２１
細胞)を、ＰＴＹＲ緩衝液中で溶解する前に、指示濃度
のＫ２５２ａの存在下で１８時間インキュベートした。
細胞溶解物を(Ａ,Ｂ)抗ｇｐ１４０^trk抗血清または(Ｃ)
抗ｐｐ６０^v-srcモノクローナル抗体３２７で免疫沈降
し、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画した。試料をニト
ロセルロースフィルターに移し、(Ａ,Ｂ)抗ホスホチロ
シンモノクローナル抗体４Ｇ１０または(Ｃ)ポリクロー
ナルホスホチロシン抗血清でブロッティングした。フィ
ルターを[¹²⁵Ｉ]−プロテインＡとともにインキュベー
トし、増感スクリーンの助けを借りて−７０℃にてコダ
ックＸ−Ｏｍａｔフィルムに６時間暴露した。ｐ７０
^trk、ｇｐ１２０^trk5およびｐｐ６０^v-srcの移動を矢印
で示す。一緒に電気泳動にかけた分子量マーカーは、図
２で説明したものと同じであった。

【００１５】図８： Ｋ２５２ａは、ｔｒｋ癌遺伝子に
より誘発される形態的トランスフォーメーションを選択
的に元に戻す ｔｒｋ癌遺伝子でトランスフォームしたＮＩＨ３Ｔ３細
胞(１０６−６３２)、ｔｒｋ５癌遺伝子でトランスフォ
ームしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(Ｂ３８−９４１)、ｖ−ｓｒ
ｃ癌遺伝子でトランスフォームしたＮＩＨ３Ｔ３細胞
(Ｃ７４−３２１)およびｖ−ｆｍｓ癌遺伝子でトランス
フォームしたＮＩＨ３Ｔ３細胞(Ｃ５１−６４２)を、指
示濃度のＫ２５２ａの不存在下(−)または存在下(＋)で
２〜４日間増殖させた位相差顕微鏡写真。

【００１６】本発明の組成物および方法は、チロシンプ
ロテインキナーゼ活性を示す癌遺伝子コードタンパク質
により全体的または部分的に引き起こされる種々の癌の
治療に用いることができる。そのような癌遺伝子には、
ｔｒｋ群に由来するあらゆる癌遺伝子または癌原遺伝子
並びに他の関連するチロシンプロテインキナーゼ癌遺伝
子が含まれる。

【００１７】とりわけ、本発明の組成物および方法は、
チロシンプロテインキナーゼ活性領域を含有するｔｒｋ
癌遺伝子タンパク質(これらはｔｒｋ癌遺伝子によりコ
ードされるタンパク質である)により引き起こされる癌
を治療するのに用いることができる。ｔｒｋ癌遺伝子は
ｔｒｋ癌原遺伝子に由来する。ｔｒｋ癌原遺伝子はｔｒ
ｋ群レセプターをコードする。これらｔｒｋ群レセプタ
ーには、ｔｒｋレセプター[マーチン−ザンカら、Ｍol.
Ｃell.Ｂiol.９、２４〜３３(１９８９)参照]、ｔｒｋ
Ｂレセプター[クラインら、ＥＭＢＯ Ｊ.８、３７０１
〜３７０９(１９８９)参照]およびｔｒｋＣレセプター
[ランバルレ(Ｌamballe,Ｆ.)ら、Ｃell６６、９６７〜
９７９(１９９１)参照]が含まれる。

【００１８】治療しようとする特定の癌の原因であるプ
ロテインキナーゼを抑制し得るあらゆるチロシンプロテ
インキナーゼインヒビターを本発明に従って用いること
ができる。適当なチロシンプロテインキナーゼインヒビ
ターには、式：

【化２】 (式中、Ｒ₁は水素またはメチル、Ｒ₂は水素、メチルま
たはｎ−ヘキシル、Ｒ₃は水素またはメチル、Ｒ₄は水素
または−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃)で示されるものが含まれ
る。これら化合物の多くは、カミヤ・バイオメディカル
・カンパニー(Ｋamiya Ｂiomedical Ｃompany)(サウザ
ンドオークス、カリフォルニア州、９１３５９)から市
販されている。特に好ましいのは、Ｒ₁、Ｒ₃およびＲ₄
が水素であり、Ｒ₂がメチルである化合物、すなわち、
(８Ｒ＊，９Ｓ＊，１１Ｓ＊)−(−)−９−ヒドロキシ−
９−メトキシカルボニル−８−メチル−２−３−９−１
０−テトラヒドロ−８,１１−エポキシ−１Ｈ,８Ｈ,１
１Ｈ−２,７ｂ,１１ａ−トリアザジベンゾ(ａ,ｇ)シク
ロオクタ(ｃｄｅ)トリンデン−１−オンである(該化合
物はＢichem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun.１４２、４３６〜
４４０(１９８７)に記載されている)。

【００１９】本発明の方法を行うに際しては、そのよう
な治療を要する種々の哺乳動物種、たとえばサル、イ
ヌ、ネコ、ラット、ヒト等に本発明のチロシンプロテイ
ンキナーゼインヒビターを投与すればよい。チロシンプ
ロテインキナーゼインヒビターは経口や非経口などのよ
うに全身的に投与することもできるし、または局部的
に、たとえば局所投与により投与することもできる。チ
ロシンプロテインキナーゼインヒビターは、錠剤、カプ
セル剤、エリキシル剤または注射剤などの通常の剤型中
に用いることができる。上記剤型にはまた、必要な担体
物質、賦形剤、滑沢剤、緩衝液、抗菌剤、充填剤(マン
ニトールなど)、抗酸化剤(アスコルビン酸や重亜硫酸ナ
トリウム)なども含まれる。非経口の剤型も極めて満足
のいくものであるが、経口剤型が好ましい。

【００２０】そのような全身または局所調合物に関して
は、約５〜約２５００ｍｇ、好ましくは約１０〜約２０
００ｍｇ／１日に１〜４回の１回または分割投与量を、
治療しようとする癌の予防、安定化または緩解に充分な
期間、上記のような全身剤型にてまたは局所的に投与す
る。

【００２１】

【実施例】つぎに本発明を実施例に基づいてさらに詳し
く説明し、化学名が(８Ｒ＊，９Ｓ＊，１１Ｓ＊)−(−)
−９−ヒドロキシ−９−メトキシカルボニル−８−メチ
ル−２−３−９−１０−テトラヒドロ−８,１１−エポ
キシ−１Ｈ,８Ｈ,１１Ｈ−２,７ｂ,１１ａ−トリアザジ
ベンゾ(ａ,ｇ)シクロオクタ(ｃｄｅ)トリンデン−１−
オンである化合物がｔｒｋ群の癌遺伝子のチロシンプロ
テインキナーゼ活性を抑制し、それゆえ新生組織生成細
胞のトランスフォーメーションを元に戻す能力について
調べる。しかしながら、この実施例は本発明の範囲を限
定するものではなく、本発明をさらに理解するのを助け
るためのものである。

【００２２】実施例 Ｉ．材料および方法 Ａ．細胞株：ＮＩＨ３Ｔ３(ジェインチル(Ｊainchill,
Ｊ.Ｌ.)ら(１９６９)、Ｊ.Ｖirol.,４、５４９〜５５
３)およびＮＩＨ３Ｔ３由来細胞株を１０％ウシ血清含
有ＤＭＥＭ中で増殖させた。これら細胞株には、ｇｐ１
４０^trkを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞(Ｅ２５−４２およ
びＥ２５−４８；クラインら(１９９１)、Ｃell、６
５、１８９〜１９７)、ｇｐ１４５^trkBを発現するＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞(Ｚ５２−１７；クラインら(１９９１)、
Ｃell、６６、３９５〜４０３)、ｇｐ１４５^trkCを発現
するＮＩＨ３Ｔ３細胞(ＲＡ−３１；ランベルラら(１９
９１)、Ｃell、６６、９６７〜９７９)、ｐ７０^trkを発
現するＮＩＨ３Ｔ３細胞(１０６−６３２；マーチン−
ザンカら(１９８６)、Ｎature、３１９、７４３〜７４
８)、ｐｐ６０^v-srcを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞(Ｃ７
４−３２１；クアドラド(Ｃuadrado,Ａ.)ら(１９９
０)、Ｃell Ｇrowth Ｄiff.,１、９〜１５)、ｇｐ１２
０^v-fmsを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞(Ｃ５１−６４２；
クアドラドら(１９９０)、Ｃell Ｇrowth Ｄiff.,１、
９〜１５)、およびｇｐ１２０^trk5を発現するＮＩＨ３
Ｔ３細胞(Ｂ３８−９４１；クーリエ(Ｃoulier,Ｆ.)ら
(１９９０)、Ｍol.Ｃell.Ｂiol.,１０、４２０２〜４２
１０)が含まれる。

【００２３】ヒトＥＧＦレセプターを過剰発現するＮＩ
Ｈ３Ｔ３由来細胞株であるＦ１９−９１細胞は、ヒトＥ
ＧＦレセプターをコードする発現プラスミドであるｐＨ
ＥＲＮ３Ｂ(シュレシンガー(Ｓchlessinger)より入手)
でＮＩＨ３Ｔ３細胞をトランスフェクションすることに
より得た。ｔｒｋ群のレセプターの自己分泌活性化によ
りトランスフォームされたＮＩＨ３Ｔ３由来細胞株は、
ＮＩＨ３Ｔ３細胞をプラスミドｐＤＭ６９(ｇｐ１４０
^trk)＋ｐＬＴＲＳＮＧＦ(ＮＧＦ)(Ｚ９９−５４１細
胞)、ｐＦＫＲ４４(ｇｐ１４５^trkB)＋ｐＬＬ４２(ＢＤ
ＮＦ)(Ｚ８２−４３２細胞)およびｐＦＬ２０(ｇｐ１４
５^trkC)＋ｐＬＬ４３(ＮＴ−３)(Ｚ８２−７１１細胞)
[マーチン・ザンカら(１９８９)、Ｍol.Ｃell.Ｂiol.,
９、２４〜３３；コードン−カードら(１９９１)、Ｃel
l、６６、１７３〜１８３；クラインら(１９９１)、Ｃe
ll、６６、３９５〜４０３；ランベルラら(１９９１)、
Ｃell、６６、９６７〜９７９]でコトランスフェクショ
ンすることにより得た(グラハム(Ｇraham,Ｆ.Ｌ.)およ
びファン・デア・エブ(van der ＥＢ,Ａ.Ｊ.)(１９７
３)、Ｖirology５３、４５６〜４６７)。

【００２４】すでに記載されたようにして(オスカム(Ｏ
skam,Ｒ.)ら(１９８８)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８
５、２９６４〜２９６８)、トランスフォームした細胞
のフォーカスをクローニングシリンダーで釣り上げ、半
固体アガー中での増殖によりクローニングした。１０％
ウシ血清および５％ウマ血清を含有するＤＭＥＭ中、コ
ラーゲンをコーティングしたディッシュ(ビトロジェン
(Ｖitrogen))上でラットクロム親和性細胞腫ＰＣ１２細
胞(グリーン(Ｇreene,Ｌ.Ａ.)およびティッシュラー(Ｔ
ischler Ａ.Ｓ.)(１９７６)、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A、７３、２４２４〜２４２８)を増殖させた。神経突起
の生長を測定するため、プレート当たり５×１０⁴細胞
の密度でＰＣ１２細胞を３５ｍｍディッシュ上にプレー
ティングした。プレーティングから２４時間後、Ｋ２５
２ａの不存在下または存在下、５０ｍｇ／ｍｌの濃度で
因子を添加した。神経突起の生長のパーセントは、細胞
の直径の少なくとも２倍の全長の神経突起を示した細胞
のパーセントとして評価した。

【００２５】Ｂ．Ｋ２５２ａ、因子および抗血清：Ｋ２
５２ａはカミヤ・バイオメディカル・カンパニー(サウ
ザンドオークス、カリフォルニア州)から入手し、ＤＭ
ＳＯ中に溶解し、暗所にて−２０℃で貯蔵した。マウス
ＥＧＦ、酸性および塩基性ＦＧＦ、２.５Ｓ ＮＧＦおよ
びヒトＡＢＰＤＧＦをアップステート・バイオテクノロ
ジー(Ｕpstate Ｂiotechnology Ｉnc.)(ニューヨーク)
から購入した。すでに記載されたようにして(コードン
−カードら(１９９１)、Ｃell、６６、１７３〜１８
３)、組換えバクロウイルスｐＡｃＳ２７(ＢＤＮＦ)お
よびｐＡｃＳ２８(ＮＴ−３)を感染させたＳｆ９昆虫細
胞の上澄み液からＢＤＮＦおよびＮＴ−３を約９５％の
均質性に精製した。抗血清には、ｇｐ１４０^trkレセプ
ターのカルボキシル末端に対応するペプチドに対して産
生させたウサギ抗血清(４３−４)(マーチン−ザンカら
(１９８９)、Ｍol.Ｃell.Ｂiol.,９、２４〜３３)、Ｐ
ＤＧＦレセプターに対するウサギポリクローナル抗血清
(抗ＰＲ４、コートネージ(Ｓ.Ｃourtneidge)より贈与)
(キプタ(Ｋypta,Ｒ.Ｍ.)ら(１９９０)、Ｃell、６２、
４８１〜４９２)、抗ヒトＥＧＦレセプターモノクロー
ナル抗体(アップステート・バイオテクノロジー)、抗ｐ
ｐ６０^v-srcモノクローナル抗体３２７(オンコジーン・
サイエンシズ(Ｏncogene Ｓciences))、抗ホスホチロシ
ンモノクローナル抗体４Ｇ１０(アップステート・バイ
オテクノロジー)およびアフィニティー精製ウサギ抗マ
ウス免疫グロブリン(ダコ(Ｄako))が含まれる。ポリク
ローナルホスホチロシン抗血清は、ポリホスホチロシン
−グリシン−アラニン免疫源でウサギを免疫することに
より調製した(カンプス(Ｋamps,Ｍ.Ｐ.)およびセフトン
(Ｓefton,Ｂ.Ｍ.)(１９８８)、Ｏncogene、２、３０５
〜３１５)。

【００２６】Ｃ．ウエスタンブロット分析：増殖因子で
刺激する前に０.５％ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中で
４８時間培養することによりＮＩＨ３Ｔ３由来細胞株を
静止状態にした。ＰＣ１２細胞は静止状態にしなかっ
た。因子で処理した後、Ｐ−ＴＹＲ溶解緩衝液(５０ｍ
Ｍ Ｈepes、ｐＨ７.５；１％トリトンＸ−１００；５０
ｍＭ ＮａＣｌ；５０ｍＭ ＮａＦ；１０ｍＭピロリン酸
ナトリウム；５ｍＭ ＥＤＴＡ；０.５ｍＭオルトバナジ
ウム酸ナトリウムおよび０.５ｍＭ ＰＭＳＦ)中で溶解
する前に、０.１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウムを
含有する冷ＰＢＳ中で細胞を濯いだ。１２,０００ｒｐ
ｍにて１０分間遠心分離することにより、溶解液から不
溶性物質を除いた。ついで、清澄化した細胞溶解液を適
当な抗血清とともにインキュベートし、得られた免疫複
合体をプロテインＡ−セファロースで沈澱させることに
より回収し、溶解緩衝液で４回洗浄し、８％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより分画し、ニトロセルロースフィルターに移
した(ハーロウ(Ｈarlow)およびレイン(Ｌane)(１９８
８)、アンチボディーズ：ア・ラボラトリー・マニュア
ル(Ａntibodies：Ａ ＬaboratoryＭanual)(コールド・
スプリング・ハーバー、ニューヨーク：コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー))。レセプターのチロ
シンリン酸化レベルは、抗ホスホチロシンモノクローナ
ル抗体４Ｇ１０でブロッティングし、ついでウサギ抗マ
ウス免疫グロブリンおよび[¹²⁵Ｉ]−プロテインＡ(デュ
ポンＮＥＮ)とともにインキュベートすることにより決
定した(コードン−カードら(１９９１)、Ｃell、６６、
１７３〜１８３)。ｐｐ６０^v-srcリン酸化のウエスタン
ブロット分析も上記と同様にして行ったが、ニトロセル
ロースフィルターをポリクローナルホスホチロシン抗血
清でプローブした。

【００２７】Ｄ．インビトロチロシンプロテインキナー
ゼアッセイ：０.１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム
を含有する冷ＰＢＳで細胞を濯ぎ、ＮＰ−４０溶解緩衝
液(２０ｍＭトリス−Ｃｌ ｐＨ７.５；１５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ；１％アプロチニン；０.５ｍＭオルトバナジウム
酸ナトリウム；２.５ｍＭ ＥＤＴＡ；１０ｍＭ ＮａＦ)
中で溶解した。溶解液を清澄化し、上記対応抗血清で免
疫沈降させた。得られた免疫複合体をＮＰ−４０溶解緩
衝液で４回洗浄し、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１％アプ
ロチニンを含有する２０ｍＭ Ｈepes(ｐＨ７.２)で１回
洗浄し、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１％アプロチニンを
含有する２０ｍＭＨepes(ｐＨ７.２)(４７μｌ)中に再
懸濁し、１０ｍＭ ＭｎＣｌ₂を含有する２０ｍＭ Ｈepe
s(ｐＨ７.２)(４７μｌ)中に再懸濁した。試料を指示濃
度のＫ２５２ａの存在下、３０℃にて５分間インキュベ
ートした。１０μＣｉの[γ−³²Ｐ]−ＡＴＰ(６０００
Ｃｉ／ミリモル；デュポンＮＥＮ)および４μＭ ＡＴＰ
を添加してキナーゼ反応を開始させた。３０℃にて１０
分間反応を続け、０.５ｍｌのＮＰ−４０溶解緩衝液を
加えて反応を停止させた。試料をＮＰ−４０緩衝液で２
回洗浄し、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画した。オートラ
ジオグラフィーにかける前に、電気泳動したゲルを１Ｎ
ＮａＯＨで５５℃にて２時間洗浄した。

【００２８】ＩＩ．結果 Ａ．ＮＧＦおよびＦＧＦにより誘発されるＰＣ１２細胞
のニューロン分化に対するＫ２５２ａの特有の効果：Ｎ
ＧＦやＦＧＦなどの神経親和性因子をＰＣ１２細胞に添
加すると、長い神経突起の生長を特徴とする過程である
ニューロンの分化が誘発される(グリーンおよびティッ
シュラー(１９８２)、Ｉn Ａdvances in Ｃellular Ｎe
urobiology(フェデロッフ(Ｓ.Ｆederoff)およびヘルツ
(Ｌ.Ｈertz)編)、３７３〜４１４頁、アカデミックプレ
ス、ニューヨーク)。以前の観察(コイズミ(Ｋoizumi,
Ｓ.)ら(１９８８)、Ｊ.Ｎeurosci.,８、７１５〜７２
１)と一致して、ＮＧＦにより誘発された場合に、プロ
テインキナーゼインヒビターＫ２５２ａはこの分化過程
を有効に阻止した。図１に示すように、Ｋ２５２ａは、
約４０ｎＭのＩＣ₅₀にてＮＧＦに暴露されたＰＣ１２細
胞における神経突起過程の出現を阻止した。しかしなが
ら、Ｋ２５２ａは、ＦＧＦなどの他の神経親和性因子に
よる神経突起生成の誘発に対しては、たとえ３００ｎＭ
という高濃度でも検出可能な効果を有しなかった(図
１)。興味深いことに、ミクロモル未満の濃度のＫ２５
２ａは、ＰＣ１２細胞の増殖に対して有意の抑制効果を
有しなかった(データは示していない)。

【００２９】Ｂ．Ｋ２５２ａはｇｐ１４０^trk ＮＧＦレ
セプターのリガンド依存性活性化を抑制するが、他のチ
ロシンキナーゼ増殖因子レセプターの活性化は抑制しな
い：これらの結果は、Ｋ２５２ａが、ＮＧＦにより活性
化されるシグナル変換経路の特定の成員、おそらくプロ
テインキナーゼを阻止することを示唆している。それゆ
え、ＮＧＦレセプターであるｇｐ１４０^trkのチロシン
キナーゼ活性を抑制することにより、ＮＧＦにより誘発
されるＰＣ１２分化をＫ２５２ａが阻止するかどうかを
調べた。この目的のため、１００ｎＭのＫ２５２ａの不
存在下または存在下、血清飢渇した(serum−starved)Ｐ
Ｃ１２細胞を１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦとともにインキ
ュベートした。ｇｐ１４０^trkのカルボキシ末端に対し
て産生させた抗体を用いて細胞抽出物を免疫沈降させ、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、抗ホスホチロシン抗体
でブロッティングした。図２Ａに示すように、Ｋ２５２
ａはｇｐ１４０^trkのチロシン残基上でのＮＧＦ誘発リ
ン酸化を完全に阻止した。１００ｎＭ Ｋ２５２ａの存
在下でＮＩＨ３Ｔ３細胞をＰＤＧＦ(１００ｎｇ／ｍｌ)
とともにインキュベートしても、ＰＤＧＦレセプターの
チロシン残基のリン酸化にはなんらの影響もなかった
(図２Ｃ)。同様の結果は、ヒトＥＧＦレセプターを過剰
に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞株であるＦ１９−９１細胞
をＥＧＦ(１００ｎｇ／ｍｌ)で刺激した場合にも得られ
た(図２Ｂ)。これらの観察結果は、Ｋ２５２ａがｇｐ１
４０^trkチロシンキナーゼレセプターのインヒビターで
あることを示している。

【００３０】チロシンプロテインキナーゼレセプターの
活性化は、リガンドに誘発されたオリゴマー化工程の後
にそのチロシン残基が自己リン酸化されることにより媒
体されると考えられている(ウルリッヒ(Ｕllrich,Ａ.)
およびシュレシンガー(１９９０)、Ｃell、６１、２０
３〜２１２)。それゆえ、上記結果は、ｇｐ１４０^trkキ
ナーゼの触媒活性に対するＫ２５２ａの直接的な抑制作
用の結果であると思われる。この仮説を正式に示すた
め、ｇｐ１４０^trkレセプターを含有する免疫沈降物の
インビトロチロシンキナーゼ活性に対するＫ２５２ａの
影響を調べた。図３Ａに示すように、Ｋ２５２ａは約３
０ｎＭのＩＣ₅₀にてｇｐ１４０^trkの触媒活性を有効に
抑制した。これと平行したインビボでの実験では、Ｋ２
５２ａはｇｐ１４０^trkのチロシンリン酸化を約３ｎＭ
のＩＣ₅₀にて抑制した(図３Ｂ)。インビトロの方がＫ２
５２ａの抑制効果が低いのは、このアッセイの非生理学
的条件を反映しているためと思われる。しかしながら、
Ｋ２５２ａが、触媒ドメインの外部にある構造またはｇ
ｐ１４０^trkのキナーゼ活性に影響を与える補助タンパ
ク質とインビボで相互反応する可能性を排除することは
できない。

【００３１】Ｃ．Ｋ２５２ａはｔｒｋ群のニューロトロ
フィン(neurotrophin)レセプターのインヒビターであ
る：ｇｐ１４０^trkＮＧＦレセプターは、関連チロシン
プロテインキナーゼの小群の１成員であり、該小群に
は、ｔｒｋＢ遺伝子の産物であり(クラインら(１９８
９)、ＥＭＢＯ Ｊ.,８、３７０１〜３７０９；クライン
ら(１９９０)、Ｃell、６１、６４７〜６５６；ミドル
マス(Ｍiddlemas,Ｄ.Ｓ.)ら(１９９１)、Ｍol.Ｃell.Ｂ
iol.,１１、１４３〜１５３)ＢＤＮＦおよび一層低い程
度ではあるがＮＴ−３の生物学的活性を媒体する(グラ
ス(Ｇlass,Ｄ.Ｊ.)ら(１９９１)、Ｃell、６６、４０５
〜４１３；クラインら(１９９１)、Ｃell、６６、３９
５〜４０３；ソッペト(Ｓoppet,Ｄ.)ら(１９９１)、Ｃe
ll、６５、８９５〜９０３；スキント(Ｓquinto,Ｓ.
Ｐ.)ら(１９９１)、Ｃell、６５、８８５〜８９３)ｇｐ
１４５^trkB、およびｔｒｋＣ遺伝子によりコードされる
チロシンプロテインキナーゼでありＮＴ−３に特異的な
レセプターであるｇｐ１４５^trkC(ランバルレら(１９９
１)、Ｃell、６６、９６７〜９７９)が含まれる。

【００３２】Ｋ２５２ａが、その同種リガンドによるこ
れらｔｒｋ関連レセプターの活性化に対する有効なイン
ヒビターであるかどうかについても調べた。この目的の
ため、ｇｐ１４０^trkを発現するＰＣ１２細胞およびｇ
ｐ１４０^trkを異所的に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞(Ｅ２
５−４２細胞)、ｇｐ１４５^trkBを異所的に発現するＮ
ＩＨ３Ｔ３細胞(Ｚ５２−１７細胞)およびｇｐ１４５
^trkCを異所的に発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞(ＲＡ−３１
細胞)を、１００ｎＭ Ｋ２５２ａの不存在下または存在
下、それぞれ１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ、ＢＤＮＦおよ
びＮＴ−３とともにインキュベートした。細胞抽出物
を、上記各レセプターを認識することがわかっている抗
ｇｐ１４０^trk抗体で免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
により分画し、抗ホスホチロシン抗体でブロッティング
した。図４に示すように、１００ｎＭのＫ２５２ａは、
３つの各リガンド活性化レセプターのチロシン残基上で
のリン酸化を完全に阻止した。それゆえ、Ｋ２５２ａは
ｔｒｋ群のニューロトロフィンのインヒビターであると
思われる。

【００３３】Ｄ．Ｋ２５２ａはｔｒｋ群ニューロトロフ
ィンレセプターのインビボ変異源活性を抑制する：ｔｒ
ｋ群のレセプターの公知成員のいずれかをそのリガンド
とともにＮＩＨ３Ｔ３細胞中で一緒に発現すると強い変
異源性シグナルが示されることが最近になって示された
(コードン−カードら(１９９１)、Ｃell、６６、１７３
〜１８３；クラインら(１９９１)、Ｃell、６６、３９
５〜４０３；ランバルレら(１９９１)、Ｃell、６６、
９６７〜９７９)。この自己分泌変異源活性は、最終的
に、これら細胞の悪性トランスフォーメーションとな
る。これら知見により、ＰＣ１２細胞かまたはより生理
学的環境(ニューロンなど)中で活性を示すために必要と
されるかもしれないニューロトロフィンシグナル変換経
路の他の成員(たとえば、ｐ７５^LNGFR)とは独立にｔｒ
ｋレセプターキナーゼのインビボ活性を調べることが可
能になった。ｇｐ１４０^trkをコードするプラスミド(ｐ
ＤＭ６９)とＮＧＦをコードするプラスミド(ｐＬＴＲＳ
ＮＧＦ)、ｇｐ１４５^trkBをコードするプラスミド(ｐＦ
ＲＫ４４)とＢＤＮＦをコードするプラスミド(ｐＬＬ４
２)、またはｇｐ１４５^trkCをコードするプラスミド(ｐ
Ｆ１２０)とＮＴ−３をコードするプラスミド(ｐＬＬ４
３)とでＮＩＨ３Ｔ３細胞をコトランスフェクションし
た。ついで、トランスフェクションした細胞を１００ｎ
Ｍ Ｋ２５２ａの不存在下または存在下でトランスフォ
ームした細胞のフォーカスの出現についてモニターし
た。以前の研究結果と一致して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、
ｔｒｋ群レセプターの３つの成員のそれぞれとそのリガ
ンドとで一緒に発現することにより有効にトランスフォ
ームされた。しかしながら、このトランスフォーメーシ
ョンは、１００ｎＭＫ２５２ａの存在下でトランスフェ
クションＮＩＨ３Ｔ３細胞を増殖させた場合には完全に
阻止された(表１)。

【００３４】ｔｒｋ群レセプターの自己分泌活性化によ
り誘発された形態的トランスフォーメーションをＫ２５
２ａが元に戻すことができるかどうかを決定するため、
発現プラスミドｐＤＭ６９とｐＬＴＲＳＮＧＦ(Ｚ９９
−５４１細胞)、ｐＦＲＫ４４とｐＬＬ４２(Ｚ８２−４
３２細胞)、およびｐＦＬ２０とｐＬＬ４３(Ｚ８２−７
１１細胞)とでコトランスフェクションすることにより
トランスフォームしたＮＩＨ３Ｔ３細胞株を生成した。
ついで、トランスフェクションしていないＮＩＨ３Ｔ３
細胞をコントロールとして用い、これら細胞をＫ２５２
ａ不存在下または種々の濃度(３０ｎＭ〜１μＭ)のＫ２
５２ａの存在下で増殖させた。ミクロモル濃度のＫ２５
２ａは、とりわけトランスフェクションしていないＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞に対してかなり毒性があることがわかった
(データは示していない)。しかしながら、３００ｎＭ以
下のＫ２５２ａ濃度では、これら細胞の増殖特性に対し
て有意の影響は観察されなかった。図５に示すように、
１００ｎＭ Ｋ２５２ａは、ｔｒｋレセプター群の３つ
の成員とそのリガンドとで一緒に発現させることにより
トランスフォームさせたこれらＮＩＨ３Ｔ３由来細胞株
のトランスフォームされた表現型を完全に元に戻した。
低い濃度(３０ｎＭ)のＫ２５２ａでは、限られた効果し
か得られなかった(データは示していない)。これら結果
は、Ｋ２５２ａがｔｒｋ群レセプターのチロシンキナー
ゼ活性のインビボでの強力なインヒビターであること、
およびこのキナーゼ活性の抑制により、リガンドによる
自己分泌刺激後にｔｒｋ群レセプターにより示される変
異源特性およびトランスフォーメーション特性が阻止さ
れることを示している。

【００３５】Ｅ．Ｋ２５２ａはｔｒｋ癌遺伝子のチロシ
ンキナーゼ活性を抑制する：ヒトｔｒｋ癌原遺伝子座で
の遺伝子再配列(genetic rearrangement)は、結腸およ
び胸腺乳頭癌腫を含むある種のヒト癌の進行において意
味をもたらされてきた(マーチン−ザンカら(１９８
６)、Ｎature、３１９、７４３〜７４８；ボンガーゾン
(Ｂongarzone,Ｉ.)ら(１９８９)、Ｏncogene、４、１４
５７〜１４６２)。それゆえ、Ｋ２５２ａがこれらヒト
癌遺伝子の選択的なインヒビターでもあるかどうかを調
べた。これらの研究のため、２つのクラスのｔｒｋ癌遺
伝子を選択した(バーバシッド(Ｂarbacid,Ｍ.)ら(１９
９１)、ＢＢＡ Ｒeviews in Ｃancer、印刷中)。第一の
クラスは、その全リガンド結合ドメインが非筋肉トロポ
ミオシン配列で置換された、当初ヒト結腸癌腫癌遺伝子
のｃＤＮＡクローンを包含する。このｔｒｋ癌遺伝子
は、７０,０００ダルトンの細胞質タンパク質であるｐ
７０^trk(もはや経膜レセプターとは類似しない)をコー
ドする(マーチン−ザンカら(１９８６)、Ｎature、３１
９、７４３〜７４８)。この研究のために選択した第二
の癌遺伝子は、ｔｒｋ癌原遺伝子産物の細胞外ドメイン
中の５１アミノ酸残基の欠失となる読み取り枠欠失によ
る遺伝子移動の間に生成した癌遺伝子であるｔｒｋ５で
あった(オスカム(Ｏskam,Ｒ.)ら(１９８８)、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA、８５、２９６４〜２９６８；クーリエ
(Ｃoulier,Ｆ.)ら(１９９０)、Ｍol.Ｃell.Ｂiol.,１
０、４２０２〜４２１０)。その結果、このｔｒｋ５癌
遺伝子は１２０,０００ダルトンの糖タンパク質である
ｇｐ１２０^trk5をコードし、この糖タンパク質はチロシ
ンプロテインキナーゼレセプターの基本的な構造的特性
を保持している(オスカムら(１９８８)、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA、８５、２９６４〜２９６８；クーリエら(１
９９０)、Ｍol.Ｃell.Ｂiol.,１０、４２０２〜４２１
０)。

【００３６】図６に示すように、Ｋ２５２ａは、これら
ｔｒｋ癌遺伝子産物であるｐ７０^trkおよびｇｐ１２０
^trk5のインビトロキナーゼ活性を両方ともそれぞれ３０
０ｎＭおよび１００ｎＭのＩＣ₅₀にて抑制した。これと
は対照的に、１０μＭもの高濃度のＫ２５２ａは、非関
連チロシンプロテインキナーゼであるｐｐ６０^v-srcの
触媒活性に対して何等有意の抑制効果を有しなかった
(図６Ｃ)。同様の結果は、ヒトｔｒｋ癌遺伝子でトラン
スフォームしたＮＩＨ３Ｔ３細胞株(１０６−６３２細
胞)およびインビトロで生成させたｔｒｋ５癌遺伝子で
トランスフォームしたＮＩＨ３Ｔ３細胞株(Ｂ３８−９
４１細胞)中に存在するｐ７０^trkおよびｇｐ１２０^trk5
癌タンパク質のチロシンリン酸化レベルに対するＫ２５
２ａの影響を測定した場合にも得られた。上記のよう
に、これらタンパク質のチロシンリン酸化レベルは、イ
ンビボでの自己リン酸化活性を反映しているように思わ
れる。図７に示すように、Ｋ２５２ａは、これら両癌タ
ンパク質のチロシンリン酸化を約５０ｎＭ(ｐ７０^trk)
および３０ｎＭ(ｇｐ１２０^trk5)のＩＣ₅₀にて有効に抑
制した。インビトロでのキナーゼアッセイで得られた結
果と一致して、Ｋ２５２ａは、１μＭもの高濃度でさえ
もｐｐ６０^v-srcのチロシンリン酸化レベルに対して抑
制作用を有しなかった(図７Ｃ)。

【００３７】Ｆ．Ｋ２５２ａはｔｒｋ癌遺伝子により誘
発されたトランスフォームされた表現型を元に戻す：上
記結果は、これらｔｒｋ癌遺伝子によってトランスフォ
ームされたＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフォーム表現型
を元に戻すことができることをも示唆していた。図８に
示すように、ｔｒｋによりトランスフォームされた１０
６−６３２細胞またはｔｒｋ５によりトランスフォーム
されたＢ３８−９４１細胞を１００ｎＭ Ｋ２５２ａの
存在下でわずか３６時間処理するだけでそのトランスフ
ォーム表現型を完全に元に戻した。ｖ−ｓｒｃ(Ｃ７４
−３２１細胞)、およびｖ−ｆｍｓ(Ｃ５１−６４２細
胞)を含む他の幾つかのチロシンプロテインキナーゼ癌
遺伝子、チロシンプロテインキナーゼレセプターに由来
する他の癌遺伝子によりトランスフォームしたＮＩＨ３
Ｔ３細胞株の形態に対しては、３倍までの高い濃度でも
Ｋ２５２ａは効果を有しなかった(図８)。これらｖ−ｓ
ｒｃおよびｖ−ｆｍｓＮＩＨ３Ｔ３トランスフォーム細
胞を増加量(約１μＭ)のＫ２５２ａで処理すると、形態
的な変換の兆候を何等示すことなく毒性作用が現れた
(データは示していない)。これら結果は、Ｋ２５２ａ
が、変異を活性化する性質に拘わらずｔｒｋ癌遺伝子の
トランスフォーム特性のインヒビターであることを確立
するものである。

【００３８】ＩＩＩ．検討 チロシンタンパク質のリン酸化は、細胞が細胞外シグナ
ルを増殖および／または分化応答に変換する基本的機構
の一つである(カントリー(Ｃantley,Ｌ.Ｃ.)ら(１９９
１)、Ｃell、６４、２８１〜３０２)。インシュリン、
ＩＧＦ−Ｉ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＣＳＦ−１、
ＳＦ、ＨＧＦおよびＮＧＦ群のニューロトロフィンを含
む多くの増殖因子は、チロシンプロテインキナーゼレセ
プターを介してその生物学的機能を媒体する。加えて、
Ｓｒｃ群、ｃ−Ａｂ１およびｃ−Ｆｅｓ／Ｆｐｓなどの
一層多くの細胞質チロシンプロテインキナーゼがシグナ
ルの変換に関与していることがわかっている(カントリ
ーら(１９９１)、Ｃell、６４、２８１〜３０２)。これ
らチロシンプロテインキナーゼにより媒体される種々の
生理学的機能のために、特定のインヒビターを開発する
ためにこれらチロシンプロテインキナーゼが魅力的な標
的となってきた。現在までに、エルブスタチン(erbstat
in)、ゲニステイン(genistein)、ヘルビマイシンＡ(her
bimycin Ａ)、ラベンデュスチンＡ(lavendustin Ａ)お
よびトルホスチン(trphostins)などの幾つかのチロシン
プロテインキナーゼインヒビターが単離されてきた。残
念なことに、これらインヒビターは種々のチロシンプロ
テインキナーゼに対して選択性をほとんど示さず、それ
ゆえ治療に使用するには適していなかった。

【００３９】セリン／スレオニンキナーゼの公知インヒ
ビターであるＫ２５２ａ(カセ(Ｋase,Ｈ.)ら(１９８
６)、Ｊ.Ａntibiot.,３９、１０５９〜１０６５；カセ
ら(１９８７)、Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃommun.,１４
２、４３６〜４４０)をミクロモル未満で用いると、Ｎ
ＧＦレセプターであるｇｐ１４０^trkのインビトロでの
チロシンプロテインキナーゼ活性が完全に抑制される。
さらに重要なことに、Ｋ２５２ａは、ＮＧＦにより媒体
されるｇｐ１４０^trkレセプターのインビボでの自己リ
ン酸化を３ｎＭのＩＣ₅₀にて抑制する。同様の結果は、
本発明者らが関連ｇｐ１４５^trkBおよびｇｐ１４５^trkC
チロシンプロテインキナーゼ(それぞれ、ＮＧＦ関連ニ
ューロトロフィンであるＢＤＮＦおよびＮＴ−３のレセ
プターとして働く)を用いた場合にも得られた(グラスら
(１９９１)、Ｃell、６６、４０５〜４１３；クライン
ら(１９９１)、Ｃell、６６、３９５〜４０３；ランベ
ルレら(１９９１)、Ｃell、６６、９６７〜９７９；ソ
ッペトら(１９９１)、Ｃell、６５、８９５〜９０３；
スキントら(１９９１)、Ｃell、６５、８８５〜８９
３)。対照的に、Ｋ２５２ａは、ＥＧＦレセプターおよ
びＰＤＧＦレセプターをその同種リガンドにより活性化
した場合には、これらレセプターの自己リン酸化活性に
対して影響を有しなかった。これら観察結果は、Ｋ２５
２ａがｔｒｋ群のニューロトロフィンレセプターのチロ
シンプロテインキナーゼ活性の強力なインヒビターであ
ることを示している。

【００４０】各ｔｒｋレセプターがその同種リガンドに
より自己分泌刺激されると、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の形態的
トランスフォーメーションが起こる。Ｋ２５２ａは１０
０ｎＭもの低濃度でこのトランスフォーム活性を完全に
阻止し、ｔｒｋレセプターと対応リガンドとを一緒に発
現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフォームした表
現型を元に戻した。興味深いことに、３００ｎＭもの高
濃度のＫ２５２ａでもこれらＮＩＨ３Ｔ３由来細胞の増
殖速度に何等有意の影響を与えなかったし、検出し得る
毒性効果も示さなかった。それゆえ、Ｋ２５２ａは、プ
ロテインキナーゼＣなどのセリン／スレオニンキナーゼ
(その活性は、これら細胞の適当な代謝機能に必要であ
ると思われる)などのインヒビターであるよりも一層有
効なｔｒｋ群レセプターのインヒビターであると思われ
る。

【００４１】ｔｒｋ癌原遺伝子は、種々の遺伝的変化に
よりトランスフォーム特性を獲得し得る(バーバシッド
ら(１９９１)、ＢＢＡ Ｒeviews in Ｃancer、印刷
中)。これら殆どの変異の結果、ｔｒｋ癌遺伝子が生成
し、その生成物は細胞表面レセプターの構造特性をもは
や示さない。ヒト腫瘍では、ｔｒｋ癌遺伝子はその細胞
外配列が非筋肉トロポミオシン(マーチン−ザンカら(１
９８６)、Ｎature、３１９、７４３〜７４８)やｔｐｒ
(グレコ(Ｇreco)ら、公に提供されている)などの非関連
遺伝子により置換されている。加えて、ｔｒｋ配列はイ
ンビトロで組み換えてｔｒｋ癌遺伝子をしばしば生成さ
せることができる(コズマ(Ｋozma,Ｓ.Ｃ.)ら(１９８
８)、ＥＭＢＯ Ｊ.、７、１４７〜１５４；オスカムら
(１９８８)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８５、２９６４
〜２９６８)。これらインビトロで生成したｔｒｋ癌遺
伝子の幾つかは、その細胞外配列が外来遺伝子により置
換されているという点でヒト腫瘍中に認められる遺伝子
と類似している。他のものは、基本的な細胞表面レセプ
ター構造の喪失とならない点突然変異または小さな読み
取り枠欠失により活性化される(クーリエら(１９９
０)、Ｍol.Ｃell.Ｂiol.,１０、４２０２〜４２１０)。
本研究で示したように、Ｋ２５２ａは、細胞質分子また
は細胞表面分子のいずれをコードするかに拘わらず、ｔ
ｒｋ癌遺伝子のチロシンプロテインキナーゼの有効なイ
ンヒビターである。しかしながら、Ｋ２５２ａは、その
癌遺伝子の対立遺伝子のチロシンキナーゼ活性の抑制に
比べておよそ１オーダー高い正常ｔｒｋレセプターのチ
ロシンキナーゼ活性の抑制を示す。ｔｒｋ癌遺伝子に対
するＫ２５２ａの抑制作用が一層限られているのは、癌
遺伝子が活性化されることによる変異のために触媒ドメ
インが構造的に変化する結果であると思われる。

【００４２】Ｋ２５２ａがｔｒｋ癌遺伝子のキナーゼ活
性を抑制するＩＣ₅₀が低いにも拘わらず、このインヒビ
ターは、ヒト結腸癌腫ｔｒｋトランスフォーム遺伝子か
またはインビトロで生成したｔｒｋ５癌遺伝子のいずれ
かを発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフォームした
表現型を１００ｎＭの濃度で有効に元に戻した。対照的
に、チロシンプロテインキナーゼ癌遺伝子ｖ−ｓｒｃお
よびｖ−ｆｍｓを含有するＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランス
フォームした表現型に対しては、１μＭもの高い濃度で
もＫ２５２ａは何らの効果も有しなかった。

【００４３】Ｋ２５２ａは、キナーゼ触媒ドメインへの
ＡＴＰの結合に競合することによりその生物学的活性を
示す一群の天然アルカロイド(スタウロスポリン(stauro
sporine)、Ｋ２５２ｂ)および合成アルカロイド(ＫＴ５
７２０、ＫＴ５８２３、ＫＴ５９２６)の１種である(カ
セら(１９８６)、Ｊ.Ａntibiot.,３９、１０５９〜１０
６５；カセら(１９８７)、Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃo
mmun.,１４２、４３６〜４４０)。正常および癌遺伝子
ｔｒｋキナーゼの触媒活性に対するＫ２５２ａの抑制作
用は、チロシンプロテインキナーゼインヒビターの合理
的な設計の構造的基礎を確立するうえで助けとなるはず
である。

【００４４】

【表１】表１ ： Ｋ２５２ａは、ｔｒｋ群のレセプターをコード
する発現プラスミドおよびそのリガンドをコードする発
現プラスミドでコトランスフェクションすることによる
ＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフォーメーションを抑制す
る。 コトランスフェクションするＤＮＡ^a プラスミド プラスミド Ｋ２５２ａ トランスフォーム活性(レセプター) (ニューロトロフィン) １００ｎＭ (フォーカス／１０⁵細胞) − − − ０ pDM69(gp140^trk) pLTRSNGF(NGF) − ＞１０００ pDM69(gp140^trk) pLTRSNGF(NGF) ＋ ０ pFRK44(gp145^trkB) pLL42(BDNF) − ＞１０００ pFRK44(gp145^trkB) pLL42(BDNF) ＋ ０ pFL20(gp145^trkC) pLL43(NT-3) − ＞１０００ pFL20(gp145^trkC) pLL43(NT-3) ＋ ０ (注)ａ：１００ｎｇのレセプターＤＮＡおよび１μｇの
ニューロトロフィンＤＮＡを各トランスフェクションに
用いた(グラハムおよびファン・デア・エブ、Ｖirology
５３、４５６〜４６７(１９７３))。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＮＧＦおよびＦＧＦにより誘発されるＰＣ１
２細胞のニューロン分化に及ぼすＫ２５２ａの効果を示
すグラフ。

【図２】 各種レセプターのチロシンリン酸化に及ぼす
Ｋ２５２ａの効果を示すウエスタンブロット分析結果の
模式図。

【図３】 Ｋ２５２ａのチロシンプロテインキナーゼ活
性抑制効果を各種濃度で調べたウエスタンブロット分析
結果の模式図。

【図４】 ｔｒｋ群レセプターのチロシンリン酸化に及
ぼすＫ２５２ａの効果を示すウエスタンブロット分析結
果の模式図。

【図５】 Ｋ２５２ａの不存在下または存在下で、レセ
プターをコードするプラスミドおよびリガンドをコード
するプラスミドでコトランスフェクションすることによ
りトランスフォームした細胞の位相差顕微鏡写真。

【図６】 Ｋ２５２ａによるｔｒｋ癌タンパク質のイン
ビトロチロシンプロテインキナーゼ活性の投与量依存性
抑制を示すウエスタンブロット分析結果の模式図。

【図７】 Ｋ２５２ａによるｔｒｋ癌タンパク質のイン
ビボチロシンリン酸化の投与量依存性抑制を示すウエス
タンブロット分析結果の模式図。

【図８】 Ｋ２５２ａの不存在下または存在下で、各種
癌遺伝子でトランスフォームした細胞の位相差顕微鏡写
真。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年３月９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図８

【補正方法】変更

【補正内容】

【図８】

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 治療学的有効量のチロシンプロテインキ
   ナーゼインヒビターを含有することを特徴とする癌の予
   防、安定化および緩解用組成物。
2. 【請求項２】 該チロシンプロテインキナーゼインヒビ
   ターが式： 【化１】 (式中、Ｒ₁は水素またはメチル、Ｒ₂は水素、メチルま
   たはｎ−ヘキシル、Ｒ₃は水素またはメチル、Ｒ₄は水素
   または−ＯＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₃)で示される化合物から選ば
   れる請求項１に記載の組成物。
3. 【請求項３】 該チロシンプロテインキナーゼインヒビ
   ターが(８Ｒ＊，９Ｓ＊，１１Ｓ＊)−(−)−９−ヒドロ
   キシ−９−メトキシカルボニル−８−メチル−２−３−
   ９−１０−テトラヒドロ−８,１１−エポキシ−１Ｈ,８
   Ｈ,１１Ｈ−２,７ｂ,１１ａ−トリアザジベンゾ(ａ,ｇ)
   シクロオクタ(ｃｄｅ)トリンデン−１−オンである請求
   項２に記載の組成物。