JPH05240861A - 微生物の免疫学的測定方法及び微生物濾過容器 - Google Patents

微生物の免疫学的測定方法及び微生物濾過容器

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JPH05240861A
JPH05240861A JP4043151A JP4315192A JPH05240861A JP H05240861 A JPH05240861 A JP H05240861A JP 4043151 A JP4043151 A JP 4043151A JP 4315192 A JP4315192 A JP 4315192A JP H05240861 A JPH05240861 A JP H05240861A
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JP
Japan
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microorganism
sample water
sample
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water outlet
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JP4043151A
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Akira Matsuyuki
昭 松行
Masayoshi Fukuoka
正芳 福岡
Susumu Nagasaki
進 長崎
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Meidensha Corp
Meidensha Electric Manufacturing Co Ltd
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Meidensha Corp
Meidensha Electric Manufacturing Co Ltd
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    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N1/10Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state
    • G01N1/14Suction devices, e.g. pumps; Ejector devices
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 微生物の回収操作を容易かつ短時間に行うこ
とができ、かつ微生物の回収率を高くかつ安定化するこ
とができる微生物の免疫学的測定方法及び微生物濾過容
器を提供する 【構成】 試料水流入口2及び濾過水流出口3を備えた
外筒1の内部に、この外筒内を試料水流入口側と試料水
流出口側とに仕切る微生物捕捉フィルタ4を有する微生
物濾過容器を用意し、この微生物濾過容器内に試料水を
流通して微生物を捕捉した後に、上記試料水流入口から
超音波破砕用懸濁液を注入する。更に、前記懸濁液を注
入した微生物濾過容器内の微生物を超音波破砕すること
を特徴とする微生物の免疫学的測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、微生物の免疫学的測定
方法に関し、特に試料水中の微生物数を測定する際の前
処理に関する。
【0002】
【従来の技術】従来、試料水中の微生物の測定は、メン
ブランフィルタにより試料水を濃縮して超音波破砕した
後に免疫測定を行うことによりなされている。
【0003】このメンブランフィルタにより試料水の濃
縮を行う際は、濃縮時間の短縮や夾雑物の除去を行うた
めにプレフィルタを用いる必要がある。
【0004】図3に上記プレフィルタ及びメンブランフ
ィルタを用いた微生物濃縮装置の説明図を示す。
【0005】この図に示されるように、この微生物濃縮
装置は試料水を入れる漏斗21、この試料水を濾過濃縮
する濾過部22、濾過濃縮された試料水を収容する枝付
きフラスコ23、及び漏斗21と枝付きフラスコ23と
を固定する固定ばさみ26により構成されている。
【0006】図4はこの微生物濃縮装置の濾過部の拡大
図を示し、濾過部22は漏斗21とOリング24、メン
ブランフィルタ25、枝付きフラスコ23ががこの順に
配置されて形成されている。
【0007】上記装置にて微生物の濃縮を行うには、漏
斗21に試料水をいれ、枝付きフラスコ27の枝管を通
じて吸引ポンプにて内圧を低くすることにより試料水を
枝付きフラスコ内部に吸引する。
【0008】この際、試料水中の微生物は濾過部のメン
ブランフィルタ5に捕捉されるので、このメンブランフ
ィルタ5を回収し、ガラスビーカ内にて緩衝液及びガラ
スビーズを加えて振とうする。
【0009】これによりメンブランフィルタの表面に補
足された菌を緩衝液中に均一に懸濁させた後、上記懸濁
液をピペットにて分取し、サンプルチューブに移す。
【0010】更に、超音波破砕器にてサンプルチューブ
内の懸濁液の超音波破砕を行った後に酵素免疫測定を行
うことにより試料水中の微生物を測定している。
【0011】
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記従来の測
定方法においては酵素免疫測定の前処理である回収操作
が繁雑で回収率が一定とはなり難く、測定精度が低くな
る。また回収操作に15分程度を必要とし、時間のロス
が大きい。
【0012】更に枝付きフラスコや漏斗等の濾過装置や
回収時に用いる振とう機等の大がかりな装置や器具が必
要となるうえ、前処理の自動化も困難である。
【0013】本発明は上記背景の下になされたものであ
り、微生物の回収操作を容易かつ短時間に行うことがで
き、かつ微生物の回収率を高くかつ安定化することがで
きる微生物の免疫学的測定方法及び微生物濾過容器を提
供することを目的とする。
【0014】
【課題を解決するための手段及び作用】上記課題を解決
するため、本発明は試料水流入口及び濾過水流出口を備
えた外筒の内部に、この外筒内を試料水流入口側と試料
水流出口側とに仕切る微生物捕捉フィルタを有する微生
物濾過容器を用意し、次に前記微生物濾過容器内に試料
水を流通することにより前記微生物捕捉フィルタに微生
物を捕捉した後に、前記試料水流入口から超音波破砕用
懸濁液を注入し、更に超音波破砕装置にて前記懸濁液を
注入した微生物濾過容器内の微生物を超音波破砕するこ
とを特徴とする。
【0015】また、試料水流入口及び濾過水流出口を備
えた外筒の内部に、この外筒内を超音波破砕用懸濁液の
注入が可能な試料水流入口側と、試料水流出口側とに仕
切る微生物捕捉フィルタを設けたことを特徴とする微生
物濾過容器も提供される。上記のように微生物の捕捉及
び破砕を行うことで微生物を容易かつ高収率にて回収す
ることができ、また回収時間も大幅に短縮することがで
きる。
【0016】以下、本発明を更に詳細に説明する。
【0017】まず、本発明を実施するにあたって、試料
水流入口及び濾過水流出口を備えた外筒の内部に、この
外筒内を試料水流入口側と試料水流出口側とに仕切る微
生物捕捉フィルタを有する微生物濾過容器を用意する。
【0018】上記外筒の形状は特に限定されないが、例
えば円筒形が挙げられる。上記微生物捕捉フィルタの形
状も特に限定されないが、表面積が大きい形状、例えば
円筒形等が挙げられる。尚、微生物の回収率を高くする
ために、上記微生物捕捉フィルタとしては、ポアサイズ
0.45μm以下のものを使用することが好ましい。
【0019】また、好ましくは上記外筒内に水の透過が
可能なフィルタ支持部を設け、これにより微生物捕捉フ
ィルタの保護及び強度増強を行う。
【0020】次に、上記微生物濾過容器の試料水流入口
を通じて試料水を流入する。これにより、試料水は上記
微生物捕捉フィルタにより濾過を行われた後に濾過水流
出口より流出する。
【0021】この際、濾過は好ましくは減圧濾過及び加
圧濾過等の方法により行う。
【0022】上記濾過を終えた後に、上記試料水流入口
を通じて超音波破砕用懸濁液を注入する。この際、超音
波破砕用懸濁液が濾過水流出口から流出すると回収率が
低くなるので、好ましくは濾過水流出口を密閉した後に
超音波破砕用懸濁液を注入する。
【0023】更に、超音波破砕装置により上記微生物濾
過容器内の微生物の破砕を行う。従って、微生物捕捉フ
ィルタごと超音波破砕を行うので、従来必要とされた振
とう工程、懸濁液の分取、及びこの懸濁液をサプルチュ
ーブへ回収する工程等が不要となる。
【0024】上記のように微生物の捕捉及び超音波破砕
を行った後に免疫測定を行うことにより、正確かつ測定
感度の高い微生物の免疫学的測定を行うことができる。
【0025】
【実施例】以下、本発明を実施例によって説明する。
【0026】本実施例においては、図1に示す濾過容器
を用いて濾過を行った後に、内筒と外筒との間隙部に超
音波破砕懸濁液としてウシ血清アルブミンを含むトリス
−塩酸緩衝液を加え、超音波破砕装置により超音波照射
を行って微生物の破砕を行うものとした。
【0027】図1において1は試料水流入口2及び濾過
水流出口3を有する外筒である。
【0028】この外筒1の内部には、円筒状で一端側が
開口し、この開口側を濾過水流出口3側に配置して外筒
内部を試料水流入口2側と濾過水流出口3側とに仕切る
フィルタ支持部4が設けられている。尚、上記フィルタ
支持部は、その開口側を試料水2側に配置してもよい。
【0029】また、このフィルタ支持部4の試料水流入
口側の表面を、微生物捕捉フィルタとしてミクロフィル
タ5にて覆う構成となっている。
【0030】尚、このフィルタ支持部4は、水の透過が
可能な材質にて形成するか、もしくは金属メッシュ等の
水の透過が可能な構造とする等の方法により、ミクロフ
ィルタ5により濾過された水の透過が可能な構成とす
る。また、ミクロフィルタとしては好ましくはポアサイ
ズ0.45μm以下のものを用いる。従って、上記濾過容器
においては、試料水流入口2から流入する試料水は必ず
上記ミクロフィルタ5により濾過された後に濾過水流出
口3から流出する構成となる。
【0031】上記濾過容器により試料水の濾過を行った
後に、外筒1の試料水流入口2から緩衝液を加えて濾過
水流出口3を密閉することにより、内筒と外筒の間に緩
衝液を入れる。
【0032】更にこの緩衝液を入れて濾過水流出口3を
密閉した濾過容器を、上記図6に示す超音波破砕器にそ
のままセットして破砕を行う。
【0033】本実施例においては、大腸菌群を含む同一
の試料水を上記従来の前処理方法、及び上記濾過容器を
用いた前処理方法により処理を行った後に、酵素免疫測
定により大腸菌群の測定を行い、上記前処理方法により
従来法と同等の結果が得られるこどうかの評価を行っ
た。以下にその詳細を示す。
【0034】(a) 本実施例に係る前処理 まず、大腸菌群濃度5×104(個/ml)の試料水50mlを、図
1の濾過容器6を用いた図2に示す濾過装置10により
濾過を行った。
【0035】尚、図2において、7は試料水を入れる容
器、8はゴムチューブ、9はローラーポンプであり、ゴ
ムチューブ8の一端は容器7内に配置され、他端は濾過
容器6の試料水流入口2に接続されている。
【0036】従って、試料水はローラーポンプ9によ
り、ゴムチューブ8を通じて濾過容器6に流入し、濾過
される構成となる。
【0037】上記方法により濾過を終えた後に、濾過容
器の濾過水流出口3をシールした後に、試料水流入口2
からトリス−BSA2.5ml添加し、超音波破砕装置(コ
スモ・バイオ(株)製、UCD−200T)にて破砕を
行った。尚、破砕条件は160W、10サイクル(30
秒照射−60秒休止)とした。
【0038】また、上記微生物の分析方法において、試
料水に替えて減菌蒸留水50mlを同様に処理し、ブランク
とした。
【0039】(b) 免疫測定 まず、上記の前処理により超音波破砕を行った試料0.1m
lと、0.1%ウシ血清アルブミン及び0.1%アジ化ナトリ
ウムを含むpH8.5の0.1mol/lホウ酸緩衝液0.2mlとをプ
ラスチック製トレイに入れ、ウサギ抗大腸菌群IgG被
覆ポリスチレンボール1個を入れる。
【0040】これを室温にて1時間反応後、蒸留水にて
固相を3回洗浄し、グルコースオキシターゼ標識ウサギ
抗大腸菌群Fab'を0.3ml加え、更に室温にて1時間反応
後、蒸留水にて固相を3回洗浄する。
【0041】次に、0.5mol/lグルコースを含むpH5.1の
0.01mol/l酢酸緩衝液を0.3mlずつ加え、37℃にて30分間
静置する。
【0042】この反応液を0.1mlとり、2×10-7mol/lル
ミノールを含むpH9.8の0.2mol/l炭酸緩衝液と、6×10
-3mol/lフェリシアン化カリウム水溶液をそれぞれ0.5ml
ずつ加え、16秒〜45秒の化学発光量を測定した。
【0043】次に、比較例として、以下の方法にて微生
物の分析を行った。
【0044】(A)従来例に係る前処理 大腸菌群濃度5×104(個/ml)の試料水100mlをステンレ
スホルダーにいれ、図1及び図2に示す濾過装置にて濾
過を行った。尚、図1及び2において、メンブランフィ
ルターとしてはポアサイズ0.4μmのポリカーボネイト製
ニュクリポアー(野村マイクロサイエンス社登録商標)
を用いた。
【0045】次に、上記メンブランフィルターをビーカ
ーにいれ、直径4mmのガラスビーズをメンブラン上に隙
間なく敷き詰め、0.5%ウシ血清アルブミンを含む0.05m
ol、pH8.0のトリス−塩酸緩衝液(トリス−BSA)を
5ml添加し、これを振とう機にセットし、120rpmにて10
分間振とうを行った。
【0046】その後、上記トリス−BSAを3ml超音波
破砕用容器にとり、超音波破砕装置(島津製作所製、U
SP−600)で破砕を行った。尚、破砕条件はOUT
PUTCONTROL 3、間欠30%、氷冷、5分と
した。
【0047】尚、上記微生物の測定方法において、試料
水に替えて減菌蒸留水100mlを同様に処理してブランク
とした。
【0048】(b) 免疫測定 上記実施例と同様の方法にて測定を行った。
【0049】上記実施例及び比較例により得られた各試
料液及び各ブランクにおける化学発光量を表1に示す。
【0050】
【表1】
【0051】表1に示されるように、本実施例において
はブランク試験においては発光量が小さく、かつ試料水
の発光量は従来例よりも大きい。従って、従来法以上に
良好な感度が得られていることがわかる。
【0052】
【発明の効果】以上説明したように、本発明においては
微生物の免疫学的測定における微生物の繁雑な回収操作
が不要となり、また非常に高い回収率を安定して得られ
るので、測定精度が著しく向上し、測定時間も大幅に短
縮される。
【0053】また、従来の測定にて必要とされた濾過装
置や回収に用いる振とう機等の種々の装置及び器具が不
要となってコスト的にも有利であり、更に微生物の分析
における前処理の自動化も容易である。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の一実施例に係る微生物捕捉容器の断面
【図2】本発明の一実施例に係る微生物の濾過装置の説
明図
【図3】従来例に係る微生物の濾過装置の説明図
【図4】従来例に係る微生物の濾過装置の説明図
【符号の説明】
1…漏斗 2…濾過部 3…枝付きフラスコ 4…Oリング 5…プレフィルター 7…メンブランフィルター 8…固定ばさみ 9…ローラーポンプ 10…吸引濾過装置 21…漏斗 22…濾過部 23…枝付きフラスコ 24…Oリング 25…メンブランフィルタ 26…固定ばさみ 27…枝付きフラスコ

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 試料水流入口及び濾過水流出口を備えた
    外筒の内部に、この外筒内を試料水流入口側と試料水流
    出口側とに仕切る微生物捕捉フィルタを有する微生物濾
    過容器を用意し、 次に前記微生物濾過容器内に試料水を流通することによ
    り前記微生物捕捉フィルタに微生物を捕捉した後に、前
    記試料水流入口から超音波破砕用懸濁液を注入し、 更に超音波破砕装置にて前記懸濁液を注入した微生物濾
    過容器内の微生物を超音波破砕することを特徴とする微
    生物の免疫学的測定方法。
  2. 【請求項2】 試料水流入口及び濾過水流出口を備えた
    外筒の内部に、この外筒内を超音波破砕用懸濁液の注入
    が可能な試料水流入口側と、試料水流出口側とに仕切る
    微生物捕捉フィルタを設けたことを特徴とする微生物濾
    過容器。
JP4043151A 1992-02-28 1992-02-28 微生物の免疫学的測定方法及び微生物濾過容器 Pending JPH05240861A (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3018193A4 (en) * 2013-07-05 2017-02-15 Satake Corporation Microorganism concentrator

Cited By (3)

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US10260997B2 (en) 2013-07-05 2019-04-16 Satake Corporation Microorganism concentrator
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