JPH05168473A - 新規なヘルペスウィルスの組み換え体と、これらの組み換え体に基づくワクチンと、その製造方法と、製造に用いる遺伝子、ベクター及びプラスミド - Google Patents

新規なヘルペスウィルスの組み換え体と、これらの組み換え体に基づくワクチンと、その製造方法と、製造に用いる遺伝子、ベクター及びプラスミド

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JPH05168473A
JPH05168473A JP3255852A JP25585291A JPH05168473A JP H05168473 A JPH05168473 A JP H05168473A JP 3255852 A JP3255852 A JP 3255852A JP 25585291 A JP25585291 A JP 25585291A JP H05168473 A JPH05168473 A JP H05168473A
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ジョセフ ノーマン ロス ルイス
Matthew Mckinley Binns
マッキンレイ ビンス マシュー
Arielle Rey-Senelonge
レイ−スヌローニュ アリエル
Michel Emile Albert Riviere
エミール アルベール リヴィエール ミシェル
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規なヘルペスウィルスの組み換え体と、こ
れらの組み換え体に基づくワクチンと、その製造方法
と、製造に用いる遺伝子、ベクターおよびプラスミド 【構成】 キナーゼ蛋白をコードするマレック病ウィル
スの短い特異領域Usの塩基配列。ヘルペスウィルスのキ
ナーゼ蛋白をコードする遺伝子上の相同性のある領域に
ヘテロ遺伝子が挿入されたウィルスの組み換え体。血清
型の異なるマレック病ウィルスの鳥類の病原物質の遺伝
子を発現するマレック病ウィルスの組み換え体。これら
組み換え体の製造方法とそれから得られるワクチン。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヘルペスウィルス組み換
え体 (virus herps recombinant)、特にワクチン製造用
のヘルペスウィルスと、その製造方法と、この製造方法
の過程で得られるプラスミドとに関するものである。本
発明はさらに、上記ワクチンの製造で使用可能なマレッ
ク病ウィルス（Marek's disease virus MDV)のゲノムの
一部にも関するものである。
【０００２】
【従来の技術】外部遺伝子、特に抗原蛋白質をコードす
る遺伝子の発現ベクターとしては種々の形式のウィルス
が使用されており、これらが動物の免疫感作に有用であ
るということは証明されている。組み換えウィルスを作
るためにワクチンウィルスは広く利用されてきた。ヘル
ペスウィルスすなわち単純ヘルペスウィルス (HSV) (M.
Shih達、Proc. Natl. Acad. Sci., USA、1984年、第81
巻、第5867-5870 頁) や水痘・帯状ヘルペスウィルス(V
ZV) (R. Lowe達、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1987
年、第84巻、第3896-3900 頁) のヘルペスウィルスも用
いられてきた。すなわち、外部遺伝子をこれらヘルペス
ウィルスのゲノムのＤＮＡ断片のウィルス自身の複製に
は必須ではない領域に挿入し、プラスミド中でクローニ
ングする。外部遺伝子は相同組み換えによってウィルス
のゲノム中に組み込まれる。上記ゲノムＤＮＡは本来感
染性であるので、この組み込み段階はヘルペスゲノムＤ
ＮＡとプラスミドとの同時形質転換(cotransfection)に
よって行われる。
【０００３】種々のヘルペスウィルスの遺伝子がウィル
スの成長に必須でない遺伝子として同定されており、こ
れらの内のいくつかはビルレンス（病原体の毒性）と関
連付けられている。 (1) 単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子
（D. Dubbs達, Virology,1965年, 22巻, 493-502 頁)
、アウゼスキー(Aujeszky)ウィルスのチミジンキナー
ゼ遺伝子(G. Tatarov,Zentralbl. Vet. Med. , 1968
年, 15B 巻, 848-853 頁) 、牛の感染性ライノウィルス
気管炎ウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子 (S.Kit 達、
Virology, 1983年、 130巻, 381-389 頁) 。 (2) アウゼスキーウィルスのgIII遺伝子（A. Robins
達、J. Virol., 1986年、59 巻, 635-645 頁) 。 (3) アウゼスキーウィルスのgX遺伝子（D. Thomsen達、
J. Virol., 1987年、61巻, 229-232 頁) 。 (4) アウゼスキーウィルスのgI遺伝子（C. Mettenleite
r 達、J. Virol., 1987年, 61巻, 4030-4032 頁) 。 これらの遺伝子を取り除いたウィルスはマウスに対する
潜伏的な感染を起こす能力を保持している。
【０００４】マグニー(B. Magnier)達は単純ヘルペスウ
ィルス HSV-1のゲノムの特異な短い領域に関する研究を
行って (Virology、1988年、162 巻、251-254 頁) 、こ
の短い領域を取り除いたウィルス HSV-1は弱毒化してい
ることを明らかにした。プルベス(F.C. Purves) 達は H
SV-1ウィルスの短い断片のオープンリーディングフレー
ム(open reading frame) US3がウィルスの酵素、キナー
ゼ蛋白をコードし、ウィルスの複製には必須ではないこ
とを示している (Journal of Virology,1987年, 61巻,
9 号,2896-2901頁) 。
【０００５】ガンマヘルペスウィルスの亜科に属するマ
レック病 (maladie de Marek) ウィルスに関する研究も
行われている。このウィルスは約 175キロベースの二重
セグメント( segment)の直線状ゲノムＤＮＡを有するエ
ンベロープ（膜構造）をもつウィルスである。このウィ
ルスのゲノムは両側に末端反復配列を有する長いセグメ
ント（UL）と短いセグメント(Us)とで構成されている。
マレック病ウィルスは通常２〜５ヵ月のニワトリに麻痺
やリンパ増殖性疾患を起こす。この病気は重大な経済的
損失を与える（L. Payne, Biology of Marek'sDiseaseV
irus and the Herpes Virus of Turkeys, in the Herpe
s Virus, 第１巻、347-431 頁, B. Roizman, Plenum Pr
ess) 。 マレック病ウィルスは下記の３つの血清型に分類され
る: (1) 血清型１： 病原性株およびこれに由来する弱毒株 (2) 血清型２： 天然の弱毒株 (3) 血清型３： 七面鳥のヘルペスウィルス（HVT)とそ
の変異株。 従って、弱毒化マレック病ウィルスという用語は上記の
血清型１、２および３を同時に意味する。
【０００６】マレック病ウィルス（MDV)と七面鳥のヘル
ペスウィルス（HVT)とは良く似た染色体構造を持ち（A.
Buckmaster 達、J. Gen. Virol., 1988年, 第69巻, 第
2033-2042 頁) 、そのゲノム全般にわって多数の相同な
塩基配列を有している (C.Gibbs 達、Proc. Acad. Nat
l. Sci. USA, 1984年, 81巻, 3365-3369 頁) 。生後一
日で予防接種を受けたひなどりは、マレック病に対して
一生涯続く防御力を得る。長い間、この病気を抑えるた
めには七面鳥のヘルペスウィルス（HVT)を用いた予防接
種が非常に効果的であった。しかし、高い病原性を持っ
た新しいウィルス株が出たため、予防効果を向上させた
別の血清型のマレック病ウィルスの弱毒株、例えばマレ
ック病ウィルス血清型１のCVI 988 株を細胞間移動によ
って弱毒化したもの（B. Rispens達、AvianDis., 1972
年, 16巻, 1108-125頁)やマレック病ウィルス血清型３
の七面鳥のヘルペスウィルスと血清型２のSB１株との混
合物（K. Schat達、J. Natl. CancerInst., 1987 年,
第60巻, 1075-1082頁) 等が接種されている。
【０００７】マレック病ウィルスのゲノムはαウィル
ス、単純ヘルペスウィルス(HSV）および水痘・帯状ヘル
ペスウィルス（VZV)にかなり良く似ている。このゲノム
の長い領域 UL 上に局在している大部分の遺伝子は単純
ヘルペスウィルス、水痘・帯状ヘルペスウィルス（D. M
cGeoch, J. Gen, Virol., 1988年, 第69巻, 1531-1574
頁) とマレック病ウィルス(A. Buckmaster, 1988年) と
の間でほぼ互いにリニアー (colinaire)な関係にある。
国際特許公開 WO 90/02802号には、 HVTと MDVのこの領
域に遺伝子を挿入する方法が提案されている。一方、Us
フラグメント上の遺伝子配列は各ヘルペスウィルスで大
きく異なってる。すなわち、単純ヘルペスウィルスにつ
いて確認された多くのオープンリーディングフレームの
うち、水痘・帯状ヘルペスウィルスと相同関係があるの
は僅かに４個である（McGeoch, 1988 年, 上記参照) 。
このことは、過去において、マレック病ウィルスのゲノ
ムの短いユニーク配列と HSV-1のゲノムとの相同性の研
究をするこという発想は全く無かったという事実を示し
ている。
【０００８】本発明は、マレック病ウィルス（MDV)のゲ
ノムのキナーゼ蛋白をコードしている配列を最初に明ら
かにし、驚くべきことにウィルスの複製をブロックしな
くてもこの遺伝子が除去可能であること、そして、そこ
にヘテロな配列を挿入して一連のウィルス発現ベクター
を開発する道を開くことができるということを最初に明
らかにしたものである。遺伝子を組み換えたこのような
弱毒化マレック病ウィルスはこの病気のワクチンとして
使用可能な特性を有する他に、ウィルス性、細菌性およ
び寄生虫に起因する他の病気、例えば鳥類の感染性気管
支炎、ニューカッスル病、ニワトリのペスト、エッグド
ロップシンドローム(egg-drop syndorome)、ガンボロ
(Gumboro)病、ニワトリの貧血症、コクシジウム症、鶏
痘、感染性喉頭気管炎、鳥類の大腸菌症、パスツレラ
症、血友病等に対するワクチンとして利用可能であると
いう利点を有しているので、家禽類の多価抗体予防接種
用の外部遺伝子を発現するウィルスベクター開発のため
の選択候補になる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヘル
ペスウィルスの組み換え体と、ワクチンとして利用可能
な組み換えをした弱毒化マレック病ウィルス（血清型
１、２または３）と、ウィルス性、細菌性または寄生虫
に起因する鳥類の疾患に対する多価抗体予防接種を可能
にするベクターウィルスおよび組み換えウィルスの製造
方法とを提供することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明の一つの対象は、
単純ヘルペスウィルスのキナーゼ蛋白の遺伝子と相同な
US３遺伝子およびその周辺領域に対応するヌクレオチド
配列とその変異体にある。ここで、ヌクレオチド配列の
「変異体 (variantes)」とは、一般的に使われるよう
に、例えばコードの脱落、小規模な変異、突然変異によ
って生じるような全ての均等な配列または異種ウィルス
の対応する配列等を意味する。本発明の他の対象は、擬
似恐水病 (maladie d'Aujesky)、牛の感染性ライノウィ
ルス気管炎(rhinotracheite infectieuse)、馬のライノ
ウィルス肺臓炎、猫のライノウィルス気管炎、犬のヘル
ペスなどの原因となるウィルスを含むヘルペスウィルス
から選択した組み換えウィルスにある。本発明のさらに
他の対象は、マレック病ウィルスのUS３遺伝子に対応す
るゲノム領域に発現可能な状態で挿入された１つ以上の
ヘテロ遺伝子を有するマレック病ウィルスの組み換え体
にある。
【００１１】「ヘテロ（異種）遺伝子」とは、ウィル
ス、細菌または寄生虫の病原物質、特に鳥類の病原物質
の蛋白または抗原糖蛋白をコードする遺伝子をいう。こ
のヘテロ遺伝子には雑種ウィルスの構成物、例えばマレ
ック病ウィルスの血清型１および／または２の抗原をコ
ードする遺伝子を七面鳥のヘルペスウィルスに導入した
ハイブリッドウィルスの構成物も含まれる。この「ヘテ
ロ遺伝子」という用語はペプチドまたは蛋白質、例えば
ホルモン、成長因子、免疫調節物質等のペプチドまたは
蛋白質をコードする遺伝子を意味する。このヘテロ遺伝
子は US3遺伝子の転写調節配列のコントロール下で発現
されるものであるのが好ましい。しかし、この発現を、
これ以外の別の遺伝子に由来するプロモータ配列、例え
ばTK遺伝子、gA遺伝子、gB遺伝子のプロモータ配列によ
って調節するか、他のヘルペスウィルスのプロモータ、
例えば牛の感染性ライノウィルス気管炎ウィルスのｇＩ
遺伝子または疑似恐水病ウィルスのIIまたはIII遺伝子
のプロモータの配列によって調節することもできるとい
うことは理解できよう。US３遺伝子の開始コドンおよび
終止コドンは発現させる遺伝子自身のもので置換するの
が好ましい。
【００１２】
【実施例】材料および方法 ウィルス株 マレック病ウィルス (MDV)の血清型１ RB1B 株を用いた
(Schat K.A.達, 1982年, Avian Pathol. 11巻, 593-60
5 頁) 。ウィルスの培養法とウィルスの高分子量ＤＮＡ
の抽出方法は C. Lee 達の1980年, J. Gen. Virol., 51
巻, 235-253頁; N. Ross 達の1989年, 第70巻, 1789-
1804頁に記載されている。細胞培養 N. Ross, 1975 年, J. Gen. Virol., 28巻, 第37-47 頁
に記載の方法で、にわとりの胚の繊維芽細胞（CEP)をペ
ニシリン、ストレプトマイシン、ファンジゾーン（fung
izone)およびウシ胎児血清を加えた培地199 F10 で培養
した。ウィルスＤＮＡのクローニング 組み換えプラスミドの調製はマニアチス (T. Maniatis)
達の方法(T. Maniatis達, 1982年、Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaborato
ry, Cold Spring Harbor, NY) を用いた。クローニング
およびサブクローニングの全ての段階で、適切な制限酵
素で直鎖化したベクターをリゲーションの前に脱リンし
た。アガロースゲルからのＤＮＡ断片の精製はメーカ
ー：ジェネクリーン社 (Geneclean 、Bio 101, San Di
ego,California, USA)の記載の方法で行った。塩基配列決定 クローニングされた断片はサンガー(Sanger)の古典的な
方法 (G. Sanger, S.Nicklen, A. Coulson, 1977 年, P
roc. Natl. Acad., USA 第74巻 , 5463-5467頁) で配
列を決定した。翻訳後の配列を既に公表されている単純
ヘルペスウィルスおよび水痘・帯状ヘルペスウィルスの
配列(McGeogh, 1985年, J. Mol. Biol.第181 巻, 1, 1
3; K. Davison 達, 1986年, J. Gen, Virol. 67巻, 17
59-1816頁) と比較した。コントロール下での突然変異誘起 ブルースクリプト (Blue Script)ベクター (Stratagen
e, La Jolla, Califor-nia, USA) にサブクローニング
されたＤＮＡ断片を、R408ヘルパーファージ (M.Russe
l, S. Kidd, M. Kelley, 1986年, Gene 45 巻, 333-338
頁) を用いて単純なDNA 断片を分離した後に、突然変
異を誘起させる。突然変異誘起の手順と、E. Coli の C
J236 dut -および ung- 株を用いた突然変異体の選択手
順はクンケル (T. Kunkel, 1985年, Proc. Natl. Aca
d. Sci.,82巻 488-492頁および T. Kunkel達, 1987年,
Methods of Enzymology 154巻,367-382 頁, Acad. Pre
ss)に記載されている。生体内組み換え 組み換えウィルスは感受性細胞にＤＮＡを取り込ませる
従来公知の方法、例えばリン酸カルシウム法やメーカー
BRLに記載のリポフェクチン反応物質を用いる方法(P.
L.Felgner達, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84
巻, 7413頁) で行った。すなわち、ニワトリの胚の繊
維芽細胞が塊になる状態まで培養し、ゲノムＤＮＡと、
両側の５’と３’末端に組み換えを起こすような染色体
配列を備えた挿入ＤＮＡ断片を運ぶプラスミドとを用い
て同時形質転換(cotransfection)を行った。次いで、組
み換えウィルスを適当なプローブを用いたハイブリダイ
ゼーションあるいはプラークカラーリングによってスク
リーニングする。遺伝子マーカーであるβ−ガラクトシ
ダーゼのlacZ遺伝子がマレック病ウィルスの遺伝子に挿
入されていれば、β−ガラクトシダーゼの色原体基質、
例えばＸgel(5-ブロモ-4- クロロ-3- インドリル- β-D
- ガラクトシド) を含むアガロースを、細胞の表面に添
加することによって、この遺伝子の発現を追うことがで
きる。
【００１３】実施例１ 5.25キロベースのEcoRＩ断片の単離 ウィルスのゲノムＤＮＡを制限酵素 EcoR Ｉで切断し、
断片をベクター pUC13( ファルマシア社) にクローニン
グした (Yannisch, perron達, 1985年, Gene,33巻, 10
3-119 頁) 。クローニングされた断片の内、短い断片Us
上に位置する5.25キロベースの断片について詳しく分析
し、塩基配列を決定した（pMDV 05; 配列番号 no.１)
。この配列は６つのオープンリーディングフレーム (O
RF)を持つ。これらの内の４つの ORFの翻訳配列はＩ型
HSVウィルスのUs断片上に位置する蛋白質と相同性があ
った。特にマレック病ウィルスのUS３遺伝子は単純ヘル
ペスウィルスのキナーゼ蛋白の遺伝子と相同性があっ
た。驚くべきことに、この領域の研究によって、US３遺
伝子を取り除いてもウィルスの複製は妨げられない事が
示された。
【００１４】実施例２ US3遺伝子を lacＺ遺伝子で置換したプラスミドpMDV 53
Lの作製 (図１) クローンpMDV 05 から取り出した5.25キロベースのEcoR
I 断片を、NcoI酵素で切断し、末端をＤＮＡポリメラー
ゼのクレノーフラグメント(Klenow Fragment)で修復す
る。次いで、KpnI酵素で切断し、遊離した1989個の塩基
対を持つ断片をEcoRV および KpnI 酵素で直鎖状にした
ブルースクリプトベクターにクローニングし、4947個の
塩基対を持つプラスミドpMDV 52 を得た。添付の配列リ
スト中の配列番号 no.２および３に示すオリゴヌクレオ
チドを用いた突然変異誘起によって、クローニングされ
た断片の５’および３’末端にそれぞれNcoIおよびSalI
部位を導入してpMDV 53 プラスミドを作製する。lacZ遺
伝子は pMC 1871 プラスミド(Phaumacia LKB, Uppsala,
Sweden)を酵素SmaIまたはSalIで切断して単離した (S.
K. Shamira達, 1983年, Gene 25巻, 71-82)。次に、こ
のlacZ遺伝子を pMDV 53プラスミドに挿入して6687個の
塩基対を持つプラスミドpMDV 53Lを得た。 pMDV 53プラ
スミドは予め部分的にNcoI酵素で処理し、ＤＮＡポリメ
ラーゼのクレノー断片 (Klenow Fragment)で処理し、Sa
lI酵素で処理した。
【００１５】実施例３ LacZ遺伝子を持つマレック病ウィルスの調製 ニワトリの胚繊維芽細胞をウィルスの全染色体ＤＮＡお
よび直鎖状にしたプラスミド pMDV53LのＤＮＡ(10 〜50
μg)を用いて同時形質転換させた。感染中心が現れるま
で培養細胞を４〜６日間観察した。別の方法では、細胞
を72時間後にトリプシンで処理し、リシス断片が得られ
るまで新しい培地に植え継いだ (1:1 または1:2)。次い
で、培地を１％アガロースと0.5 ％Ｘgel を含むものと
変えた。組み換えウィルスのプラークをその青色によっ
て識別する。プラークを単離して組み換えウィルスを精
製した。これを健康な細胞に接種すると、Ｘgel の存在
下で青色に着色した細胞病理学的な影響の徴候を示す。
【００１６】実施例４ ヒトのサイトメガロウィルス (CMV)の直前早期プロモー
タの制御下 にあるlacZ遺伝子を持ったプラスミドpMDV 5
3 CLの調製 (図２) β- ガラクトシダーゼのlacZ遺伝子を、ヒトのサイトメ
ガロウィルスの直前早期プロモーター(promoteur immed
iat precoce)(IECMV) の調節下にベクターpCMV-LacZ 中
に挿入した。サイトメガロウィルスのプロモータIEとLa
cZ遺伝子との全体を含む約4500塩基対の断片をEcoRI 酵
素で切断し、末端をＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラ
グメントで埋め、SalI酵素で切断した。この遊離の断片
をpMDV53 ベクターにクローニングし、NcoI酵素で部分
的に切断し、ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメン
トで処理し、さらにSalI酵素で処理した。この8200の塩
基対からなるプラスミドを pMDV 53 CL と称する。
【００１７】実施例５ US3遺伝子の代わりにLacZ遺伝子をサイトメガロウィル
スの直前早期 プロモータの制御下に導入したマレック病ウィルスの組
み代え体の調製 上記 CEPをウィルスのゲノムＤＮＡおよび直鎖状にした
プラスミドpMDV 53 CLのＤＮＡ10〜50μg で同時形質転
換させた。得られた組み換えウィルスは色原体基質であ
るＸgel の存在下で青色に着色した感染プラークとして
識別することができる。このウィルスはプラーク単離法
によって精製し、次のニワトリ胚繊維芽細胞に感染させ
た。Ｘgel の存在下で青色感染株のプラークが得られ
る。これはUS３遺伝子の代わりにlacZが挿入されている
ことを示している。
【００１８】実施例６ US3遺伝子の代わりにニューカッスル病のフュージョン
プロテイン 遺伝子を持つプラスミド pMDV 53F の調製
(図３) フュージョン遺伝子(gene fusion)(J.Taylor達, 1990
年, J. Virol., 64 巻,1441-1450 頁) を断片の形でブ
ルースクリプトベクターの末端のSmaI部位に挿入して、
5300塩基対を持つpNF1プラスミドとした。コントロール
下での突然変異誘起によって、フュージョン遺伝子のＡ
ＴＧコドンおよびストップコドン部位の NcoI およびSa
lI部位に、添付配列リストに配列番号 no.４および no.
５で示すオリゴヌクレオチドを導入した。pNF2 プラス
ミド由来の1682塩基対を有する NcoI/SalI断片を、NcoI
酵素で部分的に切断しSalIで処理した pMDV 53ベクター
に導入して5369個の塩基対を持つpMDV 53Fプラスミドを
作製した。
【００１９】実施例７ ニューカッスル病のフュージョンプロテイン遺伝子を持
った マレック病ウィルスの調製 ニワトリの繊維胚芽細胞を、ウィルスの全ゲノムＤＮＡ
および直鎖化したpMDV53F プラスミドのＤＮＡ10〜50μ
g で同時形質転換し、感染したプラークが見られるまで
培養を続けた。組み換えウィルスをフュージョン遺伝子
を含むプローブを用いたハイブリッド化によってスクリ
ーニングした。
【００２０】鳥類以外のヘルペスウィルスの組み換え体
を調製する場合にも類似の手法を用いて、ヘテロ遺伝子
をマレック病ウィルスのUs領域、特にUS３遺伝子と相同
な遺伝子の部位に挿入する。本発明はさらに、本発明で
調製された組み換えウィルスで構成される、またはそれ
を含む生ワクチンまたは死ワクチン、あるいは、これら
のウィルスによって発現する免疫原を含むワクチンにも
関するものである。以下、上記説明で用いた塩基配列リ
ストのデータをまとめて示す。 塩基配列リスト
【００２１】配列番号 no.１ シーケンスの長さ： 5,255 塩基対 配列分子のタイプ： ゲノムＤＮＡ 分子の由来 ： マレック病ウィルス，ＲＢ１
Ｂ株 試験材料 ： プラスミド ｐＭＤＶ 05 特徴 ： １〜 324 塩基対: ノンコーディング領域 325〜1135 塩基対: ＵＳ１遺伝子。この遺伝子はここ
に示した配列で相補的（complementary)ＤＮＡ断片でコ
ードされ、右から左に転写される（配列番号 no.１.
Ｂ） 623〜1214 塩基対: ＵＳ２遺伝子 1215〜1245 塩基対: ノンコーディング領域 1246〜2451 塩基対: ＵＳ３遺伝子 2452〜2563 塩基対: ノンコーディング領域 2564〜3004 塩基対: ＵＳ４遺伝子 3005〜3190 塩基対: ノンコーディング領域 3191〜4384 塩基対: ＵＳ５遺伝子 4385〜4494 塩基対: ノンコーディング領域 4495〜5253 塩基対: ＵＳ６遺伝子
【００２２】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【００２３】配列番号 no.１Ｂ シーケンスの長さ： 1,188 塩基対 配列分子のタイプ： ゲノムＤＮＡ 分子の由来 ： マレック病ウィルス，ＲＢ１
Ｂ株 試験材料 ： プラスミド ｐＭＤＶ 05 特徴 ： １〜 324 塩基対: ノンコーディング領域 325〜1135 塩基対: ＵＳ１遺伝子。この遺伝子は右か
ら左に転写され、ここに示した配列は no.１の配列と相
補的である
【００２４】
【表６】
【００２５】配列番号 no.２ シーケンスのタイプ： オリゴヌクレオチド シーケンスの長さ： 分子のタイプ ： ＤＮＡ
【００２６】
【式１】
【００２７】配列番号 no.３ シーケンスのタイプ： オリゴヌクレオチド シーケンスの長さ： 分子のタイプ ： ＤＮＡ
【００２８】
【式２】
【００２９】配列番号 no.４ シーケンスのタイプ： オリゴヌクレオチド シーケンスの長さ： 分子のタイプ ： ＤＮＡ
【００３０】
【式３】
【００３１】配列番号 no.５ シーケンスのタイプ： オリゴヌクレオチド シーケンスの長さ： 分子のタイプ ： ＤＮＡ
【００３２】
【式４】
【図面の簡単な説明】
【図１】 US３遺伝子の代わりにLacZ遺伝子を挿入した
プラスミドpMDV 53Lの構造。
【図２】 US３遺伝子の代わりにヒトのサイトメガロウ
ィルスの直前早期プロモーター (CMV)のコントロール下
にあるLacZ遺伝子を持つプラスミドpMDV 53 CLの構造。
【図３】 US３遺伝子の代わりにニューカッスル病ウィ
ルスのフュージョンプロテイン遺伝子を持ったプラスミ
ドpMDV 53Fの構造。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/38 15/54 //(Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 アリエル レイ−スヌローニュ フランス国 69140 リリュー ラ パプ アレ ドゥ ラ スカルプ 35 (72)発明者 ミシェル エミール アルベール リヴィ エール フランス国 69130 エキュリ シュマン ドュ シャンスリエ 11

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 複製に必須でなく且つ単純ヘルペスウィ
    ルスのキナーゼ蛋白の遺伝子と相同であるUS３遺伝子に
    対応することを特徴とするマレック病ウィルスの短い特
    異的な領域（Us) の塩基配列およびその変異体。
  2. 【請求項２】 配列番号 no.１に示したマレック病（MD
    V)ウィルスのUS３遺伝子である請求項１に記載の塩基配
    列およびその変異体。
  3. 【請求項３】 配列番号 no.１の塩基配列、遺伝子およ
    びこの配列を有する変異体。
  4. 【請求項４】 キナーゼ蛋白遺伝子に対応し且つヘルペ
    スウィルスのゲノムのUs領域に挿入された少なくとも一
    つのヘテロ遺伝子によって構成されるヘルペスウィルス
    から選択されるウィルスの組み換え体。
  5. 【請求項５】 上記遺伝子がウィルス、細菌または寄生
    虫の免疫原をコードするいる遺伝子である請求項４に記
    載のウィルスの組み換え体。
  6. 【請求項６】 US３遺伝子に該当するゲノムの領域に少
    なくとも一つのヘテロ遺伝子が発現可能な状態で挿入さ
    れている請求項５に記載のマレック病ウィルスの組み換
    え体。
  7. 【請求項７】 上記で挿入されるヘテロ遺伝子が鳥類の
    感染性気管支炎、ニューカッスル病、ガンボロ病、ニワ
    トリのペスト、ニワトリの貧血症、エッグドロップシン
    ドローム(egg-drop syndorome)、鶏痘、感染性喉頭気管
    炎、鳥類の大腸菌症、パスツレラ症、コクシジウム症、
    血友病からなる群の中から選択される病原体をコードす
    る請求項６に記載のウィルスの組み換え体。
  8. 【請求項８】 上記ウィルスがマレック病ウィルスであ
    る請求項６または７に記載のウィルスの組み換え体。
  9. 【請求項９】 上記ウィルスが七面鳥のヘルペスウィル
    ス(HVT) である請求項６または７に記載のウィルスの組
    み換え体。
  10. 【請求項10】 上記で挿入される遺伝子がマレック病ウ
    ィルスの血清型１または２の免疫原をコードする請求項
    ９に記載のウィルスの組み換え体。
  11. 【請求項11】 上記遺伝子が、キナーゼ蛋白遺伝子の転
    写調節の配列のコントロール下で発現されるように挿入
    されている請求項４〜10のいずれか一項に記載のウィル
    スの組み換え体。
  12. 【請求項12】 上記で挿入されるヘテロ遺伝子が問題ウ
    ィルスまたはその他のヘルペスウィルスに由来のプロモ
    ータ配列のコントロール下に発現可能である請求項４〜
    11のいずれか一項に記載のウィルスの組み換え体。
  13. 【請求項13】 上記で挿入される遺伝子のスタートおよ
    びストップコドンがUS３遺伝子のスタートおよびストッ
    プコドンと置換されている請求項４〜12のいずれか一項
    に記載のウィルスの組み換え体。
  14. 【請求項14】 請求項３〜９のいずれか一項に記載のウ
    ィルスを含むことを特徴とするワクチン。
  15. 【請求項15】 US３遺伝子に対応するウィルスのゲノム
    の領域に少なくとも一つのヘテロ遺伝子を発現可能な状
    態で挿入することを特徴とするマレック病ウィルスの組
    み換え体の製造方法。
JP3255852A 1990-09-07 1991-09-07 新規なヘルペスウィルスの組み換え体と、これらの組み換え体に基づくワクチンと、その製造方法と、製造に用いる遺伝子、ベクター及びプラスミド Pending JPH05168473A (ja)

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