JPH05252950A - インターロイキン１β変換酵素精製用アフィニティークロマトグラフィーマトリックス - Google Patents

インターロイキン１β変換酵素精製用アフィニティークロマトグラフィーマトリックス

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JPH05252950A
JPH05252950A JP4218038A JP21803892A JPH05252950A JP H05252950 A JPH05252950 A JP H05252950A JP 4218038 A JP4218038 A JP 4218038A JP 21803892 A JP21803892 A JP 21803892A JP H05252950 A JPH05252950 A JP H05252950A
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ハーブ・ジー・ブル
Kevin T Chapman
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Merck and Co Inc
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 担体（サポート）と官能性スペーサと分離及
び／または精製に必要とされる高度で特異的な親和性を
持つ化合物（リガンド）を含むアフィニティクロマトグ
ラフィーマトリックスの提供。 【構成】 粗細胞溶解物調製物又は不完全に精製された
細胞溶解物調製物からインターロイキン−１β変換酵素
（ＩＣＥ）を精製するのに有用なアフィニティクロマト
グラフィーマトリックス。クロマトグラフィーマトリッ
クスは、二官能性スペーサによりアフィニティカラム担
体に結合された式Ｉの特異的ＩＣＥインヒビターを含
む。 （具体的には例えば 又は

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はアフィニティクロマトグ
ラフィーに関するものである。より詳細に特徴を述べれ
ば、この発明は、担体（サポート）と官能性スペーサと
分離及び／または精製に必要とされる高度で特異的な親
和性を持つ化合物（リガンド）を含むアフィニティクロ
マトグラフィーマトリックスの使用に関するものであ
る。さらに本発明は、活性のあるインターロイキン１β
変換酵素（ＩＣＥ）の精製に役立つアフィニティクロマ
トグラフィーにも関する。
【０００２】
【従来の技術】アフィニティクロマトグラフィーに関す
る論文、モノグラフ及び書籍の文献があり、アフィニテ
ィクロマトグラフィー担体、クロスリンクするメンバ、
リガンドおよびそれらの準備と使用法に関する各種の重
要テーマを包含している。これらの参考文献としては、
下記のようなものがある。
【０００３】アフィニティクロマトグラフィー：一般的
手法。Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９９０，
１８２ （Ｇｕｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉ
ｆ．）， ３５７−７１。
【０００４】親和性に基づく蛋白質精製の新規処理。
Ｊ． Ｆｅｒｍｅｎｔ． Ｂｉｏｅｎｇ． １９９０，
７０（３）， １９９−２０９。
【０００５】ペプチドとタンパク質の分離および精製に
おける高性能液体色相分析の予備適用。 Ｊ． Ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒ． １９８９， ４９２， ４３１−６
９酵素の大規模精製。 Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ． Ｒｅｓ．， Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ． Ｓｙｍ
ｐ． １９８５， １１１（Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｏｒｇ．
Ｓｙｎｔｈ．）， ４０−５６ （Ｅｎｇ）。
【０００６】ヘパリン・セファローズアフィニティクロ
マトグラフィーによる酵素の精製。Ｊ． Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒ． １９８０， １８４（３）， ３３５−４
５。
【０００７】アフィニティクロマトグラフィーによる多
結晶酵素精製の原則。 Ｅｎｚｙｍｅ Ｅｎｇ． １９
７８， ４， ４４１−２。
【０００８】固体支持上の不動低分子量における色相分
析法による酵素および生物学上の実質的タンパク質の精
製。 Ｐｏｓｔｅｐｙ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９７７，
２３（１）， １１３ ２７。
【０００９】酵素精製における一般リガンドアフィニテ
ィクロマトグラフィー。リガンド、アフィニティクロマ
トグラフィー、酵素精製。 Ｊ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ．
Ｓｃｉ． Ｃｈｅｍ． １９７６， Ａ１０（１−
２）， １５−５２。
【００１０】酵素の親和性精製。 Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃ
ｈｎｏｌ． １９７５， ５（９）， ５６４−７１。
【００１１】色相分析法、親和性。 Ｅｎｃｙｃｌ．
Ｐｏｌｙｍ． Ｓｃｉ． Ｅｎｇ．１９８５， ３，
５３１−４８。
【００１２】生物親和性色相分析法。 Ｐｒａｃｔ．
Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍ． Ｌｉｑ． Ｃｈｒｏｍａ
ｔｏｇｒ． １９７６， １９３−２０６。
【００１３】プラズマ蛋白質のアフィニティクロマトグ
ラフィー−その概要。 Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ． Ｗｏｒｋ
ｓｈｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅ
ｐ．Ｉｍｐｒｏｖ． 血液プラズマ分別。１９７７，
４２２−３５。
【００１４】酵素のアフィニティクロマトグラフィー。
Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｐｒｏ
ｃ． Ｉｎｔ． Ｓｙｍｐ． １９７７ （Ｐｕｂ．
１９７８）， ２５−３８。
【００１５】蛋白質の固定化とアフィニティクロマトグ
ラフィー。 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｚｙｍｅｓ， Ｐａｐ． Ｃｏｎ
ｆ．１９７６ （Ｐｕｂ． １９７７）， ８３−１０
２。
【００１６】蛋白質構造研究におけるアフィニティクロ
マトグラフィーの使用。 Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｃ． Ｅ
ｕｒ． Ｐｅｐｔ． Ｓｙｍｐ． １１ｔｈ １９７１
（Ｐｕｂ． １９７３）， ２０３−２２。
【００１７】酵素のアフィニティクロマトグラフィー。
Ｆｅｄ． Ｅｕｒ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．
Ｍｅｅｔ． ［Ｐｒｏｃ］ １９７４， ３０。
【００１８】酵素固定用支持物質およびアフィニティク
ロマトグラフィー。ＢｏｎｄｅｄＳｔａｔｉｏｎａｒｙ
Ｐｈａｓｅｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． １９７４，
９３−１１２。
【００１９】酵素固定用支持およびアフィニティクロマ
トグラフィー。 Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈｎｏｌ． １９
７４， ４（１１）， ６９４−７００。
【００２０】アフィニティクロマトグラフィー。酵素阻
害剤。 Ｍｅｔｈｏｄｏｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ． １９７３， ２， １０９−１２。
【００２１】アフィニティクロマトグラフィー。蛋白質
の特殊分離。Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ １９７
１ ４（１２）， ５７８−８７。
【００２２】アフィニティクロマトグラフィー。その実
際的アプローチ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅ
ｄ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ （１９８５）
および酵素学の手法、Ｖｏｌ． ３４： 親和性技術の
酵素精製： １９７４． ８１０ｐｐ。
【００２３】種々のアフィニティクロマトグラフィーサ
ポート（スペーサつきとスペーサなし）はＳＩＧＭＡの
カタログに公表されている。ＳＩＧＭＡ ＣＨＥＭＩＣ
ＡＬＣｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ。
【００２４】インターロイキン１β変換酵素（ＩＣＥ）
は、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）前駆体を生物
学的に活性のＩＬ−１βに変換するのに関わる酵素とし
て認識されている。したがってインターロイキン１β変
換酵素は、ＩＬ−１が関係する病気の診断またはＩＬ−
１の製造を増強する上で有用である。
【００２５】哺乳類のインターロイキン１（ＩＬ−１）
は、炎症性反応の一部として細胞の種類によって分泌さ
れる免疫調整蛋白質である。ＩＬ−１の製造に関わる第
一の細胞の種類は、末梢血液単核細胞である。その他の
細胞の種類についてもＩＬ−１またはＩＬ−１様分子の
リリースや含有について述べられている。これらには下
記に示す各種の細胞が含まれている。上皮細胞 （Ｌｕ
ｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｎｏｌ． １
２７：１４９３−１４９８（１９８１）， Ｌｅｅｔ
ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８： ２５２
０−２５２６（１９８７） ａｎｄ Ｌｏｖｅｔｔ
ａｎｄ Ｌａｒｓｅｎ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅ
ｓｔ． ８２： １１５−１２２（１９８８）、結合組
織細胞（Ｏｌｌｉｖｉｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍ
ｍ． １４１： ９０４−９１１（１９８６）， Ｌｅ
ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３８： ２
５２０−２５２６ （１９８７）、神経起源の細胞
（Ｇｉｕｌｉａｎｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｓｐ． Ｍ
ｅｄ． １６４： ９４−６０４（１９８６）、および
白血球 （Ｐｉｓｔｏｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ． １３６： １６８８−１６９２（１９
８６）， Ａｃｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ． ２４： ４７９−４８５（１９８
７）、 Ａｃｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ： Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ． １３８： ２１３２−２１３６（１９８７）
ａｎｄＬｉｎｄｅｎｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ １４０：８３７−８３９（１９８
８）。
【００２６】生物学的に活性のＩＬ−１は、２種類の異
なった形で存在している。その１つは、およそｐＩ５．
２の等電点を持つＩＬ−１αであり、他の１つはおよそ
７．０の等電点を持ち約１７，５００の分子量を持つＩ
Ｌ−１βである。（Ｂａｙｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．
Ｅｓｐ． Ｍｅｄ． １６３： １２６７−１２８０
（１９８６） ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄｔ， Ｊ． Ｅｓ
ｐ． Ｍｅｄ． １６０： ７７２（１９８４）。ポリ
ペプチドは進化的に保存されているように見え、アミノ
酸レベルでおよそ２７−３３％相同性を示している。
（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ． １４： ７８９７−７９１４（１９
８６）。
【００２７】哺乳類のＩＬ−１βは、およそ３１．４
ｋＤａの分子量を持つ細胞関連前駆体ポリペプチドとし
て合成されている。（Ｌｉｍｊｕｃｏ ｅｔ ａｌ．，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ
ＳＡ ８３： ３９７２−３９７６ （１９８６）。前
駆体ＩＬ−１βはＩＬ−１受容体に結合できず生物学的
に不活性である。（Ｍｏｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２： ２９４１−
２９４４（１９８７）。生物学的活性は、前駆体の３
１．５ ｋＤａ形を１７．５ ｋＤａの成熟した形に変
換させる何らかの形式の蛋白質加水分解処理に依存する
ようにみられている。前駆体のＩＬ−１βを成熟したＩ
Ｌ−１βに変換すること阻害することによって、インタ
ーロイキン１の活性を効果的に阻害できるという証拠が
得られている。
【００２８】ＩＬ−１βの製造能力を有する哺乳動物細
胞には、下記に示すものがあるがそれらに制限されるわ
けではない。カラティノサイト、内皮細胞、メサンジア
ル細胞、胸腺上皮細胞、皮膚結合織形成細胞、軟骨細
胞、アストロサイト、神経膠腫細胞、単核喰細胞、顆粒
球、Ｔ及びＢリンパ球およびＮＫ細胞。
【００２９】Ｊ． Ｊ． オッペンハイム、その他の著
書・現代免疫学、 ｖｏｌ． ７（２）：４５−５６
（１９８６）に述べられているように、インターロイキ
ン１の活性は多岐にわたっている。これは、軟骨マトリ
ックスの分解を促進する因子であるカタボリンが、ＩＬ
−１の胸腺細胞コミトジェニックの活性も示し、軟骨細
胞を刺激してコラゲナーゼ中性プロテアーゼおよびプラ
スミノーゲンアクチベーターを放出させることも観察さ
れている。さらに蛋白質分解誘導因子と呼ばれる血漿因
子がプロスタグラジンを製造するために筋肉細胞を刺激
し、このプロスタグラジンが順に蛋白質加水分解を導き
アミノ酸を放出するとともに、これが長期にわたって実
行されると筋肉が衰弱し、熱誘導、急性反応、および胸
腺細胞コミトジェニック活性を持つＩＬ−１の断片を示
すようになる。
【００３０】ＩＬ−１は炎症と傷の治癒に関連する細胞
に対して複数の効果を持っている。ＩＬ−１の皮下注射
は、好中性のマージネイションを導くとともに多形核白
血球（ＰＭＮ）の白血球の血管外浸潤を最大にする。イ
ンビトロ研究によれば、ＩＬ−１が、グルコースの新陳
代謝を高速化しニトロブルーテトラゾリウムを減少さ
せ、リソゾマール酵素を放出させるためにＰＭＮを活性
化するＰＭＮの走化性吸引物となることが明らかになっ
ている。内皮細胞は、トロンボキサンを製造するためと
粘着性を強めるため、さらには凝固促進活性を解放する
ために、ＩＬ−１によって増殖を刺激される。ＩＬ−１
はまた表皮細胞によってＩＶ型コラーゲンの製造を増強
させ、骨芽細胞増殖およびアルカリのホスファターゼの
製造を誘発し、破骨細胞を刺激して骨を再吸収する。マ
クロファージはＩＬ−１に走化的に吸引され、ＩＬ−１
に対する反応としてプロスタグランジンを製造し、より
延長された活性の腫瘍状態を示すことが報告されてい
る。
【００３１】ＩＬ−１はまた組織形態学（サバチーニ、
Ｍ． 他著 ＰＮＡＳ ８５：５２３５−５２３９，
１９８８）によって明らかにされているように、ネズ
ミに注射することによりハイパーカリーミアを引き起こ
す有力な骨の再吸収剤であり、骨再吸収面を増大させ
る。
【００３２】したがって、ＩＬ−１は、下記に列記する
疾病に関連を持っている。随膜炎や卵管炎など、体内の
どこかに存在する感染性の疾病。敗血症、多発内部血管
凝結、あるいは成人性呼吸困難症を含む感染症の余病。
抗原または抗体あるいは補体沈澱物による急性あるいは
慢性の炎症。関節炎、コランジティス、大腸炎、脳炎、
心内膜炎、糸球体腎炎、肝炎、心筋炎、膵臓炎、心膜
炎、再潅流傷害および動脈炎を含む炎症状態。これらに
は式ＩのＩＣＥインヒビタによる可能性のある免疫ベー
スの疾病が含まれるが、これには急性および遅延性過敏
症、植皮拒否症、拒絶反応などのＴ細胞あるいはマクロ
ファージの関わる状態に制限されない。Ｉ型糖尿病およ
び多発性硬化症を含む自己免疫性疾病。ＩＬ−１はまた
細胞外のマトリックスにおける過剰沈澱をもたらす疾病
はもちろんのこと、骨および軟骨再吸収の処置において
も関連がある。これらの疾病には、歯周病、肺隙間繊維
症、硬変症、体系的硬化症、およびケロイド形成なども
含まれている。
【００３３】
【発明の要約】アフィニティクロマトグラフィーマトリ
ックスは、原液または不完全に精製された細胞の溶解調
製物からインターロイキン１β変換酵素（ＩＣＥ）を精
製することに役立つことが公表されている。このクロマ
トグラフィーマトリックスは、二重機能型スペーサによ
ってサポートする親和カラムに付着する式Ｉの特殊ＩＣ
Ｅインヒビタによって構成されている。
【００３４】
【化２６】
【００３５】
【発明の説明】本発明を具体例の１つは、下記事項より
構成されたアフィニティクロマトグラフィーマトリック
スを含む。
【００３６】（ａ）式Ｉの化合物
【００３７】
【化２７】
【００３８】ここでＹは次の通り：
【００３９】
【化２８】
【００４０】（ｂ）アフィニティークロマトグラフィー
の支持体（担体）； および（ｃ）前述の式Ｉの化合物
および前述の支持体に結合するスペーサ・コヴァレント
リ（共有結合性スペーサー）；前述の式Ｉの化合物は下
記のように定義されている。
【００４１】Ｒ1は（ａ）置換されたＣ1-12アルキル、
ここで置換基は下記の物質から選択される。
【００４２】（１）水素、（２）ヒドロキシ、（３）ハ
ロゲン、（４）Ｃ1-6アルキルカルボニル、（５）ホル
ミル、（６）アミノ、（７）カルボキシ、（８）チオー
ル、および（９）オキシラニール；（ｂ）アリール Ｃ
1-6アルキル、ここでアリール基は下記の物質によって
構成されるグループから選択される：（１）フェニル、
（２）ナフチル、（３）ピリジル、（４）フリル、
（５）ティエニル、（６）ティアゾリル、（７）イソテ
ィアゾニル、（８）イミダゾリル、（９）ベンズイミダ
ゾリール、（１０）ピラジニル、（１１）ピリミディ
ル、（１２）キノリル、（１３）イソキノリル、（１
４）ベンゾフリル、（１５）ベンゾティエニル、（１
６）ピラゾリル、（１７）インドリル、（１８）ピュリ
ニル、（１９）イソキサゾリル、および（２０）オキサ
ゾリル、さらにモノおよびジ置換アリールは、上記
（１）項より（２０）項に定義された通りであり、置換
基はそれぞれ独立にＣ1-6アルキル、ハロゲン、ヒドロ
キシ、アミノＣ1-6アルキル、チオＣ1-6アルキル、ホル
ミルＣ1-6アルキル、およびヒドロキシＣ1-6アルキルで
ある。
【００４３】Ｒ２は次の通り。
【００４４】（ａ）Ｈ、（ｂ）
【００４５】
【化２９】
【００４６】ここで、Ｒ4およびＲ5は、水素、弗素およ
びヒドロキシからそれぞれに個別に選択される。
【００４７】Ｒ6は下記の物質によって構成されるグル
ープから選択される。
【００４８】（１）水素、（２）弗素、（３）置換した
Ｃ1-6アルキル ここで置換基は下記の物質から選択される。
【００４９】（ａ）水素、（ｂ）ヒドロキシ、（ｃ）ハ
ロゲン、（ｄ）Ｃ1-6アルキルカルボニル、（４）アリ
ールＣ1-6アルキル ここで、アルキルは、水素、ＯＸＯ、Ｃ1-3アルキル、
ハロゲン、またはヒドロキシと置換される。
【００５０】アリールは上に定義された通りで、これは
モノまたはジ置換であってもよい。置換基は、それぞれ
独立にＣ1-6アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ1-6ア
ルキル・アミノ、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチ
オ、およびＣ1-6アルキルカルボニルである。
【００５１】（５）Ｃ1-6アルキルアミノカルボニル、
Ｃ1-6アルキル、またはＣ1-6アルキルカルボニルアミ
ノ、Ｃ1-6アルキル、（６）アリールアミノカルボニ
ル、Ｃ1-6アルキル、またはアリールカルボニルアミ
ノ、Ｃ1-6アルキル、ここで、アリールは上に定義され
た通りであり、アリールはモノまたはジ置換であっても
よい。置換基は、それぞれ独立にＣ1-6アルキル、ハロ
ゲン、ヒドロキシ、Ｃ1-6アルキルアミノ、Ｃ1-6アルコ
キシ、Ｃ1-6アルキルチオ、およびＣ1-6アルキルカボニ
ルである。
【００５２】（７）アリール、Ｃ1-6アルキルアミノカ
ルボニル、Ｃ1-6アルキル、またはアリールＣ1-6アルキ
ルカルボニルアミノ、Ｃ1-6アルキル、ここで、アリー
ルは上に定義された通りであり、これはモノまたはジ置
換であってもよい。置換基は、それぞれ独立にＣ1-6ア
ルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ1-6アルキルアミ
ノ、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、およびＣ
1-6アルキルカルボニルである。
【００５３】ＡＡ1は下記の物質によって構成されるグ
ループから独立して選択される： （ａ）単結合、および （ｂ）式ＡＩのアミノ酸
【００５４】
【化３０】
【００５５】ここで、Ｒ７は下記の物質によって構成さ
れるグループから選択される：（ａ）水素、（ｂ）置換
したＣ1-10アルキル；ここで、置換基は下記の物質から
選択される：（１）水素、（２）ヒドロキシ、（３）ハ
ロゲン、（４）−Ｓ−Ｃ1-4アルキル、（５）ＳＨ、
（６）ホルミル、（７）アミノ、（８）オキシラニル、
（９）Ｃ1-6アルキルカルボニル、（１０）カルボキシ
（１１）
【００５６】
【化３１】
【００５７】（１２）アミノカルボニルアミノ、（１
３）Ｃ1-4アルキルアミノ、ここで、アルキル部は水素
またはヒドロキシで置換されており、そしてアミノは水
素またはＣＢＺで置換されている。
【００５８】（１４）グアニジノ、および（ｃ）アリー
ルＣ1-6アルキル、ここで、アリールは上に定義された
通りであり、これはモノまたはジ置換であってもよい。
置換基は、それぞれ独立にＣ1-6アルキル、ハロゲン、
ヒドロキシ、アミノ、チオール、カルボキシ、ホルミ
ル、オキシラニルアミノＣ1-6アルキル、ホルミルＣ1-6
アルキル、オキシラニルＣ1-6アルキル、チオールＣ1-6
アルキル、カーボキシＣ1-6アルキル、ヒドロキシＣ1-6
アルキル、およびハロＣ1-6アルキルである。
【００５９】ＡＡ2は下記の物質によって構成されるグ
ループから独立して選択される。
【００６０】（ａ）単結合、および （ｂ）式ＡＩＩのアミノ酸
【００６１】
【化３２】
【００６２】ＡＡＡ3は、下記の物質によって構成され
るグループから、それぞれ独立して選択される。
【００６３】（ａ）単結合、または （ｂ）式ＡＩＩＩのアミノ酸
【００６４】
【化３３】
【００６５】ここで、Ｒ8およびＲ9は下記の物質によっ
て構成されるグループからそれぞれ独立して選択され
る。
【００６６】（ａ）水素、（ｂ）置換したＣ1-10アルキ
ル、ここで、置換基は下記の物質から選択される。
【００６７】（１）水素、（２）ヒドロキシ、（３）ハ
ロゲン、ここで置換基は下記の物質から選択される。
【００６８】（４）−Ｓ−Ｃ1-4アルキル、（５）Ｓ
Ｈ、（６）Ｃ1-6アルキルカルボニル、（７）カルボキ
シ、（８）
【００６９】
【化３４】
【００７０】（９）アミノカルボニルアミノ、（１０）
Ｃ1-4アルキルアミノ ここで、アルキル部は水素またはヒドロキシで置換され
ている。そしてアミノは水素またはＣＢＺで置換されて
いる。
【００７１】（１１）グアニジノ、（１２）ホルミル、
（１３）オキシラニル、および（１４）アミノ （ｃ）アリールＣ1-6アルキル、ここで、アリールは上
に定義された通りであり、これはモノまたはジ置換であ
ってもよい。置換基は、それぞれ独立にＣ1-6アルキ
ル、ヒドロキシ、アミノ、ホルミル、チオール、オキシ
ラニル、カルボキシアミノＣ1-6アルキル、ホルミルＣ
1-6アルキル、オキシラニルＣ1-6アルキル、チオールＣ
1-6アルキル、カルボキシＣ1-6アルキル、ヒドロキシＣ
1-6アルキル、およびハロＣ1-6アルキルである。
【００７２】前述のスペーサは、次のように定義されて
いる。
【００７３】（１）単結合、または （２）−Ｘ−Ｚ−Ｙ− ここで、ＸとＹは最初と２番目の反応性、または活性化
できる官能基であり、ＸとＹは、ヒドロキシ、アミノ、
チオール、カルボキシ、オキシラニル、ホルミル、ハロ
ゲン、イソシアネート、およびクロロサルフォニルなど
の基からそれぞれ独立して選択され、Ｚは次のようなグ
ループから選択される。
【００７４】（ａ）Ｃ1-12アルキル、（ｂ）アリール、
（ｃ）Ｃ1-6アルキルアリール、（ｄ）Ｃ1-6アルキルア
リールＣ1-6アルキル ここで、アルキルの１個、２個またはそれ以上の炭素原
子が１つの酸素、硫黄、または窒素と置き換えられるこ
とがあり、アリールにはフェニル、ナフチル、ピリジ
ル、またはティエニルなどが含有され、これら以外のも
のも含有される。さらに （ｅ）２から１０のアミノ酸ペプチド、このアミノ酸
は、下記のアミノ酸のＬ−型およびＤ−型以外のものも
含有される。
【００７５】グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、
イソロイシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、
アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、ヒ
ドロキシ・リシン、ヒスチジン、アルギニン、フェニル
アラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、メ
チオニン、オルニチン、β−アラニン、ホモセリン、ホ
モタイロシン、ホモフェニルアラニンおよびシトルリ
ン。
【００７６】下記に示すスペーサを含むが、これらに限
定されるわけではない。ｐ−ベンゾキノン、ビス−（ジ
アゾベンジジン）３、６−ビス−（水銀メチル）ジオキ
サン、ビスオキシラン、塩化シアヌール酸、ｐ，ｐ’−
ジフルオロ−ｍ，ｍ’−、ジシクロヘキシル・カルボジ
イミド、ジニトロフェニルサルフォン、ジメチルアディ
ピミデート、ジメチルスベルイミデート、ジビニルサル
フォン、Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス（ヨードアセトアミ
ド）、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンビス−（メ
ール・イミド）、ジイソシアン化ヘキサメチレン、Ｎ，
Ｎ’１，３−フェニレン−ビス（メールイミド）、フェ
ノール−２、４塩化ジサルフォニル、テトラ窒化ｏ−ジ
アニシジン、ジイソシアン化トルエン、ウッドワードの
Ｋ試薬、水溶性カルボジイミド、６アミノヘキサン酸、
ヘキサメチレンジアミン、１，７−ジアミノ−４−アザ
−ヘプタン（３，３’−ジアミノ−ジプロピラミン）、
およびアミノ酸またはペプチド。
【００７７】前述のアフィニティクロマトグラフィー支
持体には、グラス、アガロース、ポリアクリルアミン、
デキストランなどが含まれるが、これらに限定されるわ
けではなく、クロスリンクしたデキストラン（セファロ
ーズ）セルロースなどが含まれており、マトレックス・
セルフィン・ホルミル（アミコン）、カルボキシメチル
セルロースのような置換セルロースおよびセルロース炭
酸塩、アルミナ、ヒドロキシアルキルメタクリル酸塩も
含む。前述の支持体を支えるヒドロキシル、カルボキシ
ル、アミン、フェノール、無水物、アルデヒド、エポキ
シド、またはチオールなどの反応性基が含まれている。
ここで、スペーサの１官能基は前述の媒体における前述
の反応性官能基と縮合されており、前述の２番目の反応
性官能基は、前述の式Ｉの化合物と縮合されている。
【００７８】この出願の背景の部分に述べられているよ
うに、これらの支持体とスペーサは当業界の中ではよく
知られているが、その手法はそのスペーサに支持体とリ
ガンドを付着する方法である。その例は、本書に参考文
献として組み込まれているアフィニティクロマトグラフ
ィー、その実際的アプローチ（ＩＲＬ ＰｒｅｓｓＬｔ
ｄ．， Ｏｘｆｏｒｄ Ｅｎｇｌａｎｄ １９８５）を
参照のこと。
【００７９】アフィニティクロマトグラフィー支持体は
マトレックス・セルロース・セルフィンホルミルなどの
ビス・オキシレン被置換セルロースまたはセファロース
ＣＬ−４Ｂなどのクロスリンクしたデクストランなどか
ら構成されるグループから選択される属が最初の具体例
に含まれる。
【００８０】この属の１つのクラスは、式Ｉの化合物で
あり、ここで、Ｒ1は下記のように定義されている。
【００８１】（ａ）置換したＣ1-6アルキル ここで、置換基は下記の物質から選択される。
【００８２】（１）水素、（２）ヒドロキシ、（３）ク
ロロまたはフッ素、および （ｂ）アリールＣ1-6アルキル ここで、アリール・グループは下記の物質によって構成
されるグループから選択される。
【００８３】（１）フェニル、（２）ナフチル、（３）
ピリジル、（４）フリル、（５）ティエニル、（６）テ
ィアゾリル、（７）イソティアゾニル、（８）ベンゾフ
リル、（９）ベンゾティエニル、（１０）インドリル、
（１１）イソオキサゾリル、および（１２）オキサゾリ
ル、さらにモノおよびジ置換のＣ６−１０アリールは、
（１）項から（１２）項の中で上のように定義されてい
る。
【００８４】ここで、置換基はそれぞれ独立にＣ1-4ア
ルキル、ハロゲン、およびヒドロキシである。
【００８５】Ｒ2は水素である。
【００８６】ＡＡ1は下記の物質によって構成されるグ
ループから独立して選択される。
【００８７】（ａ）単結合、および （ｂ）式ＡＩのアミノ酸
【００８８】
【化３５】
【００８９】ここで、Ｒ7はアリールＣ1-6アルキルであ
る。アリールは上に定義された通りであり、これはモノ
またはジ置換であってもよい。置換基は、それぞれ独立
してＣ1-6アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノＣ
1-6アルキル、ヒドロキシＣ1-6アルキル、チオＣ1-6ア
ルキル、およびホルミルＣ1-6アルキルである。
【００９０】ＡＡ2は下記の物質によって構成されるグ
ループから独立して選択される。
【００９１】（ａ）単結合、および （ｂ）式ＡＩＩのアミノ酸
【００９２】
【化３６】
【００９３】ＡＡ3は、下記の物質によって構成される
グループからそれぞれ独立して選択される。
【００９４】（ａ）単結合、および （ｂ）式ＡＩＩＩのアミノ酸
【００９５】
【化３７】
【００９６】ここで、Ｒ8およびＲ9は下記の物質によっ
て構成されるグループからそれぞれ独立して選択され
る。
【００９７】（ａ）水素、（ｂ）置換したＣ1-10アルキ
ルここで、置換基は下記の物質から選択される。
【００９８】（１）水素、（２）ヒドロキシ（３）ハロ
ゲン、（４）ＳＨ、（６）Ｃ1-6アルキルカルボニル、
（７）カルボキシ（８）ホルミル、（９）オキシラニ
ル、（１０）アミノ、（ｃ）アリールＣ1-6アルキル、
ここで、アリールは上に定義された通りであり、これは
モノまたはジ置換であってもよい。置換基は、それぞれ
独立してＣ1-6アルキル、ヒドロキシ、アミノ、ホルミ
ル、チオール、オキシラニル、カルボキシアミノＣ1-6
アルキル、ホルミルＣ1-6アルキル、オキシラニルＣ1-6
アルキル、チオールＣ1-6アルキル、カルボキシＣ1-6ア
ルキル、ヒドロキシＣ1-6アルキル、およびハロＣ1-6ア
ルキルである。
【００９９】このクラスに含まれるものは、ＡＡ１、Ａ
Ａ２、およびＡＡ３が、下記に示す成分を含むＬ−型お
よびＤ−型のアミノ酸で構成されるグループから、それ
ぞれ独立して選択された化合物である。グリシン、アラ
ニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレ
オニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン
酸、グルタミン、リシン、ヒドロキシ・リシン、ヒスチ
ジン、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、トリ
プトファン、システイン、メチオニン、オルニチン、β
−アラニン、ホモセリン、ホモタイロシン、ホモフェニ
ルアラニンおよびシトルリン。
【０１００】二者択一的に言えば、このクラスに含まれ
るものは、化合物のサブクラスである。
【０１０１】ここで、Ｒ1は、Ｃ1-3アルキル、Ｒ2は、
水素、およびＲ8とＲ9は、それぞれ個別に下記のもので
ある。
【０１０２】（ａ）水素、（ｂ）Ｃ1-6アルキル、
（ｃ）メルカプト基を含んだＣ1-10アルキル、（ｄ）ヒ
ドロキシＣ1-10アルキル、（ｅ）カルボキシＣ1-10アル
キル、（ｆ）アミノＣ1-10アルキル、（ｇ）ホルミルＣ
1-10アルキル、（ｈ）オキシラニルＣ1-10アルキル、
（ｉ）アリールＣ1-6アルキル ここで、アリール基は、フェニルおよびインドリールか
ら選択され、さらにアリール基は、下記に示す基で置換
することもできる。
【０１０３】ヒドロキシ、Ｃ1-3アルキル、アミノ、カ
ルボキシ、ホルミル、オキシラニル、チオール、ヒドロ
キシＣ1-6アルキル、アミノＣ1-6アルキル、カルボキシ
Ｃ1-6アルキル、ホルミルＣ1-6アルキル、オキシラニル
Ｃ1-6アルキル、チオールＣ1-6アルキル、ハロＣ1-6ア
ルキル。
【０１０４】このサブ・クラスに含まれるものは次の化
合物である。
【０１０５】Ｒ1は、メチル、Ｒ2は、水素、Ｒ8は、Ｃ
1-6アルキル、およびＲ9は、置換したＣ1-10アルキルで
ある。
【０１０６】ここで、置換基は下記に示すものである。
【０１０７】（ａ）Ｈ、（ｂ）ＯＨ、（ｃ）ＣＯ2Ｈ、
（ｄ）ＮＨ2、（ｅ）ホルミル、（ｆ）オキシラニル、
（ｇ）ハロゲン、（ｈ）チオール、（ｉ）置換したフェ
ニルＣ1-6アルキル ここで、置換基は下記の成分である。
【０１０８】ヒドロキシ、アミノ、またはカルボキシ、
ホルミル、オキシラニル、チオール、ヒドロキシＣ1-6
アルキル、アミノＣ1-6アルキル、カルボキシＣ1-6アル
キル、ホルミルＣ1-6アルキル、オキシラニルＣ1-6アル
キル、チオールＣ1-6アルキル、ハロＣ1-6アルキル。
【０１０９】本発明の例は下記の化合物である。
【０１１０】（ａ）Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−
バリニル−リミニル）−３−アミノ−４−オキソブタン
酸、またはリング・チェーン互変異性体、またはその水
化物である。
【０１１１】本明細書の目的にとって、下記に示すＹの
均等形とはっきり対応する化合物に関する上記の説明
は、
【０１１２】
【化３８】
【０１１３】下記に示す均等形を含有するよう意図され
ている。
【０１１４】
【化３９】
【０１１５】本発明の２番目の具体例においては、下記
の順序であり、上述のインターロイキン１β変換酵素の
精製用アフィニティクロマトグラフィーマトリックスを
用いる方法とも関連している。
【０１１６】（ａ）インターロイキン１β変換酵素を含
む調製物を前述のマトリックスにロードする （ｂ）中性ｐＨ（例えば６．５ｐＨから７． ５ｐＨ）
をもつバッファで前述のマトリックスを洗浄し、汚染蛋
白質を除去する （ｃ）式Ｉの化合物を添加することにより前述のインタ
ーロイキン１β変換酵素を溶出する （ｄ）前述のインターロイキン１β変換酵素を回収す
る。
【０１１７】アフィニティクロマトグラフィーにおいて
は、原液から酵素を選択的に抽出するには、バッチ処理
または連続処理のどちらかで親和マトリックスが使用さ
れる。汚染蛋白質を洗い落とした後は、酵素に結合する
ためのマトリックスと競合するフリー・リガンドを導入
することによりマトリックスから酵素を解放する。溶出
された酵素は、透析あるいは限外濾過技術によってイン
ヒビターから解放される。または潜在的インヒビターの
場合は、インヒビターへの結合を妨害する化学処理によ
る。
【０１１８】アフィニティマトリックスは、円筒状のカ
ラムにパックされ、連続した流れ処理が可能となるが、
バッチ処理も原液から酵素を抽出する適切な代替手法と
なる。親和カラムは、自然のサポート・マトリックス
（例えば、セファロースＣＬ−４Ｂ）のガード・カラム
よって保護されており、マトリックスに非特異的に付着
する蛋白質を除去するが、付着した酵素を完全に洗浄す
ることは困難となる。
【０１１９】この２つのカラムは、通常は酵素液に適用
する前に中性ｐＨにおいてバッファで平衡を保たれてい
る。そのため、３個以上のカラム容量が充分とみなされ
る。中性に近いｐＫａを持つ非反応型化合物の場合は、
どれでも充分である。酵素を不活性モノマーに分離する
速度を落とすショ糖と洗剤がすでに発見されているた
め、満足すべきＮ−［２ハイドロキシエチル］ピペラジ
ンＮ’−［２−エタン−スルホニック酸］（緩衝液調整
剤）を発見した。一方で１０％のショ糖と０．１％の３
−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］
−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）も含有され
ている。
【０１２０】式Ｉで表されるインヒビターのクラスに対
する多少とも独得な考慮すべき点は、酵素の結合と分離
に用いる速度定数が正規のものより遅いという点であ
る。酵素に適用して、保持を正常に保つには、結合に用
いる遅い速度定数は、通常外の遅いフロー速度（つまり
１時間当たり１ベッド容量以下）を用いる必要がある。
時間当たり１／４ベッド量に等しいフロー速度は、４゜
Ｃが適切であることが判明している。
【０１２１】付着した酵素は、バッファで洗浄され、汚
染蛋白質の最終トレースを排除する。２０カラム容量の
バッファを使用する十分な洗浄が望ましいところであ
り、この方法によれば処理中に損失は検出できない。小
量の汚染でも許容されないため、純酵素を得るには１，
０００ないし１００，０００の繰り返し精製が必要とな
る。
【０１２２】洗浄後、酵素はフリー・リガンドを添加す
ることによってマトリックスから溶出されるか、または
式Ｉで表されるファミリの中から別のインヒビターを洗
浄バッファに添加することによって溶出される。再度強
調するが、このクラスのインヒビターと均衡を保つため
の遅い速度定数は、特別な考慮を必要とする。リシンを
用いてアフィニティーマトリックスに結合させた場合の
化合物Ａのモデルとなるよう考慮された化合物Ｂの解離
の半減期は、２３゜Ｃで〜１００分が最小であり、酵素
の溶出に連続フローを使用するには遅すぎる。その結
果、フリー・リガンド（１００ｕＭが満足すべきものと
判明している）が充満したカラムにおいて溶出はバッチ
処理によって行われ、それにより酵素溶出のフローを再
開する前に、一晩温置すると均衡に達する交換が可能と
なる。
【０１２３】最終的には、精製ＩＣＥはＥ−Ｉ化合物か
ら分離されなければならない。この時点において、精製
酵素は抽出リガンドと化合させられる。
【０１２４】リガンドの排除と酵素の再活性化は、透析
またはジアフィルトレーションによってクラス別に行わ
れるが、現在のインヒビターのクラスに対しては、特別
な考慮を適用する。その代わりに２通りの化学的協同ア
プローチを採用することが望ましい。これらはそのオキ
シムへのインヒビターの変換と関連を持っており、酸化
グルタチオンと相互交換するチオール・ジサルファイド
によって、酸素活性部位チオールを封鎖する。
【０１２５】
【化４０】
【０１２６】酵素の再活性化速度は、フリー酵素とイン
ヒビター（Ｋ2＝１×１０-4 ｓｅｃ-1）を形成するＥ
−Ｉ化合物の解離速度、オキシム形成速度（Ｋ4＝７．
７±１．７ｘ１０-2 Ｍ-1 ｓｅｃ-1）、およびフリー
酵素とグルタチオン・ジスルフィド（Ｋ3＝３ Ｍ-1
ｓｅｃ-1）間のチオール・ジサルファイドの相互交換速
度などによって左右される。
【０１２７】生成物はこれらの技術のどれか１つを用い
て製造されるが、２つの方法を併用することも好んで行
われる。この条件におけるグルタチオンの適用は、ジチ
オスレイトールまたは他のフリー・チオールで還元する
ことによって逆に再活性化可能な混合ジスルフィドを与
える。酵素をグルタチオンによる選択保護することは前
例がない。一方、ヒドロキシルアミンと反応させること
によってアルデヒドをオキシムに変換する方法は１９世
紀に至って発見された。オキシム形成の速度定数
（Ｋ4）、とチオール・ジサルファイドのグルタチオン
・ジサルファイドとの相互交換（Ｋ3）は、本発明者が
測定した。これらの速度定数は、グルタチオン・ジサル
ファイドとヒドロキシルアミンの最適濃度を予測するの
に使用される。これらに基づいて酵素−インヒビター化
合物の解離速度が制限される。この２つのアプローチを
同時に適用することは、再活性化を最高のレベルで達成
するために必要である。酸化もしくは変換は、これらの
反応に使用できる標準手法のどれかを用いることによっ
て達成することができる。下記の文献を参照のこと。
Ｈ．Ｒ． Ｍａｈｌｅｒ ａｎｄ Ｅ． Ｈ． Ｃｏｒ
ｄｅｓ， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ， Ｈａｒｐｅｒ ａｎｄ Ｒｏｗ， Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ （１９７１）．Ｗ． Ｐ． Ｊｅｎｃｋｓ， Ｃ
ａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９６９）．上述の速度定数に基
づいて、１００ｍＭのヒドロキシルアミンと１０ｍＭの
グルタチオン・ジサルファイドの添加が適切であること
が判明している。反応は、約１６時間（１０半減期）以
内に終了するようにする。
【０１２８】再活性化が完了した後は、低分子量生成物
と過剰反応体は従来の透析または限外濾過によって除去
することができる。アミコン・セントリコン１０の限外
濾過セルを使用すれば、通常はクロマトグラフィーバッ
ファで５回の交換を行い、十億分の１のモル濃度にな
る。これによりグルタチオンと精製酵素の結合体が入手
可能となる。必要であれば、この結合体を１０ｍＭのジ
チオトレイトール（最小半減期１）に還元するか、また
は他のどれかのフリーチ・オールで還元することにより
活性酵素を入手する。どちらの状態においても、精製酵
素は−８０゜Ｃで無期限に安定している。
【０１２９】本発明の化合物は、下記に述べる手続きを
用いることによって便利に作成することができるが、よ
り明示的には以降の例題のセクションで説明する。
【０１３０】図式Ｉ
【０１３１】
【化４１】
【０１３２】図式Ｉの反応は、次のように進行する。イ
ソブチルクロロフォルム（ＩＢＣＦ）を持つアリロキシ
ーカルボニル（Ａｌｌｏｃ）−（Ｓ）−アスパラギン酸
β−ｔブチル・エステルの混合無水物は、Ｎメチルモル
フォリン（ＮＭＭ）を供給することによって形成され
る。この無水物はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）とメタ
ノールの比率が４対１の溶剤に０゜Ｃで水素化ホウ素ナ
トリウムを使用することにより、対応するアルコールＩ
Ｉに還元される。このアルコールＩＩは、やがてジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、塩化オキサリル、および
トリエチル・アミンを用いて酸化され、対応するアルデ
ヒドに変わるが、このアルデヒドは、メタノール、トリ
メチル、オルトギ酸塩およびｐ−トルエンスルホン酸を
用いて保護されており、ＩＩＩを産出する。Ａｌｌｏｃ
による保護グループは、やがてモルホリンを添加するこ
とにより、テトラキス、トリフェニルフォスフィン・パ
ラジゥムで除去され、アミンＩＶを産出する。このアミ
ンは、その後ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢ
ｔ）とＮＭＭの存在下にジシクロヘキシル・カーボディ
イミデ（ＤＣＣ）を用いることによりトリペプチド、Ｎ
アセチル−（Ｓ）−チロシニル−（Ｓ）−アラニン・バ
リニル−（Ｓ）−に結合され、ＶＩを産出する。ｔ−ブ
チルエステルは、やがてきれいなＴＦＡで除去され、環
状０−メチルアシラールＶＩＩを供給する。最後の加水
分解は、水とメタノールの比率が１対１の希薄な塩化水
素酸で達成されてＶＩＩＩを提供する。さらにＶＩはＬ
ｉ０Ｈで鹸化されて、ジメチルアセタールを供給する。
【０１３３】図式ＩＩ
【０１３４】
【化４２】
【０１３５】ＸＶＩＩＩなどの構造体は、図式ＩＩに示
すように作成される。Ｎ−ＣＢＺ−アスパラギン酸β−
メチルエステルは、Ｎメチルモルホリン（ＮＭＭ）とそ
れに続くジアゾメタンを添加することによってｉ−ブチ
ルクロロフォルメイトを用いて処理することができ、ジ
アゾメチルケトンＸＩを産出する。塩化水素酸を用いる
ＸＩの処理では、クロロメチルケトンＸＩＩを供給する
が、これはジ−ｔ−ブチルマロネートのナトリウム塩の
アルキル化に使用され、ケトジエステルＸＩＩＩを入手
する。ｔ−ブチル基は、トリフルオロ酢酸で除去するこ
とができ、その結果として産出されるジカルボン酸は、
熱ピリジンで脱炭酸化されてケト酸ＸＩＶを産出する。
酸ＸＩＶは、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢ
ｔ）の存在下エチルジメチルアミノプロピルカルボジイ
ミドを用い、ベンジールアミンに結合され、アミドＸＶ
を産出する。ＣＢＺグループの除去は、炭素に１０％の
パラジウムを添加することによって行われ、アミンＸＶ
Ｉを産出する。このアミンはやがてＨＯＢｔの存在下、
ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いてＮアセチール
チロシニル−バリニル−アラニンに結合され、ＸＶＩＩ
を産出する。カルボン酸の最終保護解除は、リチウム水
酸化物で行われ、必要とするＩＣＥインヒビターＸＶＩ
ＩＩを産出する。
【０１３６】この後の実施例に表現されているように、
式（Ｉ）の本発明の化合物は、インターロイキン１βに
関するインビトロインヒビター活性を明示することが示
されている。
【０１３７】特にこれらの化合物は、前駆体のインター
ロイキン１βを切断して、１ｕＭ以下のＫｉにおいて活
性なインターロイキン１βを形成するように、インター
ロイキン１β変換酵素が抑止されることが示されてい
る。
【０１３８】
【化４３】
【０１３９】図式ＩＩＩの反応は次のように進行する。
イソブチルクロロホルメート（ＩＢＣＦ）を持つアリロ
キシ−カルボニル（Ａｌｌｏｃ）（Ｓ）−アスパラギン
酸ｂ−ｔ−ブチルエステルの混合無水物は、Ｎ−メチル
モルホリン（ＮＭＭ）を添加することによって形成され
る。この無水物は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）とメ
タノールの比率が４対１の溶剤中に０゜Ｃで水素化ホウ
素ナトリウムを使用することにより対応するアルコール
に還元される。このアルコールは、やがてジメチルスル
ホキシド（ＤＭＳＯ）、塩化オキサリル、およびトリエ
チルアミンを用いて対応するアルデヒドに酸化される
が、これはメタノール、トリメチルオルトギ酸エステ
ル、およびｐ−トルエンスルホン酸を用いてジメチル・
アセタンとして保護されている。Ａｌｌｏｃの保護基
は、その後モルホリンの存在下テトラキス・トリフェニ
ルフォスフィン・パラジゥムを用いて除去され、その結
果生成されるアミンは、やがてヒドロキシベンゾトリア
ゾール（ＨＯＢｔ）とＮＭＭの存在下、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いてトリペプチド、Ｎ
−アセチル−（Ｓ）−チロシニル−（Ｓ）バリニル−
（Ｓ）−ＣＢＺ）−リシンに結合される。ＣＢＺグルー
プは、水素の存在下パールマンの触媒（炭素上のＰｄ
（ＯＨ）2）で除去され、必要な保護つき親和リガンド
を産出する。
【０１４０】
【化４４】
【０１４１】ＩＬ−１β変換酵素の精製用親和カラム
は、図式ＩＶに示す方法で作成される。セファロース
は、ｐＨ１１で１，４−ブタンジオールジグリシジルエ
ーテルに結合される。その結果として生成される樹脂エ
ポキシドは、ｐＨ１１と３７゜Ｃの条件で前駆体の親和
リガンドに反応する。その過程で、ｔ−ブチルエステル
は鹸化される。ジメチルアセタールの保護解除は、希薄
な塩化水素酸で行われて、必要とする親和マトリックス
を産出する。
【０１４２】以下に示す実施例は、本発明を説明するこ
とを目的としているが、請求の範囲についてはもちろん
のこと、本発明を制限するものではない。
【０１４３】
【実施例】実施例１ 化合物Ａからのクロマトグラフィーマトリックス作成 インターロイキン１変換酵素用親和カラムは、強力なペ
プチド・アルデヒド・インヒビターであるＡｃｅｔｙｌ
−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ＣＨＯ（化合物
Ａ）から作成され、１２原子のビス・オキシラン・スペ
ーサを介してリシン残基によってセファロースＣＬ−４
Ｂに結合される。
【０１４４】
【化４５】
【０１４５】親和マトリックスの合成 ステップＡ： エポキシで活性化したセファロースＣＬ
−４Ｂ エポキシで活性化したセファロースＣＬ−４Ｂは、下記
の文献に述べられた方法で作成される。（Ｓｕｎｄｂｅ
ｒｇ， Ｌ．， ａｎｄ Ｐｏｒａｔｈ， Ｊ． （１
９７４）Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． ９０， ８７
−９８）特に、１００ｇｍの吸引乾燥セファロースＣＬ
−４Ｂ、１００ｍｌの１，４ブタンジオールジグリシダ
イルエーテル（名目７０％溶液）、および２ｍｇ／ｍｌ
のＮａＢＨ４を含む１００ｍｌの０．６ＭのＮａＯＨで
構成されるスラリーは、周囲温度で１６時間の間オーバ
ヘッドかくはん機で混合される。その結果として生成さ
れるエポキシ活性化セファロースＣＬ−４Ｂは、堅い焼
結グラス・ロートの中で１０リットル水を使用して徹底
的に洗浄され、４゜Ｃで水中に貯蔵される。
【０１４６】ステップＢ： ペプチド・アルデヒド・ジ
メチル・アセタールの結合
【０１４７】
【化４６】
【０１４８】化合物Ａである活性アルデヒドのブロック
化されたアスパルチル−ｔ−ブチルエステル、ジメチル
アセタール（化合物Ａ’）は、１０ｍＭの溶液としてメ
タノールに溶解し、やがてより多くのメタノールと水と
で結合される。さらに４００ｍＭの炭酸ナトリウム溶液
でＨＣＬを用いてｐＨ１１．００に調整されて、２ｍＭ
のインヒビターと２００ｍＭの炭酸塩バッファを含む５
０％のメタノールを供給される。この溶液（１０ｍｌ）
は、吸引乾燥のケーキ（１０ｇｍ）とエポキシ活性化セ
ファロースＣＬ−４Ｂに混合され、そのスラリーは３７
゜Ｃで３日間回転させて撹拌される。この結果生成され
る親和マトリックスは、１Ｍ ＫＣ１と水で徹底的に洗
浄されて、４゜Ｃでスラリーとして貯蔵される。この合
成は、［１４−Ｃ］−リシノプリル を用いた結果に基
づいており、パックされた親和マトリックスが１ ｕｍ
ｏｌ／ｍｌとなるように見積もられている。下記文献参
照。
【０１４９】（Ｂｕｌｌ， Ｈ． Ｇ．， Ｔｈｏｒｎ
ｂｅｒｒｙ， Ｎ． Ａ．， ａｎｄＣｏｒｄｅｓ，
Ｅ． Ｈ． （１９８５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅ
ｍ．２６０， ２９６３−２９７２） ステップＣ： アルデヒドの活性化 上述の手順は、スペーサ・アームに結合したＡｃｅｔｙ
ｌ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−ＣＨＯのジメチ
ル・アセタールを供給している。アスパルテート残基上
のｔ−ブチル保護基は、結合状態に消失する。アルデヒ
ドに対するこのマトリックスの活性化は、０．０１Ｎ
ＨＣ１でマトリックスの均衡を保つとともに２５゜Ｃで
２時間放置することにより、使用に先立って親和マトリ
ックスの中で実行される。トレーサとして［１４−Ｃ］
グリシンを含んだ制御マトリックスは、これらの条件の
下でリガンドが損失した証拠（＜１％）は何も示さな
い。
【０１５０】実施例２ アフィニティクロマトグラフィー手順 出発酵素調製物を、実施例４に述べるようにアニオン交
換クロマトグラフィーによりＴＨＰ１細胞溶解物から１
００倍精製した。
【０１５１】ステップＡ： ＩＣＥの結合 活性化された親和カラム（５ｍｌ、１ｃｍｘ６．５ｃ
ｍ）と同じ寸法のネイティブセファロースＣＬ−４Ｂの
ガード・カラムは、１ｍＭのジチオトレイトールで補充
された１０カラム量のクロマトグラフィーバッファ（ｐ
Ｈ７．５０の条件で、１００ｍＭ ｈｅｐｅｓ、１０％
ショ糖、および０．１％の３［（３−コラミドプロピ
ル）、ジメチルアンモニオ）］−１−プロパンスルホネ
ート（ＣＨＡＰＳ））で平衡とした。酵素液（１５ｍ
ｌ、１５０，０００単位、１５０ｍｇの蛋白質）は、ガ
ード・カラムを通して供給され４゜Ｃで０．０２２ｍｌ
／ｍｉｎのフロー速度で親和カラム上に流されるととも
に、同じフロー速度で１０ｍｌの補助クロマトグラフィ
ーバッファで洗浄される。詰め込み間は、結合に必要な
速度定数が遅いためと推定され、酵素の活性の８％は保
持されない。詰め込みあとは、ガード・カラムが除去さ
れ、親和カラムは４゜Ｃで０．５ｍｌ／ｍｉｎの高速フ
ロー速度によって２５カラム量のバッファを用いて洗浄
される。洗浄分溜においては酵素活性はいっさい検出さ
れていない。
【０１５２】ステップＢ： 付着ＩＣＥの溶出 酵素を溶出するには、２００μＭのＡｃｅｔｙｌ−Ｔｙ
ｌ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−（ＣＢＺ）−Ａｓｐ−ＣＨＯ（化
合物Ｂ）を含有する１カラム量のバッファを充満させ、
室温で２４時間放置することによりマトリックスに付着
した酵素を解離することができる。その後、酵素の排除
されたインヒビター化合物は、０．０２２ｍｌ／ｍｉｎ
のフロー速度で２カラム量のバッファで洗浄することに
より親和カラムから回収することができる。酵素が５％
以下の新鮮なインヒビターで交換を繰り返すと、最初の
交換が十分であったことが指摘された。
【０１５３】ステップＣ：ＩＣＥの再活性化 溶出されたＩＣＥは、２通りの協同化学アプローチを用
いることによって再活性化することができる。その１つ
はインヒビターをそのオキシムに変換することであり、
他の１つは活性部位チオールの酸化を、チオール・ジサ
ルファイドの相互交換によってグルタチオンとジスルフ
ィドとの混合体に変換することである。
【０１５４】親和カラムから回収される酵素インヒビタ
ー溶液は、１００ｍＭの中性ヒドロキシルアミンを含有
するように調整され、１０ｍＭのグルタチオンジスルフ
ィドを再活性化させる。それらの条件の下で、過剰のフ
リー・インヒビターの消費に１００ｓｅｃの半減期とい
う短期ラグを要したあと、Ｅ−Ｉ化合物の分離は全体の
速度が２５゜Ｃで〜１００ｍｉｎの半減期となるよう決
定する。交換のために１０半減期をとったあと、インヒ
ビターオキシムと過剰な試薬は、４゜Ｃでクロマトグラ
フィーバッファを用いることによりアミコンセントリコ
ン１０限外濾過細胞の中で徹底的な脱塩によって除去さ
れる。必要であれば、酵素グルタチオンの合体物質が、
１０ｍＭのジチオトレイトール（半減期 ＜ １ ｍｉ
ｎ）で還元されて活性酵素が生成される。精製酵素は−
８０゜Ｃで無期限に安定を保つ。親和クロマトグラフィ
ー分析による酵素の活性の回復は、ＳＤＳポリアクリア
ミドゲル電気泳動によって測定されているように、９０
％以上が可能であり、その精製は〜５，０００の繰り返
しによって達成される。その結果は表１に要約されてい
る。
【０１５５】
【表１】
【０１５６】実施例３ 粗溶解物からの精製 実施例１の親和マトリックスは、原液細胞溶解物からの
酵素の均質化精製に直接使用することができる。この代
替方式では、７．５ｍｌの濃縮されたＴＨＰ１細胞溶解
物（実施例４に述べた方法で作成される）は、５ｍｌの
セファロースＣＬ−４Ｂガード・カラムによって保護さ
れた５００ｕｌの親和カラムに供給される。１０カラム
量のバッファで親和カラムを洗浄したあと、実施例２に
述べた方法で酵素が溶出される。この時点で、ＳＤＳポ
リアクリアミドゲル電気泳動によって測定されているよ
うに、〜１００倍の精製が行われた。それは洗浄が不十
分であることを示している。回復された酵素は上述のよ
うに再活性化され、それは洗浄力を強化した新鮮な親和
カラム上で再びクロマトグラフィー分析が行われる。こ
の溶出においては、１００，０００回以上の精製を行っ
たのに等しい等質性酵素が生成される。
【０１５７】実施例４ ステップＡ： 細胞の成長 ＡＴＣＣ（受託番号ＡＴＣＣ ＴＩＢ２０２）から入手
したＴＨＰ．１細胞は、９％のホース血清を含むローラ
・ボトルの中か、ウィートンターボリフトの４６リット
ル懸濁フラスコのどちらかの、イスコブの修正ダルベッ
コの媒体、またはダルベッコの修正イーグルの媒体（Ｊ
ＲＨバイオサイエンス）の中で懸濁状態におかれて成長
するが、これはまた７５，２００もしくは３００リット
ル発酵槽の中でミリリットル当たり１−２ｘ１０の６乗
の細胞を（週当り３ないし４倍増）を毎週取り出すこと
となる。懸濁フラスコまたは発酵槽に使用される媒体
も、細胞上の剪断力を減少させるために、０．１ないし
０．３％のＦ６８プルロニックを含有している。この細
胞は、ＡＴＣＣの薬瓶を用いて通常は３ないし４ヵ月以
上、次に述べる開始手順にしたがって成長させられる。
【０１５８】ステップＢ： 細胞破損と分画 細胞はＰＢＳの中で３回にわたって洗浄され、２５ｍＭ
のＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＭｇＣ１2、およ
び１ｍＭのＥＧＴＡを含有する低張バッファの中でミリ
リットル当り１０の８乗の細胞数に調整して０゜Ｃで２
０分間懸濁状態におかれる。プロテアーゼ・インヒビタ
ーが添加されて（１ｍＭのＰＭＳＦと１０μｇ／ｍｌの
ペプスタチンおよびロイペプチン）、この細胞は、２５
または１５ストロークを使用することにより、ダウンス
・ホモジナイザーに十分フィットした１００または３０
０ｍｌ中で破損され、９０ないし９５％の分量を産出す
る。破損された細胞は、核と破損されない細胞を除去す
るために、ベックマンＧＰＲ遠心分離機の中で５゜Ｃで
１０分間３０００ｒｐｍの条件で遠心分離が行われる。
その結果入手されたペレットは、プロテーゼ・インヒビ
ターを含有した低張バッファの最初の量の約１／４を再
び懸濁状態におき、１０ストロークの間懸濁がリダウン
スされ、再び遠心分離が行われる。この２番目のポスト
核上澄み液が最初のものに添加される。
【０１５９】このポスト核上澄み液は、ＳＳ３４ロータ
ー付きのソールバール遠心分離機で、１６，０００ｒｐ
ｍで２０分間遠心分離されるが、引き続きベックマン遠
心分離機（５０．２Ｔｉローター）の中で５０，０００
ｒｐｍ、または４５，０００ｒｐｍ（４５Ｔｉの回転
子）の条件で６０分間、２回目の回転による遠心分離を
行う。２ｍＭのＤＴＴを添加した後は、その結果として
生成される上澄み液がＩＣＥの精製を行うまで−８０゜
Ｃで貯蔵される。
【０１６０】ステップＣ： ＩＣＥのＨＰＬＣカラムに
よる精製 溶融した上澄み液は、０．２２μの空洞ファイバ濾過に
よって清澄にされ、アミコンＹＭ３の螺旋カートリッジ
を用いて１０ないし２０倍に濃縮される。さらにこれ
は、２０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ７．８、１０％のショ
糖、０．１％のＣＨＡＰＳ、および２ｍＭのＤＴＴとい
う条件に対して（８０００分子量の透析皮膜遮断）とい
う条件で一晩中透析が行われる。透析された上澄み液
（約３−５ｇの蛋白質、サイトソリック溶出の１０００
ｍｌに対応）は、水を用いて５００マイクロシーメンス
以下の伝導性に調整され、４７５ｍｌのベッド量のＤＥ
ＡＥ−５ＰＷＨＰＬＣ（ＢＩＯＲＡＤ）カラムに供給さ
れる。ＩＣＥは同じバッファを持つ約４０ｍＭ ＮａＣ
ｌの勾配中で溶出される。その勾配は、０．５ＭのＮａ
Ｃｌと２２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣ１の比率に増大して
いる。ＩＣＥの活性の一部は、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、
ｐＨ７．５、１０％のショ糖、０．１％のＣＨＡＰＳ、
および２ｍＭのＤＴＴという条件のバッファの中で１０
０μＭのＹＶＡＤ−ＡＭＣ基質を含有する１００μｌの
ボリュームを持つ９６ウェルプレート蛍光計を用いて分
析される。
【０１６１】ＤＥＡＥカラムから取り出されたＩＣＥの
活性の一部はプールされ、ＨＥＰＥＳ、ショ糖、ＣＨＡ
ＰＳ， ＤＴＴバッファで薄められて、ｐＨ７．０に調
節される。さらに１５０ｍｌベッド量のＳＰ−５ＰＷの
ＨＰＬＣ（ＢＩＯＲＡＤ）カラムに供給されて、同じバ
ッファで勾配のつけられたＫＣ１中、約８５ｎＭに溶出
される。ＩＣＥの活性の一部はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０
−２０、１７−２７、１６または１８％ゲル）と活性を
追跡する帯域を決定するための染色銀によってクロマト
グラフィーが行われる。これらのＳＰ−ＨＰＬＣの一部
は、さらに０．０％のＴＦＡでアセトニトリル勾配で溶
出されたＣ4ナローボア（ＡＢＩ）ＨＰＬＣカラム上で
クロマトグラフィーが行われる。
【０１６２】実施例５
【０１６３】
【化４７】
【０１６４】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−リシニル）−３−アミノ−４−オキソブタン酸ジメ
チルアセタールｂ−ｔ−ブチルエステルステップＡ ：Ｎ−アリルオキシカルボニル−３−アミノ
−４−ヒドロキシブタン酸 ｔ−ブチルエステル。
【０１６５】
【化４８】
【０１６６】Ｎ−アリルオキシカルボニル（Ｓ）アスパ
ラギン酸ｂ−ｔ−ブチルーエステル（２．００ｇ、７．
３２ｍｍｏｌ）を０゜Ｃで５０ｍＬのテトラヒドロフラ
ン（ＴＨＦ）に溶解した液に、Ｎ−メチルモルホリン
（ＮＭＭ、８８５ｍＬ、８．０５ｍｍｏｌ）を添加し、
その後にイソブチルクロロホルネート（ＩＢＣＦ， ９
９７ｍＬ， ７．６８ｍｍｏｌ）が加えられる。１５分
後、この混合液は、−４５゜Ｃで５０ｍＬのＴＨＦと１
２．５ｍＬのメタノールの中で水素化ホウ素ナトリウム
（５５０ｍｇ、１４．５５ｍｍｏｌ）に添加されて懸濁
状態におかれる。−４５゜Ｃで３０分を経た後、この混
合液は０゜Ｃに暖められ、３０分間その温度に保たれ
る。この反応は酢酸で停止され、酢酸エチルとヘキサン
の比率が１対１の溶液で薄められた後、ナトリウム重炭
酸塩を水で薄めた溶液で３回にわたって洗浄される。有
機体は、硫酸ナトリウムで乾燥されて、濾過して集めら
れる。残留物は、シリカ・ゲル（３５ｘ３５０ｍｍカラ
ム、３０％酢酸エチル／ヘクサン）上のＭＰＬＣによっ
て精製され、下記に示す必要な生成物が産出される。
【０１６７】１Ｈ ＮＭＲ （２００ＭＨｚ， ＣＤ3
ＯＤ） ｄ ５．９ （ｍ， １Ｈ）， ５．２８
（ｂｒ ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １７Ｈｚ）， ５．１
５ （ｂｒ ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ９Ｈｚ）， ４．
５２ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ，Ｊ ＝ ６Ｈｚ）， ３．
９８ （ｍ， １Ｈ）， ３．４８ （ＡＢＸ， ２
Ｈ， Ｊ ＝ ５， ６， １１Ｈｚ）， ２．５３
（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝ ５， １６Ｈｚ）， ２．３
２ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ９， １６Ｈｚ），
１．４３ （ｓ， ９Ｈ）。
【０１６８】ステップＢ：Ｎ−アリルオキシカルボニル
−３−アミノ−４−オキソブタン酸 ｂ−ｔ−ブチルエ
ステルジメチルアセタール。
【０１６９】
【化４９】
【０１７０】ジメチルスルホキシド（７５７ｍＬ， １
０．６７ｍｍｏｌ）を−４５゜Ｃで１０ｍＬのジクロロ
メタンと混合した溶液に塩化オキサリル（５０８ｍＬ，
５．８２ｍｍｏｌ）が添加される。５分後に、Ｎ−ア
リルオキシカルボニル−３−アミノ−４−ハイドロキシ
ブタン酸 ｔ−ブチル−エステル（１．２５ｇ， ４．
８５ｍｍｏｌ）を１０ｍＬのジクロロメタンに添加す
る。１５分後に、トリエチルアミン（２．０３ｍＬ，
１４．５５ｍｍｏｌ）が添加される。３０分後に、この
混合液が−２３゜Ｃに暖められ、３０分間かき混ぜられ
る。この混合液は酢酸エチルとヘキサンの比率が１対１
の水で薄めた溶液に浸され、水で洗浄され、１Ｎ硫化水
素ナトリウムに浸された後、再び２回水で洗浄される。
有機体は硫酸ナトリウムで乾燥されて、濾過して集めら
れる。この結果として生成されるオイルは、２００ｍＬ
のメタノールと２０ｍＬのトリメチルオルトギ酸塩で薄
められてから、１００ｍｇのｐトルエンスルフォン酸が
添加される。１６分後、反応は飽和ナトリウム重炭酸塩
で停止されて真空濃縮される。混合液はエーテルで薄め
られ、ナトリウム重炭酸塩の水溶液で５回にわたって洗
浄される。エーテル層は、硫酸マグネシウムで乾燥され
て、濾過して集められた上、無色オイルとして標題化合
物が産出される。
【０１７１】１Ｈ ＮＭＲ （２００ＭＨｚ， ＣＤ3
ＯＤ） ｄ ５．９ （ｍ， １Ｈ）， ５．２６
（ｂｒ ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １７Ｈｚ）， ５．１
４ （ｂｒ ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １０Ｈｚ），
４．５１ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ，Ｊ ＝ ５．３３Ｈ
ｚ）， ４．２５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ４．７９
Ｈｚ）， ４．１１ （ｍ， １Ｈ）， ３．４０
（ｓ， ３Ｈ）， ３．３９（ｓ， ３Ｈ）， ２．５
２ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ４．８６， １５．２
７Ｈｚ）， ２．３０ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝
９．００， １５．２８Ｈｚ）， １．４３ （ｓ，
９Ｈ）。
【０１７２】ステップＣ：３−アミノ−４−オキソブタ
ン酸 ｂ−ｔ−ブチルエステルジメチルアセタール
【０１７３】
【化５０】
【０１７４】Ｎ−アリルオキシカルボニル−３−アミノ
−４−オキソブタン酸 ｂ−ｔ−ブチルエステルジメチ
ルアセタール（３１２ｍｇ， １．０３ｍｍｏｌ）と１
０ｍＬのＴＨＦの混合液にモルホリン（８９７ｍＬ，
１０．３ｍｍｏｌ）とテトラキストリフェニルフォスフ
ィンパラジゥム（１００ｍｇ）を添加する。３分後、こ
の混合液を１：１の酢酸エチルとヘキサンで薄め、ナト
リウム重炭酸塩を水で薄めた溶液で５回にわたって洗浄
する。有機物は、乾燥して硫酸ナトリウムとなり、濾過
して集められる。この結果として生成されるオイルは、
シリカ・ゲル（２２ｘ３００ｍｍカラム、ジクロロメタ
ン中、１％のアンモニアと１０％のジクロロメタンの線
形勾配を持つ）でのＭＰＬＣによって精製され、青白色
オイルとして標題化合物を得る。
【０１７５】１Ｈ ＮＭＲ （２００ＭＨｚ， ＣＤ3
ＯＤ） ｄ ４．１５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ５．
６７Ｈｚ）， ３．４１ （ｓ， ３Ｈ）， ３．４０
（ｓ， ３Ｈ）， ３．１９ （ｍ， １Ｈ），
２．４７ （ｄｄ， １Ｈ，Ｊ ＝ ４．８８， １
６．０６Ｈｚ）， ２．２２ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝
７．８６， １６．１６Ｈｚ）， １．４５ （ｓ，
９Ｈ）。
【０１７６】ステップＤ：Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシ
ニル−バリニル−（ｅ−ＣＢＺ−リシニル−３−アミノ
−４−オキソブタン酸 ｂ−ｔ−ブチルエステルジメチ
ルアセタール。
【０１７７】
【化５１】
【０１７８】３−アミノ−４−オキソブタン酸 ｂ−ｔ
−ブチルエステルジメチルアセテル（２３８ｍｇ，
１．０９ｍｍｏｌ）に０゜Ｃで５ｍＬのＤＭＦを添加し
た溶液にＮ−メチルモルホリン（５９９ｍＬ， ５．４
５ｍｍｏｌ）を添加し、引き続きＮ−アセチール−チロ
シニール−バリニル−ｅ−ＣＢＺ−リシン（７３５ｍ
ｇ， １．０９ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール（２２１ｍｇ， １．６４ｍｍｏｌ）、およびジシ
クロヘキシルカルボジイミド（２２５ｍｇ， １．０９
ｍｍｏｌ）を逐次添加する。周囲温度で１６時間後、こ
の混合液は濾過されてセファデックス”ＬＨ−２０クロ
マトグラフィー（１Ｍｘ５０ｍｍカラム、メタノール溶
解分離剤）によって精製される。この結果生成される生
成物はシリカ・ゲル（２２ｘ３００ｍｍカラム、ジクロ
ロメタン中、１％のアンモニアと１０％のジクロロメタ
ンの線形勾配を持つ［ジクロロメタン中］）上のＭＰＬ
Ｃによってさらに精製が行われ、下記に示す無色の標題
固体化合物を産出する。
【０１７９】１Ｈ ＮＭＲ （２００ＭＨｚ， ＣＤ3
ＯＤ） ｄ ７．３１ （ｂｒ ｓ， ５Ｈ）， ７．
０４ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．３５Ｈ
ｚ），６．６７ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．
４５Ｈｚ）， ５．０４ （ｓ， ２Ｈ）， ４．６１
０ （ｍ， １Ｈ）， ４．４４−４．２５ （ｍ，３
Ｈ）， ４．１７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．２７
Ｈｚ）， ３．３９（ｓ， ３Ｈ）， ３．３８
（ｓ， ３Ｈ）， ３．１−２．９ （ｍ， ３Ｈ），
２．７５ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ９．２８，
１４．１２Ｈｚ）， ２．５３ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ
＝ ５．４７， １５．５８Ｈｚ），２．３３ （ｄ
ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．９６， １５．５３Ｈ
ｚ）， ２．０４ （ｍ， １Ｈ）， １．８８
（ｓ， ３Ｈ）， １．８−１．２ （ｍ， ６Ｈ），
１．４１ （ｓ， １５９Ｈ）， ０．９４ （ｄ，
６Ｈ，Ｊ ＝ ６．７４Ｈｚ）。
【０１８０】ステップＥ：Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシ
ニル−バリニル−リシニル）−３−アミノ−４−オキソ
ブタン酸 ジメチルアセタールｂ−ｔ−ブチルエステル
【０１８１】
【化５２】
【０１８２】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−ｅ−ＣＢＺ−リシニル）−３−アミノ−４−オキソ
ブタン酸 ｂ−ｔ−ブチルエステルジメチルアセタール
（１５．６ｍｇ）を２ｍＬのメタノールに溶解して１０
ｍｇパールマン触媒（炭素上のＰｄ（ＯＨ）2）を添加
する。水素の下で３０分後、この混合液は濾過されて集
められ、下記に示す標題化合物を産出する。
【０１８３】１Ｈ ＮＭＲ （２００ＭＨｚ， ＣＤ3
ＯＤ） ｄ ７．０４ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝
８．４４Ｈｚ）， ６．６７ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ，
Ｊ＝ ８．５４Ｈｚ）， ４．５７ （ｄｄ， １
Ｈ， Ｊ ＝ ５．２３，９．０４Ｈｚ）， ４．５−
４．０ （ｍ， ４Ｈ）， ３．３８ （ｓ， ３
Ｈ）， ３．３４ （ｓ， ３Ｈ）， ３．０２ （ｄ
ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝５．１７， １３．８１Ｈｚ），
２．７５ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ９．２３，
１４．０６Ｈｚ）， ２．６６ （ｔ， ２Ｈ， Ｊ
＝ ７．０８Ｈｚ）， ２．５３ （ｄｄ， １Ｈ，
Ｊ ＝ ５．４７， １５．５８Ｈｚ）， ２．３４
（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．９１， １５．５７Ｈ
ｚ），２．０３ （ｍ， １Ｈ）， １．８８ （ｓ，
３Ｈ）， １．９−１．２（ｍ， ６Ｈ）， １．４
１ （ｓ， ９Ｈ）， ０．９４ （ｄ， ６Ｈ，Ｊ
＝ ６．６９Ｈｚ）， ０．９３ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ
＝ ６．６４Ｈｚ）。
【０１８４】実施例６ Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニル−アラニニ
ル）−３−アミノ−４−オキソブタン酸ステップＡ ：Ｎ−アリロキシーカルボニル−３−アミノ
−４−ハイドロブタン酸 ｔ−ブチルエステル
【０１８５】
【化５３】
【０１８６】Ｎ−アリロキシーカルボニル（Ｓ）−アス
パラギン酸 βタートブチルエステル（２．００ｇ、
７．３２ｍｍｏｌ）を０゜Ｃで５０ｍＬのテトラヒドロ
フラン（ＴＨＦ）に溶解した液にＮ−メチルモルホリン
（ＮＭＭ， ８８５ｍＬ， ８．０５ｍｍｏｌ）が添加
され、続いてイソブチルクロロホルメート（ＩＢＣＦ，
９９７ｍＬ， ７．６８ｍｍｏｌ）に添加される。１５
分後、この混合液は水素化ホウ素ナトリウム（５５０ｍ
ｇ， １４．５５ｍｍｏｌ）に添加されて−４５゜Ｃで
５０ｍＬのＴＨＦと１２．５ｍＬのメタノールの中で懸
濁状態におかれる。−４５゜Ｃで３０分経過した後、こ
の混合液は０゜Ｃに暖められたあとさらに３０分間その
温度に保たれる。反応は酢酸で停止され、酢酸エチルと
ヘキサン１対１で薄め、ナトリウム重炭酸塩を水で薄め
て３回にわたって洗浄を行う。有機物は硫酸ナトリウム
で乾燥されて、濾過して集められる。残留物はシリカ・
ゲル（３５ｘ３５０ｍｍカラム、３０％酢酸エチル／ヘ
キサン）のＭＰＬＣによって精製され、下記に示すよう
に求める所望生成物が産出される。
【０１８７】１Ｈ ＮＭＲ （２００ＭＨｚ， ＣＤ３
ＯＤ） δ５．９ （ｍ， １Ｈ）， ５．２８ （ｂ
ｒ ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １７Ｈｚ）， ５．１５
（ｂｒ ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ９Ｈｚ）， ４．５２
（ｂｒ ｄ， ２Ｈ， Ｊ＝ ６Ｈｚ）， ３．９８
（ｍ， １Ｈ）， ３．４８ （ＡＢＸ， ２Ｈ，
Ｊ ＝ ５， ６， １１Ｈｚ）， ２．５３ （ｄ
ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝５， １６Ｈｚ）， ２．３２
（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ９， １６Ｈｚ）， １．
４３ （ｓ， ９Ｈ）。
【０１８８】ステップＢ：Ｎ−アリロキシカルボニル−
３−アミノ−４−オキソブタン酸 β−ｔ−ブチルエス
テルジメチルアセタール
【０１８９】
【化５４】
【０１９０】ジメチルスルホキシド（７５７ｍＬ， １
０．６７ｍｍｏｌ）に−４５゜Ｃで１０ｍＬのジクロロ
メタンを添加した溶液に塩化オキサリル（５０８ｍＬ，
５．８２ｍｍｏｌ）が添加される。５分後、Ｎ−アリ
ルオキシカルボニル−３−アミノ−４−ハイドロブタン
酸 ｔ−ブチルエステル（１．２５ｇ， ４．８５ｍｍ
ｏｌ）を１０ｍＬのジクロロメタンに添加する。１５分
後、トリエチルアミン（２．０３ｍＬ， １４．５５ｍ
ｍｏｌ）が添加される。さらに３０分後、この混合液は
−２３゜Ｃに暖められ、３０分間かき混ぜられる。その
上でこの混合液は酢酸エチルとヘキサンを１対１の割合
で水に薄めた溶液に浸ししてから、水で洗浄し、さらに
１Ｎ硫化水素ナトリウムに浸した後２回にわたって水で
洗浄する。有機物は硫酸ナトリウムで乾燥されて、濾過
して集められる。この結果として産出されたオイルは、
２００ｍＬのメタノールと２０ｍＬのトリメチルオルト
ギ酸エステルの中で溶解され、１００ｍｇｐ−トルエン
スルホン酸が添加される。１６時間後、反応は飽和した
ナトリウム重炭酸塩で停止され、真空濃縮される。この
混合液はエーテルで薄められた上、５回にわたってナト
リウム重炭酸塩水で洗浄される。エーテル層は硫酸マグ
ネシウムで乾燥されて、濾過して集められ、下記の無色
のオイル状の表題の化合物を産出される。
【０１９１】１Ｈ ＮＭＲ （２００ＭＨｚ， ＣＤ３
ＯＤ） δ５．９ （ｍ， １Ｈ）， ５．２６ （ｂ
ｒ ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １７Ｈｚ）， ５．１４
（ｂｒ ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １０Ｈｚ）， ４．５
１ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ，Ｊ＝５．３３Ｈｚ）， ４．
２５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ４．７９Ｈｚ），４．
１１ （ｍ， １Ｈ）， ３．４０ （ｓ， ３Ｈ），
３．３９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．５２ （ｄｄ，
１Ｈ， Ｊ ＝ ４．８６， １５．２７Ｈｚ），
２．３０ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ９．００， １
５．２８Ｈｚ）， １．４３ （ｓ， ９Ｈ）。
【０１９２】ステップＣ：３−アミノ−４−オキソブタ
ン酸 β−ｔ−ブチルエステルジメチルアセタール
【０１９３】
【化５５】
【０１９４】Ｎ−アリロキシー−カルボニル−３−アミ
ノ−４−オキソブタン酸 β−タート−ブチルエステル
ジメチルアセタール（３１２ｍｇ， １．０３ｍｍｏ
ｌ）に１０ｍＬのＴＨＦを添加した溶液にモルホリン
（８９７ｍＬ， １０．３ｍｍｏｌ）とテトラキストリ
フェニルフォスフィンパラジゥム（１００ｍｇ）とが添
加される。３時間後、この混合液は酢酸エチルとヘキサ
ンの１対１溶液で薄められ、５回にわたってナトリウム
重炭酸塩水で洗浄される。有機物は硫酸ナトリウムで乾
燥されて、濾過して集められる。この結果として生成さ
れるオイルはシリカ・ゲル（２２ｘ３００ｍｍカラム、
１％のアンモニアと１０％のジクロロメタンの線形勾配
を持つ［ジクロロメタン中］）上のＭＰＬＣによって精
製され、下記に示す青白黄オイルとして標題化合物が産
出される。
【０１９５】１Ｈ ＮＭＲ （２００ＭＨｚ， ＣＤ3
ＯＤ） δ４．１５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ５．６
７Ｈｚ）， ３．４１ （ｓ， ３Ｈ）， ３．４０
（ｓ， ３Ｈ）， ３．１９ （ｍ， １Ｈ）， ２．
４７ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝ ４．８８， １６．０
６Ｈｚ）， ２．２２ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝７．
８６， １６．１６Ｈｚ）， １．４５ （ｓ， ９
Ｈ）。
【０１９６】ステップＤ：
【０１９７】
【化５６】
【０１９８】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−アラニニル）−３−アミノ−４−オキソブタン酸
β−ｔ−ブチルエステルジメチルアセタール。
【０１９９】３−アミノ−４−オキソブタン酸 β−ｔ
−ブチルエステルジメチルアセタール（１０４ｍｇ，
０．４７３ｍｍｏｌ）に０゜Ｃで３ｍＬのＤＭＦを添加
した溶液に、Ｎ−メチルモルホリン（２６０ｍＬ，
２．３７ｍｍｏｌ）に添加され、引き続きＮ−アセチル
−チロシニル−バリニル−アラニン（２２９ｍｇ，
０．４７３ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール
（９６ｍｇ， ０．７１０ｍｍｏｌ）、およびジシクロ
ヘキシルカルボジイミド（９８ｍｇ， ０．４７３ｍｍ
ｏｌ）が逐次添加される。周囲温度で２４時間経過した
後、この混合液は濾過されて、セファデックスＬＨ−２
０のクロマトグラフィー（１Ｍｘ５０ｍｍカラム、メタ
ノール溶解分離剤）によって精製される。この結果とし
て生成される製品はシリカ・ゲル（２２ｘ３００ｍｍカ
ラム、１％のアンモニアと１０％のジクロロメタン線形
勾配を持つ［ジクロロメタン中］）でのＭＰＬＣによっ
てさらに精製され、下記の無色固体の化合物として産出
される。
【０２００】１Ｈ ＮＭＲ （２００ＭＨｚ， ＣＤ3
ＯＤ） δ ７．０４ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝
８．５４Ｈｚ）， ６．６７ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ，
Ｊ＝ ８．５７Ｈｚ）， ４．５８ （ｄｄ， １
Ｈ， Ｊ ＝ ５．６１，９．０３）， ４．４−４．
２ （ｍ， ３Ｈ）， ４．１６ （ｄ， １Ｈ，Ｊ
＝ ７．１２Ｈｚ）， ３．３９ （ｓ， ３Ｈ），
３．３８ （ｓ，３Ｈ）， ３．０１ （ｄｄ， １
Ｈ， Ｊ ＝ ５．５４， １３．９７Ｈｚ）， ２．
７６ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．８９， １３．
９０Ｈｚ）， ２．５３ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝
５．５０， １４．４５Ｈｚ），２．３４ （ｄｄ，
１Ｈ， Ｊ ＝ ７．８３， １５．４９Ｈｚ），
２．０５ （ｍ， １Ｈ）， １．９０ （ｓ， ３
Ｈ）， １．４１ （ｓ， ９Ｈ）， １．３３
（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．１６Ｈｚ）， ０．９４
（ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ６．７３Ｈｚ）， ０．９
２ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝６．７７Ｈｚ）。
【０２０１】ステップＥ：
【０２０２】
【化５７】
【０２０３】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−アラニニル）−３−アミノ−４−オキソブタン酸。
【０２０４】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−アラニニル）−３−アミノ−４−オキソブタン酸
β−ｔ−ブチルエステルジメチルアセタール（１７．４
ｍｇ）を２ｍＬのトリフルオロアセチル酸の中で１５分
間熟成し、真空濃縮する。生成物は１．０ｍＬのメタノ
ールに溶解して６０ｕＬの塩化チオニールを含む１．０
ｍＬの水を添加する。２時間後、溶液のｐＨ値をナトリ
ウムアセテートに合わせて５に調整し、下記の化合物溶
液を産出する。
【０２０５】１Ｈ ＮＭＲ （２００ＭＨｚ， ＣＤ3
ＯＤ） δ ７．０８ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝
８．４４Ｈｚ）， ６．７６ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ，
Ｊ＝ ８．４９Ｈｚ）， ４．７−４．１ （ｍ，
４Ｈ）， ４．０４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．６
７Ｈｚ）， ３．０５−２．４０ （ｍ， ４Ｈ），
２．０５ （ｍ， １Ｈ）， １．９６ （ｓ， ３
Ｈ）， １．３５ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝ ７．２３
Ｈｚ）， ０．８９ （ｄ， ６Ｈ， Ｊ ＝６．８４
Ｈｚ）。
【０２０６】実施例７ Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニル−ｅ−ＣＢ
Ｚ−リシニル）−３−アミノ−４−オキソブタン酸。
【０２０７】ステップＡ：
【０２０８】
【化５８】
【０２０９】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−（ｅ−ＣＢＺ−リシニル−３−アミノ−４−オキソ
ブタン酸 β−ｔ−ブチルエステルジメチルアセター
ル。
【０２１０】３−アミノ−４−オキソブタン酸 β−ｔ
−ブチルエステルジメチルアセタール（２３８ｍｇ，
１．０９ｍｍｏｌ）を０゜Ｃで５ｍＬのＤＭＦに添加し
た溶液に、Ｎ−メチルモルホリン（５９９ｍＬ， ５．
４５ｍｍｏｌ）に添加し、引き続きＮ−アセチール−チ
ロシニル−バリニル−ｅ−ＣＢＺ−リシン（７３５ｍ
ｇ， １．０９ｍｍｏｌ）、ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール（２２１ｍｇ， １．６４ｍｍｏｌ）、およびジシ
クロヘキシルカルボジイミド（２２５ｍｇ， １．０９
ｍｍｏｌ）に逐次添加する。周囲温度で１６時間経過
後、この混合液は濾過されて、セファデックスＬＨ−２
０のクロマトグラフィー（１Ｍｘ５０ｍｍカラム、メタ
ノール溶解分離剤）によって精製される。この結果生成
される製品はシリカ・ゲル（２２ｘ３００ｍｍカラム、
１％のアンモニアと１０％のジクロロメタンの線形勾配
を持つ［ジクロロメタン中］）でのＭＰＬＣによってさ
らに精製され、下記に示す無色固体の標題化合物を産出
する。
【０２１１】１Ｈ ＮＭＲ （２００ＭＨｚ， ＣＤ3
ＯＤ） δ７．３１ （ｂｒ ｓ，５Ｈ）， ７．０４
（ｂｒ ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．３５Ｈｚ），
６．６７ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．４５Ｈ
ｚ）， ５．０４ （ｓ，２Ｈ）， ４．６１ （ｍ，
１Ｈ）， ４．４４−４．２５ （ｍ， ３Ｈ），
４．１７ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．２７Ｈｚ），
３．３９ （ｓ， ３Ｈ）， ３．３８ （ｓ， ３
Ｈ）， ３．１−２．９ （ｍ， ３Ｈ）， ２．７５
（ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ９．２８， １４．１２
Ｈｚ），２．５３ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ５．４
７， １５．５８Ｈｚ）， ２．３３ （ｄｄ， １
Ｈ， Ｊ ＝ ７．９６， １５．５３Ｈｚ）， ２．
０４（ｍ， １Ｈ）， １．８８ （ｓ， ３Ｈ），
１．８−１．２ （ｍ，６Ｈ）， １．４１ （ｓ，
９Ｈ）， ０．９４ （ｄ， ６Ｈ， Ｊ ＝６．７４
Ｈｚ）。
【０２１２】ステップＢ：
【０２１３】
【化５９】
【０２１４】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−ｅ−ＣＢＺ−リシニル）−３−アミノ−４−オキソ
ブタン酸。
【０２１５】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−ｅ−ＣＢＺ−リシニル）−３−アミノ−４−オキソ
ブタン酸 β−ｔ−ブチルエステルジメチルアセタール
（１４．９ｍｇ）を１ｍＬのトリフルオロアセチル酸で
処理して、１５分間熟成させ真空濃縮する。残留物は
１、０ｍＬのメタノールに溶解し、２０ｕＬの塩化チオ
ニールを含む１．０ｍＬの水を添加する。１時間後、ナ
トリウムアセテートに合わせてｐＨ値を５に調整し、下
記の標題溶液化合物を産出する。
【０２１６】１Ｈ ＮＭＲ （２００ＭＨｚ， ＣＤ3
ＯＤ） δ ７．３３ （ｂｒ ｓ， ５Ｈ）， ７．
０５ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．３５Ｈ
ｚ），６．７４ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ８．
３５Ｈｚ）， ４．６−３．９（ｍ， ５Ｈ）， ３．
１−２．３ （ｍ， ６Ｈ）， １．９８ （ｍ，１
８）， １．９２ （ｓ， ３Ｈ）， １．８−１．２
（ｍ， ６Ｈ），０．８９ （ｄ， ６Ｈ， Ｊ ＝
６．６０Ｈｚ）。
【０２１７】実施例８
【０２１８】
【化６０】
【０２１９】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−リシニル）−３−アミノ−４−オキソブタン酸。
【０２２０】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−ｅ−ＣＢＺ−リシニル）−３−アミノ−４−オキソ
ブタン酸 β−ｔ−ブチルエステルジメチルアセタール
（１６．８ｍｇ）を２ｍＬのメタノールに溶解し、パー
ルマンの触媒（炭素上のＰｄ（ＯＨ）2）を添加する。
水素の下で３０分経過した後、この混合液は濾過して集
められる。残留物は２ｍＬのトリフルオロアセチル酸で
処理され、１５分間熟成させて真空濃縮する。生成物は
１．０ｍＬのメタノールに溶解し２０ｕＬの塩化チオニ
ールを含む１．０ｍＬの水を添加する。１時間後、ナト
リウムアセテートでｐＨ値を５に調整し、下記の溶液化
合物を産出する。
【０２２１】１Ｈ ＮＭＲ （２００ＭＨｚ， ＣＤ3
ＯＤ） δ ７．１０ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝
８．０１Ｈｚ）， ６．７７ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ，
Ｊ＝ ８．２５Ｈｚ）， ４．７−４．０ （ｍ，
５Ｈ）， ３．１−２．４（ｍ， ６Ｈ）， ２．０４
（ｍ， １Ｈ）， １．９５ （ｓ， ３Ｈ），
１．９−１．３ （ｍ， ６Ｈ）， ０．９０ （ｄ，
６Ｈ， Ｊ ＝６．５９Ｈｚ）。
【０２２２】実施例９
【０２２３】
【化６１】
【０２２４】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−リシニル）−３−アミノ−４−オキソブタン酸 ジ
メチルアセタール。
【０２２５】Ｎ−（Ｎ−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−ｅ−ＣＢＺ−リシニル）−３−アミノ−４−オキソ
ブタン酸 β−ｔ−ブチルエステルジメチルアセタール
（１５．６ｍｇ）を２ｍＬのメタノールに溶解し、１０
ｍｇのパールマンの触媒（炭素上でＰｄ（ＯＨ）2）を
添加する。水素の下で３０分経過した後、この混合液は
濾過して集められる。固体は１ｍＬのメタノールと１ｍ
Ｌの水に溶解させる。リチウム水酸化物（２２ｍｇ）を
添加する。周囲温度で１６時間経過した後、この混合液
を真空濃縮し、水酸化リチウムの存在下に標記化合物を
生成する。
【０２２６】１Ｈ ＮＭＲ （２００ＭＨｚ， ＣＤ3
ＯＤ） δ ６．８８ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝
８．４Ｈｚ）， ６．５４ （ｂｒ ｄ， ２Ｈ，
Ｊ＝ ８．４Ｈｚ）， ４．６−４．１ （ｍ， ５
Ｈ）， ３．３８ （ｓ，６Ｈ）， ３．０−２．２
（ｍ， ６Ｈ）， ２．０８ （ｍ， １Ｈ），１．８
８ （ｓ， ３Ｈ）， １．９−１．２ （ｍ， ６
Ｈ）， ０．９４（ｄ， ６Ｈ， Ｊ ＝ ６．７Ｈ
ｚ）， ０．９１ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ ＝６．７Ｈ
ｚ）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ケビン・テイ・チヤツプマン アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07076、スコツチ・プレインズ、ダンカ ン・ドライブ・1974

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 インターロイキン１β変換酵素を精製す
    るための式Ｉ： 【化１】 の化合物の使用方法であって、アフィニティーカラム担
    体に前記式Ｉの化合物を付加することを含み、前記式Ｉ
    の化合物において、Ｙは、 【化２】 を示しており、Ｒ１は、（ａ）置換したＣ１−１２アル
    キル〔ここで、置換基は、（１）水素、（２）ヒドロキ
    シ、（３）ハロゲン、（４）Ｃ１−６アルキルカルボニ
    ル、（５）ホルミル、（６）アミノ、（７）カルボキ
    シ、（８）チオール、および（９）オキシラニルから選
    択される。〕（ｂ）アリールＣ１−６アルキル〔ここ
    で、アリール基は、（１）フェニル、（２）ナフチル、
    （３）ピリジル、（４）フリル、（５）チエニル、
    （６）チアゾリル、（７）イソチアゾリル、（８）イミ
    ダゾリル、（９）ベンズイミダゾリル、（１０）ピラジ
    ニル、（１１）ピリミジル、（１２）キノリル、（１
    ３）イソキノリル、（１４）ベンゾフリル、（１５）ベ
    ンゾチエニル、（１６）ピラゾリル、（１７）インドリ
    ル、（１８）プリニル、（１９）イソキサゾリル、およ
    び（２０）オキサゾリル、並びに、モノおよびジ−置換
    の、上記（１）項より（２０）項において定義されたア
    リールからなるグループから選択され、ここで、置換基
    は独立にＣ１−６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、アミノ
    Ｃ１−６アルキル、チオＣ１−６アルキル、ホルミルＣ
    １−６アルキル、およびヒドロキシＣ１−６アルキルで
    ある。〕Ｒ２は、（ａ）Ｈ、（ｂ） 【化３】 であり、ここで、Ｒ４およびＲ５は水素、弗素およびヒ
    ドロキシからそれぞれに別々に選択され、Ｒ６は、
    （１）水素、（２）弗素、（３）置換したＣ１−６アル
    キル〔ここで、置換基は、（ａ）水素、（ｂ）ヒドロキ
    シ、（ｃ）ハロゲン、（ｄ）Ｃ１−６アルキルカルボニ
    ルから選択される。〕（４）アリールＣ１−６アルキ
    ル、〔ここで、アルキルは、水素、オキソ、Ｃ１−３ア
    ルキル、ハロ、またはヒドロキシによって置換されてお
    り、ここで、アリールはすぐ上に定義された通りであ
    り、モノ及びジ置換されていてもよく、置換基は、それ
    ぞれ独立にＣ１−６アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、
    Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−
    ６アルキルチオ、およびＣ１−６アルキルカルボニルで
    ある。〕（５）Ｃ１−６アルキルアミノカルボニルＣ１
    −６アルキル、またはＣ１−６アルキルカルボニルアミ
    ノＣ１−６アルキル、（６）アリールアミノカルボニル
    Ｃ１−６アルキル、またはアリールカルボニルアミノＣ
    １−６アルキル、〔ここで、アリールはすぐ上に定義さ
    れた通りであり、モノ及びジ置換されていてもよく、置
    換基は、それぞれ独立にＣ１−６アルキル、ハロ、ヒド
    ロキシ、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ１−６アルコキ
    シ、Ｃ１−６アルキルチオ、およびＣ１−６アルキルカ
    ルボニルである。〕（７）アリールＣ１−６アルキルア
    ミノカルボニルＣ１−６アルキル、またはアリールＣ１
    −６アルキルカルボニルアミノＣ１−６アルキル、〔こ
    こで、アリールはすぐ上に定義された通りであり、モノ
    及びジ置換されていてもよく、置換基は、それぞれ独立
    にＣ１−６アルキル、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１−６アル
    キルアミノ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチ
    オ、およびＣ１−６アルキルカルボニルである。〕から
    なるグループから選択され、ＡＡ１が独立に、（ａ）単
    結合、および（ｂ）式ＡＩのアミノ酸 【化４】 からなるグループから選択され、ここで、Ｒ７が、
    （ａ）水素、（ｂ）置換したＣ１−１０アルキル〔ここ
    で、置換基は、（１）水素、（２）ヒドロキシ、（３）
    ハロゲン、（４）−Ｓ−Ｃ１−４アルキル、（５）スリ
    フヒドリル、（６）ホルミル、（７）アミノ、（８）オ
    キシラニル、（９）Ｃ１−６アルキルカルボニル、（１
    ０）カルボキシ（１１） 【化５】 （１２）アミノカルボニルアミノ、（１３）Ｃ１−４−
    アルキルアミノ〔ここで、アルキル部分は水素またはヒ
    ドロキシで置換されており、アミノは水素またはＣＢＺ
    で置換されている。〕（１４）グアニジノから選択され
    る。〕、および（ｃ）アリールＣ１−６アルキル〔ここ
    で、アリールはすぐ上に定義された通りであり、これは
    モノ及びジ置換されていてもよく、置換基は、それぞれ
    独立にＣ１−６アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミ
    ノ、チオール、カルボキシ、ホルミル、オキシラニルア
    ミノＣ１−６アルキル、ホルミルＣ１−６アルキル、オ
    キシラニルＣ１−６アルキル、チオールＣ１−６アルキ
    ル、カルボキシＣ１−６アルキル、ヒドロキシＣ１−６
    アルキル、およびハロゲンＣ１−６アルキルである。〕
    からなるグループから選択され、ＡＡ２は独立に、
    （ａ）単結合、および（ｂ）式ＡＩＩ 【化６】 のアミノ酸から成るグループから選択され、ＡＡ３は独
    立に、（ａ）単結合、および（ｂ）式ＡＩＩＩ 【化７】 から成るグループから選択され、ここで、Ｒ８およびＲ
    ９は独立に、（ａ）水素、（ｂ）置換したＣ１−１０ア
    ルキル〔ここで、置換基は、（１）水素、（２）ヒドロ
    キシ、（３）ハロ、（４）−Ｓ−Ｃ１−４アルキル、
    （５）スリフヒドリル、（６）Ｃ１−６アルキルカルボ
    ニル、（７）カルボキシ、（８） 【化８】 （９）アミノカルボニルアミノ、（１０）Ｃ１−４アル
    キルアミノ、〔ここで、アルキル部分は水素またはヒド
    ロキシで置換されており、アミノは水素またはＣＢＺで
    置換されている。〕（１１）グアニジノ、（１２）ホル
    ミル、（１３）オキシラニル、および（１４）アミノか
    ら選択される。〕（ｃ）アリールＣ１−６アルキル、
    〔ここで、アリールはすぐ上に定義された通りであり、
    モノ及びジ置換されていてもよく、置換基は、それぞれ
    独立にＣ１−６アルキル、ヒドロキシ、アミノ、ホルミ
    ル、チオール、オキシラニル、カルボキシ、アミノＣ１
    −６アルキル、ホルミルＣ１−６アルキル、オキシラニ
    ルＣ１−６アルキル、チオールＣ１−６アルキル、カル
    ボキシＣ１−６アルキル、ヒドロキシＣ１−６アルキ
    ル、およびハロゲンＣ１−６アルキルである。〕からな
    るグループから選択されている前記方法。
  2. 【請求項２】 Ｒ１が、（ａ）置換したＣ１−６アルキ
    ル〔ここで、置換基は、（１）水素、（２）ヒドロキ
    シ、（３）クロロまたはフルオロから選択される。〕、
    および（ｂ）アリールＣ１−６アルキル、〔ここで、ア
    リール基は、（１）フェニル、（２）ナフチル、（３）
    ピリジル、（４）フリル、（５）チエニル、（６）チア
    ゾリル、（７）イソチアゾリル、（８）ベンゾフリル、
    （９）ベンゾチエニル、（１０）インドリル、（１１）
    イソオキサゾリル、および（１２）オキサゾリル、並び
    に、モノおよびジ置換の、上記（１）項より（１２）項
    に定義されたＣ６−１０アリールからなるグループから
    選択され、ここで、置換基はそれぞれ独立にＣ１−４ア
    ルキル、ハロゲン、およびヒドロキシである。〕であ
    り、Ｒ２が水素であり、ＡＡ１が式ＡＩ 【化９】 のアミノ酸であり、ここで、Ｒ７がアリールＣ１−６ア
    ルキルであり、ここで、アリールはすぐ上に定義された
    通りであり、モノ及びジ置換されていてもよく、置換基
    は、それぞれ独立にＣ１−６アルキル、ハロゲン、ヒド
    ロキシ、アミノＣ１−６アルキル、ヒドロキシＣ１−６
    アルキル、チオＣ１−６アルキル、およびホルミルＣ１
    −６アルキルであり、ＡＡ２が式ＡＩＩ 【化１０】 のアミノ酸であり、ＡＡ３が式ＡＩＩＩ 【化１１】 のアミノ酸であり、ここで、Ｒ８およびＲ９がそれぞれ
    独立に、（ａ）水素、（ｂ）置換したＣ１−１０アルキ
    ル〔ここで、置換基は、（１）水素、（２）ヒドロキ
    シ、（３）ハロゲン、（４）スリフヒドリル、（６）Ｃ
    １−６アルキルカルボニル、（７）カルボキシ、（８）
    ホルミル、（９）オキシラニル、（１０）アミノ、から
    選択される。〕（ｃ）アリールＣ１−６アルキル、〔こ
    こで、アリールはすぐ上に定義された通りであり、これ
    はモノ及びジ置換されていてもよく、置換基は、それぞ
    れ独立にＣ１−６アルキル、ヒドロキシ、アミノ、ホル
    ミル、チオール、オキシラニル、カルボキシ、アミノＣ
    １−６アルキル、ホルミルＣ１−６アルキル、オキシラ
    ニルＣ１−６アルキル、チオールＣ１−６アルキル、カ
    ルボキシＣ１−６アルキル、ヒドロキシＣ１−６アルキ
    ル、およびハロゲンＣ１−６アルキルである。〕からな
    るグループから選択されることを特徴とする請求項１に
    記載の方法。
  3. 【請求項３】 Ｒ１がＣ１−３アルキルであり、Ｒ２が
    水素であり、Ｒ８およびＲ９が、それぞれ（ａ）水素、
    （ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）メルカプトＣ１−６ア
    ルキル、（ｄ）ヒドロキシＣ１−６アルキル、（ｅ）カ
    ルボキシＣ１−６アルキル、（ｆ）アミノＣ１−６アル
    キル、（ｈ）ホルミルＣ１−６アルキル、（ｈ）オキシ
    ラニルＣ１−６アルキル、（ｉ）アリールＣ１−６アル
    キル〔ここで、アリール基は、フェニルとインドリルか
    ら選択され、ヒドロキシ、Ｃ１−３アルキル、アミノで
    置換されてもよく、またはカルボキシ、ホルミル、オキ
    シラニル、チオール、ヒドロキシＣ１−６アルキル、ア
    ミノＣ１−６アルキル、カルボキシＣ１−６アルキル、
    ホルミルＣ１−６アルキル、オキシラニルＣ１−６アル
    キル、チオールＣ１−６アルキル、およびハロゲンＣ１
    −６アルキルで置換されてもよい。〕であることを特徴
    とする請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 Ｒ１がメチルであり、Ｒ２が水素であ
    り、Ｒ８がＣ１−６アルキルであり、Ｒ９が置換したＣ
    １−６アルキルであり、置換基は、（ａ）Ｈ（ｂ）Ｏ
    Ｈ、（ｃ）ＣＯ2Ｈ、（ｄ）ＮＨ2、（ｅ）ホルミル、
    （ｆ）オキシラニル、（ｇ）ハロゲン、（ｈ）チオー
    ル、（ｉ）置換したフェニルＣ１−６アルキル〔ここ
    で、置換基はヒドロキシ、アミノ、またはカルボキシ、
    ホルミル、オキシラニル、チオール、ヒドロキシＣ１−
    ６アルキル、アミノＣ１−６アルキル、カルボキシＣ１
    −６アルキル、ホルミルＣ１−６アルキル、オキシラニ
    ルＣ１−６アルキル、チオールＣ１−６アルキル、ハロ
    ゲンＣ１−６アルキルである。〕であることを特徴とす
    る請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 式Ｉの化合物がＮ−（Ｎ−アセチル−チ
    ロシニル−バリニル−リシニル）−３−アミノ−４−オ
    キソブタン酸であることを特徴とする請求項４に記載の
    方法。
  6. 【請求項６】 インターロイキン１β変換酵素の精製用
    アフィニティークロマトグラフィーマトリックスであっ
    て、式Ｉ 【化１２】 の化合物を含み、Ｙは、 【化１３】 であり、Ｒ１は、（ａ）置換したＣ１−１２アルキル
    〔ここで、置換基は、（１）水素、（２）ヒドロキシ、
    （３）ハロゲン、（４）Ｃ１−６アルキルカルボニル、
    （５）ホルミル、（６）アミノ、（７）カルボキシ、
    （８）チオール、および（９）オキシラニルから選択さ
    れる。〕（ｂ）アリールＣ１−６アルキル〔ここで、ア
    リール基は、（１）フェニル、（２）ナフチル、（３）
    ピリジル、（４）フリル、（５）チエニル、（６）チア
    ゾリル、（７）イソチアゾリル、（８）イミダゾリル、
    （９）ベンズイミダゾリル、（１０）ピラジニル、（１
    １）ピリミジル、（１２）キノリル、（１３）イソキノ
    リル、（１４）ベンゾフリル、（１５）ベンゾチエニ
    ル、（１６）ピラゾリル、（１７）インドリル、（１
    ８）プリニル、（１９）イソキサゾリル、および（２
    ０）オキサゾリル、並びに、モノ及びジ置換の、上記
    （１）項より（２０）項に定義したアリールからなるグ
    ループから選択され、ここで、置換基はそれぞれ独立に
    Ｃ１−６アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノＣ１
    −６アルキル、チオＣ１−６アルキル、ホルミルＣ１−
    ６アルキル、およびヒドロキシＣ１−６アルキルであ
    る。〕であり、Ｒ２は、（ａ）Ｈ、（ｂ） 【化１４】 であり、ここで、Ｒ４とＲ５は水素、弗素およびヒドロ
    キシからそれぞれに独立に選択され、Ｒ６は、（１）水
    素、（２）弗素、（３）置換したＣ１−６アルキル〔こ
    こで、置換基は、（ａ）水素、（ｂ）ヒドロキシ、
    （ｃ）ハロ、（ｄ）Ｃ１−６アルキルカルボニルから選
    択される。〕（４）アリールＣ１−６アルキル、〔ここ
    で、アルキルは水素、オキソ、Ｃ１−３アルキル、ハロ
    またはヒドロキシで置換され、ここで、アリールはすぐ
    上に定義された通りであり、モノ及びジ置換されていて
    もよく、置換基は、それぞれ独立にＣ１−６アルキル、
    ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ１
    −６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、およびＣ１−
    ６アルキルカルボニルである。〕（５）Ｃ１−６アルキ
    ルアミノカルボニルＣ１−６アルキルまたはＣ１−６ア
    ルキルカルボニルアミノＣ１−６アルキル、（６）アリ
    ールアミノカルボニルＣ１−６アルキルまたはアリール
    カルボニルアミノＣ１−６アルキル、〔ここで、アリー
    ルはすぐ上に定義された通りであり、モノ及びジ置換基
    されていてもよく、置換基は、それぞれ独立にＣ１−６
    アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルア
    ミノ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、お
    よびＣ１−６アルキルカルボニルである。〕（７）アリ
    ールＣ１−６アルキルアミノカルボニルＣ１−６アルキ
    ル、またはアリールＣ１−６アルキルカルボニルアミノ
    Ｃ１−６アルキル〔ここで、アリールはすぐ上に定義さ
    れた通りであり、モノ及びジ置換されていてもよく、置
    換基は、それぞれ独立にＣ１−６アルキル、ハロゲン、
    ヒドロキシ、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ１−６アルコ
    キシ、Ｃ１−６アルキルチオ、およびＣ１−６アルキル
    カルボニルである。〕からなるグループから選択され、
    ＡＡ１は独立に、（ａ）単結合、および（ｂ）式ＡＩ 【化１５】 のアミノ酸から選択され、ここで、Ｒ７は、（ａ）水
    素、（ｂ）置換したＣ１−１０アルキル〔ここで、置換
    基は下記の物質から選択され、（１）水素、（２）ヒド
    ロキシ、（３）ハロゲン、（４）−Ｓ−Ｃ１−４アルキ
    ル、（５）スリフヒドリル、（６）ホルミル、（７）ア
    ミノ、（８）オキシラニル、（９）Ｃ１−６アルキルカ
    ルボニル、（１０）カルボキシ（１１） 【化１６】 （１２）アミノカルボニルアミノ、（１３）Ｃ１−４ア
    ルキルアミノ、〔ここで、アルキル部分は水素またはヒ
    ドロキシで置換されており、アミノは水素またはＣＢＺ
    で置換されている。〕（１４）グアニジノから選択され
    る。〕、および（ｃ）アリールＣ１−６アルキル〔ここ
    で、アリールはすぐ上に定義された通りであり、モノ及
    びジ置換されていてもよく、置換基は、それぞれ独立に
    Ｃ１−６アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、チ
    オール、カルボキシ、ホルミル、オキシラニルアミノＣ
    １−６アルキル、ホルミルＣ１−６アルキル、オキシラ
    ニルＣ１−６アルキル、チオールＣ１−６アルキル、カ
    ルボキシＣ１−６アルキル、ヒドロキシＣ１−６アルキ
    ル、およびハロＣ１−６アルキルである。〕からなるグ
    ループから選択され、ＡＡ２は独立に、（ａ）単結合、
    および（ｂ）式ＡＩＩ 【化１７】 のアミノ酸から成るグループから選択され、ＡＡ３は独
    立に、（ａ）単結合、および（ｂ）式ＡＩＩＩ 【化１８】 のアミノ酸から成るグループから選択され、ここで、Ｒ
    ８とＲ９はそれぞれ、（ａ）水素、（ｂ）置換したＣ１
    −１０アルキル〔ここで、置換基は、（１）水素、
    （２）ヒドロキシ、（３）ハロゲン、（４）−Ｓ−Ｃ１
    −４アルキル、（５）スリフヒドリル、（６）Ｃ１−６
    アルキルカルボニル、（７）カルボキシ、（８） 【化１９】 （９）アミノカルボニルアミノ、（１０）Ｃ１−４アル
    キルアミノ、〔ここで、アルキル部分は水素またはヒド
    ロキシで置換されており、アミノは水素またはＣＢＺで
    置換されている。〕（１１）グアニジノ、（１２）ホル
    ミル、（１３）オキシラニル、および（１４）アミノか
    ら選択される。〕（ｃ）アリールＣ１−６アルキル、
    〔ここで、アリールはすぐ上に定義された通りであり、
    モノ及びジ置換されていてもよく、置換基は、それぞれ
    独立にＣ１−６アルキル、ヒドロキシ、アミノ、ホルミ
    ル、チオール、オキシラニル、カルボキシ、アミノＣ１
    −６アルキル、ホルミルＣ１−６アルキル、オキシラニ
    ルＣ１−６アルキル、チオールＣ１−６アルキル、カル
    ボキシＣ１−６アルキル、ヒドロキシＣ１−６アルキ
    ル、およびハロＣ１−６アルキルである。〕からなるグ
    ループから選択される前記マトリックス。
  7. 【請求項７】 Ｒ１が、（ａ）置換したＣ１−６アルキ
    ル〔ここで、置換基は、（１）水素、（２）ヒドロキ
    シ、（３）クロロまたはフルオロから選択される。〕、
    および（ｂ）アリールＣ１−６アルキル〔ここで、アリ
    ール基は、（１）フェニル、（２）ナフチル、（３）ピ
    リジル、（４）フリル、（５）チエニル、（６）チアゾ
    リル、（７）イソチアゾリル、（８）ベンゾフリル、
    （９）ベンゾチエニル、（１０）インドリル、（１１）
    イソキサゾリル、および（１２）オキサゾリル、並び
    に、モノ及びジ−置換の、上記（１）項より（１２）項
    に定義されたＣ６−１０アリールからなるグループから
    選択され、ここで、置換基は独立にＣ１−４アルキル、
    ハロゲン及びヒドロキシである。〕であり、Ｒ２が水素
    であり、ＡＡ１が式ＡＩ 【化２０】 のアミノ酸であり、ここで、Ｒ７はアリールＣ１−６ア
    ルキルであり、ここで、アリールはすぐ上に定義された
    通りであり、モノ及びジ置換されていてもよく、置換基
    は、それぞれ独立にＣ１−６アルキル、ハロゲン、ヒド
    ロキシ、Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ１−６アルコキ
    シ、Ｃ１−６アルキルチオ、およびＣ１−６アルキルカ
    ルボニルであり、ＡＡ２が式ＡＩＩ 【化２１】 のアミノ酸であり、ＡＡ３が式ＡＩＩＩ 【化２２】 のアミノ酸であり、ここで、Ｒ８とＲ９が独立に、
    （ａ）水素、（ｂ）置換したＣ１−１０アルキル〔ここ
    で、置換基は、（１）水素、（２）ヒドロキシ、（３）
    ハロゲン、（４）スリフヒドリル、（６）Ｃ１−６アル
    キルカルボニル、（７）カルボキシ、（８）ホルミル、
    （９）オキシラニル、（１０）アミノから選択され
    る。〕（ｃ）アリールＣ１−６アルキル〔ここで、アリ
    ールはすぐ上に定義された通りであり、モノ及びジ置換
    されていてもよく、置換基は、それぞれ独立にＣ１−６
    アルキル、ヒドロキシ、アミノ、ホルミル、チオール、
    オキシラニル、カルボキシ、アミノＣ１−６アルキル、
    ホルミルＣ１−６アルキル、オキシラニルＣ１−６アル
    キル、チオールＣ１−６アルキル、カルボキシＣ１−６
    アルキル、ヒドロキシＣ１−６アルキル、およびハロＣ
    １−６アルキルである。〕からなるグループから選択さ
    れることを特徴とする請求項６に記載のインターロイキ
    ン１β変換酵素精製用アフィニティークロマトグラフィ
    ーマトリックス。
  8. 【請求項８】 Ｒ１がＣ１−３アルキルであり、Ｒ２が
    水素であり、Ｒ８とＲ９の各々が、（ａ）水素、（ｂ）
    Ｃ１−６アルキル、（ｃ）メルカプトＣ１−６アルキ
    ル、（ｄ）ヒドロキシＣ１−６アルキル、（ｅ）カルボ
    キシＣ１−６アルキル、（ｆ）アミノＣ１−６アルキ
    ル、（ｇ）ホルミルＣ１−６アルキル、（ｈ）オキシラ
    ニルＣ１−６アルキル、（ｉ）アリールＣ１−６アルキ
    ル〔ここで、アリール基はフェニルとインドリルから選
    択され、さらにヒドロキシ、Ｃ１−３アルキル、アミ
    ノ、またはカルボキシ、ホルミル、オキシラニル、チオ
    ール、ヒドロキシＣ１−６アルキル、アミノＣ１−６ア
    ルキル、カルボキシＣ１−６アルキル、ホルミルＣ１−
    ６アルキル、オキシラニルＣ１−６アルキル、チオール
    Ｃ１−６アルキル、およびハロＣ１−６アルキルで置換
    されてもよい。〕からなるグループから選択されること
    を特徴とする請求項７に記載のインターロイキン１β変
    換酵素精製用アフィニティークロマトグラフィーマトリ
    ックス。
  9. 【請求項９】 Ｒ１がメチルであり、Ｒ２が水素であ
    り、Ｒ８がＣ１−６アルキルであり、Ｒ９が置換したＣ
    １−６アルキルであり、置換基は、（ａ）Ｈ（ｂ）Ｏ
    Ｈ、（ｃ）ＣＯ2Ｈ、（ｄ）ＮＨ2、（ｅ）ホルミル、
    （ｆ）オキシラニル、（ｇ）ハロゲン、（ｈ）チオー
    ル、（ｉ）置換したフェニルＣ１−６アルキル〔置換基
    はヒドロキシ、アミノ、またはカルボキシ、ホルミル、
    オキシラニル、チオール、ヒドロキシＣ１−６アルキ
    ル、アミノＣ１−６アルキル、カルボキシＣ１−６アル
    キル、ホルミルＣ１−６アルキル、オキシラニルＣ１−
    ６アルキル、チオールＣ１−６アルキル、ハロゲンＣ１
    −６アルキルである。〕であることを特徴とする請求項
    ８に記載のインターロイキン１β変換酵素精製用アフィ
    ニティークロマトグラフィーマトリックス。
  10. 【請求項１０】 前記式Ｉの化合物がＮ−（Ｎ−アセチ
    ル−チロシニル−バリニル−リシニル）−３−アミノ−
    ４−オキソブタン酸であることを特徴とする請求項８に
    記載のインターロイキン１β変換酵素精製用アフィニテ
    ィークロマトグラフィーマトリックス。
  11. 【請求項１１】 更にスペーサを含み、前記スペーサ
    が、Ｒ１、Ｒ７、Ｒ８、またはＲ９で前記式Ｉの化合物
    に共有結合していることを特徴とする請求項６に記載の
    インターロイキン１β変換酵素精製用アフィニティーク
    ロマトグラフィーマトリックス。
  12. 【請求項１２】 前記スペーサがＲ７またはＲ９で前記
    式Ｉの化合物に共有結合していることを特徴とする請求
    項１１に記載のアフィニティクロマトグラフィーマトリ
    ックス。
  13. 【請求項１３】 Ｒ１が、（ａ）置換したＣ１−６アル
    キル〔ここで、置換基は、（１）水素、（２）ヒドロキ
    シ、（３）クロロまたはフルオロから選択される。〕、
    および（ｂ）アリールＣ１−６アルキル〔ここで、アリ
    ール基は、（１）フェニル、（２）ナフチル、（３）ピ
    リジル、（４）フリル、（５）チエニル、（６）チアゾ
    リル、（７）イソチアゾリル、（８）ベンゾフリル、
    （９）ベンゾチエニル、（１０）インドリル、（１１）
    イソオキサゾリル、および（１２）オキサゾリル、並び
    に、モノ及びジ−置換の、上記（１）項から（１２）項
    に定義されたＣ６−１０アリールからなるグループから
    選択され、置換基は独立にＣ１−４アルキル、ハロゲ
    ン、およびヒドロキシである。〕であり、Ｒ２が水素で
    あり、ＡＡ１が式ＡＩ 【化２３】 のアミノ酸であり、ここで、Ｒ７はアリールＣ１−６ア
    ルキルであり、アリールはすぐ上に定義された通りであ
    り、モノ及びジ置換されていてもよく、置換基は、それ
    ぞれ独立にＣ１−６アルキル、ハロゲン、ヒドロキシ、
    Ｃ１−６アルキルアミノ、Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−
    ６アルキルチオ、およびＣ１−６アルキルカルボニルで
    あり、ＡＡ２が式ＡＩＩ 【化２４】 のアミノ酸であり、ＡＡ３が式ＡＩＩＩ 【化２５】 のアミノ酸であり、ここで、Ｒ８とＲ９が独立に、
    （ａ）水素、（ｂ）置換したＣ１−１０アルキル〔ここ
    で、置換基は、（１）水素、（２）ヒドロキシ、（３）
    ハロゲン、（４）スリフヒドリル、（６）Ｃ１−６アル
    キルカルボニル、（７）カルボキシ、（８）ホルミル、
    （９）オキシラニル、（１０）アミノから選択され
    る。〕、（ｃ）アリールＣ１−６アルキル〔ここで、ア
    リールはすぐが上に定義された通りであり、モノ及びジ
    置換されていてもよく、置換基は、それぞれ独立にＣ１
    −６アルキル、ヒドロキシ、アミノ、ホルミル、チオー
    ル、オキシラニル、カルボキシ、アミノＣ１−６アルキ
    ル、ホルミルＣ１−６アルキル、オキシラニルＣ１−６
    アルキル、チオールＣ１−６アルキル、カルボキシＣ１
    −６アルキル、ヒドロキシＣ１−６アルキル、およびハ
    ロＣ１−６アルキルである。〕からなるグループから選
    択されることを特徴とする請求項１２に記載のアフィニ
    ティークロマトグラフィーマトリックス。
  14. 【請求項１４】 Ｒ１がＣ１−３アルキルであり、Ｒ２
    が水素であり、Ｒ８とＲ９が独立に、（ａ）水素、
    （ｂ）Ｃ１−６アルキル、（ｃ）メルカプトＣ１−６ア
    ルキル（ｄ）ヒドロキシＣ１−６アルキル、（ｅ）カル
    ボキシＣ１−６アルキル、（ｇ）アミノＣ１−６アルキ
    ル、（１）アリールＣ１−６アルキル〔ここで、アリー
    ル基はフェニルとインドリルから選択され、さらにヒド
    ロキシ、Ｃ１−３アルキル、アミノ、またはカルボキ
    シ、ホルミル、オキシラニル、チオール、ヒドロキシＣ
    １−６アルキル、アミノＣ１−６アルキル、カルボキシ
    Ｃ１−６アルキル、ホルミルＣ１−６アルキル、オキシ
    ラニルＣ１−６アルキル、チオールＣ１−６アルキル、
    およびハロＣ１−６アルキルによって置換されてもよ
    い。〕であることを特徴とする請求項１３に記載のアフ
    ィニティークロマトグラフィーマトリックス。
  15. 【請求項１５】 Ｒ１がメチルであり、Ｒ２が水素であ
    り、Ｒ８がＣ１−６アルキルであり、Ｒ９が置換したＣ
    １−１０アルキルであり、ここで、置換基は、（ａ）
    Ｈ、（ｂ）ＯＨ、（ｃ）ＣＯ2Ｈ、（ｄ）ＮＨ2、（ｅ）
    ホルミル、（ｆ）オキシラニル、（ｇ）ハロゲン、
    （ｈ）チオール、（ｉ）置換したフェニルＣ１−６アル
    キル〔ここで、置換基はヒドロキシ、アミノ、またはカ
    ルボキシ、ホルミル、オキシラニル、チオール、ヒドロ
    キシＣ１−６アルキル、アミノＣ１−６アルキル、カル
    ボキシＣ１−６アルキル、ホルミルＣ１−６アルキル、
    オキシラニルＣ１−６アルキル、チオールＣ１−６アル
    キル、ハロＣ１−６アルキルである。〕であることを特
    徴とする請求項１４に記載のアフィニティークロマトグ
    ラフィーマトリックス。
  16. 【請求項１６】 前記式Ｉの化合物がＮ−（Ｎ−アセチ
    ル−チロシニル−バリニル−リシニル）−３−アミノ−
    ４−オキソブタン酸であることを特徴とする請求項１５
    に記載のアフィニティークロマトグラフィーマトリック
    ス。
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