JPH05252950A - インターロイキン1β変換酵素精製用アフィニティークロマトグラフィーマトリックス - Google Patents
インターロイキン1β変換酵素精製用アフィニティークロマトグラフィーマトリックスInfo
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Abstract
(57)【要約】 (修正有)
【目的】 担体(サポート)と官能性スペーサと分離及
び/または精製に必要とされる高度で特異的な親和性を
持つ化合物(リガンド)を含むアフィニティクロマトグ
ラフィーマトリックスの提供。 【構成】 粗細胞溶解物調製物又は不完全に精製された
細胞溶解物調製物からインターロイキン−1β変換酵素
(ICE)を精製するのに有用なアフィニティクロマト
グラフィーマトリックス。クロマトグラフィーマトリッ
クスは、二官能性スペーサによりアフィニティカラム担
体に結合された式Iの特異的ICEインヒビターを含
む。 (具体的には例えば 又は
び/または精製に必要とされる高度で特異的な親和性を
持つ化合物(リガンド)を含むアフィニティクロマトグ
ラフィーマトリックスの提供。 【構成】 粗細胞溶解物調製物又は不完全に精製された
細胞溶解物調製物からインターロイキン−1β変換酵素
(ICE)を精製するのに有用なアフィニティクロマト
グラフィーマトリックス。クロマトグラフィーマトリッ
クスは、二官能性スペーサによりアフィニティカラム担
体に結合された式Iの特異的ICEインヒビターを含
む。 (具体的には例えば 又は
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はアフィニティクロマトグ
ラフィーに関するものである。より詳細に特徴を述べれ
ば、この発明は、担体(サポート)と官能性スペーサと
分離及び/または精製に必要とされる高度で特異的な親
和性を持つ化合物(リガンド)を含むアフィニティクロ
マトグラフィーマトリックスの使用に関するものであ
る。さらに本発明は、活性のあるインターロイキン1β
変換酵素(ICE)の精製に役立つアフィニティクロマ
トグラフィーにも関する。
ラフィーに関するものである。より詳細に特徴を述べれ
ば、この発明は、担体(サポート)と官能性スペーサと
分離及び/または精製に必要とされる高度で特異的な親
和性を持つ化合物(リガンド)を含むアフィニティクロ
マトグラフィーマトリックスの使用に関するものであ
る。さらに本発明は、活性のあるインターロイキン1β
変換酵素(ICE)の精製に役立つアフィニティクロマ
トグラフィーにも関する。
【0002】
【従来の技術】アフィニティクロマトグラフィーに関す
る論文、モノグラフ及び書籍の文献があり、アフィニテ
ィクロマトグラフィー担体、クロスリンクするメンバ、
リガンドおよびそれらの準備と使用法に関する各種の重
要テーマを包含している。これらの参考文献としては、
下記のようなものがある。
る論文、モノグラフ及び書籍の文献があり、アフィニテ
ィクロマトグラフィー担体、クロスリンクするメンバ、
リガンドおよびそれらの準備と使用法に関する各種の重
要テーマを包含している。これらの参考文献としては、
下記のようなものがある。
【0003】アフィニティクロマトグラフィー:一般的
手法。Methods Enzymol. 1990,
182 (Guide Protein Puri
f.), 357−71。
手法。Methods Enzymol. 1990,
182 (Guide Protein Puri
f.), 357−71。
【0004】親和性に基づく蛋白質精製の新規処理。
J. Ferment. Bioeng. 1990,
70(3), 199−209。
J. Ferment. Bioeng. 1990,
70(3), 199−209。
【0005】ペプチドとタンパク質の分離および精製に
おける高性能液体色相分析の予備適用。 J. Chr
omatogr. 1989, 492, 431−6
9酵素の大規模精製。 Appl. Microbio
l. Res., Ciba Found. Sym
p. 1985, 111(Enzymes Org.
Synth.), 40−56 (Eng)。
おける高性能液体色相分析の予備適用。 J. Chr
omatogr. 1989, 492, 431−6
9酵素の大規模精製。 Appl. Microbio
l. Res., Ciba Found. Sym
p. 1985, 111(Enzymes Org.
Synth.), 40−56 (Eng)。
【0006】ヘパリン・セファローズアフィニティクロ
マトグラフィーによる酵素の精製。J. Chroma
togr. 1980, 184(3), 335−4
5。
マトグラフィーによる酵素の精製。J. Chroma
togr. 1980, 184(3), 335−4
5。
【0007】アフィニティクロマトグラフィーによる多
結晶酵素精製の原則。 Enzyme Eng. 19
78, 4, 441−2。
結晶酵素精製の原則。 Enzyme Eng. 19
78, 4, 441−2。
【0008】固体支持上の不動低分子量における色相分
析法による酵素および生物学上の実質的タンパク質の精
製。 Postepy Biochem. 1977,
23(1), 113 27。
析法による酵素および生物学上の実質的タンパク質の精
製。 Postepy Biochem. 1977,
23(1), 113 27。
【0009】酵素精製における一般リガンドアフィニテ
ィクロマトグラフィー。リガンド、アフィニティクロマ
トグラフィー、酵素精製。 J. Macromol.
Sci. Chem. 1976, A10(1−
2), 15−52。
ィクロマトグラフィー。リガンド、アフィニティクロマ
トグラフィー、酵素精製。 J. Macromol.
Sci. Chem. 1976, A10(1−
2), 15−52。
【0010】酵素の親和性精製。 Chem. Tec
hnol. 1975, 5(9), 564−71。
hnol. 1975, 5(9), 564−71。
【0011】色相分析法、親和性。 Encycl.
Polym. Sci. Eng.1985, 3,
531−48。
Polym. Sci. Eng.1985, 3,
531−48。
【0012】生物親和性色相分析法。 Pract.
High Perform. Liq. Chroma
togr. 1976, 193−206。
High Perform. Liq. Chroma
togr. 1976, 193−206。
【0013】プラズマ蛋白質のアフィニティクロマトグ
ラフィー−その概要。 Proc.Int. Work
shop Technol. Protein Se
p.Improv. 血液プラズマ分別。1977,
422−35。
ラフィー−その概要。 Proc.Int. Work
shop Technol. Protein Se
p.Improv. 血液プラズマ分別。1977,
422−35。
【0014】酵素のアフィニティクロマトグラフィー。
Affinity Chromatogr. Pro
c. Int. Symp. 1977 (Pub.
1978), 25−38。
Affinity Chromatogr. Pro
c. Int. Symp. 1977 (Pub.
1978), 25−38。
【0015】蛋白質の固定化とアフィニティクロマトグ
ラフィー。 Biotechnol. Appl. P
rotein Enzymes, Pap. Con
f.1976 (Pub. 1977), 83−10
2。
ラフィー。 Biotechnol. Appl. P
rotein Enzymes, Pap. Con
f.1976 (Pub. 1977), 83−10
2。
【0016】蛋白質構造研究におけるアフィニティクロ
マトグラフィーの使用。 Pept. Proc. E
ur. Pept. Symp. 11th 1971
(Pub. 1973), 203−22。
マトグラフィーの使用。 Pept. Proc. E
ur. Pept. Symp. 11th 1971
(Pub. 1973), 203−22。
【0017】酵素のアフィニティクロマトグラフィー。
Fed. Eur. Biochem. Soc.
Meet. [Proc] 1974, 30。
Fed. Eur. Biochem. Soc.
Meet. [Proc] 1974, 30。
【0018】酵素固定用支持物質およびアフィニティク
ロマトグラフィー。BondedStationary
Phases Chromatogr. 1974,
93−112。
ロマトグラフィー。BondedStationary
Phases Chromatogr. 1974,
93−112。
【0019】酵素固定用支持およびアフィニティクロマ
トグラフィー。 Chem. Technol. 19
74, 4(11), 694−700。
トグラフィー。 Chem. Technol. 19
74, 4(11), 694−700。
【0020】アフィニティクロマトグラフィー。酵素阻
害剤。 Methodol. Develop Bio
chem. 1973, 2, 109−12。
害剤。 Methodol. Develop Bio
chem. 1973, 2, 109−12。
【0021】アフィニティクロマトグラフィー。蛋白質
の特殊分離。Chromatographia 197
1 4(12), 578−87。
の特殊分離。Chromatographia 197
1 4(12), 578−87。
【0022】アフィニティクロマトグラフィー。その実
際的アプローチ、IRL Press Limite
d, Oxford England (1985)
および酵素学の手法、Vol. 34: 親和性技術の
酵素精製: 1974. 810pp。
際的アプローチ、IRL Press Limite
d, Oxford England (1985)
および酵素学の手法、Vol. 34: 親和性技術の
酵素精製: 1974. 810pp。
【0023】種々のアフィニティクロマトグラフィーサ
ポート(スペーサつきとスペーサなし)はSIGMAの
カタログに公表されている。SIGMA CHEMIC
ALCo., St. Louis, MO。
ポート(スペーサつきとスペーサなし)はSIGMAの
カタログに公表されている。SIGMA CHEMIC
ALCo., St. Louis, MO。
【0024】インターロイキン1β変換酵素(ICE)
は、インターロイキン1β(IL−1β)前駆体を生物
学的に活性のIL−1βに変換するのに関わる酵素とし
て認識されている。したがってインターロイキン1β変
換酵素は、IL−1が関係する病気の診断またはIL−
1の製造を増強する上で有用である。
は、インターロイキン1β(IL−1β)前駆体を生物
学的に活性のIL−1βに変換するのに関わる酵素とし
て認識されている。したがってインターロイキン1β変
換酵素は、IL−1が関係する病気の診断またはIL−
1の製造を増強する上で有用である。
【0025】哺乳類のインターロイキン1(IL−1)
は、炎症性反応の一部として細胞の種類によって分泌さ
れる免疫調整蛋白質である。IL−1の製造に関わる第
一の細胞の種類は、末梢血液単核細胞である。その他の
細胞の種類についてもIL−1またはIL−1様分子の
リリースや含有について述べられている。これらには下
記に示す各種の細胞が含まれている。上皮細胞 (Lu
ger, et al., J. Immnol. 1
27:1493−1498(1981), Leet
al., J. Immunol. 138: 252
0−2526(1987) and Lovett
and Larsen, J. Clin. Inve
st. 82: 115−122(1988)、結合組
織細胞(Ollivierre et al., Bi
ochem. Biophys. Res. Com
m. 141: 904−911(1986), Le
et al, J. Immunol. 138: 2
520−2526 (1987)、神経起源の細胞
(Giulianet al., J. Esp. M
ed. 164: 94−604(1986)、および
白血球 (Pistoia et al., J. I
mmunol. 136: 1688−1692(19
86), Acres et al., Mol. I
mmunol. 24: 479−485(198
7)、 Acres et al.,J: Immun
ol. 138: 2132−2136(1987)
andLindenmann et al., J.
Immunol 140:837−839(198
8)。
は、炎症性反応の一部として細胞の種類によって分泌さ
れる免疫調整蛋白質である。IL−1の製造に関わる第
一の細胞の種類は、末梢血液単核細胞である。その他の
細胞の種類についてもIL−1またはIL−1様分子の
リリースや含有について述べられている。これらには下
記に示す各種の細胞が含まれている。上皮細胞 (Lu
ger, et al., J. Immnol. 1
27:1493−1498(1981), Leet
al., J. Immunol. 138: 252
0−2526(1987) and Lovett
and Larsen, J. Clin. Inve
st. 82: 115−122(1988)、結合組
織細胞(Ollivierre et al., Bi
ochem. Biophys. Res. Com
m. 141: 904−911(1986), Le
et al, J. Immunol. 138: 2
520−2526 (1987)、神経起源の細胞
(Giulianet al., J. Esp. M
ed. 164: 94−604(1986)、および
白血球 (Pistoia et al., J. I
mmunol. 136: 1688−1692(19
86), Acres et al., Mol. I
mmunol. 24: 479−485(198
7)、 Acres et al.,J: Immun
ol. 138: 2132−2136(1987)
andLindenmann et al., J.
Immunol 140:837−839(198
8)。
【0026】生物学的に活性のIL−1は、2種類の異
なった形で存在している。その1つは、およそpI5.
2の等電点を持つIL−1αであり、他の1つはおよそ
7.0の等電点を持ち約17,500の分子量を持つI
L−1βである。(Bayne et al., J.
Esp. Med. 163: 1267−1280
(1986) and Schmidt, J. Es
p. Med. 160: 772(1984)。ポリ
ペプチドは進化的に保存されているように見え、アミノ
酸レベルでおよそ27−33%相同性を示している。
(Clark et al., Nucleic Ac
ids Res. 14: 7897−7914(19
86)。
なった形で存在している。その1つは、およそpI5.
2の等電点を持つIL−1αであり、他の1つはおよそ
7.0の等電点を持ち約17,500の分子量を持つI
L−1βである。(Bayne et al., J.
Esp. Med. 163: 1267−1280
(1986) and Schmidt, J. Es
p. Med. 160: 772(1984)。ポリ
ペプチドは進化的に保存されているように見え、アミノ
酸レベルでおよそ27−33%相同性を示している。
(Clark et al., Nucleic Ac
ids Res. 14: 7897−7914(19
86)。
【0027】哺乳類のIL−1βは、およそ31.4
kDaの分子量を持つ細胞関連前駆体ポリペプチドとし
て合成されている。(Limjuco et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 83: 3972−3976 (1986)。前
駆体IL−1βはIL−1受容体に結合できず生物学的
に不活性である。(Mosley et al.,
J. Biol. Chem. 262: 2941−
2944(1987)。生物学的活性は、前駆体の3
1.5 kDa形を17.5 kDaの成熟した形に変
換させる何らかの形式の蛋白質加水分解処理に依存する
ようにみられている。前駆体のIL−1βを成熟したI
L−1βに変換すること阻害することによって、インタ
ーロイキン1の活性を効果的に阻害できるという証拠が
得られている。
kDaの分子量を持つ細胞関連前駆体ポリペプチドとし
て合成されている。(Limjuco et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 83: 3972−3976 (1986)。前
駆体IL−1βはIL−1受容体に結合できず生物学的
に不活性である。(Mosley et al.,
J. Biol. Chem. 262: 2941−
2944(1987)。生物学的活性は、前駆体の3
1.5 kDa形を17.5 kDaの成熟した形に変
換させる何らかの形式の蛋白質加水分解処理に依存する
ようにみられている。前駆体のIL−1βを成熟したI
L−1βに変換すること阻害することによって、インタ
ーロイキン1の活性を効果的に阻害できるという証拠が
得られている。
【0028】IL−1βの製造能力を有する哺乳動物細
胞には、下記に示すものがあるがそれらに制限されるわ
けではない。カラティノサイト、内皮細胞、メサンジア
ル細胞、胸腺上皮細胞、皮膚結合織形成細胞、軟骨細
胞、アストロサイト、神経膠腫細胞、単核喰細胞、顆粒
球、T及びBリンパ球およびNK細胞。
胞には、下記に示すものがあるがそれらに制限されるわ
けではない。カラティノサイト、内皮細胞、メサンジア
ル細胞、胸腺上皮細胞、皮膚結合織形成細胞、軟骨細
胞、アストロサイト、神経膠腫細胞、単核喰細胞、顆粒
球、T及びBリンパ球およびNK細胞。
【0029】J. J. オッペンハイム、その他の著
書・現代免疫学、 vol. 7(2):45−56
(1986)に述べられているように、インターロイキ
ン1の活性は多岐にわたっている。これは、軟骨マトリ
ックスの分解を促進する因子であるカタボリンが、IL
−1の胸腺細胞コミトジェニックの活性も示し、軟骨細
胞を刺激してコラゲナーゼ中性プロテアーゼおよびプラ
スミノーゲンアクチベーターを放出させることも観察さ
れている。さらに蛋白質分解誘導因子と呼ばれる血漿因
子がプロスタグラジンを製造するために筋肉細胞を刺激
し、このプロスタグラジンが順に蛋白質加水分解を導き
アミノ酸を放出するとともに、これが長期にわたって実
行されると筋肉が衰弱し、熱誘導、急性反応、および胸
腺細胞コミトジェニック活性を持つIL−1の断片を示
すようになる。
書・現代免疫学、 vol. 7(2):45−56
(1986)に述べられているように、インターロイキ
ン1の活性は多岐にわたっている。これは、軟骨マトリ
ックスの分解を促進する因子であるカタボリンが、IL
−1の胸腺細胞コミトジェニックの活性も示し、軟骨細
胞を刺激してコラゲナーゼ中性プロテアーゼおよびプラ
スミノーゲンアクチベーターを放出させることも観察さ
れている。さらに蛋白質分解誘導因子と呼ばれる血漿因
子がプロスタグラジンを製造するために筋肉細胞を刺激
し、このプロスタグラジンが順に蛋白質加水分解を導き
アミノ酸を放出するとともに、これが長期にわたって実
行されると筋肉が衰弱し、熱誘導、急性反応、および胸
腺細胞コミトジェニック活性を持つIL−1の断片を示
すようになる。
【0030】IL−1は炎症と傷の治癒に関連する細胞
に対して複数の効果を持っている。IL−1の皮下注射
は、好中性のマージネイションを導くとともに多形核白
血球(PMN)の白血球の血管外浸潤を最大にする。イ
ンビトロ研究によれば、IL−1が、グルコースの新陳
代謝を高速化しニトロブルーテトラゾリウムを減少さ
せ、リソゾマール酵素を放出させるためにPMNを活性
化するPMNの走化性吸引物となることが明らかになっ
ている。内皮細胞は、トロンボキサンを製造するためと
粘着性を強めるため、さらには凝固促進活性を解放する
ために、IL−1によって増殖を刺激される。IL−1
はまた表皮細胞によってIV型コラーゲンの製造を増強
させ、骨芽細胞増殖およびアルカリのホスファターゼの
製造を誘発し、破骨細胞を刺激して骨を再吸収する。マ
クロファージはIL−1に走化的に吸引され、IL−1
に対する反応としてプロスタグランジンを製造し、より
延長された活性の腫瘍状態を示すことが報告されてい
る。
に対して複数の効果を持っている。IL−1の皮下注射
は、好中性のマージネイションを導くとともに多形核白
血球(PMN)の白血球の血管外浸潤を最大にする。イ
ンビトロ研究によれば、IL−1が、グルコースの新陳
代謝を高速化しニトロブルーテトラゾリウムを減少さ
せ、リソゾマール酵素を放出させるためにPMNを活性
化するPMNの走化性吸引物となることが明らかになっ
ている。内皮細胞は、トロンボキサンを製造するためと
粘着性を強めるため、さらには凝固促進活性を解放する
ために、IL−1によって増殖を刺激される。IL−1
はまた表皮細胞によってIV型コラーゲンの製造を増強
させ、骨芽細胞増殖およびアルカリのホスファターゼの
製造を誘発し、破骨細胞を刺激して骨を再吸収する。マ
クロファージはIL−1に走化的に吸引され、IL−1
に対する反応としてプロスタグランジンを製造し、より
延長された活性の腫瘍状態を示すことが報告されてい
る。
【0031】IL−1はまた組織形態学(サバチーニ、
M. 他著 PNAS 85:5235−5239,
1988)によって明らかにされているように、ネズ
ミに注射することによりハイパーカリーミアを引き起こ
す有力な骨の再吸収剤であり、骨再吸収面を増大させ
る。
M. 他著 PNAS 85:5235−5239,
1988)によって明らかにされているように、ネズ
ミに注射することによりハイパーカリーミアを引き起こ
す有力な骨の再吸収剤であり、骨再吸収面を増大させ
る。
【0032】したがって、IL−1は、下記に列記する
疾病に関連を持っている。随膜炎や卵管炎など、体内の
どこかに存在する感染性の疾病。敗血症、多発内部血管
凝結、あるいは成人性呼吸困難症を含む感染症の余病。
抗原または抗体あるいは補体沈澱物による急性あるいは
慢性の炎症。関節炎、コランジティス、大腸炎、脳炎、
心内膜炎、糸球体腎炎、肝炎、心筋炎、膵臓炎、心膜
炎、再潅流傷害および動脈炎を含む炎症状態。これらに
は式IのICEインヒビタによる可能性のある免疫ベー
スの疾病が含まれるが、これには急性および遅延性過敏
症、植皮拒否症、拒絶反応などのT細胞あるいはマクロ
ファージの関わる状態に制限されない。I型糖尿病およ
び多発性硬化症を含む自己免疫性疾病。IL−1はまた
細胞外のマトリックスにおける過剰沈澱をもたらす疾病
はもちろんのこと、骨および軟骨再吸収の処置において
も関連がある。これらの疾病には、歯周病、肺隙間繊維
症、硬変症、体系的硬化症、およびケロイド形成なども
含まれている。
疾病に関連を持っている。随膜炎や卵管炎など、体内の
どこかに存在する感染性の疾病。敗血症、多発内部血管
凝結、あるいは成人性呼吸困難症を含む感染症の余病。
抗原または抗体あるいは補体沈澱物による急性あるいは
慢性の炎症。関節炎、コランジティス、大腸炎、脳炎、
心内膜炎、糸球体腎炎、肝炎、心筋炎、膵臓炎、心膜
炎、再潅流傷害および動脈炎を含む炎症状態。これらに
は式IのICEインヒビタによる可能性のある免疫ベー
スの疾病が含まれるが、これには急性および遅延性過敏
症、植皮拒否症、拒絶反応などのT細胞あるいはマクロ
ファージの関わる状態に制限されない。I型糖尿病およ
び多発性硬化症を含む自己免疫性疾病。IL−1はまた
細胞外のマトリックスにおける過剰沈澱をもたらす疾病
はもちろんのこと、骨および軟骨再吸収の処置において
も関連がある。これらの疾病には、歯周病、肺隙間繊維
症、硬変症、体系的硬化症、およびケロイド形成なども
含まれている。
【0033】
【発明の要約】アフィニティクロマトグラフィーマトリ
ックスは、原液または不完全に精製された細胞の溶解調
製物からインターロイキン1β変換酵素(ICE)を精
製することに役立つことが公表されている。このクロマ
トグラフィーマトリックスは、二重機能型スペーサによ
ってサポートする親和カラムに付着する式Iの特殊IC
Eインヒビタによって構成されている。
ックスは、原液または不完全に精製された細胞の溶解調
製物からインターロイキン1β変換酵素(ICE)を精
製することに役立つことが公表されている。このクロマ
トグラフィーマトリックスは、二重機能型スペーサによ
ってサポートする親和カラムに付着する式Iの特殊IC
Eインヒビタによって構成されている。
【0034】
【化26】
【0035】
【発明の説明】本発明を具体例の1つは、下記事項より
構成されたアフィニティクロマトグラフィーマトリック
スを含む。
構成されたアフィニティクロマトグラフィーマトリック
スを含む。
【0036】(a)式Iの化合物
【0037】
【化27】
【0038】ここでYは次の通り:
【0039】
【化28】
【0040】(b)アフィニティークロマトグラフィー
の支持体(担体); および(c)前述の式Iの化合物
および前述の支持体に結合するスペーサ・コヴァレント
リ(共有結合性スペーサー);前述の式Iの化合物は下
記のように定義されている。
の支持体(担体); および(c)前述の式Iの化合物
および前述の支持体に結合するスペーサ・コヴァレント
リ(共有結合性スペーサー);前述の式Iの化合物は下
記のように定義されている。
【0041】R1は(a)置換されたC1-12アルキル、
ここで置換基は下記の物質から選択される。
ここで置換基は下記の物質から選択される。
【0042】(1)水素、(2)ヒドロキシ、(3)ハ
ロゲン、(4)C1-6アルキルカルボニル、(5)ホル
ミル、(6)アミノ、(7)カルボキシ、(8)チオー
ル、および(9)オキシラニール;(b)アリール C
1-6アルキル、ここでアリール基は下記の物質によって
構成されるグループから選択される:(1)フェニル、
(2)ナフチル、(3)ピリジル、(4)フリル、
(5)ティエニル、(6)ティアゾリル、(7)イソテ
ィアゾニル、(8)イミダゾリル、(9)ベンズイミダ
ゾリール、(10)ピラジニル、(11)ピリミディ
ル、(12)キノリル、(13)イソキノリル、(1
4)ベンゾフリル、(15)ベンゾティエニル、(1
6)ピラゾリル、(17)インドリル、(18)ピュリ
ニル、(19)イソキサゾリル、および(20)オキサ
ゾリル、さらにモノおよびジ置換アリールは、上記
(1)項より(20)項に定義された通りであり、置換
基はそれぞれ独立にC1-6アルキル、ハロゲン、ヒドロ
キシ、アミノC1-6アルキル、チオC1-6アルキル、ホル
ミルC1-6アルキル、およびヒドロキシC1-6アルキルで
ある。
ロゲン、(4)C1-6アルキルカルボニル、(5)ホル
ミル、(6)アミノ、(7)カルボキシ、(8)チオー
ル、および(9)オキシラニール;(b)アリール C
1-6アルキル、ここでアリール基は下記の物質によって
構成されるグループから選択される:(1)フェニル、
(2)ナフチル、(3)ピリジル、(4)フリル、
(5)ティエニル、(6)ティアゾリル、(7)イソテ
ィアゾニル、(8)イミダゾリル、(9)ベンズイミダ
ゾリール、(10)ピラジニル、(11)ピリミディ
ル、(12)キノリル、(13)イソキノリル、(1
4)ベンゾフリル、(15)ベンゾティエニル、(1
6)ピラゾリル、(17)インドリル、(18)ピュリ
ニル、(19)イソキサゾリル、および(20)オキサ
ゾリル、さらにモノおよびジ置換アリールは、上記
(1)項より(20)項に定義された通りであり、置換
基はそれぞれ独立にC1-6アルキル、ハロゲン、ヒドロ
キシ、アミノC1-6アルキル、チオC1-6アルキル、ホル
ミルC1-6アルキル、およびヒドロキシC1-6アルキルで
ある。
【0043】R2は次の通り。
【0044】(a)H、(b)
【0045】
【化29】
【0046】ここで、R4およびR5は、水素、弗素およ
びヒドロキシからそれぞれに個別に選択される。
びヒドロキシからそれぞれに個別に選択される。
【0047】R6は下記の物質によって構成されるグル
ープから選択される。
ープから選択される。
【0048】(1)水素、(2)弗素、(3)置換した
C1-6アルキル ここで置換基は下記の物質から選択される。
C1-6アルキル ここで置換基は下記の物質から選択される。
【0049】(a)水素、(b)ヒドロキシ、(c)ハ
ロゲン、(d)C1-6アルキルカルボニル、(4)アリ
ールC1-6アルキル ここで、アルキルは、水素、OXO、C1-3アルキル、
ハロゲン、またはヒドロキシと置換される。
ロゲン、(d)C1-6アルキルカルボニル、(4)アリ
ールC1-6アルキル ここで、アルキルは、水素、OXO、C1-3アルキル、
ハロゲン、またはヒドロキシと置換される。
【0050】アリールは上に定義された通りで、これは
モノまたはジ置換であってもよい。置換基は、それぞれ
独立にC1-6アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、C1-6ア
ルキル・アミノ、C1-6アルコキシ、C1-6アルキルチ
オ、およびC1-6アルキルカルボニルである。
モノまたはジ置換であってもよい。置換基は、それぞれ
独立にC1-6アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、C1-6ア
ルキル・アミノ、C1-6アルコキシ、C1-6アルキルチ
オ、およびC1-6アルキルカルボニルである。
【0051】(5)C1-6アルキルアミノカルボニル、
C1-6アルキル、またはC1-6アルキルカルボニルアミ
ノ、C1-6アルキル、(6)アリールアミノカルボニ
ル、C1-6アルキル、またはアリールカルボニルアミ
ノ、C1-6アルキル、ここで、アリールは上に定義され
た通りであり、アリールはモノまたはジ置換であっても
よい。置換基は、それぞれ独立にC1-6アルキル、ハロ
ゲン、ヒドロキシ、C1-6アルキルアミノ、C1-6アルコ
キシ、C1-6アルキルチオ、およびC1-6アルキルカボニ
ルである。
C1-6アルキル、またはC1-6アルキルカルボニルアミ
ノ、C1-6アルキル、(6)アリールアミノカルボニ
ル、C1-6アルキル、またはアリールカルボニルアミ
ノ、C1-6アルキル、ここで、アリールは上に定義され
た通りであり、アリールはモノまたはジ置換であっても
よい。置換基は、それぞれ独立にC1-6アルキル、ハロ
ゲン、ヒドロキシ、C1-6アルキルアミノ、C1-6アルコ
キシ、C1-6アルキルチオ、およびC1-6アルキルカボニ
ルである。
【0052】(7)アリール、C1-6アルキルアミノカ
ルボニル、C1-6アルキル、またはアリールC1-6アルキ
ルカルボニルアミノ、C1-6アルキル、ここで、アリー
ルは上に定義された通りであり、これはモノまたはジ置
換であってもよい。置換基は、それぞれ独立にC1-6ア
ルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、C1-6アルキルアミ
ノ、C1-6アルコキシ、C1-6アルキルチオ、およびC
1-6アルキルカルボニルである。
ルボニル、C1-6アルキル、またはアリールC1-6アルキ
ルカルボニルアミノ、C1-6アルキル、ここで、アリー
ルは上に定義された通りであり、これはモノまたはジ置
換であってもよい。置換基は、それぞれ独立にC1-6ア
ルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、C1-6アルキルアミ
ノ、C1-6アルコキシ、C1-6アルキルチオ、およびC
1-6アルキルカルボニルである。
【0053】AA1は下記の物質によって構成されるグ
ループから独立して選択される: (a)単結合、および (b)式AIのアミノ酸
ループから独立して選択される: (a)単結合、および (b)式AIのアミノ酸
【0054】
【化30】
【0055】ここで、R7は下記の物質によって構成さ
れるグループから選択される:(a)水素、(b)置換
したC1-10アルキル;ここで、置換基は下記の物質から
選択される:(1)水素、(2)ヒドロキシ、(3)ハ
ロゲン、(4)−S−C1-4アルキル、(5)SH、
(6)ホルミル、(7)アミノ、(8)オキシラニル、
(9)C1-6アルキルカルボニル、(10)カルボキシ
(11)
れるグループから選択される:(a)水素、(b)置換
したC1-10アルキル;ここで、置換基は下記の物質から
選択される:(1)水素、(2)ヒドロキシ、(3)ハ
ロゲン、(4)−S−C1-4アルキル、(5)SH、
(6)ホルミル、(7)アミノ、(8)オキシラニル、
(9)C1-6アルキルカルボニル、(10)カルボキシ
(11)
【0056】
【化31】
【0057】(12)アミノカルボニルアミノ、(1
3)C1-4アルキルアミノ、ここで、アルキル部は水素
またはヒドロキシで置換されており、そしてアミノは水
素またはCBZで置換されている。
3)C1-4アルキルアミノ、ここで、アルキル部は水素
またはヒドロキシで置換されており、そしてアミノは水
素またはCBZで置換されている。
【0058】(14)グアニジノ、および(c)アリー
ルC1-6アルキル、ここで、アリールは上に定義された
通りであり、これはモノまたはジ置換であってもよい。
置換基は、それぞれ独立にC1-6アルキル、ハロゲン、
ヒドロキシ、アミノ、チオール、カルボキシ、ホルミ
ル、オキシラニルアミノC1-6アルキル、ホルミルC1-6
アルキル、オキシラニルC1-6アルキル、チオールC1-6
アルキル、カーボキシC1-6アルキル、ヒドロキシC1-6
アルキル、およびハロC1-6アルキルである。
ルC1-6アルキル、ここで、アリールは上に定義された
通りであり、これはモノまたはジ置換であってもよい。
置換基は、それぞれ独立にC1-6アルキル、ハロゲン、
ヒドロキシ、アミノ、チオール、カルボキシ、ホルミ
ル、オキシラニルアミノC1-6アルキル、ホルミルC1-6
アルキル、オキシラニルC1-6アルキル、チオールC1-6
アルキル、カーボキシC1-6アルキル、ヒドロキシC1-6
アルキル、およびハロC1-6アルキルである。
【0059】AA2は下記の物質によって構成されるグ
ループから独立して選択される。
ループから独立して選択される。
【0060】(a)単結合、および (b)式AIIのアミノ酸
【0061】
【化32】
【0062】AAA3は、下記の物質によって構成され
るグループから、それぞれ独立して選択される。
るグループから、それぞれ独立して選択される。
【0063】(a)単結合、または (b)式AIIIのアミノ酸
【0064】
【化33】
【0065】ここで、R8およびR9は下記の物質によっ
て構成されるグループからそれぞれ独立して選択され
る。
て構成されるグループからそれぞれ独立して選択され
る。
【0066】(a)水素、(b)置換したC1-10アルキ
ル、ここで、置換基は下記の物質から選択される。
ル、ここで、置換基は下記の物質から選択される。
【0067】(1)水素、(2)ヒドロキシ、(3)ハ
ロゲン、ここで置換基は下記の物質から選択される。
ロゲン、ここで置換基は下記の物質から選択される。
【0068】(4)−S−C1-4アルキル、(5)S
H、(6)C1-6アルキルカルボニル、(7)カルボキ
シ、(8)
H、(6)C1-6アルキルカルボニル、(7)カルボキ
シ、(8)
【0069】
【化34】
【0070】(9)アミノカルボニルアミノ、(10)
C1-4アルキルアミノ ここで、アルキル部は水素またはヒドロキシで置換され
ている。そしてアミノは水素またはCBZで置換されて
いる。
C1-4アルキルアミノ ここで、アルキル部は水素またはヒドロキシで置換され
ている。そしてアミノは水素またはCBZで置換されて
いる。
【0071】(11)グアニジノ、(12)ホルミル、
(13)オキシラニル、および(14)アミノ (c)アリールC1-6アルキル、ここで、アリールは上
に定義された通りであり、これはモノまたはジ置換であ
ってもよい。置換基は、それぞれ独立にC1-6アルキ
ル、ヒドロキシ、アミノ、ホルミル、チオール、オキシ
ラニル、カルボキシアミノC1-6アルキル、ホルミルC
1-6アルキル、オキシラニルC1-6アルキル、チオールC
1-6アルキル、カルボキシC1-6アルキル、ヒドロキシC
1-6アルキル、およびハロC1-6アルキルである。
(13)オキシラニル、および(14)アミノ (c)アリールC1-6アルキル、ここで、アリールは上
に定義された通りであり、これはモノまたはジ置換であ
ってもよい。置換基は、それぞれ独立にC1-6アルキ
ル、ヒドロキシ、アミノ、ホルミル、チオール、オキシ
ラニル、カルボキシアミノC1-6アルキル、ホルミルC
1-6アルキル、オキシラニルC1-6アルキル、チオールC
1-6アルキル、カルボキシC1-6アルキル、ヒドロキシC
1-6アルキル、およびハロC1-6アルキルである。
【0072】前述のスペーサは、次のように定義されて
いる。
いる。
【0073】(1)単結合、または (2)−X−Z−Y− ここで、XとYは最初と2番目の反応性、または活性化
できる官能基であり、XとYは、ヒドロキシ、アミノ、
チオール、カルボキシ、オキシラニル、ホルミル、ハロ
ゲン、イソシアネート、およびクロロサルフォニルなど
の基からそれぞれ独立して選択され、Zは次のようなグ
ループから選択される。
できる官能基であり、XとYは、ヒドロキシ、アミノ、
チオール、カルボキシ、オキシラニル、ホルミル、ハロ
ゲン、イソシアネート、およびクロロサルフォニルなど
の基からそれぞれ独立して選択され、Zは次のようなグ
ループから選択される。
【0074】(a)C1-12アルキル、(b)アリール、
(c)C1-6アルキルアリール、(d)C1-6アルキルア
リールC1-6アルキル ここで、アルキルの1個、2個またはそれ以上の炭素原
子が1つの酸素、硫黄、または窒素と置き換えられるこ
とがあり、アリールにはフェニル、ナフチル、ピリジ
ル、またはティエニルなどが含有され、これら以外のも
のも含有される。さらに (e)2から10のアミノ酸ペプチド、このアミノ酸
は、下記のアミノ酸のL−型およびD−型以外のものも
含有される。
(c)C1-6アルキルアリール、(d)C1-6アルキルア
リールC1-6アルキル ここで、アルキルの1個、2個またはそれ以上の炭素原
子が1つの酸素、硫黄、または窒素と置き換えられるこ
とがあり、アリールにはフェニル、ナフチル、ピリジ
ル、またはティエニルなどが含有され、これら以外のも
のも含有される。さらに (e)2から10のアミノ酸ペプチド、このアミノ酸
は、下記のアミノ酸のL−型およびD−型以外のものも
含有される。
【0075】グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、
イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、
アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、ヒ
ドロキシ・リシン、ヒスチジン、アルギニン、フェニル
アラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メ
チオニン、オルニチン、β−アラニン、ホモセリン、ホ
モタイロシン、ホモフェニルアラニンおよびシトルリ
ン。
イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、
アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、ヒ
ドロキシ・リシン、ヒスチジン、アルギニン、フェニル
アラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メ
チオニン、オルニチン、β−アラニン、ホモセリン、ホ
モタイロシン、ホモフェニルアラニンおよびシトルリ
ン。
【0076】下記に示すスペーサを含むが、これらに限
定されるわけではない。p−ベンゾキノン、ビス−(ジ
アゾベンジジン)3、6−ビス−(水銀メチル)ジオキ
サン、ビスオキシラン、塩化シアヌール酸、p,p’−
ジフルオロ−m,m’−、ジシクロヘキシル・カルボジ
イミド、ジニトロフェニルサルフォン、ジメチルアディ
ピミデート、ジメチルスベルイミデート、ジビニルサル
フォン、N,N’−エチレン−ビス(ヨードアセトアミ
ド)、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンビス−(メ
ール・イミド)、ジイソシアン化ヘキサメチレン、N,
N’1,3−フェニレン−ビス(メールイミド)、フェ
ノール−2、4塩化ジサルフォニル、テトラ窒化o−ジ
アニシジン、ジイソシアン化トルエン、ウッドワードの
K試薬、水溶性カルボジイミド、6アミノヘキサン酸、
ヘキサメチレンジアミン、1,7−ジアミノ−4−アザ
−ヘプタン(3,3’−ジアミノ−ジプロピラミン)、
およびアミノ酸またはペプチド。
定されるわけではない。p−ベンゾキノン、ビス−(ジ
アゾベンジジン)3、6−ビス−(水銀メチル)ジオキ
サン、ビスオキシラン、塩化シアヌール酸、p,p’−
ジフルオロ−m,m’−、ジシクロヘキシル・カルボジ
イミド、ジニトロフェニルサルフォン、ジメチルアディ
ピミデート、ジメチルスベルイミデート、ジビニルサル
フォン、N,N’−エチレン−ビス(ヨードアセトアミ
ド)、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンビス−(メ
ール・イミド)、ジイソシアン化ヘキサメチレン、N,
N’1,3−フェニレン−ビス(メールイミド)、フェ
ノール−2、4塩化ジサルフォニル、テトラ窒化o−ジ
アニシジン、ジイソシアン化トルエン、ウッドワードの
K試薬、水溶性カルボジイミド、6アミノヘキサン酸、
ヘキサメチレンジアミン、1,7−ジアミノ−4−アザ
−ヘプタン(3,3’−ジアミノ−ジプロピラミン)、
およびアミノ酸またはペプチド。
【0077】前述のアフィニティクロマトグラフィー支
持体には、グラス、アガロース、ポリアクリルアミン、
デキストランなどが含まれるが、これらに限定されるわ
けではなく、クロスリンクしたデキストラン(セファロ
ーズ)セルロースなどが含まれており、マトレックス・
セルフィン・ホルミル(アミコン)、カルボキシメチル
セルロースのような置換セルロースおよびセルロース炭
酸塩、アルミナ、ヒドロキシアルキルメタクリル酸塩も
含む。前述の支持体を支えるヒドロキシル、カルボキシ
ル、アミン、フェノール、無水物、アルデヒド、エポキ
シド、またはチオールなどの反応性基が含まれている。
ここで、スペーサの1官能基は前述の媒体における前述
の反応性官能基と縮合されており、前述の2番目の反応
性官能基は、前述の式Iの化合物と縮合されている。
持体には、グラス、アガロース、ポリアクリルアミン、
デキストランなどが含まれるが、これらに限定されるわ
けではなく、クロスリンクしたデキストラン(セファロ
ーズ)セルロースなどが含まれており、マトレックス・
セルフィン・ホルミル(アミコン)、カルボキシメチル
セルロースのような置換セルロースおよびセルロース炭
酸塩、アルミナ、ヒドロキシアルキルメタクリル酸塩も
含む。前述の支持体を支えるヒドロキシル、カルボキシ
ル、アミン、フェノール、無水物、アルデヒド、エポキ
シド、またはチオールなどの反応性基が含まれている。
ここで、スペーサの1官能基は前述の媒体における前述
の反応性官能基と縮合されており、前述の2番目の反応
性官能基は、前述の式Iの化合物と縮合されている。
【0078】この出願の背景の部分に述べられているよ
うに、これらの支持体とスペーサは当業界の中ではよく
知られているが、その手法はそのスペーサに支持体とリ
ガンドを付着する方法である。その例は、本書に参考文
献として組み込まれているアフィニティクロマトグラフ
ィー、その実際的アプローチ(IRL PressLt
d., Oxford England 1985)を
参照のこと。
うに、これらの支持体とスペーサは当業界の中ではよく
知られているが、その手法はそのスペーサに支持体とリ
ガンドを付着する方法である。その例は、本書に参考文
献として組み込まれているアフィニティクロマトグラフ
ィー、その実際的アプローチ(IRL PressLt
d., Oxford England 1985)を
参照のこと。
【0079】アフィニティクロマトグラフィー支持体は
マトレックス・セルロース・セルフィンホルミルなどの
ビス・オキシレン被置換セルロースまたはセファロース
CL−4Bなどのクロスリンクしたデクストランなどか
ら構成されるグループから選択される属が最初の具体例
に含まれる。
マトレックス・セルロース・セルフィンホルミルなどの
ビス・オキシレン被置換セルロースまたはセファロース
CL−4Bなどのクロスリンクしたデクストランなどか
ら構成されるグループから選択される属が最初の具体例
に含まれる。
【0080】この属の1つのクラスは、式Iの化合物で
あり、ここで、R1は下記のように定義されている。
あり、ここで、R1は下記のように定義されている。
【0081】(a)置換したC1-6アルキル ここで、置換基は下記の物質から選択される。
【0082】(1)水素、(2)ヒドロキシ、(3)ク
ロロまたはフッ素、および (b)アリールC1-6アルキル ここで、アリール・グループは下記の物質によって構成
されるグループから選択される。
ロロまたはフッ素、および (b)アリールC1-6アルキル ここで、アリール・グループは下記の物質によって構成
されるグループから選択される。
【0083】(1)フェニル、(2)ナフチル、(3)
ピリジル、(4)フリル、(5)ティエニル、(6)テ
ィアゾリル、(7)イソティアゾニル、(8)ベンゾフ
リル、(9)ベンゾティエニル、(10)インドリル、
(11)イソオキサゾリル、および(12)オキサゾリ
ル、さらにモノおよびジ置換のC6−10アリールは、
(1)項から(12)項の中で上のように定義されてい
る。
ピリジル、(4)フリル、(5)ティエニル、(6)テ
ィアゾリル、(7)イソティアゾニル、(8)ベンゾフ
リル、(9)ベンゾティエニル、(10)インドリル、
(11)イソオキサゾリル、および(12)オキサゾリ
ル、さらにモノおよびジ置換のC6−10アリールは、
(1)項から(12)項の中で上のように定義されてい
る。
【0084】ここで、置換基はそれぞれ独立にC1-4ア
ルキル、ハロゲン、およびヒドロキシである。
ルキル、ハロゲン、およびヒドロキシである。
【0085】R2は水素である。
【0086】AA1は下記の物質によって構成されるグ
ループから独立して選択される。
ループから独立して選択される。
【0087】(a)単結合、および (b)式AIのアミノ酸
【0088】
【化35】
【0089】ここで、R7はアリールC1-6アルキルであ
る。アリールは上に定義された通りであり、これはモノ
またはジ置換であってもよい。置換基は、それぞれ独立
してC1-6アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノC
1-6アルキル、ヒドロキシC1-6アルキル、チオC1-6ア
ルキル、およびホルミルC1-6アルキルである。
る。アリールは上に定義された通りであり、これはモノ
またはジ置換であってもよい。置換基は、それぞれ独立
してC1-6アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノC
1-6アルキル、ヒドロキシC1-6アルキル、チオC1-6ア
ルキル、およびホルミルC1-6アルキルである。
【0090】AA2は下記の物質によって構成されるグ
ループから独立して選択される。
ループから独立して選択される。
【0091】(a)単結合、および (b)式AIIのアミノ酸
【0092】
【化36】
【0093】AA3は、下記の物質によって構成される
グループからそれぞれ独立して選択される。
グループからそれぞれ独立して選択される。
【0094】(a)単結合、および (b)式AIIIのアミノ酸
【0095】
【化37】
【0096】ここで、R8およびR9は下記の物質によっ
て構成されるグループからそれぞれ独立して選択され
る。
て構成されるグループからそれぞれ独立して選択され
る。
【0097】(a)水素、(b)置換したC1-10アルキ
ルここで、置換基は下記の物質から選択される。
ルここで、置換基は下記の物質から選択される。
【0098】(1)水素、(2)ヒドロキシ(3)ハロ
ゲン、(4)SH、(6)C1-6アルキルカルボニル、
(7)カルボキシ(8)ホルミル、(9)オキシラニ
ル、(10)アミノ、(c)アリールC1-6アルキル、
ここで、アリールは上に定義された通りであり、これは
モノまたはジ置換であってもよい。置換基は、それぞれ
独立してC1-6アルキル、ヒドロキシ、アミノ、ホルミ
ル、チオール、オキシラニル、カルボキシアミノC1-6
アルキル、ホルミルC1-6アルキル、オキシラニルC1-6
アルキル、チオールC1-6アルキル、カルボキシC1-6ア
ルキル、ヒドロキシC1-6アルキル、およびハロC1-6ア
ルキルである。
ゲン、(4)SH、(6)C1-6アルキルカルボニル、
(7)カルボキシ(8)ホルミル、(9)オキシラニ
ル、(10)アミノ、(c)アリールC1-6アルキル、
ここで、アリールは上に定義された通りであり、これは
モノまたはジ置換であってもよい。置換基は、それぞれ
独立してC1-6アルキル、ヒドロキシ、アミノ、ホルミ
ル、チオール、オキシラニル、カルボキシアミノC1-6
アルキル、ホルミルC1-6アルキル、オキシラニルC1-6
アルキル、チオールC1-6アルキル、カルボキシC1-6ア
ルキル、ヒドロキシC1-6アルキル、およびハロC1-6ア
ルキルである。
【0099】このクラスに含まれるものは、AA1、A
A2、およびAA3が、下記に示す成分を含むL−型お
よびD−型のアミノ酸で構成されるグループから、それ
ぞれ独立して選択された化合物である。グリシン、アラ
ニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレ
オニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン
酸、グルタミン、リシン、ヒドロキシ・リシン、ヒスチ
ジン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、トリ
プトファン、システイン、メチオニン、オルニチン、β
−アラニン、ホモセリン、ホモタイロシン、ホモフェニ
ルアラニンおよびシトルリン。
A2、およびAA3が、下記に示す成分を含むL−型お
よびD−型のアミノ酸で構成されるグループから、それ
ぞれ独立して選択された化合物である。グリシン、アラ
ニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレ
オニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン
酸、グルタミン、リシン、ヒドロキシ・リシン、ヒスチ
ジン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、トリ
プトファン、システイン、メチオニン、オルニチン、β
−アラニン、ホモセリン、ホモタイロシン、ホモフェニ
ルアラニンおよびシトルリン。
【0100】二者択一的に言えば、このクラスに含まれ
るものは、化合物のサブクラスである。
るものは、化合物のサブクラスである。
【0101】ここで、R1は、C1-3アルキル、R2は、
水素、およびR8とR9は、それぞれ個別に下記のもので
ある。
水素、およびR8とR9は、それぞれ個別に下記のもので
ある。
【0102】(a)水素、(b)C1-6アルキル、
(c)メルカプト基を含んだC1-10アルキル、(d)ヒ
ドロキシC1-10アルキル、(e)カルボキシC1-10アル
キル、(f)アミノC1-10アルキル、(g)ホルミルC
1-10アルキル、(h)オキシラニルC1-10アルキル、
(i)アリールC1-6アルキル ここで、アリール基は、フェニルおよびインドリールか
ら選択され、さらにアリール基は、下記に示す基で置換
することもできる。
(c)メルカプト基を含んだC1-10アルキル、(d)ヒ
ドロキシC1-10アルキル、(e)カルボキシC1-10アル
キル、(f)アミノC1-10アルキル、(g)ホルミルC
1-10アルキル、(h)オキシラニルC1-10アルキル、
(i)アリールC1-6アルキル ここで、アリール基は、フェニルおよびインドリールか
ら選択され、さらにアリール基は、下記に示す基で置換
することもできる。
【0103】ヒドロキシ、C1-3アルキル、アミノ、カ
ルボキシ、ホルミル、オキシラニル、チオール、ヒドロ
キシC1-6アルキル、アミノC1-6アルキル、カルボキシ
C1-6アルキル、ホルミルC1-6アルキル、オキシラニル
C1-6アルキル、チオールC1-6アルキル、ハロC1-6ア
ルキル。
ルボキシ、ホルミル、オキシラニル、チオール、ヒドロ
キシC1-6アルキル、アミノC1-6アルキル、カルボキシ
C1-6アルキル、ホルミルC1-6アルキル、オキシラニル
C1-6アルキル、チオールC1-6アルキル、ハロC1-6ア
ルキル。
【0104】このサブ・クラスに含まれるものは次の化
合物である。
合物である。
【0105】R1は、メチル、R2は、水素、R8は、C
1-6アルキル、およびR9は、置換したC1-10アルキルで
ある。
1-6アルキル、およびR9は、置換したC1-10アルキルで
ある。
【0106】ここで、置換基は下記に示すものである。
【0107】(a)H、(b)OH、(c)CO2H、
(d)NH2、(e)ホルミル、(f)オキシラニル、
(g)ハロゲン、(h)チオール、(i)置換したフェ
ニルC1-6アルキル ここで、置換基は下記の成分である。
(d)NH2、(e)ホルミル、(f)オキシラニル、
(g)ハロゲン、(h)チオール、(i)置換したフェ
ニルC1-6アルキル ここで、置換基は下記の成分である。
【0108】ヒドロキシ、アミノ、またはカルボキシ、
ホルミル、オキシラニル、チオール、ヒドロキシC1-6
アルキル、アミノC1-6アルキル、カルボキシC1-6アル
キル、ホルミルC1-6アルキル、オキシラニルC1-6アル
キル、チオールC1-6アルキル、ハロC1-6アルキル。
ホルミル、オキシラニル、チオール、ヒドロキシC1-6
アルキル、アミノC1-6アルキル、カルボキシC1-6アル
キル、ホルミルC1-6アルキル、オキシラニルC1-6アル
キル、チオールC1-6アルキル、ハロC1-6アルキル。
【0109】本発明の例は下記の化合物である。
【0110】(a)N−(N−アセチル−チロシニル−
バリニル−リミニル)−3−アミノ−4−オキソブタン
酸、またはリング・チェーン互変異性体、またはその水
化物である。
バリニル−リミニル)−3−アミノ−4−オキソブタン
酸、またはリング・チェーン互変異性体、またはその水
化物である。
【0111】本明細書の目的にとって、下記に示すYの
均等形とはっきり対応する化合物に関する上記の説明
は、
均等形とはっきり対応する化合物に関する上記の説明
は、
【0112】
【化38】
【0113】下記に示す均等形を含有するよう意図され
ている。
ている。
【0114】
【化39】
【0115】本発明の2番目の具体例においては、下記
の順序であり、上述のインターロイキン1β変換酵素の
精製用アフィニティクロマトグラフィーマトリックスを
用いる方法とも関連している。
の順序であり、上述のインターロイキン1β変換酵素の
精製用アフィニティクロマトグラフィーマトリックスを
用いる方法とも関連している。
【0116】(a)インターロイキン1β変換酵素を含
む調製物を前述のマトリックスにロードする (b)中性pH(例えば6.5pHから7. 5pH)
をもつバッファで前述のマトリックスを洗浄し、汚染蛋
白質を除去する (c)式Iの化合物を添加することにより前述のインタ
ーロイキン1β変換酵素を溶出する (d)前述のインターロイキン1β変換酵素を回収す
る。
む調製物を前述のマトリックスにロードする (b)中性pH(例えば6.5pHから7. 5pH)
をもつバッファで前述のマトリックスを洗浄し、汚染蛋
白質を除去する (c)式Iの化合物を添加することにより前述のインタ
ーロイキン1β変換酵素を溶出する (d)前述のインターロイキン1β変換酵素を回収す
る。
【0117】アフィニティクロマトグラフィーにおいて
は、原液から酵素を選択的に抽出するには、バッチ処理
または連続処理のどちらかで親和マトリックスが使用さ
れる。汚染蛋白質を洗い落とした後は、酵素に結合する
ためのマトリックスと競合するフリー・リガンドを導入
することによりマトリックスから酵素を解放する。溶出
された酵素は、透析あるいは限外濾過技術によってイン
ヒビターから解放される。または潜在的インヒビターの
場合は、インヒビターへの結合を妨害する化学処理によ
る。
は、原液から酵素を選択的に抽出するには、バッチ処理
または連続処理のどちらかで親和マトリックスが使用さ
れる。汚染蛋白質を洗い落とした後は、酵素に結合する
ためのマトリックスと競合するフリー・リガンドを導入
することによりマトリックスから酵素を解放する。溶出
された酵素は、透析あるいは限外濾過技術によってイン
ヒビターから解放される。または潜在的インヒビターの
場合は、インヒビターへの結合を妨害する化学処理によ
る。
【0118】アフィニティマトリックスは、円筒状のカ
ラムにパックされ、連続した流れ処理が可能となるが、
バッチ処理も原液から酵素を抽出する適切な代替手法と
なる。親和カラムは、自然のサポート・マトリックス
(例えば、セファロースCL−4B)のガード・カラム
よって保護されており、マトリックスに非特異的に付着
する蛋白質を除去するが、付着した酵素を完全に洗浄す
ることは困難となる。
ラムにパックされ、連続した流れ処理が可能となるが、
バッチ処理も原液から酵素を抽出する適切な代替手法と
なる。親和カラムは、自然のサポート・マトリックス
(例えば、セファロースCL−4B)のガード・カラム
よって保護されており、マトリックスに非特異的に付着
する蛋白質を除去するが、付着した酵素を完全に洗浄す
ることは困難となる。
【0119】この2つのカラムは、通常は酵素液に適用
する前に中性pHにおいてバッファで平衡を保たれてい
る。そのため、3個以上のカラム容量が充分とみなされ
る。中性に近いpKaを持つ非反応型化合物の場合は、
どれでも充分である。酵素を不活性モノマーに分離する
速度を落とすショ糖と洗剤がすでに発見されているた
め、満足すべきN−[2ハイドロキシエチル]ピペラジ
ンN’−[2−エタン−スルホニック酸](緩衝液調整
剤)を発見した。一方で10%のショ糖と0.1%の3
−[(3−コラミドプロピル)−ジメチルアンモニオ]
−1−プロパンスルホネート(CHAPS)も含有され
ている。
する前に中性pHにおいてバッファで平衡を保たれてい
る。そのため、3個以上のカラム容量が充分とみなされ
る。中性に近いpKaを持つ非反応型化合物の場合は、
どれでも充分である。酵素を不活性モノマーに分離する
速度を落とすショ糖と洗剤がすでに発見されているた
め、満足すべきN−[2ハイドロキシエチル]ピペラジ
ンN’−[2−エタン−スルホニック酸](緩衝液調整
剤)を発見した。一方で10%のショ糖と0.1%の3
−[(3−コラミドプロピル)−ジメチルアンモニオ]
−1−プロパンスルホネート(CHAPS)も含有され
ている。
【0120】式Iで表されるインヒビターのクラスに対
する多少とも独得な考慮すべき点は、酵素の結合と分離
に用いる速度定数が正規のものより遅いという点であ
る。酵素に適用して、保持を正常に保つには、結合に用
いる遅い速度定数は、通常外の遅いフロー速度(つまり
1時間当たり1ベッド容量以下)を用いる必要がある。
時間当たり1/4ベッド量に等しいフロー速度は、4゜
Cが適切であることが判明している。
する多少とも独得な考慮すべき点は、酵素の結合と分離
に用いる速度定数が正規のものより遅いという点であ
る。酵素に適用して、保持を正常に保つには、結合に用
いる遅い速度定数は、通常外の遅いフロー速度(つまり
1時間当たり1ベッド容量以下)を用いる必要がある。
時間当たり1/4ベッド量に等しいフロー速度は、4゜
Cが適切であることが判明している。
【0121】付着した酵素は、バッファで洗浄され、汚
染蛋白質の最終トレースを排除する。20カラム容量の
バッファを使用する十分な洗浄が望ましいところであ
り、この方法によれば処理中に損失は検出できない。小
量の汚染でも許容されないため、純酵素を得るには1,
000ないし100,000の繰り返し精製が必要とな
る。
染蛋白質の最終トレースを排除する。20カラム容量の
バッファを使用する十分な洗浄が望ましいところであ
り、この方法によれば処理中に損失は検出できない。小
量の汚染でも許容されないため、純酵素を得るには1,
000ないし100,000の繰り返し精製が必要とな
る。
【0122】洗浄後、酵素はフリー・リガンドを添加す
ることによってマトリックスから溶出されるか、または
式Iで表されるファミリの中から別のインヒビターを洗
浄バッファに添加することによって溶出される。再度強
調するが、このクラスのインヒビターと均衡を保つため
の遅い速度定数は、特別な考慮を必要とする。リシンを
用いてアフィニティーマトリックスに結合させた場合の
化合物Aのモデルとなるよう考慮された化合物Bの解離
の半減期は、23゜Cで〜100分が最小であり、酵素
の溶出に連続フローを使用するには遅すぎる。その結
果、フリー・リガンド(100uMが満足すべきものと
判明している)が充満したカラムにおいて溶出はバッチ
処理によって行われ、それにより酵素溶出のフローを再
開する前に、一晩温置すると均衡に達する交換が可能と
なる。
ることによってマトリックスから溶出されるか、または
式Iで表されるファミリの中から別のインヒビターを洗
浄バッファに添加することによって溶出される。再度強
調するが、このクラスのインヒビターと均衡を保つため
の遅い速度定数は、特別な考慮を必要とする。リシンを
用いてアフィニティーマトリックスに結合させた場合の
化合物Aのモデルとなるよう考慮された化合物Bの解離
の半減期は、23゜Cで〜100分が最小であり、酵素
の溶出に連続フローを使用するには遅すぎる。その結
果、フリー・リガンド(100uMが満足すべきものと
判明している)が充満したカラムにおいて溶出はバッチ
処理によって行われ、それにより酵素溶出のフローを再
開する前に、一晩温置すると均衡に達する交換が可能と
なる。
【0123】最終的には、精製ICEはE−I化合物か
ら分離されなければならない。この時点において、精製
酵素は抽出リガンドと化合させられる。
ら分離されなければならない。この時点において、精製
酵素は抽出リガンドと化合させられる。
【0124】リガンドの排除と酵素の再活性化は、透析
またはジアフィルトレーションによってクラス別に行わ
れるが、現在のインヒビターのクラスに対しては、特別
な考慮を適用する。その代わりに2通りの化学的協同ア
プローチを採用することが望ましい。これらはそのオキ
シムへのインヒビターの変換と関連を持っており、酸化
グルタチオンと相互交換するチオール・ジサルファイド
によって、酸素活性部位チオールを封鎖する。
またはジアフィルトレーションによってクラス別に行わ
れるが、現在のインヒビターのクラスに対しては、特別
な考慮を適用する。その代わりに2通りの化学的協同ア
プローチを採用することが望ましい。これらはそのオキ
シムへのインヒビターの変換と関連を持っており、酸化
グルタチオンと相互交換するチオール・ジサルファイド
によって、酸素活性部位チオールを封鎖する。
【0125】
【化40】
【0126】酵素の再活性化速度は、フリー酵素とイン
ヒビター(K2=1×10-4 sec-1)を形成するE
−I化合物の解離速度、オキシム形成速度(K4=7.
7±1.7x10-2 M-1 sec-1)、およびフリー
酵素とグルタチオン・ジスルフィド(K3=3 M-1
sec-1)間のチオール・ジサルファイドの相互交換速
度などによって左右される。
ヒビター(K2=1×10-4 sec-1)を形成するE
−I化合物の解離速度、オキシム形成速度(K4=7.
7±1.7x10-2 M-1 sec-1)、およびフリー
酵素とグルタチオン・ジスルフィド(K3=3 M-1
sec-1)間のチオール・ジサルファイドの相互交換速
度などによって左右される。
【0127】生成物はこれらの技術のどれか1つを用い
て製造されるが、2つの方法を併用することも好んで行
われる。この条件におけるグルタチオンの適用は、ジチ
オスレイトールまたは他のフリー・チオールで還元する
ことによって逆に再活性化可能な混合ジスルフィドを与
える。酵素をグルタチオンによる選択保護することは前
例がない。一方、ヒドロキシルアミンと反応させること
によってアルデヒドをオキシムに変換する方法は19世
紀に至って発見された。オキシム形成の速度定数
(K4)、とチオール・ジサルファイドのグルタチオン
・ジサルファイドとの相互交換(K3)は、本発明者が
測定した。これらの速度定数は、グルタチオン・ジサル
ファイドとヒドロキシルアミンの最適濃度を予測するの
に使用される。これらに基づいて酵素−インヒビター化
合物の解離速度が制限される。この2つのアプローチを
同時に適用することは、再活性化を最高のレベルで達成
するために必要である。酸化もしくは変換は、これらの
反応に使用できる標準手法のどれかを用いることによっ
て達成することができる。下記の文献を参照のこと。
H.R. Mahler and E. H. Cor
des, Biological Chemistr
y, Harper and Row, New Yo
rk (1971).W. P. Jencks, C
atalysis in Chemistryand
Enzymology, McGraw−Hill,
New York (1969).上述の速度定数に基
づいて、100mMのヒドロキシルアミンと10mMの
グルタチオン・ジサルファイドの添加が適切であること
が判明している。反応は、約16時間(10半減期)以
内に終了するようにする。
て製造されるが、2つの方法を併用することも好んで行
われる。この条件におけるグルタチオンの適用は、ジチ
オスレイトールまたは他のフリー・チオールで還元する
ことによって逆に再活性化可能な混合ジスルフィドを与
える。酵素をグルタチオンによる選択保護することは前
例がない。一方、ヒドロキシルアミンと反応させること
によってアルデヒドをオキシムに変換する方法は19世
紀に至って発見された。オキシム形成の速度定数
(K4)、とチオール・ジサルファイドのグルタチオン
・ジサルファイドとの相互交換(K3)は、本発明者が
測定した。これらの速度定数は、グルタチオン・ジサル
ファイドとヒドロキシルアミンの最適濃度を予測するの
に使用される。これらに基づいて酵素−インヒビター化
合物の解離速度が制限される。この2つのアプローチを
同時に適用することは、再活性化を最高のレベルで達成
するために必要である。酸化もしくは変換は、これらの
反応に使用できる標準手法のどれかを用いることによっ
て達成することができる。下記の文献を参照のこと。
H.R. Mahler and E. H. Cor
des, Biological Chemistr
y, Harper and Row, New Yo
rk (1971).W. P. Jencks, C
atalysis in Chemistryand
Enzymology, McGraw−Hill,
New York (1969).上述の速度定数に基
づいて、100mMのヒドロキシルアミンと10mMの
グルタチオン・ジサルファイドの添加が適切であること
が判明している。反応は、約16時間(10半減期)以
内に終了するようにする。
【0128】再活性化が完了した後は、低分子量生成物
と過剰反応体は従来の透析または限外濾過によって除去
することができる。アミコン・セントリコン10の限外
濾過セルを使用すれば、通常はクロマトグラフィーバッ
ファで5回の交換を行い、十億分の1のモル濃度にな
る。これによりグルタチオンと精製酵素の結合体が入手
可能となる。必要であれば、この結合体を10mMのジ
チオトレイトール(最小半減期1)に還元するか、また
は他のどれかのフリーチ・オールで還元することにより
活性酵素を入手する。どちらの状態においても、精製酵
素は−80゜Cで無期限に安定している。
と過剰反応体は従来の透析または限外濾過によって除去
することができる。アミコン・セントリコン10の限外
濾過セルを使用すれば、通常はクロマトグラフィーバッ
ファで5回の交換を行い、十億分の1のモル濃度にな
る。これによりグルタチオンと精製酵素の結合体が入手
可能となる。必要であれば、この結合体を10mMのジ
チオトレイトール(最小半減期1)に還元するか、また
は他のどれかのフリーチ・オールで還元することにより
活性酵素を入手する。どちらの状態においても、精製酵
素は−80゜Cで無期限に安定している。
【0129】本発明の化合物は、下記に述べる手続きを
用いることによって便利に作成することができるが、よ
り明示的には以降の例題のセクションで説明する。
用いることによって便利に作成することができるが、よ
り明示的には以降の例題のセクションで説明する。
【0130】図式I
【0131】
【化41】
【0132】図式Iの反応は、次のように進行する。イ
ソブチルクロロフォルム(IBCF)を持つアリロキシ
ーカルボニル(Alloc)−(S)−アスパラギン酸
β−tブチル・エステルの混合無水物は、Nメチルモル
フォリン(NMM)を供給することによって形成され
る。この無水物はテトラヒドロフラン(THF)とメタ
ノールの比率が4対1の溶剤に0゜Cで水素化ホウ素ナ
トリウムを使用することにより、対応するアルコールI
Iに還元される。このアルコールIIは、やがてジメチ
ルスルホキシド(DMSO)、塩化オキサリル、および
トリエチル・アミンを用いて酸化され、対応するアルデ
ヒドに変わるが、このアルデヒドは、メタノール、トリ
メチル、オルトギ酸塩およびp−トルエンスルホン酸を
用いて保護されており、IIIを産出する。Alloc
による保護グループは、やがてモルホリンを添加するこ
とにより、テトラキス、トリフェニルフォスフィン・パ
ラジゥムで除去され、アミンIVを産出する。このアミ
ンは、その後ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOB
t)とNMMの存在下にジシクロヘキシル・カーボディ
イミデ(DCC)を用いることによりトリペプチド、N
アセチル−(S)−チロシニル−(S)−アラニン・バ
リニル−(S)−に結合され、VIを産出する。t−ブ
チルエステルは、やがてきれいなTFAで除去され、環
状0−メチルアシラールVIIを供給する。最後の加水
分解は、水とメタノールの比率が1対1の希薄な塩化水
素酸で達成されてVIIIを提供する。さらにVIはL
i0Hで鹸化されて、ジメチルアセタールを供給する。
ソブチルクロロフォルム(IBCF)を持つアリロキシ
ーカルボニル(Alloc)−(S)−アスパラギン酸
β−tブチル・エステルの混合無水物は、Nメチルモル
フォリン(NMM)を供給することによって形成され
る。この無水物はテトラヒドロフラン(THF)とメタ
ノールの比率が4対1の溶剤に0゜Cで水素化ホウ素ナ
トリウムを使用することにより、対応するアルコールI
Iに還元される。このアルコールIIは、やがてジメチ
ルスルホキシド(DMSO)、塩化オキサリル、および
トリエチル・アミンを用いて酸化され、対応するアルデ
ヒドに変わるが、このアルデヒドは、メタノール、トリ
メチル、オルトギ酸塩およびp−トルエンスルホン酸を
用いて保護されており、IIIを産出する。Alloc
による保護グループは、やがてモルホリンを添加するこ
とにより、テトラキス、トリフェニルフォスフィン・パ
ラジゥムで除去され、アミンIVを産出する。このアミ
ンは、その後ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOB
t)とNMMの存在下にジシクロヘキシル・カーボディ
イミデ(DCC)を用いることによりトリペプチド、N
アセチル−(S)−チロシニル−(S)−アラニン・バ
リニル−(S)−に結合され、VIを産出する。t−ブ
チルエステルは、やがてきれいなTFAで除去され、環
状0−メチルアシラールVIIを供給する。最後の加水
分解は、水とメタノールの比率が1対1の希薄な塩化水
素酸で達成されてVIIIを提供する。さらにVIはL
i0Hで鹸化されて、ジメチルアセタールを供給する。
【0133】図式II
【0134】
【化42】
【0135】XVIIIなどの構造体は、図式IIに示
すように作成される。N−CBZ−アスパラギン酸β−
メチルエステルは、Nメチルモルホリン(NMM)とそ
れに続くジアゾメタンを添加することによってi−ブチ
ルクロロフォルメイトを用いて処理することができ、ジ
アゾメチルケトンXIを産出する。塩化水素酸を用いる
XIの処理では、クロロメチルケトンXIIを供給する
が、これはジ−t−ブチルマロネートのナトリウム塩の
アルキル化に使用され、ケトジエステルXIIIを入手
する。t−ブチル基は、トリフルオロ酢酸で除去するこ
とができ、その結果として産出されるジカルボン酸は、
熱ピリジンで脱炭酸化されてケト酸XIVを産出する。
酸XIVは、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOB
t)の存在下エチルジメチルアミノプロピルカルボジイ
ミドを用い、ベンジールアミンに結合され、アミドXV
を産出する。CBZグループの除去は、炭素に10%の
パラジウムを添加することによって行われ、アミンXV
Iを産出する。このアミンはやがてHOBtの存在下、
ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いてNアセチール
チロシニル−バリニル−アラニンに結合され、XVII
を産出する。カルボン酸の最終保護解除は、リチウム水
酸化物で行われ、必要とするICEインヒビターXVI
IIを産出する。
すように作成される。N−CBZ−アスパラギン酸β−
メチルエステルは、Nメチルモルホリン(NMM)とそ
れに続くジアゾメタンを添加することによってi−ブチ
ルクロロフォルメイトを用いて処理することができ、ジ
アゾメチルケトンXIを産出する。塩化水素酸を用いる
XIの処理では、クロロメチルケトンXIIを供給する
が、これはジ−t−ブチルマロネートのナトリウム塩の
アルキル化に使用され、ケトジエステルXIIIを入手
する。t−ブチル基は、トリフルオロ酢酸で除去するこ
とができ、その結果として産出されるジカルボン酸は、
熱ピリジンで脱炭酸化されてケト酸XIVを産出する。
酸XIVは、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOB
t)の存在下エチルジメチルアミノプロピルカルボジイ
ミドを用い、ベンジールアミンに結合され、アミドXV
を産出する。CBZグループの除去は、炭素に10%の
パラジウムを添加することによって行われ、アミンXV
Iを産出する。このアミンはやがてHOBtの存在下、
ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いてNアセチール
チロシニル−バリニル−アラニンに結合され、XVII
を産出する。カルボン酸の最終保護解除は、リチウム水
酸化物で行われ、必要とするICEインヒビターXVI
IIを産出する。
【0136】この後の実施例に表現されているように、
式(I)の本発明の化合物は、インターロイキン1βに
関するインビトロインヒビター活性を明示することが示
されている。
式(I)の本発明の化合物は、インターロイキン1βに
関するインビトロインヒビター活性を明示することが示
されている。
【0137】特にこれらの化合物は、前駆体のインター
ロイキン1βを切断して、1uM以下のKiにおいて活
性なインターロイキン1βを形成するように、インター
ロイキン1β変換酵素が抑止されることが示されてい
る。
ロイキン1βを切断して、1uM以下のKiにおいて活
性なインターロイキン1βを形成するように、インター
ロイキン1β変換酵素が抑止されることが示されてい
る。
【0138】
【化43】
【0139】図式IIIの反応は次のように進行する。
イソブチルクロロホルメート(IBCF)を持つアリロ
キシ−カルボニル(Alloc)(S)−アスパラギン
酸b−t−ブチルエステルの混合無水物は、N−メチル
モルホリン(NMM)を添加することによって形成され
る。この無水物は、テトラヒドロフラン(THF)とメ
タノールの比率が4対1の溶剤中に0゜Cで水素化ホウ
素ナトリウムを使用することにより対応するアルコール
に還元される。このアルコールは、やがてジメチルスル
ホキシド(DMSO)、塩化オキサリル、およびトリエ
チルアミンを用いて対応するアルデヒドに酸化される
が、これはメタノール、トリメチルオルトギ酸エステ
ル、およびp−トルエンスルホン酸を用いてジメチル・
アセタンとして保護されている。Allocの保護基
は、その後モルホリンの存在下テトラキス・トリフェニ
ルフォスフィン・パラジゥムを用いて除去され、その結
果生成されるアミンは、やがてヒドロキシベンゾトリア
ゾール(HOBt)とNMMの存在下、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド(DCC)を用いてトリペプチド、N
−アセチル−(S)−チロシニル−(S)バリニル−
(S)−CBZ)−リシンに結合される。CBZグルー
プは、水素の存在下パールマンの触媒(炭素上のPd
(OH)2)で除去され、必要な保護つき親和リガンド
を産出する。
イソブチルクロロホルメート(IBCF)を持つアリロ
キシ−カルボニル(Alloc)(S)−アスパラギン
酸b−t−ブチルエステルの混合無水物は、N−メチル
モルホリン(NMM)を添加することによって形成され
る。この無水物は、テトラヒドロフラン(THF)とメ
タノールの比率が4対1の溶剤中に0゜Cで水素化ホウ
素ナトリウムを使用することにより対応するアルコール
に還元される。このアルコールは、やがてジメチルスル
ホキシド(DMSO)、塩化オキサリル、およびトリエ
チルアミンを用いて対応するアルデヒドに酸化される
が、これはメタノール、トリメチルオルトギ酸エステ
ル、およびp−トルエンスルホン酸を用いてジメチル・
アセタンとして保護されている。Allocの保護基
は、その後モルホリンの存在下テトラキス・トリフェニ
ルフォスフィン・パラジゥムを用いて除去され、その結
果生成されるアミンは、やがてヒドロキシベンゾトリア
ゾール(HOBt)とNMMの存在下、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド(DCC)を用いてトリペプチド、N
−アセチル−(S)−チロシニル−(S)バリニル−
(S)−CBZ)−リシンに結合される。CBZグルー
プは、水素の存在下パールマンの触媒(炭素上のPd
(OH)2)で除去され、必要な保護つき親和リガンド
を産出する。
【0140】
【化44】
【0141】IL−1β変換酵素の精製用親和カラム
は、図式IVに示す方法で作成される。セファロース
は、pH11で1,4−ブタンジオールジグリシジルエ
ーテルに結合される。その結果として生成される樹脂エ
ポキシドは、pH11と37゜Cの条件で前駆体の親和
リガンドに反応する。その過程で、t−ブチルエステル
は鹸化される。ジメチルアセタールの保護解除は、希薄
な塩化水素酸で行われて、必要とする親和マトリックス
を産出する。
は、図式IVに示す方法で作成される。セファロース
は、pH11で1,4−ブタンジオールジグリシジルエ
ーテルに結合される。その結果として生成される樹脂エ
ポキシドは、pH11と37゜Cの条件で前駆体の親和
リガンドに反応する。その過程で、t−ブチルエステル
は鹸化される。ジメチルアセタールの保護解除は、希薄
な塩化水素酸で行われて、必要とする親和マトリックス
を産出する。
【0142】以下に示す実施例は、本発明を説明するこ
とを目的としているが、請求の範囲についてはもちろん
のこと、本発明を制限するものではない。
とを目的としているが、請求の範囲についてはもちろん
のこと、本発明を制限するものではない。
【0143】
【実施例】実施例1 化合物Aからのクロマトグラフィーマトリックス作成 インターロイキン1変換酵素用親和カラムは、強力なペ
プチド・アルデヒド・インヒビターであるAcetyl
−Tyr−Val−Lys−Asp−CHO(化合物
A)から作成され、12原子のビス・オキシラン・スペ
ーサを介してリシン残基によってセファロースCL−4
Bに結合される。
プチド・アルデヒド・インヒビターであるAcetyl
−Tyr−Val−Lys−Asp−CHO(化合物
A)から作成され、12原子のビス・オキシラン・スペ
ーサを介してリシン残基によってセファロースCL−4
Bに結合される。
【0144】
【化45】
【0145】親和マトリックスの合成 ステップA: エポキシで活性化したセファロースCL
−4B エポキシで活性化したセファロースCL−4Bは、下記
の文献に述べられた方法で作成される。(Sundbe
rg, L., and Porath, J. (1
974)J. Chromatogr. 90, 87
−98)特に、100gmの吸引乾燥セファロースCL
−4B、100mlの1,4ブタンジオールジグリシダ
イルエーテル(名目70%溶液)、および2mg/ml
のNaBH4を含む100mlの0.6MのNaOHで
構成されるスラリーは、周囲温度で16時間の間オーバ
ヘッドかくはん機で混合される。その結果として生成さ
れるエポキシ活性化セファロースCL−4Bは、堅い焼
結グラス・ロートの中で10リットル水を使用して徹底
的に洗浄され、4゜Cで水中に貯蔵される。
−4B エポキシで活性化したセファロースCL−4Bは、下記
の文献に述べられた方法で作成される。(Sundbe
rg, L., and Porath, J. (1
974)J. Chromatogr. 90, 87
−98)特に、100gmの吸引乾燥セファロースCL
−4B、100mlの1,4ブタンジオールジグリシダ
イルエーテル(名目70%溶液)、および2mg/ml
のNaBH4を含む100mlの0.6MのNaOHで
構成されるスラリーは、周囲温度で16時間の間オーバ
ヘッドかくはん機で混合される。その結果として生成さ
れるエポキシ活性化セファロースCL−4Bは、堅い焼
結グラス・ロートの中で10リットル水を使用して徹底
的に洗浄され、4゜Cで水中に貯蔵される。
【0146】ステップB: ペプチド・アルデヒド・ジ
メチル・アセタールの結合
メチル・アセタールの結合
【0147】
【化46】
【0148】化合物Aである活性アルデヒドのブロック
化されたアスパルチル−t−ブチルエステル、ジメチル
アセタール(化合物A’)は、10mMの溶液としてメ
タノールに溶解し、やがてより多くのメタノールと水と
で結合される。さらに400mMの炭酸ナトリウム溶液
でHCLを用いてpH11.00に調整されて、2mM
のインヒビターと200mMの炭酸塩バッファを含む5
0%のメタノールを供給される。この溶液(10ml)
は、吸引乾燥のケーキ(10gm)とエポキシ活性化セ
ファロースCL−4Bに混合され、そのスラリーは37
゜Cで3日間回転させて撹拌される。この結果生成され
る親和マトリックスは、1M KC1と水で徹底的に洗
浄されて、4゜Cでスラリーとして貯蔵される。この合
成は、[14−C]−リシノプリル を用いた結果に基
づいており、パックされた親和マトリックスが1 um
ol/mlとなるように見積もられている。下記文献参
照。
化されたアスパルチル−t−ブチルエステル、ジメチル
アセタール(化合物A’)は、10mMの溶液としてメ
タノールに溶解し、やがてより多くのメタノールと水と
で結合される。さらに400mMの炭酸ナトリウム溶液
でHCLを用いてpH11.00に調整されて、2mM
のインヒビターと200mMの炭酸塩バッファを含む5
0%のメタノールを供給される。この溶液(10ml)
は、吸引乾燥のケーキ(10gm)とエポキシ活性化セ
ファロースCL−4Bに混合され、そのスラリーは37
゜Cで3日間回転させて撹拌される。この結果生成され
る親和マトリックスは、1M KC1と水で徹底的に洗
浄されて、4゜Cでスラリーとして貯蔵される。この合
成は、[14−C]−リシノプリル を用いた結果に基
づいており、パックされた親和マトリックスが1 um
ol/mlとなるように見積もられている。下記文献参
照。
【0149】(Bull, H. G., Thorn
berry, N. A., andCordes,
E. H. (1985) J. Biol. Che
m.260, 2963−2972) ステップC: アルデヒドの活性化 上述の手順は、スペーサ・アームに結合したAcety
l−Tyr−Val−Lys−Asp−CHOのジメチ
ル・アセタールを供給している。アスパルテート残基上
のt−ブチル保護基は、結合状態に消失する。アルデヒ
ドに対するこのマトリックスの活性化は、0.01N
HC1でマトリックスの均衡を保つとともに25゜Cで
2時間放置することにより、使用に先立って親和マトリ
ックスの中で実行される。トレーサとして[14−C]
グリシンを含んだ制御マトリックスは、これらの条件の
下でリガンドが損失した証拠(<1%)は何も示さな
い。
berry, N. A., andCordes,
E. H. (1985) J. Biol. Che
m.260, 2963−2972) ステップC: アルデヒドの活性化 上述の手順は、スペーサ・アームに結合したAcety
l−Tyr−Val−Lys−Asp−CHOのジメチ
ル・アセタールを供給している。アスパルテート残基上
のt−ブチル保護基は、結合状態に消失する。アルデヒ
ドに対するこのマトリックスの活性化は、0.01N
HC1でマトリックスの均衡を保つとともに25゜Cで
2時間放置することにより、使用に先立って親和マトリ
ックスの中で実行される。トレーサとして[14−C]
グリシンを含んだ制御マトリックスは、これらの条件の
下でリガンドが損失した証拠(<1%)は何も示さな
い。
【0150】実施例2 アフィニティクロマトグラフィー手順 出発酵素調製物を、実施例4に述べるようにアニオン交
換クロマトグラフィーによりTHP1細胞溶解物から1
00倍精製した。
換クロマトグラフィーによりTHP1細胞溶解物から1
00倍精製した。
【0151】ステップA: ICEの結合 活性化された親和カラム(5ml、1cmx6.5c
m)と同じ寸法のネイティブセファロースCL−4Bの
ガード・カラムは、1mMのジチオトレイトールで補充
された10カラム量のクロマトグラフィーバッファ(p
H7.50の条件で、100mM hepes、10%
ショ糖、および0.1%の3[(3−コラミドプロピ
ル)、ジメチルアンモニオ)]−1−プロパンスルホネ
ート(CHAPS))で平衡とした。酵素液(15m
l、150,000単位、150mgの蛋白質)は、ガ
ード・カラムを通して供給され4゜Cで0.022ml
/minのフロー速度で親和カラム上に流されるととも
に、同じフロー速度で10mlの補助クロマトグラフィ
ーバッファで洗浄される。詰め込み間は、結合に必要な
速度定数が遅いためと推定され、酵素の活性の8%は保
持されない。詰め込みあとは、ガード・カラムが除去さ
れ、親和カラムは4゜Cで0.5ml/minの高速フ
ロー速度によって25カラム量のバッファを用いて洗浄
される。洗浄分溜においては酵素活性はいっさい検出さ
れていない。
m)と同じ寸法のネイティブセファロースCL−4Bの
ガード・カラムは、1mMのジチオトレイトールで補充
された10カラム量のクロマトグラフィーバッファ(p
H7.50の条件で、100mM hepes、10%
ショ糖、および0.1%の3[(3−コラミドプロピ
ル)、ジメチルアンモニオ)]−1−プロパンスルホネ
ート(CHAPS))で平衡とした。酵素液(15m
l、150,000単位、150mgの蛋白質)は、ガ
ード・カラムを通して供給され4゜Cで0.022ml
/minのフロー速度で親和カラム上に流されるととも
に、同じフロー速度で10mlの補助クロマトグラフィ
ーバッファで洗浄される。詰め込み間は、結合に必要な
速度定数が遅いためと推定され、酵素の活性の8%は保
持されない。詰め込みあとは、ガード・カラムが除去さ
れ、親和カラムは4゜Cで0.5ml/minの高速フ
ロー速度によって25カラム量のバッファを用いて洗浄
される。洗浄分溜においては酵素活性はいっさい検出さ
れていない。
【0152】ステップB: 付着ICEの溶出 酵素を溶出するには、200μMのAcetyl−Ty
l−Val−Lys−(CBZ)−Asp−CHO(化
合物B)を含有する1カラム量のバッファを充満させ、
室温で24時間放置することによりマトリックスに付着
した酵素を解離することができる。その後、酵素の排除
されたインヒビター化合物は、0.022ml/min
のフロー速度で2カラム量のバッファで洗浄することに
より親和カラムから回収することができる。酵素が5%
以下の新鮮なインヒビターで交換を繰り返すと、最初の
交換が十分であったことが指摘された。
l−Val−Lys−(CBZ)−Asp−CHO(化
合物B)を含有する1カラム量のバッファを充満させ、
室温で24時間放置することによりマトリックスに付着
した酵素を解離することができる。その後、酵素の排除
されたインヒビター化合物は、0.022ml/min
のフロー速度で2カラム量のバッファで洗浄することに
より親和カラムから回収することができる。酵素が5%
以下の新鮮なインヒビターで交換を繰り返すと、最初の
交換が十分であったことが指摘された。
【0153】ステップC:ICEの再活性化 溶出されたICEは、2通りの協同化学アプローチを用
いることによって再活性化することができる。その1つ
はインヒビターをそのオキシムに変換することであり、
他の1つは活性部位チオールの酸化を、チオール・ジサ
ルファイドの相互交換によってグルタチオンとジスルフ
ィドとの混合体に変換することである。
いることによって再活性化することができる。その1つ
はインヒビターをそのオキシムに変換することであり、
他の1つは活性部位チオールの酸化を、チオール・ジサ
ルファイドの相互交換によってグルタチオンとジスルフ
ィドとの混合体に変換することである。
【0154】親和カラムから回収される酵素インヒビタ
ー溶液は、100mMの中性ヒドロキシルアミンを含有
するように調整され、10mMのグルタチオンジスルフ
ィドを再活性化させる。それらの条件の下で、過剰のフ
リー・インヒビターの消費に100secの半減期とい
う短期ラグを要したあと、E−I化合物の分離は全体の
速度が25゜Cで〜100minの半減期となるよう決
定する。交換のために10半減期をとったあと、インヒ
ビターオキシムと過剰な試薬は、4゜Cでクロマトグラ
フィーバッファを用いることによりアミコンセントリコ
ン10限外濾過細胞の中で徹底的な脱塩によって除去さ
れる。必要であれば、酵素グルタチオンの合体物質が、
10mMのジチオトレイトール(半減期 < 1 mi
n)で還元されて活性酵素が生成される。精製酵素は−
80゜Cで無期限に安定を保つ。親和クロマトグラフィ
ー分析による酵素の活性の回復は、SDSポリアクリア
ミドゲル電気泳動によって測定されているように、90
%以上が可能であり、その精製は〜5,000の繰り返
しによって達成される。その結果は表1に要約されてい
る。
ー溶液は、100mMの中性ヒドロキシルアミンを含有
するように調整され、10mMのグルタチオンジスルフ
ィドを再活性化させる。それらの条件の下で、過剰のフ
リー・インヒビターの消費に100secの半減期とい
う短期ラグを要したあと、E−I化合物の分離は全体の
速度が25゜Cで〜100minの半減期となるよう決
定する。交換のために10半減期をとったあと、インヒ
ビターオキシムと過剰な試薬は、4゜Cでクロマトグラ
フィーバッファを用いることによりアミコンセントリコ
ン10限外濾過細胞の中で徹底的な脱塩によって除去さ
れる。必要であれば、酵素グルタチオンの合体物質が、
10mMのジチオトレイトール(半減期 < 1 mi
n)で還元されて活性酵素が生成される。精製酵素は−
80゜Cで無期限に安定を保つ。親和クロマトグラフィ
ー分析による酵素の活性の回復は、SDSポリアクリア
ミドゲル電気泳動によって測定されているように、90
%以上が可能であり、その精製は〜5,000の繰り返
しによって達成される。その結果は表1に要約されてい
る。
【0155】
【表1】
【0156】実施例3 粗溶解物からの精製 実施例1の親和マトリックスは、原液細胞溶解物からの
酵素の均質化精製に直接使用することができる。この代
替方式では、7.5mlの濃縮されたTHP1細胞溶解
物(実施例4に述べた方法で作成される)は、5mlの
セファロースCL−4Bガード・カラムによって保護さ
れた500ulの親和カラムに供給される。10カラム
量のバッファで親和カラムを洗浄したあと、実施例2に
述べた方法で酵素が溶出される。この時点で、SDSポ
リアクリアミドゲル電気泳動によって測定されているよ
うに、〜100倍の精製が行われた。それは洗浄が不十
分であることを示している。回復された酵素は上述のよ
うに再活性化され、それは洗浄力を強化した新鮮な親和
カラム上で再びクロマトグラフィー分析が行われる。こ
の溶出においては、100,000回以上の精製を行っ
たのに等しい等質性酵素が生成される。
酵素の均質化精製に直接使用することができる。この代
替方式では、7.5mlの濃縮されたTHP1細胞溶解
物(実施例4に述べた方法で作成される)は、5mlの
セファロースCL−4Bガード・カラムによって保護さ
れた500ulの親和カラムに供給される。10カラム
量のバッファで親和カラムを洗浄したあと、実施例2に
述べた方法で酵素が溶出される。この時点で、SDSポ
リアクリアミドゲル電気泳動によって測定されているよ
うに、〜100倍の精製が行われた。それは洗浄が不十
分であることを示している。回復された酵素は上述のよ
うに再活性化され、それは洗浄力を強化した新鮮な親和
カラム上で再びクロマトグラフィー分析が行われる。こ
の溶出においては、100,000回以上の精製を行っ
たのに等しい等質性酵素が生成される。
【0157】実施例4 ステップA: 細胞の成長 ATCC(受託番号ATCC TIB202)から入手
したTHP.1細胞は、9%のホース血清を含むローラ
・ボトルの中か、ウィートンターボリフトの46リット
ル懸濁フラスコのどちらかの、イスコブの修正ダルベッ
コの媒体、またはダルベッコの修正イーグルの媒体(J
RHバイオサイエンス)の中で懸濁状態におかれて成長
するが、これはまた75,200もしくは300リット
ル発酵槽の中でミリリットル当たり1−2x10の6乗
の細胞を(週当り3ないし4倍増)を毎週取り出すこと
となる。懸濁フラスコまたは発酵槽に使用される媒体
も、細胞上の剪断力を減少させるために、0.1ないし
0.3%のF68プルロニックを含有している。この細
胞は、ATCCの薬瓶を用いて通常は3ないし4ヵ月以
上、次に述べる開始手順にしたがって成長させられる。
したTHP.1細胞は、9%のホース血清を含むローラ
・ボトルの中か、ウィートンターボリフトの46リット
ル懸濁フラスコのどちらかの、イスコブの修正ダルベッ
コの媒体、またはダルベッコの修正イーグルの媒体(J
RHバイオサイエンス)の中で懸濁状態におかれて成長
するが、これはまた75,200もしくは300リット
ル発酵槽の中でミリリットル当たり1−2x10の6乗
の細胞を(週当り3ないし4倍増)を毎週取り出すこと
となる。懸濁フラスコまたは発酵槽に使用される媒体
も、細胞上の剪断力を減少させるために、0.1ないし
0.3%のF68プルロニックを含有している。この細
胞は、ATCCの薬瓶を用いて通常は3ないし4ヵ月以
上、次に述べる開始手順にしたがって成長させられる。
【0158】ステップB: 細胞破損と分画 細胞はPBSの中で3回にわたって洗浄され、25mM
のHEPES、pH7.5、5mMのMgC12、およ
び1mMのEGTAを含有する低張バッファの中でミリ
リットル当り10の8乗の細胞数に調整して0゜Cで2
0分間懸濁状態におかれる。プロテアーゼ・インヒビタ
ーが添加されて(1mMのPMSFと10μg/mlの
ペプスタチンおよびロイペプチン)、この細胞は、25
または15ストロークを使用することにより、ダウンス
・ホモジナイザーに十分フィットした100または30
0ml中で破損され、90ないし95%の分量を産出す
る。破損された細胞は、核と破損されない細胞を除去す
るために、ベックマンGPR遠心分離機の中で5゜Cで
10分間3000rpmの条件で遠心分離が行われる。
その結果入手されたペレットは、プロテーゼ・インヒビ
ターを含有した低張バッファの最初の量の約1/4を再
び懸濁状態におき、10ストロークの間懸濁がリダウン
スされ、再び遠心分離が行われる。この2番目のポスト
核上澄み液が最初のものに添加される。
のHEPES、pH7.5、5mMのMgC12、およ
び1mMのEGTAを含有する低張バッファの中でミリ
リットル当り10の8乗の細胞数に調整して0゜Cで2
0分間懸濁状態におかれる。プロテアーゼ・インヒビタ
ーが添加されて(1mMのPMSFと10μg/mlの
ペプスタチンおよびロイペプチン)、この細胞は、25
または15ストロークを使用することにより、ダウンス
・ホモジナイザーに十分フィットした100または30
0ml中で破損され、90ないし95%の分量を産出す
る。破損された細胞は、核と破損されない細胞を除去す
るために、ベックマンGPR遠心分離機の中で5゜Cで
10分間3000rpmの条件で遠心分離が行われる。
その結果入手されたペレットは、プロテーゼ・インヒビ
ターを含有した低張バッファの最初の量の約1/4を再
び懸濁状態におき、10ストロークの間懸濁がリダウン
スされ、再び遠心分離が行われる。この2番目のポスト
核上澄み液が最初のものに添加される。
【0159】このポスト核上澄み液は、SS34ロータ
ー付きのソールバール遠心分離機で、16,000rp
mで20分間遠心分離されるが、引き続きベックマン遠
心分離機(50.2Tiローター)の中で50,000
rpm、または45,000rpm(45Tiの回転
子)の条件で60分間、2回目の回転による遠心分離を
行う。2mMのDTTを添加した後は、その結果として
生成される上澄み液がICEの精製を行うまで−80゜
Cで貯蔵される。
ー付きのソールバール遠心分離機で、16,000rp
mで20分間遠心分離されるが、引き続きベックマン遠
心分離機(50.2Tiローター)の中で50,000
rpm、または45,000rpm(45Tiの回転
子)の条件で60分間、2回目の回転による遠心分離を
行う。2mMのDTTを添加した後は、その結果として
生成される上澄み液がICEの精製を行うまで−80゜
Cで貯蔵される。
【0160】ステップC: ICEのHPLCカラムに
よる精製 溶融した上澄み液は、0.22μの空洞ファイバ濾過に
よって清澄にされ、アミコンYM3の螺旋カートリッジ
を用いて10ないし20倍に濃縮される。さらにこれ
は、20mMのTRIS、pH7.8、10%のショ
糖、0.1%のCHAPS、および2mMのDTTとい
う条件に対して(8000分子量の透析皮膜遮断)とい
う条件で一晩中透析が行われる。透析された上澄み液
(約3−5gの蛋白質、サイトソリック溶出の1000
mlに対応)は、水を用いて500マイクロシーメンス
以下の伝導性に調整され、475mlのベッド量のDE
AE−5PWHPLC(BIORAD)カラムに供給さ
れる。ICEは同じバッファを持つ約40mM NaC
lの勾配中で溶出される。その勾配は、0.5MのNa
Clと220mM Tris HC1の比率に増大して
いる。ICEの活性の一部は、25mMのHEPES、
pH7.5、10%のショ糖、0.1%のCHAPS、
および2mMのDTTという条件のバッファの中で10
0μMのYVAD−AMC基質を含有する100μlの
ボリュームを持つ96ウェルプレート蛍光計を用いて分
析される。
よる精製 溶融した上澄み液は、0.22μの空洞ファイバ濾過に
よって清澄にされ、アミコンYM3の螺旋カートリッジ
を用いて10ないし20倍に濃縮される。さらにこれ
は、20mMのTRIS、pH7.8、10%のショ
糖、0.1%のCHAPS、および2mMのDTTとい
う条件に対して(8000分子量の透析皮膜遮断)とい
う条件で一晩中透析が行われる。透析された上澄み液
(約3−5gの蛋白質、サイトソリック溶出の1000
mlに対応)は、水を用いて500マイクロシーメンス
以下の伝導性に調整され、475mlのベッド量のDE
AE−5PWHPLC(BIORAD)カラムに供給さ
れる。ICEは同じバッファを持つ約40mM NaC
lの勾配中で溶出される。その勾配は、0.5MのNa
Clと220mM Tris HC1の比率に増大して
いる。ICEの活性の一部は、25mMのHEPES、
pH7.5、10%のショ糖、0.1%のCHAPS、
および2mMのDTTという条件のバッファの中で10
0μMのYVAD−AMC基質を含有する100μlの
ボリュームを持つ96ウェルプレート蛍光計を用いて分
析される。
【0161】DEAEカラムから取り出されたICEの
活性の一部はプールされ、HEPES、ショ糖、CHA
PS, DTTバッファで薄められて、pH7.0に調
節される。さらに150mlベッド量のSP−5PWの
HPLC(BIORAD)カラムに供給されて、同じバ
ッファで勾配のつけられたKC1中、約85nMに溶出
される。ICEの活性の一部はSDS−PAGE(10
−20、17−27、16または18%ゲル)と活性を
追跡する帯域を決定するための染色銀によってクロマト
グラフィーが行われる。これらのSP−HPLCの一部
は、さらに0.0%のTFAでアセトニトリル勾配で溶
出されたC4ナローボア(ABI)HPLCカラム上で
クロマトグラフィーが行われる。
活性の一部はプールされ、HEPES、ショ糖、CHA
PS, DTTバッファで薄められて、pH7.0に調
節される。さらに150mlベッド量のSP−5PWの
HPLC(BIORAD)カラムに供給されて、同じバ
ッファで勾配のつけられたKC1中、約85nMに溶出
される。ICEの活性の一部はSDS−PAGE(10
−20、17−27、16または18%ゲル)と活性を
追跡する帯域を決定するための染色銀によってクロマト
グラフィーが行われる。これらのSP−HPLCの一部
は、さらに0.0%のTFAでアセトニトリル勾配で溶
出されたC4ナローボア(ABI)HPLCカラム上で
クロマトグラフィーが行われる。
【0162】実施例5
【0163】
【化47】
【0164】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−リシニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸ジメ
チルアセタールb−t−ブチルエステルステップA :N−アリルオキシカルボニル−3−アミノ
−4−ヒドロキシブタン酸 t−ブチルエステル。
ル−リシニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸ジメ
チルアセタールb−t−ブチルエステルステップA :N−アリルオキシカルボニル−3−アミノ
−4−ヒドロキシブタン酸 t−ブチルエステル。
【0165】
【化48】
【0166】N−アリルオキシカルボニル(S)アスパ
ラギン酸b−t−ブチルーエステル(2.00g、7.
32mmol)を0゜Cで50mLのテトラヒドロフラ
ン(THF)に溶解した液に、N−メチルモルホリン
(NMM、885mL、8.05mmol)を添加し、
その後にイソブチルクロロホルネート(IBCF, 9
97mL, 7.68mmol)が加えられる。15分
後、この混合液は、−45゜Cで50mLのTHFと1
2.5mLのメタノールの中で水素化ホウ素ナトリウム
(550mg、14.55mmol)に添加されて懸濁
状態におかれる。−45゜Cで30分を経た後、この混
合液は0゜Cに暖められ、30分間その温度に保たれ
る。この反応は酢酸で停止され、酢酸エチルとヘキサン
の比率が1対1の溶液で薄められた後、ナトリウム重炭
酸塩を水で薄めた溶液で3回にわたって洗浄される。有
機体は、硫酸ナトリウムで乾燥されて、濾過して集めら
れる。残留物は、シリカ・ゲル(35x350mmカラ
ム、30%酢酸エチル/ヘクサン)上のMPLCによっ
て精製され、下記に示す必要な生成物が産出される。
ラギン酸b−t−ブチルーエステル(2.00g、7.
32mmol)を0゜Cで50mLのテトラヒドロフラ
ン(THF)に溶解した液に、N−メチルモルホリン
(NMM、885mL、8.05mmol)を添加し、
その後にイソブチルクロロホルネート(IBCF, 9
97mL, 7.68mmol)が加えられる。15分
後、この混合液は、−45゜Cで50mLのTHFと1
2.5mLのメタノールの中で水素化ホウ素ナトリウム
(550mg、14.55mmol)に添加されて懸濁
状態におかれる。−45゜Cで30分を経た後、この混
合液は0゜Cに暖められ、30分間その温度に保たれ
る。この反応は酢酸で停止され、酢酸エチルとヘキサン
の比率が1対1の溶液で薄められた後、ナトリウム重炭
酸塩を水で薄めた溶液で3回にわたって洗浄される。有
機体は、硫酸ナトリウムで乾燥されて、濾過して集めら
れる。残留物は、シリカ・ゲル(35x350mmカラ
ム、30%酢酸エチル/ヘクサン)上のMPLCによっ
て精製され、下記に示す必要な生成物が産出される。
【0167】1H NMR (200MHz, CD3
OD) d 5.9 (m, 1H), 5.28
(br d, 1H, J = 17Hz), 5.1
5 (br d, 1H, J = 9Hz), 4.
52 (br d, 2H,J = 6Hz), 3.
98 (m, 1H), 3.48 (ABX, 2
H, J = 5, 6, 11Hz), 2.53
(dd, 1H, J= 5, 16Hz), 2.3
2 (dd, 1H, J = 9, 16Hz),
1.43 (s, 9H)。
OD) d 5.9 (m, 1H), 5.28
(br d, 1H, J = 17Hz), 5.1
5 (br d, 1H, J = 9Hz), 4.
52 (br d, 2H,J = 6Hz), 3.
98 (m, 1H), 3.48 (ABX, 2
H, J = 5, 6, 11Hz), 2.53
(dd, 1H, J= 5, 16Hz), 2.3
2 (dd, 1H, J = 9, 16Hz),
1.43 (s, 9H)。
【0168】ステップB:N−アリルオキシカルボニル
−3−アミノ−4−オキソブタン酸 b−t−ブチルエ
ステルジメチルアセタール。
−3−アミノ−4−オキソブタン酸 b−t−ブチルエ
ステルジメチルアセタール。
【0169】
【化49】
【0170】ジメチルスルホキシド(757mL, 1
0.67mmol)を−45゜Cで10mLのジクロロ
メタンと混合した溶液に塩化オキサリル(508mL,
5.82mmol)が添加される。5分後に、N−ア
リルオキシカルボニル−3−アミノ−4−ハイドロキシ
ブタン酸 t−ブチル−エステル(1.25g, 4.
85mmol)を10mLのジクロロメタンに添加す
る。15分後に、トリエチルアミン(2.03mL,
14.55mmol)が添加される。30分後に、この
混合液が−23゜Cに暖められ、30分間かき混ぜられ
る。この混合液は酢酸エチルとヘキサンの比率が1対1
の水で薄めた溶液に浸され、水で洗浄され、1N硫化水
素ナトリウムに浸された後、再び2回水で洗浄される。
有機体は硫酸ナトリウムで乾燥されて、濾過して集めら
れる。この結果として生成されるオイルは、200mL
のメタノールと20mLのトリメチルオルトギ酸塩で薄
められてから、100mgのpトルエンスルフォン酸が
添加される。16分後、反応は飽和ナトリウム重炭酸塩
で停止されて真空濃縮される。混合液はエーテルで薄め
られ、ナトリウム重炭酸塩の水溶液で5回にわたって洗
浄される。エーテル層は、硫酸マグネシウムで乾燥され
て、濾過して集められた上、無色オイルとして標題化合
物が産出される。
0.67mmol)を−45゜Cで10mLのジクロロ
メタンと混合した溶液に塩化オキサリル(508mL,
5.82mmol)が添加される。5分後に、N−ア
リルオキシカルボニル−3−アミノ−4−ハイドロキシ
ブタン酸 t−ブチル−エステル(1.25g, 4.
85mmol)を10mLのジクロロメタンに添加す
る。15分後に、トリエチルアミン(2.03mL,
14.55mmol)が添加される。30分後に、この
混合液が−23゜Cに暖められ、30分間かき混ぜられ
る。この混合液は酢酸エチルとヘキサンの比率が1対1
の水で薄めた溶液に浸され、水で洗浄され、1N硫化水
素ナトリウムに浸された後、再び2回水で洗浄される。
有機体は硫酸ナトリウムで乾燥されて、濾過して集めら
れる。この結果として生成されるオイルは、200mL
のメタノールと20mLのトリメチルオルトギ酸塩で薄
められてから、100mgのpトルエンスルフォン酸が
添加される。16分後、反応は飽和ナトリウム重炭酸塩
で停止されて真空濃縮される。混合液はエーテルで薄め
られ、ナトリウム重炭酸塩の水溶液で5回にわたって洗
浄される。エーテル層は、硫酸マグネシウムで乾燥され
て、濾過して集められた上、無色オイルとして標題化合
物が産出される。
【0171】1H NMR (200MHz, CD3
OD) d 5.9 (m, 1H), 5.26
(br d, 1H, J = 17Hz), 5.1
4 (br d, 1H, J = 10Hz),
4.51 (br d, 2H,J = 5.33H
z), 4.25 (d, 1H, J = 4.79
Hz), 4.11 (m, 1H), 3.40
(s, 3H), 3.39(s, 3H), 2.5
2 (dd, 1H, J = 4.86, 15.2
7Hz), 2.30 (dd, 1H, J =
9.00, 15.28Hz), 1.43 (s,
9H)。
OD) d 5.9 (m, 1H), 5.26
(br d, 1H, J = 17Hz), 5.1
4 (br d, 1H, J = 10Hz),
4.51 (br d, 2H,J = 5.33H
z), 4.25 (d, 1H, J = 4.79
Hz), 4.11 (m, 1H), 3.40
(s, 3H), 3.39(s, 3H), 2.5
2 (dd, 1H, J = 4.86, 15.2
7Hz), 2.30 (dd, 1H, J =
9.00, 15.28Hz), 1.43 (s,
9H)。
【0172】ステップC:3−アミノ−4−オキソブタ
ン酸 b−t−ブチルエステルジメチルアセタール
ン酸 b−t−ブチルエステルジメチルアセタール
【0173】
【化50】
【0174】N−アリルオキシカルボニル−3−アミノ
−4−オキソブタン酸 b−t−ブチルエステルジメチ
ルアセタール(312mg, 1.03mmol)と1
0mLのTHFの混合液にモルホリン(897mL,
10.3mmol)とテトラキストリフェニルフォスフ
ィンパラジゥム(100mg)を添加する。3分後、こ
の混合液を1:1の酢酸エチルとヘキサンで薄め、ナト
リウム重炭酸塩を水で薄めた溶液で5回にわたって洗浄
する。有機物は、乾燥して硫酸ナトリウムとなり、濾過
して集められる。この結果として生成されるオイルは、
シリカ・ゲル(22x300mmカラム、ジクロロメタ
ン中、1%のアンモニアと10%のジクロロメタンの線
形勾配を持つ)でのMPLCによって精製され、青白色
オイルとして標題化合物を得る。
−4−オキソブタン酸 b−t−ブチルエステルジメチ
ルアセタール(312mg, 1.03mmol)と1
0mLのTHFの混合液にモルホリン(897mL,
10.3mmol)とテトラキストリフェニルフォスフ
ィンパラジゥム(100mg)を添加する。3分後、こ
の混合液を1:1の酢酸エチルとヘキサンで薄め、ナト
リウム重炭酸塩を水で薄めた溶液で5回にわたって洗浄
する。有機物は、乾燥して硫酸ナトリウムとなり、濾過
して集められる。この結果として生成されるオイルは、
シリカ・ゲル(22x300mmカラム、ジクロロメタ
ン中、1%のアンモニアと10%のジクロロメタンの線
形勾配を持つ)でのMPLCによって精製され、青白色
オイルとして標題化合物を得る。
【0175】1H NMR (200MHz, CD3
OD) d 4.15 (d, 1H, J = 5.
67Hz), 3.41 (s, 3H), 3.40
(s, 3H), 3.19 (m, 1H),
2.47 (dd, 1H,J = 4.88, 1
6.06Hz), 2.22 (dd, 1H, J=
7.86, 16.16Hz), 1.45 (s,
9H)。
OD) d 4.15 (d, 1H, J = 5.
67Hz), 3.41 (s, 3H), 3.40
(s, 3H), 3.19 (m, 1H),
2.47 (dd, 1H,J = 4.88, 1
6.06Hz), 2.22 (dd, 1H, J=
7.86, 16.16Hz), 1.45 (s,
9H)。
【0176】ステップD:N−(N−アセチル−チロシ
ニル−バリニル−(e−CBZ−リシニル−3−アミノ
−4−オキソブタン酸 b−t−ブチルエステルジメチ
ルアセタール。
ニル−バリニル−(e−CBZ−リシニル−3−アミノ
−4−オキソブタン酸 b−t−ブチルエステルジメチ
ルアセタール。
【0177】
【化51】
【0178】3−アミノ−4−オキソブタン酸 b−t
−ブチルエステルジメチルアセテル(238mg,
1.09mmol)に0゜Cで5mLのDMFを添加し
た溶液にN−メチルモルホリン(599mL, 5.4
5mmol)を添加し、引き続きN−アセチール−チロ
シニール−バリニル−e−CBZ−リシン(735m
g, 1.09mmol)、ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール(221mg, 1.64mmol)、およびジシ
クロヘキシルカルボジイミド(225mg, 1.09
mmol)を逐次添加する。周囲温度で16時間後、こ
の混合液は濾過されてセファデックス”LH−20クロ
マトグラフィー(1Mx50mmカラム、メタノール溶
解分離剤)によって精製される。この結果生成される生
成物はシリカ・ゲル(22x300mmカラム、ジクロ
ロメタン中、1%のアンモニアと10%のジクロロメタ
ンの線形勾配を持つ[ジクロロメタン中])上のMPL
Cによってさらに精製が行われ、下記に示す無色の標題
固体化合物を産出する。
−ブチルエステルジメチルアセテル(238mg,
1.09mmol)に0゜Cで5mLのDMFを添加し
た溶液にN−メチルモルホリン(599mL, 5.4
5mmol)を添加し、引き続きN−アセチール−チロ
シニール−バリニル−e−CBZ−リシン(735m
g, 1.09mmol)、ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール(221mg, 1.64mmol)、およびジシ
クロヘキシルカルボジイミド(225mg, 1.09
mmol)を逐次添加する。周囲温度で16時間後、こ
の混合液は濾過されてセファデックス”LH−20クロ
マトグラフィー(1Mx50mmカラム、メタノール溶
解分離剤)によって精製される。この結果生成される生
成物はシリカ・ゲル(22x300mmカラム、ジクロ
ロメタン中、1%のアンモニアと10%のジクロロメタ
ンの線形勾配を持つ[ジクロロメタン中])上のMPL
Cによってさらに精製が行われ、下記に示す無色の標題
固体化合物を産出する。
【0179】1H NMR (200MHz, CD3
OD) d 7.31 (br s, 5H), 7.
04 (br d, 2H, J = 8.35H
z),6.67 (br d, 2H, J = 8.
45Hz), 5.04 (s, 2H), 4.61
0 (m, 1H), 4.44−4.25 (m,3
H), 4.17 (d, 1H, J = 7.27
Hz), 3.39(s, 3H), 3.38
(s, 3H), 3.1−2.9 (m, 3H),
2.75 (dd, 1H, J = 9.28,
14.12Hz), 2.53 (dd, 1H, J
= 5.47, 15.58Hz),2.33 (d
d, 1H, J = 7.96, 15.53H
z), 2.04 (m, 1H), 1.88
(s, 3H), 1.8−1.2 (m, 6H),
1.41 (s, 159H), 0.94 (d,
6H,J = 6.74Hz)。
OD) d 7.31 (br s, 5H), 7.
04 (br d, 2H, J = 8.35H
z),6.67 (br d, 2H, J = 8.
45Hz), 5.04 (s, 2H), 4.61
0 (m, 1H), 4.44−4.25 (m,3
H), 4.17 (d, 1H, J = 7.27
Hz), 3.39(s, 3H), 3.38
(s, 3H), 3.1−2.9 (m, 3H),
2.75 (dd, 1H, J = 9.28,
14.12Hz), 2.53 (dd, 1H, J
= 5.47, 15.58Hz),2.33 (d
d, 1H, J = 7.96, 15.53H
z), 2.04 (m, 1H), 1.88
(s, 3H), 1.8−1.2 (m, 6H),
1.41 (s, 159H), 0.94 (d,
6H,J = 6.74Hz)。
【0180】ステップE:N−(N−アセチル−チロシ
ニル−バリニル−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸 ジメチルアセタールb−t−ブチルエステル
ニル−バリニル−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸 ジメチルアセタールb−t−ブチルエステル
【0181】
【化52】
【0182】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−e−CBZ−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸 b−t−ブチルエステルジメチルアセタール
(15.6mg)を2mLのメタノールに溶解して10
mgパールマン触媒(炭素上のPd(OH)2)を添加
する。水素の下で30分後、この混合液は濾過されて集
められ、下記に示す標題化合物を産出する。
ル−e−CBZ−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸 b−t−ブチルエステルジメチルアセタール
(15.6mg)を2mLのメタノールに溶解して10
mgパールマン触媒(炭素上のPd(OH)2)を添加
する。水素の下で30分後、この混合液は濾過されて集
められ、下記に示す標題化合物を産出する。
【0183】1H NMR (200MHz, CD3
OD) d 7.04 (br d, 2H, J =
8.44Hz), 6.67 (br d, 2H,
J= 8.54Hz), 4.57 (dd, 1
H, J = 5.23,9.04Hz), 4.5−
4.0 (m, 4H), 3.38 (s, 3
H), 3.34 (s, 3H), 3.02 (d
d, 1H, J =5.17, 13.81Hz),
2.75 (dd, 1H, J = 9.23,
14.06Hz), 2.66 (t, 2H, J
= 7.08Hz), 2.53 (dd, 1H,
J = 5.47, 15.58Hz), 2.34
(dd, 1H, J = 7.91, 15.57H
z),2.03 (m, 1H), 1.88 (s,
3H), 1.9−1.2(m, 6H), 1.4
1 (s, 9H), 0.94 (d, 6H,J
= 6.69Hz), 0.93 (d, 3H, J
= 6.64Hz)。
OD) d 7.04 (br d, 2H, J =
8.44Hz), 6.67 (br d, 2H,
J= 8.54Hz), 4.57 (dd, 1
H, J = 5.23,9.04Hz), 4.5−
4.0 (m, 4H), 3.38 (s, 3
H), 3.34 (s, 3H), 3.02 (d
d, 1H, J =5.17, 13.81Hz),
2.75 (dd, 1H, J = 9.23,
14.06Hz), 2.66 (t, 2H, J
= 7.08Hz), 2.53 (dd, 1H,
J = 5.47, 15.58Hz), 2.34
(dd, 1H, J = 7.91, 15.57H
z),2.03 (m, 1H), 1.88 (s,
3H), 1.9−1.2(m, 6H), 1.4
1 (s, 9H), 0.94 (d, 6H,J
= 6.69Hz), 0.93 (d, 3H, J
= 6.64Hz)。
【0184】実施例6 N−(N−アセチル−チロシニル−バリニル−アラニニ
ル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸ステップA :N−アリロキシーカルボニル−3−アミノ
−4−ハイドロブタン酸 t−ブチルエステル
ル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸ステップA :N−アリロキシーカルボニル−3−アミノ
−4−ハイドロブタン酸 t−ブチルエステル
【0185】
【化53】
【0186】N−アリロキシーカルボニル(S)−アス
パラギン酸 βタートブチルエステル(2.00g、
7.32mmol)を0゜Cで50mLのテトラヒドロ
フラン(THF)に溶解した液にN−メチルモルホリン
(NMM, 885mL, 8.05mmol)が添加
され、続いてイソブチルクロロホルメート(IBCF,
997mL, 7.68mmol)に添加される。15
分後、この混合液は水素化ホウ素ナトリウム(550m
g, 14.55mmol)に添加されて−45゜Cで
50mLのTHFと12.5mLのメタノールの中で懸
濁状態におかれる。−45゜Cで30分経過した後、こ
の混合液は0゜Cに暖められたあとさらに30分間その
温度に保たれる。反応は酢酸で停止され、酢酸エチルと
ヘキサン1対1で薄め、ナトリウム重炭酸塩を水で薄め
て3回にわたって洗浄を行う。有機物は硫酸ナトリウム
で乾燥されて、濾過して集められる。残留物はシリカ・
ゲル(35x350mmカラム、30%酢酸エチル/ヘ
キサン)のMPLCによって精製され、下記に示すよう
に求める所望生成物が産出される。
パラギン酸 βタートブチルエステル(2.00g、
7.32mmol)を0゜Cで50mLのテトラヒドロ
フラン(THF)に溶解した液にN−メチルモルホリン
(NMM, 885mL, 8.05mmol)が添加
され、続いてイソブチルクロロホルメート(IBCF,
997mL, 7.68mmol)に添加される。15
分後、この混合液は水素化ホウ素ナトリウム(550m
g, 14.55mmol)に添加されて−45゜Cで
50mLのTHFと12.5mLのメタノールの中で懸
濁状態におかれる。−45゜Cで30分経過した後、こ
の混合液は0゜Cに暖められたあとさらに30分間その
温度に保たれる。反応は酢酸で停止され、酢酸エチルと
ヘキサン1対1で薄め、ナトリウム重炭酸塩を水で薄め
て3回にわたって洗浄を行う。有機物は硫酸ナトリウム
で乾燥されて、濾過して集められる。残留物はシリカ・
ゲル(35x350mmカラム、30%酢酸エチル/ヘ
キサン)のMPLCによって精製され、下記に示すよう
に求める所望生成物が産出される。
【0187】1H NMR (200MHz, CD3
OD) δ5.9 (m, 1H), 5.28 (b
r d, 1H, J = 17Hz), 5.15
(br d, 1H, J = 9Hz), 4.52
(br d, 2H, J= 6Hz), 3.98
(m, 1H), 3.48 (ABX, 2H,
J = 5, 6, 11Hz), 2.53 (d
d, 1H, J =5, 16Hz), 2.32
(dd, 1H, J = 9, 16Hz), 1.
43 (s, 9H)。
OD) δ5.9 (m, 1H), 5.28 (b
r d, 1H, J = 17Hz), 5.15
(br d, 1H, J = 9Hz), 4.52
(br d, 2H, J= 6Hz), 3.98
(m, 1H), 3.48 (ABX, 2H,
J = 5, 6, 11Hz), 2.53 (d
d, 1H, J =5, 16Hz), 2.32
(dd, 1H, J = 9, 16Hz), 1.
43 (s, 9H)。
【0188】ステップB:N−アリロキシカルボニル−
3−アミノ−4−オキソブタン酸 β−t−ブチルエス
テルジメチルアセタール
3−アミノ−4−オキソブタン酸 β−t−ブチルエス
テルジメチルアセタール
【0189】
【化54】
【0190】ジメチルスルホキシド(757mL, 1
0.67mmol)に−45゜Cで10mLのジクロロ
メタンを添加した溶液に塩化オキサリル(508mL,
5.82mmol)が添加される。5分後、N−アリ
ルオキシカルボニル−3−アミノ−4−ハイドロブタン
酸 t−ブチルエステル(1.25g, 4.85mm
ol)を10mLのジクロロメタンに添加する。15分
後、トリエチルアミン(2.03mL, 14.55m
mol)が添加される。さらに30分後、この混合液は
−23゜Cに暖められ、30分間かき混ぜられる。その
上でこの混合液は酢酸エチルとヘキサンを1対1の割合
で水に薄めた溶液に浸ししてから、水で洗浄し、さらに
1N硫化水素ナトリウムに浸した後2回にわたって水で
洗浄する。有機物は硫酸ナトリウムで乾燥されて、濾過
して集められる。この結果として産出されたオイルは、
200mLのメタノールと20mLのトリメチルオルト
ギ酸エステルの中で溶解され、100mgp−トルエン
スルホン酸が添加される。16時間後、反応は飽和した
ナトリウム重炭酸塩で停止され、真空濃縮される。この
混合液はエーテルで薄められた上、5回にわたってナト
リウム重炭酸塩水で洗浄される。エーテル層は硫酸マグ
ネシウムで乾燥されて、濾過して集められ、下記の無色
のオイル状の表題の化合物を産出される。
0.67mmol)に−45゜Cで10mLのジクロロ
メタンを添加した溶液に塩化オキサリル(508mL,
5.82mmol)が添加される。5分後、N−アリ
ルオキシカルボニル−3−アミノ−4−ハイドロブタン
酸 t−ブチルエステル(1.25g, 4.85mm
ol)を10mLのジクロロメタンに添加する。15分
後、トリエチルアミン(2.03mL, 14.55m
mol)が添加される。さらに30分後、この混合液は
−23゜Cに暖められ、30分間かき混ぜられる。その
上でこの混合液は酢酸エチルとヘキサンを1対1の割合
で水に薄めた溶液に浸ししてから、水で洗浄し、さらに
1N硫化水素ナトリウムに浸した後2回にわたって水で
洗浄する。有機物は硫酸ナトリウムで乾燥されて、濾過
して集められる。この結果として産出されたオイルは、
200mLのメタノールと20mLのトリメチルオルト
ギ酸エステルの中で溶解され、100mgp−トルエン
スルホン酸が添加される。16時間後、反応は飽和した
ナトリウム重炭酸塩で停止され、真空濃縮される。この
混合液はエーテルで薄められた上、5回にわたってナト
リウム重炭酸塩水で洗浄される。エーテル層は硫酸マグ
ネシウムで乾燥されて、濾過して集められ、下記の無色
のオイル状の表題の化合物を産出される。
【0191】1H NMR (200MHz, CD3
OD) δ5.9 (m, 1H), 5.26 (b
r d, 1H, J = 17Hz), 5.14
(br d, 1H, J = 10Hz), 4.5
1 (br d, 2H,J=5.33Hz), 4.
25 (d, 1H, J = 4.79Hz),4.
11 (m, 1H), 3.40 (s, 3H),
3.39 (s, 3H), 2.52 (dd,
1H, J = 4.86, 15.27Hz),
2.30 (dd, 1H, J = 9.00, 1
5.28Hz), 1.43 (s, 9H)。
OD) δ5.9 (m, 1H), 5.26 (b
r d, 1H, J = 17Hz), 5.14
(br d, 1H, J = 10Hz), 4.5
1 (br d, 2H,J=5.33Hz), 4.
25 (d, 1H, J = 4.79Hz),4.
11 (m, 1H), 3.40 (s, 3H),
3.39 (s, 3H), 2.52 (dd,
1H, J = 4.86, 15.27Hz),
2.30 (dd, 1H, J = 9.00, 1
5.28Hz), 1.43 (s, 9H)。
【0192】ステップC:3−アミノ−4−オキソブタ
ン酸 β−t−ブチルエステルジメチルアセタール
ン酸 β−t−ブチルエステルジメチルアセタール
【0193】
【化55】
【0194】N−アリロキシー−カルボニル−3−アミ
ノ−4−オキソブタン酸 β−タート−ブチルエステル
ジメチルアセタール(312mg, 1.03mmo
l)に10mLのTHFを添加した溶液にモルホリン
(897mL, 10.3mmol)とテトラキストリ
フェニルフォスフィンパラジゥム(100mg)とが添
加される。3時間後、この混合液は酢酸エチルとヘキサ
ンの1対1溶液で薄められ、5回にわたってナトリウム
重炭酸塩水で洗浄される。有機物は硫酸ナトリウムで乾
燥されて、濾過して集められる。この結果として生成さ
れるオイルはシリカ・ゲル(22x300mmカラム、
1%のアンモニアと10%のジクロロメタンの線形勾配
を持つ[ジクロロメタン中])上のMPLCによって精
製され、下記に示す青白黄オイルとして標題化合物が産
出される。
ノ−4−オキソブタン酸 β−タート−ブチルエステル
ジメチルアセタール(312mg, 1.03mmo
l)に10mLのTHFを添加した溶液にモルホリン
(897mL, 10.3mmol)とテトラキストリ
フェニルフォスフィンパラジゥム(100mg)とが添
加される。3時間後、この混合液は酢酸エチルとヘキサ
ンの1対1溶液で薄められ、5回にわたってナトリウム
重炭酸塩水で洗浄される。有機物は硫酸ナトリウムで乾
燥されて、濾過して集められる。この結果として生成さ
れるオイルはシリカ・ゲル(22x300mmカラム、
1%のアンモニアと10%のジクロロメタンの線形勾配
を持つ[ジクロロメタン中])上のMPLCによって精
製され、下記に示す青白黄オイルとして標題化合物が産
出される。
【0195】1H NMR (200MHz, CD3
OD) δ4.15 (d, 1H, J = 5.6
7Hz), 3.41 (s, 3H), 3.40
(s, 3H), 3.19 (m, 1H), 2.
47 (dd, 1H, J= 4.88, 16.0
6Hz), 2.22 (dd, 1H, J =7.
86, 16.16Hz), 1.45 (s, 9
H)。
OD) δ4.15 (d, 1H, J = 5.6
7Hz), 3.41 (s, 3H), 3.40
(s, 3H), 3.19 (m, 1H), 2.
47 (dd, 1H, J= 4.88, 16.0
6Hz), 2.22 (dd, 1H, J =7.
86, 16.16Hz), 1.45 (s, 9
H)。
【0196】ステップD:
【0197】
【化56】
【0198】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−アラニニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸
β−t−ブチルエステルジメチルアセタール。
ル−アラニニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸
β−t−ブチルエステルジメチルアセタール。
【0199】3−アミノ−4−オキソブタン酸 β−t
−ブチルエステルジメチルアセタール(104mg,
0.473mmol)に0゜Cで3mLのDMFを添加
した溶液に、N−メチルモルホリン(260mL,
2.37mmol)に添加され、引き続きN−アセチル
−チロシニル−バリニル−アラニン(229mg,
0.473mmol)、ヒドロキシベンゾトリアゾール
(96mg, 0.710mmol)、およびジシクロ
ヘキシルカルボジイミド(98mg, 0.473mm
ol)が逐次添加される。周囲温度で24時間経過した
後、この混合液は濾過されて、セファデックスLH−2
0のクロマトグラフィー(1Mx50mmカラム、メタ
ノール溶解分離剤)によって精製される。この結果とし
て生成される製品はシリカ・ゲル(22x300mmカ
ラム、1%のアンモニアと10%のジクロロメタン線形
勾配を持つ[ジクロロメタン中])でのMPLCによっ
てさらに精製され、下記の無色固体の化合物として産出
される。
−ブチルエステルジメチルアセタール(104mg,
0.473mmol)に0゜Cで3mLのDMFを添加
した溶液に、N−メチルモルホリン(260mL,
2.37mmol)に添加され、引き続きN−アセチル
−チロシニル−バリニル−アラニン(229mg,
0.473mmol)、ヒドロキシベンゾトリアゾール
(96mg, 0.710mmol)、およびジシクロ
ヘキシルカルボジイミド(98mg, 0.473mm
ol)が逐次添加される。周囲温度で24時間経過した
後、この混合液は濾過されて、セファデックスLH−2
0のクロマトグラフィー(1Mx50mmカラム、メタ
ノール溶解分離剤)によって精製される。この結果とし
て生成される製品はシリカ・ゲル(22x300mmカ
ラム、1%のアンモニアと10%のジクロロメタン線形
勾配を持つ[ジクロロメタン中])でのMPLCによっ
てさらに精製され、下記の無色固体の化合物として産出
される。
【0200】1H NMR (200MHz, CD3
OD) δ 7.04 (br d, 2H, J =
8.54Hz), 6.67 (br d, 2H,
J= 8.57Hz), 4.58 (dd, 1
H, J = 5.61,9.03), 4.4−4.
2 (m, 3H), 4.16 (d, 1H,J
= 7.12Hz), 3.39 (s, 3H),
3.38 (s,3H), 3.01 (dd, 1
H, J = 5.54, 13.97Hz), 2.
76 (dd, 1H, J = 8.89, 13.
90Hz), 2.53 (dd, 1H, J =
5.50, 14.45Hz),2.34 (dd,
1H, J = 7.83, 15.49Hz),
2.05 (m, 1H), 1.90 (s, 3
H), 1.41 (s, 9H), 1.33
(d, 3H, J = 7.16Hz), 0.94
(d, 3H, J = 6.73Hz), 0.9
2 (d, 3H, J =6.77Hz)。
OD) δ 7.04 (br d, 2H, J =
8.54Hz), 6.67 (br d, 2H,
J= 8.57Hz), 4.58 (dd, 1
H, J = 5.61,9.03), 4.4−4.
2 (m, 3H), 4.16 (d, 1H,J
= 7.12Hz), 3.39 (s, 3H),
3.38 (s,3H), 3.01 (dd, 1
H, J = 5.54, 13.97Hz), 2.
76 (dd, 1H, J = 8.89, 13.
90Hz), 2.53 (dd, 1H, J =
5.50, 14.45Hz),2.34 (dd,
1H, J = 7.83, 15.49Hz),
2.05 (m, 1H), 1.90 (s, 3
H), 1.41 (s, 9H), 1.33
(d, 3H, J = 7.16Hz), 0.94
(d, 3H, J = 6.73Hz), 0.9
2 (d, 3H, J =6.77Hz)。
【0201】ステップE:
【0202】
【化57】
【0203】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−アラニニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸。
ル−アラニニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸。
【0204】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−アラニニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸
β−t−ブチルエステルジメチルアセタール(17.4
mg)を2mLのトリフルオロアセチル酸の中で15分
間熟成し、真空濃縮する。生成物は1.0mLのメタノ
ールに溶解して60uLの塩化チオニールを含む1.0
mLの水を添加する。2時間後、溶液のpH値をナトリ
ウムアセテートに合わせて5に調整し、下記の化合物溶
液を産出する。
ル−アラニニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸
β−t−ブチルエステルジメチルアセタール(17.4
mg)を2mLのトリフルオロアセチル酸の中で15分
間熟成し、真空濃縮する。生成物は1.0mLのメタノ
ールに溶解して60uLの塩化チオニールを含む1.0
mLの水を添加する。2時間後、溶液のpH値をナトリ
ウムアセテートに合わせて5に調整し、下記の化合物溶
液を産出する。
【0205】1H NMR (200MHz, CD3
OD) δ 7.08 (br d, 2H, J =
8.44Hz), 6.76 (br d, 2H,
J= 8.49Hz), 4.7−4.1 (m,
4H), 4.04 (d, 1H, J = 7.6
7Hz), 3.05−2.40 (m, 4H),
2.05 (m, 1H), 1.96 (s, 3
H), 1.35 (d, 3H, J = 7.23
Hz), 0.89 (d, 6H, J =6.84
Hz)。
OD) δ 7.08 (br d, 2H, J =
8.44Hz), 6.76 (br d, 2H,
J= 8.49Hz), 4.7−4.1 (m,
4H), 4.04 (d, 1H, J = 7.6
7Hz), 3.05−2.40 (m, 4H),
2.05 (m, 1H), 1.96 (s, 3
H), 1.35 (d, 3H, J = 7.23
Hz), 0.89 (d, 6H, J =6.84
Hz)。
【0206】実施例7 N−(N−アセチル−チロシニル−バリニル−e−CB
Z−リシニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸。
Z−リシニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸。
【0207】ステップA:
【0208】
【化58】
【0209】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−(e−CBZ−リシニル−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸 β−t−ブチルエステルジメチルアセター
ル。
ル−(e−CBZ−リシニル−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸 β−t−ブチルエステルジメチルアセター
ル。
【0210】3−アミノ−4−オキソブタン酸 β−t
−ブチルエステルジメチルアセタール(238mg,
1.09mmol)を0゜Cで5mLのDMFに添加し
た溶液に、N−メチルモルホリン(599mL, 5.
45mmol)に添加し、引き続きN−アセチール−チ
ロシニル−バリニル−e−CBZ−リシン(735m
g, 1.09mmol)、ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール(221mg, 1.64mmol)、およびジシ
クロヘキシルカルボジイミド(225mg, 1.09
mmol)に逐次添加する。周囲温度で16時間経過
後、この混合液は濾過されて、セファデックスLH−2
0のクロマトグラフィー(1Mx50mmカラム、メタ
ノール溶解分離剤)によって精製される。この結果生成
される製品はシリカ・ゲル(22x300mmカラム、
1%のアンモニアと10%のジクロロメタンの線形勾配
を持つ[ジクロロメタン中])でのMPLCによってさ
らに精製され、下記に示す無色固体の標題化合物を産出
する。
−ブチルエステルジメチルアセタール(238mg,
1.09mmol)を0゜Cで5mLのDMFに添加し
た溶液に、N−メチルモルホリン(599mL, 5.
45mmol)に添加し、引き続きN−アセチール−チ
ロシニル−バリニル−e−CBZ−リシン(735m
g, 1.09mmol)、ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール(221mg, 1.64mmol)、およびジシ
クロヘキシルカルボジイミド(225mg, 1.09
mmol)に逐次添加する。周囲温度で16時間経過
後、この混合液は濾過されて、セファデックスLH−2
0のクロマトグラフィー(1Mx50mmカラム、メタ
ノール溶解分離剤)によって精製される。この結果生成
される製品はシリカ・ゲル(22x300mmカラム、
1%のアンモニアと10%のジクロロメタンの線形勾配
を持つ[ジクロロメタン中])でのMPLCによってさ
らに精製され、下記に示す無色固体の標題化合物を産出
する。
【0211】1H NMR (200MHz, CD3
OD) δ7.31 (br s,5H), 7.04
(br d, 2H, J = 8.35Hz),
6.67 (br d, 2H, J = 8.45H
z), 5.04 (s,2H), 4.61 (m,
1H), 4.44−4.25 (m, 3H),
4.17 (d, 1H, J = 7.27Hz),
3.39 (s, 3H), 3.38 (s, 3
H), 3.1−2.9 (m, 3H), 2.75
(dd, 1H, J = 9.28, 14.12
Hz),2.53 (dd, 1H, J = 5.4
7, 15.58Hz), 2.33 (dd, 1
H, J = 7.96, 15.53Hz), 2.
04(m, 1H), 1.88 (s, 3H),
1.8−1.2 (m,6H), 1.41 (s,
9H), 0.94 (d, 6H, J =6.74
Hz)。
OD) δ7.31 (br s,5H), 7.04
(br d, 2H, J = 8.35Hz),
6.67 (br d, 2H, J = 8.45H
z), 5.04 (s,2H), 4.61 (m,
1H), 4.44−4.25 (m, 3H),
4.17 (d, 1H, J = 7.27Hz),
3.39 (s, 3H), 3.38 (s, 3
H), 3.1−2.9 (m, 3H), 2.75
(dd, 1H, J = 9.28, 14.12
Hz),2.53 (dd, 1H, J = 5.4
7, 15.58Hz), 2.33 (dd, 1
H, J = 7.96, 15.53Hz), 2.
04(m, 1H), 1.88 (s, 3H),
1.8−1.2 (m,6H), 1.41 (s,
9H), 0.94 (d, 6H, J =6.74
Hz)。
【0212】ステップB:
【0213】
【化59】
【0214】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−e−CBZ−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸。
ル−e−CBZ−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸。
【0215】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−e−CBZ−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸 β−t−ブチルエステルジメチルアセタール
(14.9mg)を1mLのトリフルオロアセチル酸で
処理して、15分間熟成させ真空濃縮する。残留物は
1、0mLのメタノールに溶解し、20uLの塩化チオ
ニールを含む1.0mLの水を添加する。1時間後、ナ
トリウムアセテートに合わせてpH値を5に調整し、下
記の標題溶液化合物を産出する。
ル−e−CBZ−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸 β−t−ブチルエステルジメチルアセタール
(14.9mg)を1mLのトリフルオロアセチル酸で
処理して、15分間熟成させ真空濃縮する。残留物は
1、0mLのメタノールに溶解し、20uLの塩化チオ
ニールを含む1.0mLの水を添加する。1時間後、ナ
トリウムアセテートに合わせてpH値を5に調整し、下
記の標題溶液化合物を産出する。
【0216】1H NMR (200MHz, CD3
OD) δ 7.33 (br s, 5H), 7.
05 (br d, 2H, J = 8.35H
z),6.74 (br d, 2H, J = 8.
35Hz), 4.6−3.9(m, 5H), 3.
1−2.3 (m, 6H), 1.98 (m,1
8), 1.92 (s, 3H), 1.8−1.2
(m, 6H),0.89 (d, 6H, J =
6.60Hz)。
OD) δ 7.33 (br s, 5H), 7.
05 (br d, 2H, J = 8.35H
z),6.74 (br d, 2H, J = 8.
35Hz), 4.6−3.9(m, 5H), 3.
1−2.3 (m, 6H), 1.98 (m,1
8), 1.92 (s, 3H), 1.8−1.2
(m, 6H),0.89 (d, 6H, J =
6.60Hz)。
【0217】実施例8
【0218】
【化60】
【0219】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−リシニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸。
ル−リシニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸。
【0220】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−e−CBZ−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸 β−t−ブチルエステルジメチルアセタール
(16.8mg)を2mLのメタノールに溶解し、パー
ルマンの触媒(炭素上のPd(OH)2)を添加する。
水素の下で30分経過した後、この混合液は濾過して集
められる。残留物は2mLのトリフルオロアセチル酸で
処理され、15分間熟成させて真空濃縮する。生成物は
1.0mLのメタノールに溶解し20uLの塩化チオニ
ールを含む1.0mLの水を添加する。1時間後、ナト
リウムアセテートでpH値を5に調整し、下記の溶液化
合物を産出する。
ル−e−CBZ−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸 β−t−ブチルエステルジメチルアセタール
(16.8mg)を2mLのメタノールに溶解し、パー
ルマンの触媒(炭素上のPd(OH)2)を添加する。
水素の下で30分経過した後、この混合液は濾過して集
められる。残留物は2mLのトリフルオロアセチル酸で
処理され、15分間熟成させて真空濃縮する。生成物は
1.0mLのメタノールに溶解し20uLの塩化チオニ
ールを含む1.0mLの水を添加する。1時間後、ナト
リウムアセテートでpH値を5に調整し、下記の溶液化
合物を産出する。
【0221】1H NMR (200MHz, CD3
OD) δ 7.10 (br d, 2H, J =
8.01Hz), 6.77 (br d, 2H,
J= 8.25Hz), 4.7−4.0 (m,
5H), 3.1−2.4(m, 6H), 2.04
(m, 1H), 1.95 (s, 3H),
1.9−1.3 (m, 6H), 0.90 (d,
6H, J =6.59Hz)。
OD) δ 7.10 (br d, 2H, J =
8.01Hz), 6.77 (br d, 2H,
J= 8.25Hz), 4.7−4.0 (m,
5H), 3.1−2.4(m, 6H), 2.04
(m, 1H), 1.95 (s, 3H),
1.9−1.3 (m, 6H), 0.90 (d,
6H, J =6.59Hz)。
【0222】実施例9
【0223】
【化61】
【0224】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−リシニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸 ジ
メチルアセタール。
ル−リシニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸 ジ
メチルアセタール。
【0225】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−e−CBZ−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸 β−t−ブチルエステルジメチルアセタール
(15.6mg)を2mLのメタノールに溶解し、10
mgのパールマンの触媒(炭素上でPd(OH)2)を
添加する。水素の下で30分経過した後、この混合液は
濾過して集められる。固体は1mLのメタノールと1m
Lの水に溶解させる。リチウム水酸化物(22mg)を
添加する。周囲温度で16時間経過した後、この混合液
を真空濃縮し、水酸化リチウムの存在下に標記化合物を
生成する。
ル−e−CBZ−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸 β−t−ブチルエステルジメチルアセタール
(15.6mg)を2mLのメタノールに溶解し、10
mgのパールマンの触媒(炭素上でPd(OH)2)を
添加する。水素の下で30分経過した後、この混合液は
濾過して集められる。固体は1mLのメタノールと1m
Lの水に溶解させる。リチウム水酸化物(22mg)を
添加する。周囲温度で16時間経過した後、この混合液
を真空濃縮し、水酸化リチウムの存在下に標記化合物を
生成する。
【0226】1H NMR (200MHz, CD3
OD) δ 6.88 (br d, 2H, J =
8.4Hz), 6.54 (br d, 2H,
J= 8.4Hz), 4.6−4.1 (m, 5
H), 3.38 (s,6H), 3.0−2.2
(m, 6H), 2.08 (m, 1H),1.8
8 (s, 3H), 1.9−1.2 (m, 6
H), 0.94(d, 6H, J = 6.7H
z), 0.91 (d, 3H, J =6.7H
z)。
OD) δ 6.88 (br d, 2H, J =
8.4Hz), 6.54 (br d, 2H,
J= 8.4Hz), 4.6−4.1 (m, 5
H), 3.38 (s,6H), 3.0−2.2
(m, 6H), 2.08 (m, 1H),1.8
8 (s, 3H), 1.9−1.2 (m, 6
H), 0.94(d, 6H, J = 6.7H
z), 0.91 (d, 3H, J =6.7H
z)。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ケビン・テイ・チヤツプマン アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07076、スコツチ・プレインズ、ダンカ ン・ドライブ・1974
Claims (16)
- 【請求項1】 インターロイキン1β変換酵素を精製す
るための式I: 【化1】 の化合物の使用方法であって、アフィニティーカラム担
体に前記式Iの化合物を付加することを含み、前記式I
の化合物において、Yは、 【化2】 を示しており、R1は、(a)置換したC1−12アル
キル〔ここで、置換基は、(1)水素、(2)ヒドロキ
シ、(3)ハロゲン、(4)C1−6アルキルカルボニ
ル、(5)ホルミル、(6)アミノ、(7)カルボキ
シ、(8)チオール、および(9)オキシラニルから選
択される。〕(b)アリールC1−6アルキル〔ここ
で、アリール基は、(1)フェニル、(2)ナフチル、
(3)ピリジル、(4)フリル、(5)チエニル、
(6)チアゾリル、(7)イソチアゾリル、(8)イミ
ダゾリル、(9)ベンズイミダゾリル、(10)ピラジ
ニル、(11)ピリミジル、(12)キノリル、(1
3)イソキノリル、(14)ベンゾフリル、(15)ベ
ンゾチエニル、(16)ピラゾリル、(17)インドリ
ル、(18)プリニル、(19)イソキサゾリル、およ
び(20)オキサゾリル、並びに、モノおよびジ−置換
の、上記(1)項より(20)項において定義されたア
リールからなるグループから選択され、ここで、置換基
は独立にC1−6アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アミノ
C1−6アルキル、チオC1−6アルキル、ホルミルC
1−6アルキル、およびヒドロキシC1−6アルキルで
ある。〕R2は、(a)H、(b) 【化3】 であり、ここで、R4およびR5は水素、弗素およびヒ
ドロキシからそれぞれに別々に選択され、R6は、
(1)水素、(2)弗素、(3)置換したC1−6アル
キル〔ここで、置換基は、(a)水素、(b)ヒドロキ
シ、(c)ハロゲン、(d)C1−6アルキルカルボニ
ルから選択される。〕(4)アリールC1−6アルキ
ル、〔ここで、アルキルは、水素、オキソ、C1−3ア
ルキル、ハロ、またはヒドロキシによって置換されてお
り、ここで、アリールはすぐ上に定義された通りであ
り、モノ及びジ置換されていてもよく、置換基は、それ
ぞれ独立にC1−6アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、
C1−6アルキルアミノ、C1−6アルコキシ、C1−
6アルキルチオ、およびC1−6アルキルカルボニルで
ある。〕(5)C1−6アルキルアミノカルボニルC1
−6アルキル、またはC1−6アルキルカルボニルアミ
ノC1−6アルキル、(6)アリールアミノカルボニル
C1−6アルキル、またはアリールカルボニルアミノC
1−6アルキル、〔ここで、アリールはすぐ上に定義さ
れた通りであり、モノ及びジ置換されていてもよく、置
換基は、それぞれ独立にC1−6アルキル、ハロ、ヒド
ロキシ、C1−6アルキルアミノ、C1−6アルコキ
シ、C1−6アルキルチオ、およびC1−6アルキルカ
ルボニルである。〕(7)アリールC1−6アルキルア
ミノカルボニルC1−6アルキル、またはアリールC1
−6アルキルカルボニルアミノC1−6アルキル、〔こ
こで、アリールはすぐ上に定義された通りであり、モノ
及びジ置換されていてもよく、置換基は、それぞれ独立
にC1−6アルキル、ハロ、ヒドロキシ、C1−6アル
キルアミノ、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチ
オ、およびC1−6アルキルカルボニルである。〕から
なるグループから選択され、AA1が独立に、(a)単
結合、および(b)式AIのアミノ酸 【化4】 からなるグループから選択され、ここで、R7が、
(a)水素、(b)置換したC1−10アルキル〔ここ
で、置換基は、(1)水素、(2)ヒドロキシ、(3)
ハロゲン、(4)−S−C1−4アルキル、(5)スリ
フヒドリル、(6)ホルミル、(7)アミノ、(8)オ
キシラニル、(9)C1−6アルキルカルボニル、(1
0)カルボキシ(11) 【化5】 (12)アミノカルボニルアミノ、(13)C1−4−
アルキルアミノ〔ここで、アルキル部分は水素またはヒ
ドロキシで置換されており、アミノは水素またはCBZ
で置換されている。〕(14)グアニジノから選択され
る。〕、および(c)アリールC1−6アルキル〔ここ
で、アリールはすぐ上に定義された通りであり、これは
モノ及びジ置換されていてもよく、置換基は、それぞれ
独立にC1−6アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミ
ノ、チオール、カルボキシ、ホルミル、オキシラニルア
ミノC1−6アルキル、ホルミルC1−6アルキル、オ
キシラニルC1−6アルキル、チオールC1−6アルキ
ル、カルボキシC1−6アルキル、ヒドロキシC1−6
アルキル、およびハロゲンC1−6アルキルである。〕
からなるグループから選択され、AA2は独立に、
(a)単結合、および(b)式AII 【化6】 のアミノ酸から成るグループから選択され、AA3は独
立に、(a)単結合、および(b)式AIII 【化7】 から成るグループから選択され、ここで、R8およびR
9は独立に、(a)水素、(b)置換したC1−10ア
ルキル〔ここで、置換基は、(1)水素、(2)ヒドロ
キシ、(3)ハロ、(4)−S−C1−4アルキル、
(5)スリフヒドリル、(6)C1−6アルキルカルボ
ニル、(7)カルボキシ、(8) 【化8】 (9)アミノカルボニルアミノ、(10)C1−4アル
キルアミノ、〔ここで、アルキル部分は水素またはヒド
ロキシで置換されており、アミノは水素またはCBZで
置換されている。〕(11)グアニジノ、(12)ホル
ミル、(13)オキシラニル、および(14)アミノか
ら選択される。〕(c)アリールC1−6アルキル、
〔ここで、アリールはすぐ上に定義された通りであり、
モノ及びジ置換されていてもよく、置換基は、それぞれ
独立にC1−6アルキル、ヒドロキシ、アミノ、ホルミ
ル、チオール、オキシラニル、カルボキシ、アミノC1
−6アルキル、ホルミルC1−6アルキル、オキシラニ
ルC1−6アルキル、チオールC1−6アルキル、カル
ボキシC1−6アルキル、ヒドロキシC1−6アルキ
ル、およびハロゲンC1−6アルキルである。〕からな
るグループから選択されている前記方法。 - 【請求項2】 R1が、(a)置換したC1−6アルキ
ル〔ここで、置換基は、(1)水素、(2)ヒドロキ
シ、(3)クロロまたはフルオロから選択される。〕、
および(b)アリールC1−6アルキル、〔ここで、ア
リール基は、(1)フェニル、(2)ナフチル、(3)
ピリジル、(4)フリル、(5)チエニル、(6)チア
ゾリル、(7)イソチアゾリル、(8)ベンゾフリル、
(9)ベンゾチエニル、(10)インドリル、(11)
イソオキサゾリル、および(12)オキサゾリル、並び
に、モノおよびジ置換の、上記(1)項より(12)項
に定義されたC6−10アリールからなるグループから
選択され、ここで、置換基はそれぞれ独立にC1−4ア
ルキル、ハロゲン、およびヒドロキシである。〕であ
り、R2が水素であり、AA1が式AI 【化9】 のアミノ酸であり、ここで、R7がアリールC1−6ア
ルキルであり、ここで、アリールはすぐ上に定義された
通りであり、モノ及びジ置換されていてもよく、置換基
は、それぞれ独立にC1−6アルキル、ハロゲン、ヒド
ロキシ、アミノC1−6アルキル、ヒドロキシC1−6
アルキル、チオC1−6アルキル、およびホルミルC1
−6アルキルであり、AA2が式AII 【化10】 のアミノ酸であり、AA3が式AIII 【化11】 のアミノ酸であり、ここで、R8およびR9がそれぞれ
独立に、(a)水素、(b)置換したC1−10アルキ
ル〔ここで、置換基は、(1)水素、(2)ヒドロキ
シ、(3)ハロゲン、(4)スリフヒドリル、(6)C
1−6アルキルカルボニル、(7)カルボキシ、(8)
ホルミル、(9)オキシラニル、(10)アミノ、から
選択される。〕(c)アリールC1−6アルキル、〔こ
こで、アリールはすぐ上に定義された通りであり、これ
はモノ及びジ置換されていてもよく、置換基は、それぞ
れ独立にC1−6アルキル、ヒドロキシ、アミノ、ホル
ミル、チオール、オキシラニル、カルボキシ、アミノC
1−6アルキル、ホルミルC1−6アルキル、オキシラ
ニルC1−6アルキル、チオールC1−6アルキル、カ
ルボキシC1−6アルキル、ヒドロキシC1−6アルキ
ル、およびハロゲンC1−6アルキルである。〕からな
るグループから選択されることを特徴とする請求項1に
記載の方法。 - 【請求項3】 R1がC1−3アルキルであり、R2が
水素であり、R8およびR9が、それぞれ(a)水素、
(b)C1−6アルキル、(c)メルカプトC1−6ア
ルキル、(d)ヒドロキシC1−6アルキル、(e)カ
ルボキシC1−6アルキル、(f)アミノC1−6アル
キル、(h)ホルミルC1−6アルキル、(h)オキシ
ラニルC1−6アルキル、(i)アリールC1−6アル
キル〔ここで、アリール基は、フェニルとインドリルか
ら選択され、ヒドロキシ、C1−3アルキル、アミノで
置換されてもよく、またはカルボキシ、ホルミル、オキ
シラニル、チオール、ヒドロキシC1−6アルキル、ア
ミノC1−6アルキル、カルボキシC1−6アルキル、
ホルミルC1−6アルキル、オキシラニルC1−6アル
キル、チオールC1−6アルキル、およびハロゲンC1
−6アルキルで置換されてもよい。〕であることを特徴
とする請求項2に記載の方法。 - 【請求項4】 R1がメチルであり、R2が水素であ
り、R8がC1−6アルキルであり、R9が置換したC
1−6アルキルであり、置換基は、(a)H(b)O
H、(c)CO2H、(d)NH2、(e)ホルミル、
(f)オキシラニル、(g)ハロゲン、(h)チオー
ル、(i)置換したフェニルC1−6アルキル〔ここ
で、置換基はヒドロキシ、アミノ、またはカルボキシ、
ホルミル、オキシラニル、チオール、ヒドロキシC1−
6アルキル、アミノC1−6アルキル、カルボキシC1
−6アルキル、ホルミルC1−6アルキル、オキシラニ
ルC1−6アルキル、チオールC1−6アルキル、ハロ
ゲンC1−6アルキルである。〕であることを特徴とす
る請求項3に記載の方法。 - 【請求項5】 式Iの化合物がN−(N−アセチル−チ
ロシニル−バリニル−リシニル)−3−アミノ−4−オ
キソブタン酸であることを特徴とする請求項4に記載の
方法。 - 【請求項6】 インターロイキン1β変換酵素の精製用
アフィニティークロマトグラフィーマトリックスであっ
て、式I 【化12】 の化合物を含み、Yは、 【化13】 であり、R1は、(a)置換したC1−12アルキル
〔ここで、置換基は、(1)水素、(2)ヒドロキシ、
(3)ハロゲン、(4)C1−6アルキルカルボニル、
(5)ホルミル、(6)アミノ、(7)カルボキシ、
(8)チオール、および(9)オキシラニルから選択さ
れる。〕(b)アリールC1−6アルキル〔ここで、ア
リール基は、(1)フェニル、(2)ナフチル、(3)
ピリジル、(4)フリル、(5)チエニル、(6)チア
ゾリル、(7)イソチアゾリル、(8)イミダゾリル、
(9)ベンズイミダゾリル、(10)ピラジニル、(1
1)ピリミジル、(12)キノリル、(13)イソキノ
リル、(14)ベンゾフリル、(15)ベンゾチエニ
ル、(16)ピラゾリル、(17)インドリル、(1
8)プリニル、(19)イソキサゾリル、および(2
0)オキサゾリル、並びに、モノ及びジ置換の、上記
(1)項より(20)項に定義したアリールからなるグ
ループから選択され、ここで、置換基はそれぞれ独立に
C1−6アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノC1
−6アルキル、チオC1−6アルキル、ホルミルC1−
6アルキル、およびヒドロキシC1−6アルキルであ
る。〕であり、R2は、(a)H、(b) 【化14】 であり、ここで、R4とR5は水素、弗素およびヒドロ
キシからそれぞれに独立に選択され、R6は、(1)水
素、(2)弗素、(3)置換したC1−6アルキル〔こ
こで、置換基は、(a)水素、(b)ヒドロキシ、
(c)ハロ、(d)C1−6アルキルカルボニルから選
択される。〕(4)アリールC1−6アルキル、〔ここ
で、アルキルは水素、オキソ、C1−3アルキル、ハロ
またはヒドロキシで置換され、ここで、アリールはすぐ
上に定義された通りであり、モノ及びジ置換されていて
もよく、置換基は、それぞれ独立にC1−6アルキル、
ハロゲン、ヒドロキシ、C1−6アルキルアミノ、C1
−6アルコキシ、C1−6アルキルチオ、およびC1−
6アルキルカルボニルである。〕(5)C1−6アルキ
ルアミノカルボニルC1−6アルキルまたはC1−6ア
ルキルカルボニルアミノC1−6アルキル、(6)アリ
ールアミノカルボニルC1−6アルキルまたはアリール
カルボニルアミノC1−6アルキル、〔ここで、アリー
ルはすぐ上に定義された通りであり、モノ及びジ置換基
されていてもよく、置換基は、それぞれ独立にC1−6
アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、C1−6アルキルア
ミノ、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオ、お
よびC1−6アルキルカルボニルである。〕(7)アリ
ールC1−6アルキルアミノカルボニルC1−6アルキ
ル、またはアリールC1−6アルキルカルボニルアミノ
C1−6アルキル〔ここで、アリールはすぐ上に定義さ
れた通りであり、モノ及びジ置換されていてもよく、置
換基は、それぞれ独立にC1−6アルキル、ハロゲン、
ヒドロキシ、C1−6アルキルアミノ、C1−6アルコ
キシ、C1−6アルキルチオ、およびC1−6アルキル
カルボニルである。〕からなるグループから選択され、
AA1は独立に、(a)単結合、および(b)式AI 【化15】 のアミノ酸から選択され、ここで、R7は、(a)水
素、(b)置換したC1−10アルキル〔ここで、置換
基は下記の物質から選択され、(1)水素、(2)ヒド
ロキシ、(3)ハロゲン、(4)−S−C1−4アルキ
ル、(5)スリフヒドリル、(6)ホルミル、(7)ア
ミノ、(8)オキシラニル、(9)C1−6アルキルカ
ルボニル、(10)カルボキシ(11) 【化16】 (12)アミノカルボニルアミノ、(13)C1−4ア
ルキルアミノ、〔ここで、アルキル部分は水素またはヒ
ドロキシで置換されており、アミノは水素またはCBZ
で置換されている。〕(14)グアニジノから選択され
る。〕、および(c)アリールC1−6アルキル〔ここ
で、アリールはすぐ上に定義された通りであり、モノ及
びジ置換されていてもよく、置換基は、それぞれ独立に
C1−6アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、チ
オール、カルボキシ、ホルミル、オキシラニルアミノC
1−6アルキル、ホルミルC1−6アルキル、オキシラ
ニルC1−6アルキル、チオールC1−6アルキル、カ
ルボキシC1−6アルキル、ヒドロキシC1−6アルキ
ル、およびハロC1−6アルキルである。〕からなるグ
ループから選択され、AA2は独立に、(a)単結合、
および(b)式AII 【化17】 のアミノ酸から成るグループから選択され、AA3は独
立に、(a)単結合、および(b)式AIII 【化18】 のアミノ酸から成るグループから選択され、ここで、R
8とR9はそれぞれ、(a)水素、(b)置換したC1
−10アルキル〔ここで、置換基は、(1)水素、
(2)ヒドロキシ、(3)ハロゲン、(4)−S−C1
−4アルキル、(5)スリフヒドリル、(6)C1−6
アルキルカルボニル、(7)カルボキシ、(8) 【化19】 (9)アミノカルボニルアミノ、(10)C1−4アル
キルアミノ、〔ここで、アルキル部分は水素またはヒド
ロキシで置換されており、アミノは水素またはCBZで
置換されている。〕(11)グアニジノ、(12)ホル
ミル、(13)オキシラニル、および(14)アミノか
ら選択される。〕(c)アリールC1−6アルキル、
〔ここで、アリールはすぐ上に定義された通りであり、
モノ及びジ置換されていてもよく、置換基は、それぞれ
独立にC1−6アルキル、ヒドロキシ、アミノ、ホルミ
ル、チオール、オキシラニル、カルボキシ、アミノC1
−6アルキル、ホルミルC1−6アルキル、オキシラニ
ルC1−6アルキル、チオールC1−6アルキル、カル
ボキシC1−6アルキル、ヒドロキシC1−6アルキ
ル、およびハロC1−6アルキルである。〕からなるグ
ループから選択される前記マトリックス。 - 【請求項7】 R1が、(a)置換したC1−6アルキ
ル〔ここで、置換基は、(1)水素、(2)ヒドロキ
シ、(3)クロロまたはフルオロから選択される。〕、
および(b)アリールC1−6アルキル〔ここで、アリ
ール基は、(1)フェニル、(2)ナフチル、(3)ピ
リジル、(4)フリル、(5)チエニル、(6)チアゾ
リル、(7)イソチアゾリル、(8)ベンゾフリル、
(9)ベンゾチエニル、(10)インドリル、(11)
イソキサゾリル、および(12)オキサゾリル、並び
に、モノ及びジ−置換の、上記(1)項より(12)項
に定義されたC6−10アリールからなるグループから
選択され、ここで、置換基は独立にC1−4アルキル、
ハロゲン及びヒドロキシである。〕であり、R2が水素
であり、AA1が式AI 【化20】 のアミノ酸であり、ここで、R7はアリールC1−6ア
ルキルであり、ここで、アリールはすぐ上に定義された
通りであり、モノ及びジ置換されていてもよく、置換基
は、それぞれ独立にC1−6アルキル、ハロゲン、ヒド
ロキシ、C1−6アルキルアミノ、C1−6アルコキ
シ、C1−6アルキルチオ、およびC1−6アルキルカ
ルボニルであり、AA2が式AII 【化21】 のアミノ酸であり、AA3が式AIII 【化22】 のアミノ酸であり、ここで、R8とR9が独立に、
(a)水素、(b)置換したC1−10アルキル〔ここ
で、置換基は、(1)水素、(2)ヒドロキシ、(3)
ハロゲン、(4)スリフヒドリル、(6)C1−6アル
キルカルボニル、(7)カルボキシ、(8)ホルミル、
(9)オキシラニル、(10)アミノから選択され
る。〕(c)アリールC1−6アルキル〔ここで、アリ
ールはすぐ上に定義された通りであり、モノ及びジ置換
されていてもよく、置換基は、それぞれ独立にC1−6
アルキル、ヒドロキシ、アミノ、ホルミル、チオール、
オキシラニル、カルボキシ、アミノC1−6アルキル、
ホルミルC1−6アルキル、オキシラニルC1−6アル
キル、チオールC1−6アルキル、カルボキシC1−6
アルキル、ヒドロキシC1−6アルキル、およびハロC
1−6アルキルである。〕からなるグループから選択さ
れることを特徴とする請求項6に記載のインターロイキ
ン1β変換酵素精製用アフィニティークロマトグラフィ
ーマトリックス。 - 【請求項8】 R1がC1−3アルキルであり、R2が
水素であり、R8とR9の各々が、(a)水素、(b)
C1−6アルキル、(c)メルカプトC1−6アルキ
ル、(d)ヒドロキシC1−6アルキル、(e)カルボ
キシC1−6アルキル、(f)アミノC1−6アルキ
ル、(g)ホルミルC1−6アルキル、(h)オキシラ
ニルC1−6アルキル、(i)アリールC1−6アルキ
ル〔ここで、アリール基はフェニルとインドリルから選
択され、さらにヒドロキシ、C1−3アルキル、アミ
ノ、またはカルボキシ、ホルミル、オキシラニル、チオ
ール、ヒドロキシC1−6アルキル、アミノC1−6ア
ルキル、カルボキシC1−6アルキル、ホルミルC1−
6アルキル、オキシラニルC1−6アルキル、チオール
C1−6アルキル、およびハロC1−6アルキルで置換
されてもよい。〕からなるグループから選択されること
を特徴とする請求項7に記載のインターロイキン1β変
換酵素精製用アフィニティークロマトグラフィーマトリ
ックス。 - 【請求項9】 R1がメチルであり、R2が水素であ
り、R8がC1−6アルキルであり、R9が置換したC
1−6アルキルであり、置換基は、(a)H(b)O
H、(c)CO2H、(d)NH2、(e)ホルミル、
(f)オキシラニル、(g)ハロゲン、(h)チオー
ル、(i)置換したフェニルC1−6アルキル〔置換基
はヒドロキシ、アミノ、またはカルボキシ、ホルミル、
オキシラニル、チオール、ヒドロキシC1−6アルキ
ル、アミノC1−6アルキル、カルボキシC1−6アル
キル、ホルミルC1−6アルキル、オキシラニルC1−
6アルキル、チオールC1−6アルキル、ハロゲンC1
−6アルキルである。〕であることを特徴とする請求項
8に記載のインターロイキン1β変換酵素精製用アフィ
ニティークロマトグラフィーマトリックス。 - 【請求項10】 前記式Iの化合物がN−(N−アセチ
ル−チロシニル−バリニル−リシニル)−3−アミノ−
4−オキソブタン酸であることを特徴とする請求項8に
記載のインターロイキン1β変換酵素精製用アフィニテ
ィークロマトグラフィーマトリックス。 - 【請求項11】 更にスペーサを含み、前記スペーサ
が、R1、R7、R8、またはR9で前記式Iの化合物
に共有結合していることを特徴とする請求項6に記載の
インターロイキン1β変換酵素精製用アフィニティーク
ロマトグラフィーマトリックス。 - 【請求項12】 前記スペーサがR7またはR9で前記
式Iの化合物に共有結合していることを特徴とする請求
項11に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリ
ックス。 - 【請求項13】 R1が、(a)置換したC1−6アル
キル〔ここで、置換基は、(1)水素、(2)ヒドロキ
シ、(3)クロロまたはフルオロから選択される。〕、
および(b)アリールC1−6アルキル〔ここで、アリ
ール基は、(1)フェニル、(2)ナフチル、(3)ピ
リジル、(4)フリル、(5)チエニル、(6)チアゾ
リル、(7)イソチアゾリル、(8)ベンゾフリル、
(9)ベンゾチエニル、(10)インドリル、(11)
イソオキサゾリル、および(12)オキサゾリル、並び
に、モノ及びジ−置換の、上記(1)項から(12)項
に定義されたC6−10アリールからなるグループから
選択され、置換基は独立にC1−4アルキル、ハロゲ
ン、およびヒドロキシである。〕であり、R2が水素で
あり、AA1が式AI 【化23】 のアミノ酸であり、ここで、R7はアリールC1−6ア
ルキルであり、アリールはすぐ上に定義された通りであ
り、モノ及びジ置換されていてもよく、置換基は、それ
ぞれ独立にC1−6アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、
C1−6アルキルアミノ、C1−6アルコキシ、C1−
6アルキルチオ、およびC1−6アルキルカルボニルで
あり、AA2が式AII 【化24】 のアミノ酸であり、AA3が式AIII 【化25】 のアミノ酸であり、ここで、R8とR9が独立に、
(a)水素、(b)置換したC1−10アルキル〔ここ
で、置換基は、(1)水素、(2)ヒドロキシ、(3)
ハロゲン、(4)スリフヒドリル、(6)C1−6アル
キルカルボニル、(7)カルボキシ、(8)ホルミル、
(9)オキシラニル、(10)アミノから選択され
る。〕、(c)アリールC1−6アルキル〔ここで、ア
リールはすぐが上に定義された通りであり、モノ及びジ
置換されていてもよく、置換基は、それぞれ独立にC1
−6アルキル、ヒドロキシ、アミノ、ホルミル、チオー
ル、オキシラニル、カルボキシ、アミノC1−6アルキ
ル、ホルミルC1−6アルキル、オキシラニルC1−6
アルキル、チオールC1−6アルキル、カルボキシC1
−6アルキル、ヒドロキシC1−6アルキル、およびハ
ロC1−6アルキルである。〕からなるグループから選
択されることを特徴とする請求項12に記載のアフィニ
ティークロマトグラフィーマトリックス。 - 【請求項14】 R1がC1−3アルキルであり、R2
が水素であり、R8とR9が独立に、(a)水素、
(b)C1−6アルキル、(c)メルカプトC1−6ア
ルキル(d)ヒドロキシC1−6アルキル、(e)カル
ボキシC1−6アルキル、(g)アミノC1−6アルキ
ル、(1)アリールC1−6アルキル〔ここで、アリー
ル基はフェニルとインドリルから選択され、さらにヒド
ロキシ、C1−3アルキル、アミノ、またはカルボキ
シ、ホルミル、オキシラニル、チオール、ヒドロキシC
1−6アルキル、アミノC1−6アルキル、カルボキシ
C1−6アルキル、ホルミルC1−6アルキル、オキシ
ラニルC1−6アルキル、チオールC1−6アルキル、
およびハロC1−6アルキルによって置換されてもよ
い。〕であることを特徴とする請求項13に記載のアフ
ィニティークロマトグラフィーマトリックス。 - 【請求項15】 R1がメチルであり、R2が水素であ
り、R8がC1−6アルキルであり、R9が置換したC
1−10アルキルであり、ここで、置換基は、(a)
H、(b)OH、(c)CO2H、(d)NH2、(e)
ホルミル、(f)オキシラニル、(g)ハロゲン、
(h)チオール、(i)置換したフェニルC1−6アル
キル〔ここで、置換基はヒドロキシ、アミノ、またはカ
ルボキシ、ホルミル、オキシラニル、チオール、ヒドロ
キシC1−6アルキル、アミノC1−6アルキル、カル
ボキシC1−6アルキル、ホルミルC1−6アルキル、
オキシラニルC1−6アルキル、チオールC1−6アル
キル、ハロC1−6アルキルである。〕であることを特
徴とする請求項14に記載のアフィニティークロマトグ
ラフィーマトリックス。 - 【請求項16】 前記式Iの化合物がN−(N−アセチ
ル−チロシニル−バリニル−リシニル)−3−アミノ−
4−オキソブタン酸であることを特徴とする請求項15
に記載のアフィニティークロマトグラフィーマトリック
ス。
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