JPH0515387A - Decomposition of alginic acid with bacterium - Google Patents
Decomposition of alginic acid with bacteriumInfo
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- JPH0515387A JPH0515387A JP16489991A JP16489991A JPH0515387A JP H0515387 A JPH0515387 A JP H0515387A JP 16489991 A JP16489991 A JP 16489991A JP 16489991 A JP16489991 A JP 16489991A JP H0515387 A JPH0515387 A JP H0515387A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、細菌によるアルギン酸
の分解法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for degrading alginic acid by bacteria.
【０００２】[0002]
【従来技術とその課題】アルギン酸は、コンブ、ワカ
メ、ヒジキ等の褐藻類に２０〜５０％（乾物換算）含ま
れる主要な構成多糖であり、Ｄ−マンヌロン酸とＬ−グ
ルロン酸とからなる、ヘテロポリマー又はブロックポリ
マーであるとされている。栄養学的にも食物繊維として
の機能があり、アルギン酸のカリウム塩は、Ｋ−Ｎａイ
オン交換能を有し、体内のＮａを排泄する作用があると
言われている。斯かる特性を有するアルギン酸を食品に
適用できれば、食品の生理的機能を高め得ることは明ら
かである。しかるに、アルギン酸は水に溶解すると高粘
性を示すため、一般の食品に適用することは極めて困難
である。細菌が産生するアルギン酸リアーゼにより、ア
ルギン酸を低分子化すれば、アルギン酸水溶液の粘度を
低下させ得ることが予想できる。2. Description of the Related Art Alginic acid is a main constituent polysaccharide contained in brown algae such as kelp, seaweed, and hydrangea in an amount of 20 to 50% (on a dry matter basis), and consists of D-mannuronic acid and L-guluronic acid. It is said to be a heteropolymer or a block polymer. It has a nutritional function as dietary fiber, and the potassium salt of alginic acid is said to have K-Na ion exchange ability and excrete Na in the body. If alginic acid having such properties can be applied to food, it is obvious that the physiological function of food can be enhanced. However, since alginic acid has a high viscosity when dissolved in water, it is extremely difficult to apply it to general foods. It is expected that the viscosity of an aqueous alginate solution can be reduced by lowering the molecular weight of alginate by alginate lyase produced by bacteria.
【０００３】従来、アルギン酸リアーゼは、細菌、褐
藻、貝等に存在し、細菌ではシュードモナス属、ビブリ
オ属又はクレブシェラ属に属する細菌がアルギン酸リア
ーゼを産生することが知られている。しかしながら、こ
れら細菌ではアルギン酸リアーゼ産生能が非常に低いた
め、工業的規模でアルギン酸を低分子化するのに充分な
量のアルギン酸リアーゼを得るには多大なコストが必要
となる。従って、細菌が産生するアルギン酸リアーゼに
よりアルギン酸を低分子化させることも、工業的には不
可能である。Conventionally, alginate lyase is present in bacteria, brown algae, shellfish and the like, and it is known that bacteria belonging to the genus Pseudomonas, Vibrio or Klebsiella produce alginate lyase. However, since these bacteria have a very low alginate lyase-producing ability, enormous cost is required to obtain an amount of alginate lyase sufficient to reduce the molecular weight of alginate on an industrial scale. Therefore, it is industrially impossible to reduce the molecular weight of alginic acid by alginate lyase produced by bacteria.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記従来
技術の課題を解決すべく、日本各地の土壌、水、海水等
からサンプルを採取し、アルギン酸分解能を有する微生
物の検索を行なった結果、アルギン酸リアーゼ産生能が
極めて高い細菌を２種発見した。而してこれらの細菌菌
体から非常に高い収量でアルギン酸リアーゼを得ること
ができ、工業的規模でアルギン酸を低分子化できること
を見い出した。本発明は、斯かる知見に基づき完成され
たものである。[Means for Solving the Problems] In order to solve the above-mentioned problems of the prior art, the present inventors collected samples from soil, water, seawater and the like in various parts of Japan and searched for microorganisms having alginic acid degrading ability. As a result, two types of bacteria having extremely high alginate lyase-producing ability were found. Therefore, they have found that alginate lyase can be obtained from these bacterial cells at a very high yield, and that alginate can be reduced in molecular weight on an industrial scale. The present invention has been completed based on such knowledge.
【０００５】即ち、本発明は、アルギン酸分解能を有す
るフラボバクテリウム属細菌を、アルギン酸に作用させ
てアルギン酸を分解することを特徴とするアルギン酸の
分解法に係る。That is, the present invention relates to a method for decomposing alginic acid, which comprises causing a flavobacterium having an ability to decompose alginic acid to act on alginic acid to decompose the alginic acid.
【０００６】本明細書において、アルギン酸には、アル
ギン酸の塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアル
カリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカ
リ土類金属塩や、アルギン酸のプロピレングリコール誘
導体やアセチル誘導体等も包含される。In the present specification, alginic acid includes salts of alginic acid, for example, alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt, propylene glycol derivative and acetyl derivative of alginic acid. Etc. are also included.
【０００７】本発明の方法で用いられるフラボバクテリ
ウム属細菌としては、例えばフラボバクテリウム・スピ
ーシーズＯＴＣ−６（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｐ．ＯＴＣ−６）、フラボバクテリウム・スピーシー
ズＯＴＣ−７（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．
ＯＴＣ−７）等が挙げられる。Examples of the Flavobacterium bacterium used in the method of the present invention include Flavobacterium species OTC-6 (Flavobacterium).
sp. OTC-6), Flavobacterium species OTC-7 (Flavobacterium sp.
OTC-7) etc. are mentioned.
【０００８】フラボバクテリウム・スピーシーズＯＴＣ
−６は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる（微工研寄第１２１５９号）。該菌の菌学的性質を
以下に挙げる。Flavobacterium species OTC
-6 has been deposited at the Institute of Microbial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Ministry of Mechanical Engineering No. 12159). The mycological properties of the bacterium are listed below.
【０００９】（ａ）形態；
（１）細胞の形及び大きさ：桿菌、（０．３〜０．６）
×（１．０〜１．２）μｍ
（２）運動性の有無：無し
（３）鞭毛の有無：無し
（４）芽胞の有無：無し
（５）グラム染色性：陰性。(A) Morphology; (1) Cell shape and size: Bacillus, (0.3-0.6)
X (1.0 to 1.2) μm (2) Motility: None (3) Flagella: None (4) Spores: None (5) Gram stain: Negative.
【００１０】（ｂ）各培地における生育状態；
（１）肉汁寒天平板培養：３０℃、２４時間培養で、直
径１〜２ｍｍの円形コロニー、コロニーは硬く白色
（２）標準寒天平板培養：３０℃、２４時間培養で、直
径１〜２ｍｍの円形コロニー、コロニーは硬く淡黄色
（３）リトマスミルク培養：３０℃の培養で凝固せず、
色調は青紫色で変化なし。(B) Growth state in each medium; (1) Meat broth agar plate culture: round colonies with a diameter of 1 to 2 mm and colonies are hard and white after culturing at 30 ° C. for 24 hours. (2) Standard agar plate culture: 30 ° C. , Round colonies with a diameter of 1 to 2 mm after 24 hours of culture, the colonies are hard and pale yellow (3) litmus milk culture: did not coagulate at 30 ° C.,
The color tone is bluish purple and does not change.
【００１１】（ｃ）生理学的性質；
（１）カタラーゼ：陽性
（２）オキシダーゼ：陽性
（３）ウレアーゼ：陰性
（４）フォスファターゼ：陰性
（５）ＯＦテスト：陰性
（６）ＶＰテスト：陰性
（７）インドールの生成：陰性
（８）硫化水素の生成：陰性
（９）糖類からの酸の生成：
陽性…グルコース、陰性…アラビノース、セロビオー
ス、ラクトース、マンニトール、ラフィノース、スクロ
ース、キシロース、グリセロール、フルクトース、マル
トース、ラムノース
（１０）デンプンの加水分解：陰性
（１１）ゼラチンの加水分解：陰性
（１２）エスクリンの加水分解：陰性
（１３）硝酸塩の還元：陽性
（１４）生育のｐＨ：５．０〜８．５
（１５）至適生育温度：２８〜３４℃
（１６）生育の食塩濃度：０〜１％。(C) Physiological properties; (1) catalase: positive (2) oxidase: positive (3) urease: negative (4) phosphatase: negative (5) OF test: negative (6) VP test: negative (7) ) Indole formation: Negative (8) Hydrogen sulfide formation: Negative (9) Acid formation from sugars: Positive ... Glucose, Negative ... Arabinose, Cellobiose, Lactose, Mannitol, Raffinose, Sucrose, Xylose, Glycerol, Fructose, Maltose , Rhamnose (10) Starch hydrolysis: negative (11) Gelatin hydrolysis: negative (12) Esculin hydrolysis: negative (13) Nitrate reduction: positive (14) Growth pH: 5.0-8. 5 (15) Optimal growth temperature: 28 to 34 ° C. (16) Salt concentration for growth: 0 to 1%.
【００１２】（ｄ）ＤＮＡのＧＣ含量：６３％。(D) GC content of DNA: 63%.
【００１３】以上の結果をもとに、フラボバクテリウム
・スピーシーズＯＴＣ−６を、バージーズ・マニュアル
・オブ・システマチック・バクテオリロジーで検索する
と、どの属にも該当せず、またバージーズ・マニュアル
・オブ・ディターミネイティブ・バクテオロジー第８版
で検索すると、フラボバクテリウムに属すると思われる
が、一致する種はなく、フラボバクテリウム類縁の種と
考えられる。[0013] Based on the above results, when Flavobacterium species OTC-6 was searched by the Vergies Manual of Systematic Bacteriology, it did not correspond to any genus, and the Vergies Manual A search of The 8th Edition of Determinative Bacteriology suggests that it belongs to Flavobacterium, but there is no matching species, and it is considered to be a Flavobacterium-related species.
【００１４】フラボバクテリウム・スピーシーズＯＴＣ
−７は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる（微工研寄第１２１６０号）。該菌の菌学的性質を
以下に挙げる。Flavobacterium species OTC
-7 has been deposited at the Institute of Microbial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Ministry of Engineering, No. 12160). The mycological properties of the bacterium are listed below.
【００１５】（ａ）形態；
（１）細胞の形及び大きさ：桿菌、（０．６〜０．８）
×（１．０〜１．８）μｍ
（２）運動性の有無：無し
（３）鞭毛の有無：無し
（４）芽胞の有無：無し
（５）グラム染色性：陰性。(A) Morphology; (1) Cell shape and size: bacilli, (0.6-0.8)
× (1.0 to 1.8) μm (2) Motility: None (3) Flagella: None (4) Spores: None (5) Gram stainability: Negative.
【００１６】（ｂ）各培地における生育状態；
（１）肉汁寒天平板培養：３０℃、２４時間培養で、直
径１〜２ｍｍの円形コロニー、コロニーは白色
（２）標準寒天平板培養：３０℃、２４時間培養で、直
径１〜２ｍｍの円形コロニー、コロニーは淡黄色
（３）リトマスミルク培養：３０℃の培養で凝固せず、
色調は青紫色で変化なし。(B) Growth state in each medium; (1) Meat broth agar plate culture: 30 ° C., 24 hours culture, circular colonies with diameter of 1-2 mm, colonies are white (2) Standard agar plate culture: 30 ° C. After culturing for 24 hours, circular colonies with a diameter of 1 to 2 mm, the colonies were pale yellow (3) litmus milk culture: did not coagulate at 30 ° C.,
The color tone is bluish purple and does not change.
【００１７】（ｃ）生理学的性質；
（１）カタラーゼ：陽性
（２）オキシダーゼ：陽性
（３）ウレアーゼ：陰性
（４）フォスファターゼ：陰性
（５）ＯＦテスト：陰性
（６）ＶＰテスト：陰性
（７）インドールの生成：陰性
（８）硫化水素の生成：陰性
（９）糖類からの酸の生成：
陽性…グルコース、陰性…アラビノース、セロビオー
ス、ラクトース、マンニトール、ラフィノース、スクロ
ース、キシロース、グリセロール、フルクトース、マル
トース、ラムノース
（１０）デンプンの加水分解：陰性
（１１）ゼラチンの加水分解：陰性
（１２）エスクリンの加水分解：陰性
（１３）硝酸塩の還元：陽性
（１４）生育のｐＨ：５．０〜８．５
（１５）至適生育温度：２８〜３４℃
（１６）生育の食塩濃度：０〜１％。(C) Physiological properties; (1) catalase: positive (2) oxidase: positive (3) urease: negative (4) phosphatase: negative (5) OF test: negative (6) VP test: negative (7) ) Indole formation: Negative (8) Hydrogen sulfide formation: Negative (9) Acid formation from sugars: Positive ... Glucose, Negative ... Arabinose, Cellobiose, Lactose, Mannitol, Raffinose, Sucrose, Xylose, Glycerol, Fructose, Maltose , Rhamnose (10) Starch hydrolysis: negative (11) Gelatin hydrolysis: negative (12) Esculin hydrolysis: negative (13) Nitrate reduction: positive (14) Growth pH: 5.0-8. 5 (15) Optimal growth temperature: 28 to 34 ° C. (16) Salt concentration for growth: 0 to 1%.
【００１８】（ｄ）ＤＮＡのＧＣ含量：６３％。(D) GC content of DNA: 63%.
【００１９】以上の結果をもとに、フラボバクテリウム
・スピーシーズＯＴＣ−７を、バージーズ・マニュアル
・オブ・システマチック・バクテオリロジーで検索する
と、どの属にも該当せず、またバージーズ・マニュアル
・オブ・ディターミネイティブ・バクテオリロジー第８
版で検索すると、フラボバクテリウムに属すると思われ
るが、一致する種はなく、フラボバクテリウム類縁の種
と考えられる。On the basis of the above results, when Flavobacterium species OTC-7 was searched by the Vergise Manual of Systematic Bacteriology, it did not correspond to any genus, and the Vergiz Manual. Of Determinative Bacteriology 8
A search by version suggests that it belongs to Flavobacterium, but there is no matching species, and it is considered to be a species related to Flavobacterium.
【００２０】フラボバクテリウム・スピーシーズＯＴＣ
−６とフラボバクテリウム・スピーシーズＯＴＣ−７と
を比べると、フラボバクテリウム・スピーシーズＯＴＣ
−７の菌体が少し大きい。また、フラボバクテリウム・
スピーシーズＯＴＣ−６は、液体の培地で振盪培養する
と、菌体が凝集する。Flavobacterium species OTC
-6 and Flavobacterium species OTC-7 are compared, flavobacterium species OTC
-7 cells are slightly larger. In addition, flavobacterium
When the Species OTC-6 is cultured in a liquid medium with shaking, bacterial cells aggregate.
【００２１】上記フラボバクテリウム属細菌の培養は、
通常の細菌の培養と同様に行なうことができ、液体培地
中にて通気攪拌下に行なうのが望ましい。The above-mentioned culture of Flavobacterium is
It can be carried out in the same manner as usual culture of bacteria, and it is preferably carried out in a liquid medium with aeration and stirring.
【００２２】培養に用いられる培地は、アルギン酸類を
必須成分とする。アルギン酸類としては、例えばアルギ
ン酸、その塩、エステル等を挙げることができる。アル
ギン酸の添加量は、特に制限されるものではないが、通
常培地全量に対して０．１〜２重量％程度とするのがよ
い。更に、本発明で用いられる培地には、アルギン酸類
以外に、細菌の培養に用いられている通常の炭素源、窒
素源、無機塩類等が含有されていてもよい。ここで炭素
源としては、例えばグルコース等が、窒素源としては、
例えばペプトン、肉エキス、コーンスチープリカー、酵
母エキス等の有機窒素化合物や硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム等の無機窒素化合物等が、また無機塩類と
しては、例えばリン酸一カリウム、リン酸二カリウム、
硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等がそれぞれ挙げら
れる。The medium used for culturing contains alginic acid as an essential component. Examples of the alginic acids include alginic acid, its salts and esters. The amount of alginic acid added is not particularly limited, but it is usually about 0.1 to 2% by weight based on the total amount of the medium. Further, the medium used in the present invention may contain, in addition to alginates, usual carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts and the like used for culturing bacteria. Here, as the carbon source, for example, glucose or the like, and as the nitrogen source,
For example, peptone, meat extract, corn steep liquor, organic nitrogen compounds such as yeast extract and ammonium sulfate, inorganic nitrogen compounds such as ammonium chloride and the like, and as inorganic salts, for example, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate,
Examples thereof include magnesium sulfate and sodium chloride.
【００２３】培養は、２５〜３５℃程度の温度条件下及
び５．５〜８．０程度のｐＨ条件下にて行なわれ、通常
２４〜４８時間程度で終了する。得られる培養物を従来
公知の手段に従って精製することにより、アルギン酸リ
アーゼを採取することができる。例えば、遠心分離にて
培養物から菌体を分取し、これを超音波破砕機、加圧ミ
ル等で破砕し、粗酵素を抽出した後、ＤＥＡＥ−セルロ
ース、セファデックスＧ−１５０、ヒドロキシルアパタ
イト等を用いたカラムクロマトグラフィー等により精製
すればよい。Culturing is carried out under a temperature condition of about 25 to 35 ° C. and a pH condition of about 5.5 to 8.0 and is usually completed in about 24 to 48 hours. Alginate lyase can be collected by purifying the obtained culture according to a conventionally known means. For example, cells are separated from the culture by centrifugation, the cells are crushed with an ultrasonic crusher, a pressure mill, etc., and the crude enzyme is extracted, followed by DEAE-cellulose, Sephadex G-150, hydroxylapatite. It may be purified by column chromatography using the above.
【００２４】斯くしてフラボバクテリウム・スピーシー
ズＯＴＣ−６及びフラボバクテリウム・スピーシーズＯ
ＴＣ−７から、それぞれ３種類の酵素が得られる。その
うち代表的なフラボバクテリウム・スピーシーズＯＴＣ
−６から得られた酵素２種（Ａ１−Ｉ及びＡ１−ＩＩ−
１）とフラボバクテリウム・スピーシーズＯＴＣ−７か
ら得られた酵素１種（Ａ２−Ｉ）は、下記の理化学的性
質を有している。Thus, Flavobacterium species OTC-6 and Flavobacterium species O
From TC-7, three kinds of enzymes are obtained. Among them, the representative Flavobacterium species OTC
-6 from two enzymes (A1-I and A1-II-
1) and 1 type of enzyme (A2-I) obtained from Flavobacterium species OTC-7 have the following physicochemical properties.
【００２５】（１）作用：アルギン酸類を非還元末端の
Ｃ4 −Ｃ5 間に二重結合を有する糖に分解し、最終的に
４−デオキシ−５−ケトウロン酸に分解する。(1) Action: Alginic acid is decomposed into a sugar having a double bond between C 4 and C 5 at the non-reducing end, and finally decomposed into 4-deoxy-5-ketouronic acid.
【００２６】（２）基質特異性：アルギン酸類、即ちア
ルギン酸及びその塩やエステルに作用する。詳細を下記
表１に示す。(2) Substrate specificity: It acts on alginic acid, that is, alginic acid and its salts and esters. Details are shown in Table 1 below.
【００２７】[0027]
【表１】 [Table 1]
【００２８】（３）至適ｐＨ：３種酵素の至適ｐＨは、
それぞれ８．０である。(3) Optimum pH: The optimum pH of the three kinds of enzymes is
Each is 8.0.
【００２９】（４）安定ｐＨ：３種酵素の安定ｐＨは、
それぞれ７．０〜８．０である。(4) Stable pH: The stable pH of the three enzymes is
Each is 7.0 to 8.0.
【００３０】（５）至適温度：３種酵素の至適温度は、
それぞれ７０℃である。(5) Optimum temperature: The optimum temperature of the three kinds of enzymes is
Each is 70 ° C.
【００３１】（６）金属イオン及び阻止剤の影響：詳細
を下記表２に示す。(6) Effect of metal ion and inhibitor: Details are shown in Table 2 below.
【００３２】[0032]
【表２】 [Table 2]
【００３３】（７）分子量：３種のアルギン酸リアーゼ
を、それぞれ１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動にかけ、染色液（エタノール４５％、酢酸１０
％、水４５％、コマジーブリリアントブルーＲ−２５０
０．２５％）中にて、３７℃で３時間振盪し、脱色液
（エタノール２５％、酢酸７％）で数回脱色した後、分
子量を決定した。この結果、３種とも分子量６万の蛋白
であることが判明した。(7) Molecular weight: Each of three types of alginate lyase was subjected to 12.5% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis to obtain a staining solution (45% ethanol, 10% acetic acid).
%, Water 45%, Comasy Brilliant Blue R-250
In 0.25%), the mixture was shaken at 37 ° C. for 3 hours, decolorized several times with a decolorizing solution (ethanol 25%, acetic acid 7%), and then the molecular weight was determined. As a result, it was revealed that all three proteins were proteins having a molecular weight of 60,000.
【００３４】以上の結果から、上記菌により得られる酵
素がアルギン酸リアーゼであることが確認された。From the above results, it was confirmed that the enzyme obtained by the above bacterium is alginate lyase.
【００３５】本発明において、上記菌の菌体又は菌体か
ら抽出精製した酵素及びそれらの固定化物等によるアル
ギン酸類の分解は、通常の方法に従って行なわれる。例
えばアルギン酸類の水溶液に酵素を添加すればよい。前
記水溶液中のアルギン酸類の濃度は特に制限されない
が、通常０．１〜５重量％程度とすればよい。菌体又は
酵素の添加量も、特に制限されるものではない。反応温
度は、アルギン酸リアーゼが作用し得る温度であればよ
く、通常２０〜８０℃程度である。In the present invention, the decomposition of alginic acid by the bacterial cells of the above-mentioned bacteria or the enzymes extracted and purified from the bacterial cells and their immobilized products and the like is carried out according to a usual method. For example, the enzyme may be added to an aqueous solution of alginic acid. Although the concentration of alginic acid in the aqueous solution is not particularly limited, it is usually about 0.1 to 5% by weight. The amount of cells or enzyme added is not particularly limited. The reaction temperature may be a temperature at which alginate lyase can act, and is usually about 20 to 80 ° C.
【００３６】[0036]
【発明の効果】本発明で用いられるフラボバクテリウム
属細菌は、アルギン酸リアーゼ産生能が極めて高く、従
って本発明の方法によれば、工業的規模でアルギン酸を
低分子化することができる。INDUSTRIAL APPLICABILITY The Flavobacterium bacterium used in the present invention has an extremely high alginate lyase-producing ability. Therefore, according to the method of the present invention, the molecular weight of alginic acid can be reduced on an industrial scale.
【００３７】[0037]
【実施例】以下に実施例を掲げて本発明をより一層明ら
かにする。尚、以下に単に「％」とあるのは「重量％」
を意味する。EXAMPLES The present invention will be further clarified with reference to the following examples. In addition, simply "%" in the following is "% by weight"
Means
【００３８】[0038]
【実施例１】フラボバクテリウム・スピーシーズＯＴＣ
−６を、オートクレーブで滅菌した液体培地（アルギン
酸ナトリウム１．５０％、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ０．１
０％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％、ＫＨ2 ＰＯ
4 ０．１０％、Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ ０．４
０％及び酵母エキス０．０５％を含む、ｐＨ７．２）１
０ｌに接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。得られ
た培養液を遠心分離し、菌体７３ｇを得た。これを１０
ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）６０ｍｌに懸濁
し、９ＫＨｚ、１７０ｗ、１０分の超音波破砕処理を施
した後、遠心分離（２５０００ｇ、３０分）した。菌体
抽出液１２０ｍｌを、ＤＥＡＥ−セルロース（商標名、
和光純薬（株）製）カラム（４ｃｍ×４５ｃｍ、グラジ
エント：０．５Ｍ ＮａＣｌ）で精製した。該活性画分
２５０ｍｌをヒドロキシルアパタイト（商標名：東洋曹
達（株）製）カラム（４ｃｍ×２５ｃｍ、グラジエン
ト：５００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液）で精製し、活
性画分７０ｍｌを得た。これを、ＱＡＥ−セファデック
ス Ａ−２５カラム（２．５ｃｍ×３５ｃｍ、グラジエ
ント：０．５Ｍ ＮａＣｌ）で酵素Ａ１−Ｉ及び酵素Ａ
１−ＩＩに分画した。酵素Ａ１−ＩＩは、更にセファデ
ックス−Ｇ−１５０（商標名：ファルマシア製）カラム
（１．５ｃｍ×９０ｃｍ）で、酵素Ａ１−ＩＩ−１及び
酵素Ａ１−ＩＩ−２に分画し、合計３種類の酵素液を得
た。[Example 1] Flavobacterium species OTC
-6 was sterilized in an autoclave liquid medium (sodium alginate 1.50%, (NH 4 ) 2 SO 4 0.1.
0%, MgSO 4 · 7H 2 O 0.05%, KH 2 PO
4 0.10%, Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 0.4
0% and yeast extract 0.05%, pH 7.2) 1
0 l was inoculated and cultured with shaking at 30 ° C for 24 hours. The obtained culture solution was centrifuged to obtain 73 g of bacterial cells. This is 10
The cells were suspended in 60 ml of mM Tris / HCl buffer (pH 7.0), subjected to ultrasonic disruption treatment at 9 KHz, 170 w for 10 minutes, and then centrifuged (25,000 g, 30 minutes). 120 ml of the cell extract was added to DEAE-cellulose (trade name,
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) column (4 cm × 45 cm, gradient: 0.5 M NaCl). 250 ml of the active fraction was purified with a hydroxylapatite (trade name: manufactured by Toyo Soda Co., Ltd.) column (4 cm × 25 cm, gradient: 500 mM potassium phosphate buffer) to obtain 70 ml of the active fraction. This was subjected to QAE-Sephadex A-25 column (2.5 cm × 35 cm, gradient: 0.5 M NaCl) with enzyme A1-I and enzyme A.
Fractionation 1-II. The enzyme A1-II was further fractionated into an enzyme A1-II-1 and an enzyme A1-II-2 by a Sephadex-G-150 (trade name: manufactured by Pharmacia) column (1.5 cm × 90 cm), and a total of 3 was obtained. A variety of enzyme solutions were obtained.
【００３９】[0039]
【実施例２】アルギン酸ナトリウムの２．０％水溶液
に、フラボバクテリウム・スピーシーズＯＴＣ−７から
得られたアルギン酸粗酵素液（タンパク濃度８．０ｍｇ
／ｍｌ）を０．５％添加し、５０℃で酵素反応させ、前
記水溶液の粘度の経時変化を調べた。結果を図１に示
す。図１において、Ａはアルギン酸リアーゼを加えない
場合、Ｂはアルギン酸リアーゼを０．５％添加した場合
を示す。Example 2 A 2.0% aqueous solution of sodium alginate was added to a crude alginate enzyme solution (protein concentration 8.0 mg) obtained from Flavobacterium species OTC-7.
/ Ml) was added at 0.5% and enzymatic reaction was carried out at 50 ° C., and the change in viscosity of the aqueous solution with time was examined. The results are shown in Fig. 1. In FIG. 1, A shows the case where no alginate lyase was added, and B shows the case where 0.5% of alginate lyase was added.
【００４０】図１から、酵素添加後１５分でアルギン酸
ナトリウム水溶液の粘度が１／３に低下し、約１時間で
１／７の粘度になることがわかる。From FIG. 1, it can be seen that the viscosity of the sodium alginate aqueous solution decreases to 1/3 in 15 minutes after the addition of the enzyme and becomes 1/7 in about 1 hour.
【図１】アルギン酸ナトリウム水溶液にアルギン酸リア
ーゼを添加した場合及び添加しない場合の、該水溶液の
粘度の経時変化を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing changes with time in viscosity of an aqueous solution of sodium alginate with and without addition of alginate lyase.
Ａ：アルギン酸リアーゼを添加した場合 Ｂ：アルギン酸リアーゼを添加しない場合 A: When alginate lyase was added B: When no alginate lyase was added
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡山 謙一 徳島県徳島市川内町加賀須野463番地 大 塚化学株式会社食品研究所内 (72)発明者 山口 寿子 大阪府吹田市豊津町32−27 (72)発明者 村田 幸作 京都府京都市山科区北花山中道町848 (72)発明者 木村 光 京都府京都市下京区若宮通り六条上ル81 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page (72) Inventor Kenichi Okayama 463 Kagasuno, Kawauchi Town, Tokushima City, Tokushima Prefecture Tsuka Chemical Co., Ltd. Food Research Institute (72) Inventor Hisako Yamaguchi 32-27 Toyotsu Town, Suita City, Osaka Prefecture (72) Inventor Kosaku Murata 848 Kitahanayama Nakamichi-cho, Yamashina-ku, Kyoto-shi, Kyoto Prefecture (72) Inventor Hikaru Kimura 81 Rokujoue, Wakamiya Dori, Shimogyo-ku, Kyoto-shi, Kyoto Prefecture
Claims (3)
ウム属細菌を、アルギン酸に作用させてアルギン酸を分
解することを特徴とするアルギン酸の分解法。1. A method for decomposing alginic acid, which comprises degrading alginic acid by causing a flavobacterium having an ability to decompose alginic acid to act on alginic acid.
リウム・スピーシーズＯＴＣ−６である請求項１記載の
方法。2. The method according to claim 1, wherein the Flavobacterium is Flavobacterium species OTC-6.
リウム・スピーシーズＯＴＣ−７である請求項１記載の
方法。3. The method according to claim 1, wherein the bacterium belonging to the genus Flavobacterium is Flavobacterium species OTC-7.
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| JP (1) | JP3076856B2 (en) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009149734A (en) * | 2007-12-19 | 2009-07-09 | Kao Corp | Production method for alginic acid of low molecular weight or derivative thereof |
| JP2012210208A (en) * | 2011-03-24 | 2012-11-01 | Hokkaido Univ | NEW BACTERIUM BELONGING TO GENUS FLAVOBACTERIUM, ENZYME PRODUCED BY THE SAME BACTERIUM AND DEGRADING ALGINATE, METHOD FOR PRODUCING OLIGOSACCHARIDE, UNSATURATED MONOSACCHARIDE OR α-KETO ACID BY USING THEM, NEW ENDO TYPE ALGINATE LYASE AND GENE ENCODING THE SAME ENZYME |
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-
1991
- 1991-07-05 JP JP16489991A patent/JP3076856B2/en not_active Expired - Fee Related
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