JPH05153958A - 培養装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 構成機器を１つの攪拌式混合槽に集中化し、
生物学的材料を保持する担体を固定層型とした培養装置
を提供する。 【構成】 培養装置は、単位体積当りの比表面積が大き
い多孔質体からなり、表面に培養可能で有用代謝産物を
産生し得る微生物、動物細胞、植物細胞等の生物学的材
料を保持し得る培養担体と、培養液を循環させる攪拌翼
とを、同一の培養槽内に配置している。そして、培養担
体の内部または培養担体相互間に循環する培養液がほぼ
均等に通過する空隙が多数形成されている。 【効果】 培養装置を簡単に熱殺菌処理することができ
るだけでなく、生物学的材料の培養担体からの流出や損
傷、死滅の恐れが少ない。しかも、１つの培養槽内で培
養液が循環するために外部循環ポンプが不要であり、ポ
ンプに関係するトラブルを絶滅できる。また、生物学的
材料の培養により有用代謝産物が効率よく産生される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物、動物細胞、植
物細胞等の生物学的材料の培養装置に関する。さらに詳
しくは、表面に生物学的材料を保持し得る培養担体と培
養液を循環させる攪拌翼とを同一の槽内に配置した培養
装置に関する。

【０００２】

【従来の技術とその問題点】近年のバイオテクノロジー
の進展に伴い、動物細胞の高密度培養方式が幾つか工業
化されつつある。これらの培養方式としては、比較的比
重の大きいコラーゲンビーズを培養槽に入れたマイクロ
スクェアビーズ方式、セラミックコアをバイオリアクタ
ーとする方式、ホローファイバー(Hollow fiber)方式、
マイクロキャリアビーズ方式等の固定層型、流動層型の
バイオリアクターが知られており、いずれも担体および
バイオリアクターに特徴を持たせている。また、これら
の大半は培養液がバイオリアクターとコンディショナー
とを循環する、例えば図６に示す培養方式が採用されて
いる。

【０００３】すなわち、培地入口２１から供給される培
地は、培養条件を調節するコンディショナー２２からバ
イオリアクター２３に流入し、その内部にあるセラミッ
クコア，マイクロキャリアビーズ，ポリウレタンフォー
ム等の担体に固定された動物細胞等を培養しながらバイ
オリアクター２３から流出してコンディショナー２２に
戻る。培養液はコンディショナー２２とバイオリアクタ
ー２３とを循環ポンプ２４により循環し、この間、コン
ディショナー２２において、培養液の温度，成分濃度，
ｐＨ，溶存酸素濃度等をセンサ２５で検出して、温度調
節器２６および培地，ｐＨ調整剤（リン酸緩衝液，炭酸
水素ナトリウム等）、酸素含有ガスの導入により培養条
件を最適な条件に調節する。そして、連続的または間欠
的に培養液出口２７から培養液を所定量排出してバイオ
リアクター２３内の動物細胞等が産生する有用代謝産物
を回収する。なお、２８は排気口である。

【０００４】従来のこれらの方式は、コンディショナー
とバイオリアクター間を培養液が循環する方式であり、
循環ポンプを必須としている。動物細胞等は極めて軟弱
で剪断傷害を受けやすいため培養液の循環ポンプとして
は主にダイヤフラム式またはチューブ式ポンプが用いら
れている。しかし、長期の連続運転や熱殺菌において、
ポンプの耐熱性，耐久性に問題があり、破損によるトラ
ブルが潜在している。

【０００５】一方、従来の固定層型、流動層型のバイオ
リアクターでは、動物細胞等の脱落劣化、担体の圧密、
流路の閉塞やチャンネリング等が生じやすく、これらが
有用代謝産物の産生効率に著しい影響を及ぼすことはし
ばしば経験されるところである。

【０００６】

【問題点を解決するための手段】本発明者は、上述した
従来の問題点に鑑み、工業的規模で実施できる信頼性の
ある培養装置を開発すべく研究・検討してきた結果、本
発明を完成したものである。本発明は、構成機器を１つ
の攪拌式混合槽に集中して装置全体をコンパクト化する
ことにより、装置全体の熱殺菌を簡便に実施できると共
に、動物細胞等を保持した培養担体中に培養液の流路を
確保し、動物細胞等の損傷の恐れを克服し、循環ポンプ
が不要となる培養装置を提供しようとするものである。

【０００７】すなわち、本発明は、単位体積当りの比表
面積が大きい多孔質体からなり表面に培養可能で有用代
謝産物を産生し得る微生物、動物細胞、植物細胞等の生
物学的材料を保持し得る培養担体と、培養液を循環させ
る攪拌翼とを、同一の培養槽内に配置し、培養担体の内
部または培養担体相互間に循環する培養液がほぼ均等に
通過する空隙を多数形成した培養装置にある。

【０００８】

【発明の構成】以下に本発明の構成を詳細に説明する。
生物学的材料（以下、生物材料という）を保持する培養
担体としては、鉱物、その焼成物（セラミック）等の無
機物質、ポリウレタン、ポリスチレン等の有機合成高分
子、酢酸セルロース等の半合成高分子、蛋白質、セルロ
ース、その他の多糖類等の天然高分子など、培養液に不
溶で、かつ、生物材料に対して非毒性の素材を成形、加
工または処理した単位体積当りの比表面積が大きい多孔
質体が用いられる。具体的には、粒状クレイ、多孔質セ
ラミック、、ポリウレタンフォーム、発泡ポリスチレ
ン、多種のファイバー製品等が挙げられ、このうちポリ
ウレタンフォーム、多孔質セラミックが特に好ましい。

【０００９】培養担体の表面に生物材料を保持させるに
は、懸濁した生物材料を含有する種液を無菌的に槽内に
導入後、微速攪拌による培養液の槽内循環によって生物
材料の培養担体への保持吸着を促せばよい。この接種作
業に続いて所定の培養条件のもとで培養が開始される。

【００１０】培養液の組成、温度、ｐＨ、培養担体の単
位表面積当りの生物材料の数、攪拌翼の回転速度、循環
する培養液の流速または流量等の培養条件については、
用いる生物材料の種類によって異なり、例えば、生物材
料の増殖期と有用代謝産物の産生期に好適な培養条件が
各々設定される。本発明の培養装置では、培養液の組
成、温度、攪拌速度すなわち培養液の流速、さらに必要
に応じて、酸素または酸素含有ガス（空気、窒素等の不
活性ガスで希釈された酸素）の通気量と内圧が個々の生
物材料に応じて制御される。

【００１１】次に、図１に示す本発明の培養装置につい
て具体的に説明する。図中、１は培養槽であり、その中
央部に支持された内筒２内には、正逆回転自在で可変速
の攪拌翼３を植設した攪拌軸３ａが垂設されている。培
養槽１に対する内筒２の内径比は１／４〜１／２とする
のが好ましい。また、培養槽１の周内壁と内筒２の両端
縁を残した外周との空間には、生物材料を保持した培養
担体４が配置され、培養槽１内において生物材料保持部
４ａ（以下、保持部という）を形成する。

【００１２】多孔質培養担体４の大きさおよび形状は任
意でよく、図２−Ａ〜図２−Ｄに示すような培養担体が
例示される。図２−Ａは形状が上記空間に合致するカー
トリッジ式チャンネル構造体（４Ａ）、図２−Ｂは該カ
ートリッジを複数個に分割した円桂状物（４Ｂ）を図示
している。これらの多孔質チャンネル構造体には縦長孔
４′が平行かつほぼ均等に多数貫通しており、縦長孔
４′の横断面は図２−Ａ，Ｂに図示の円形だけでなく、
楕円形、多角形、格子状等であってもよい。また、図２
−Ｃ，Ｄには、充填物としてのラッシヒリング（４
Ｃ）、サドル形（４Ｄ）培養担体を図示している。この
他、上記縦長孔４′を形成する多角形（型典的には正６
角形）の各辺が互いに隣接するいわゆるハニカム構造体
や一定形状の小塊ないし粒状物等、種類や形態を問わず
使用することが可能である。培養担体を貫通する縦長孔
４′または一定形状の培養担体を培養槽１内に多数充填
することにより形成される空隙は、培養液５の流路とし
て作用するので、培養担体表面に保持された生物材料は
流路に直接臨むことになる。培養担体４として小塊ない
し粒状物を使用する場合は、できるだけ空隙がほぼ均等
に分布するよう互いに密着して培養槽１内に充填するこ
とが望ましい。

【００１３】図１において、保持部４ａの上下両面に
は、液透過性材料または細孔を穿った環状のスクリーン
６，６′が張設されている。このうち下部スクリーン
６′は粒状担体が保持部４ａから流出しないよう培養担
体を支持するために張設している。しかし、前記カート
リッジタイプの培養担体を使用する場合は、内筒２およ
びスクリーン６，６′は必ずしも必要でなく、また、ス
クリーン６，６′を棚段に置換してもよい。培養槽１の
上部、下部（または底部）および開閉自在に取り付けた
頂部の蓋板には、それぞれ培地供給口７、培養液取出口
８および排気口９が開口している。培地供給口７は図示
してない培地またはその濃厚液を貯留する培地貯留槽
と、培養液取出口８は図示してない培養液回収槽と、そ
れぞれ開閉弁を介して接続している。培地貯留槽は培養
中に変化する培養液５のｐＨを調整し、不足する培地成
分を補償するために用意される。培養装置の熱殺菌時に
おいては、培地供給口７、培養液取出口８及びスパジャ
ー１２のいずれか１つ以上をスチーム導入口として利用
する。

【００１４】さらに、培養液５の成分濃度、温度、ｐＨ
等を検出するセンサ１０は培養槽１内に取り付けられ
る。培養槽１の周壁を介して保持部４ａを囲繞する熱交
換器１１が温度センサにより制御される。熱交換器１１
は内筒２に添設またはその中央に設置するコイル型であ
ってもよい。また、酸素または酸素含有ガスを吹き込む
スパージャー１２を付設しておくことがある。このスパ
ージャー１２は微細な気泡を発生するように工夫するの
が有利である。その際、培養液５中の溶存酸素濃度は上
記センサ１０により検出され、制御される。なお、スパ
ージャー１２を設ける代わりに培養槽１の上部空間に上
記ガスを導入して溶存酸素濃度を所定の値に制御するこ
とも可能である。

【００１５】

【作用】生物材料を保持し得る培養担体４を培養槽１に
配置した後、培地供給口７などから１２０℃程度の加圧
スチームを培養槽１内に導入して、培養装置全体を予め
熱殺菌処理する。次いで、無菌加圧空気により凝縮水お
よび残存するスチームを排出した後、培地供給口７から
培養液５を培養槽１へ導入し、液位（Ｈ）が上部スクリ
ーン６またはそれ以上に達するまで培地を満たす。

【００１６】コンプレッサまたは加圧ボンベに接続する
スパージャー１２から酸素または酸素含有ガスを必要に
応じて吹き込みながら、モータにより駆動される正逆回
転自在の攪拌翼３を回転させて培養を開始する。攪拌翼
３の回転に伴って発生する渦流により気液間物質移動が
促進されるとともに、培養液５は内筒２内において上昇
流または下降流が生じ、液位Ｈ（上昇流の場合）が図示
したように変化する。上昇流を生じさせる場合は、培養
液５は、内筒２から上部スクリーン６に向かって流れ、
培養担体４内部の縦長孔４′または培養担体４間の空隙
により形成される流路に沿って保持部４ａ内をほぼ均等
に流下しながら、内筒２と保持部４ａの間を互いに逆向
きに循環する。一方、下降流を生じさせる場合は、内筒
２の下端縁を湾曲して外方へ拡開させておくのが好まし
く、培養液５の流れは下部スクリーン６′から保持部４
ａ内に流入し、上部スクリーン６を経て内筒２へ向かう
循環系が形成される。

【００１７】このように、上部スクリーン６または下部
スクリーン６′より保持部４ａへ流入して対向するスク
リーン６′，６から流出し、循環する培養液５は、攪拌
翼３の回転数を調節することにより適切な流速に制御さ
れる。内筒２と培養槽１の直径比の好ましい比率は、前
記したとおり１／４〜１／２である。保持部４ａにおけ
る培養液５の流速が適切に制御されるので、生物材料の
培養担体４からの脱離・流出、さらに生物材料の損傷の
恐れが少ない。また、内筒２の上昇流または下降流が保
持部４ａにおいて反転するので、保持部４ａの流入口か
ら流出口方向へ流れる培養液５中の溶存酸素濃度も微妙
に制御できるばかりでなく、培養担体の圧密やチャンネ
リングを修正できる。

【００１８】この間、保持部４ａ中の流路に臨む生物材
料と培養液５との接触が良好であるため、生物材料が死
滅する恐れがなく、長期間にわたって動植物細胞、微生
物等が増殖すると共に、有用代謝産物を効率よく産生す
る。一方、スパージャー１２から必要に応じて吹き込ま
れた酸素または酸素含有ガスは培養液５中を通過後排気
口９から排出される。また、センサ１０により制御され
る熱交換器１１によって培養槽１内の温度は一定に維持
される。同時に、培養液５の成分濃度が培養中変化する
ので、これをセンサ１０で検出し、培地貯留槽から培地
供給口７を経て、リン酸緩衝液、炭酸水素ナトリウム溶
液等のｐＨ調整剤や血清、グルコース、アミノ酸、ミネ
ラル等を含む培地を補給する。培地の供給量および供給
のタイミングはセンサ１０により制御される。そして、
培養槽１内に前述のガスを導入する場合は、培養液５中
の溶存酸素濃度をセンサ１０で検出し、スパージャー１
２等から導入されるガスの通気量がセンサ１０により制
御される。

【００１９】培養の進行に伴って、有用代謝産物の他に
培養阻害物質も培養槽１内に蓄積されるので、これらの
濃度が所定の濃度に達すると、培養液５の一部を連続的
または間欠的に培養液取出口８から培養液回収槽に抜き
取り、培地貯留槽から新たに培地を供給する。回収され
た培養液中の有用代謝産物は、その後カラムクロマトグ
ラフィー等適宜の手段により分離・精製される。

【００２０】以上、本発明を図１に示す培養装置により
説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。
例えば、図３〜図５に示す培養装置も本発明に包含され
る。以下、図３〜図５について簡単に説明する。図３に
示す培養装置は、保持部４ａを培養槽１の中央下部に配
置し、その上方に攪拌翼３′およびスパージャー１２を
設けたものであり、培養槽１の容量を大きくしている。
同装置においても、攪拌翼３の回転により培養液５はや
はり保持部４ａ内を循環する。図４に示す培養装置は、
保持筒２′内に収容した保持部４ａを培養槽１の中央に
配置し、攪拌翼３をその下方に配置したものである。さ
らに、図５に示す培養装置は、保持部４ａを培養槽１の
中央下部に配置し、その下方に攪拌翼３を配置したもの
であり、図３に示す培養装置と同様に培養槽１の容量を
大きくしている。これらの培養装置は前述した図１のも
のと同様の作用を奏する。なお、各図面は攪拌翼３
（３′）と保持部４ａを形成する培養担体４の関係を特
に強調しており、一部の構成部材が省略されている。

【００２１】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明する。ワーキングボリューム５ｌのドラフトチュー
ブ型培養槽に培養担体として３〜５ｍｍ角に切断したポ
リウレタンフォーム２ｌをドラフトチューブ（内筒）の
外側に充填した。培養槽を熱殺菌した後、培地としてＧ
ＩＴ培地（日本製薬株式会社製）を用い、改変型ｔ−Ｐ
Ａ（以下、ＭＴＰＡと略記する）を産生する組換え型Ｃ
ＨＯ（Chinese Hamster Ovary)細胞を培養担体に対して
約２×１０⁶ cells／ｍｌの濃度で接種した。攪拌速度
６０ｒｐｍで培養を開始すると、ドラフトチューブ内に
取り付けた攪拌翼の回転により、培養液はドラフトチュ
ーブ内を上昇し、外側の培養担体中を下降流となって流
れ、培養槽内を循環する。培養液のｐＨは炭酸水素ナト
リウム水溶液を用いて７に調整し、温度は３７℃に維持
した。また、培養液上面に酸素と窒素の１：１混合ガス
を通気するとともに、攪拌速度をコントロールしなが
ら、溶存酸素濃度を３ppm 以上に維持した。２日目から
培地の連続的なフィード、ハーベストを開始し、１２日
間培養を継続した。最終的に、攪拌速度は２００ｒｐｍ
程度まで上昇していた。培養成績を図７，８に示す。培
地の最大供給速度は図７に示すように２９．７ｌ／日で
あった。また、図８から明らかなように、培養開始から
３日目以降、ＭＴＰＡの産生量は１３０ｍｇ／日以上を
維持し、ＭＴＰＡの濃度はＥＬＩＳＡ（enzyme-linked
immunosorbent assay)値で４〜８ｍｇ／ｌであった。

【００２２】

【発明の効果】本発明は、培養液を循環させる攪拌翼と
生物材料を保持させた培養担体とを同一の培養槽内に備
えたことにより、培養装置全体がコンパクト化され、生
物材料の培養に先立って行われる培養装置の熱殺菌処理
を簡便に実施できるだけでなく、従来の培養方式におい
て使用されてきた循環ポンプが不要となる。したがっ
て、循環ポンプによる剪断損傷を生物材料に与えること
が少なく、ポンプの破損によるトラブルを絶滅できる。
比表面積の大きい多孔質培養担体表面に生物材料を保持
させることにより、保持部に形成される流路に生物材料
が直接臨むことになる。その結果、生物材料が循環する
培養液と常時接触するので、生物材料の死滅の恐れが少
なく、しかも、生物材料の培養による有用代謝産物の産
生効率に優れている。さらに、保持部の内部を培養液が
ほぼ均等に循環するので、生物材料の培養担体からの流
出や損傷の恐れが少ない。その他に、培養担体の圧密や
チャンネリングを修正することも可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の培養装置を示した縦断面図である。

【図２】本発明で使用される培養担体の斜視図であり、
Ａはカートリッジ式培養担体、Ｂは円桂状培養担体、Ｃ
はラッシヒリング、Ｄはサドル形培養担体をそれぞれ示
す。

【図３】一部の構成部材を省略した本発明の別の培養装
置を示した縦断面図である。

【図４】一部の構成部材を省略した本発明のさらに別の
培養装置を示した縦断面図である。

【図５】一部の構成部材を省略した本発明の他の培養装
置を示した縦断面図である。

【図６】循環ポンプにより培養液が循環する従来の培養
装置を示した説明図である。

【図７】実施例における培養の経過日数と培地供給速度
の関係を示すグラフ図である。

【図８】実施例における培養の経過日数と産生されるＭ
ＴＰＡ積算値の関係を示すグラフ図である。

【符号の説明】

１ 培養槽 ２ 内筒 ３ 攪拌翼 ４ 培養担体 ４ａ 生物学的材料保持部 ５ 培養液 ２２ コンディショナー ２３ バイオリアクター ２４ 循環ポンプ

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単位体積当りの比表面積が大きい多孔質
   体からなり表面に培養可能で有用代謝産物を産生し得る
   微生物、動物細胞、植物細胞等の生物学的材料を保持し
   得る培養担体と、培養液を循環させる攪拌翼とを、同一
   の培養槽内に配置し、培養担体の内部または培養担体相
   互間に循環する培養液がほぼ均等に通過する空隙を多数
   形成したことを特徴とする培養装置。
2. 【請求項２】 攪拌翼は、回転方向が正逆回転可能であ
   り、かつ回転速度が可変速である請求項１記載の培養装
   置。