JPH048040B2 - - Google Patents
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- JPH048040B2 JPH048040B2 JP58248865A JP24886583A JPH048040B2 JP H048040 B2 JPH048040 B2 JP H048040B2 JP 58248865 A JP58248865 A JP 58248865A JP 24886583 A JP24886583 A JP 24886583A JP H048040 B2 JPH048040 B2 JP H048040B2
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Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、モノクローナル抗体に関する。
Rh式血液型は臨床上も遺伝学上も重要な意義
を有し、血液型不適合が原因で新生児溶血性疾患
や輸血副作用が起こることがよく知られている。 すなわち、Rh陰性の婦人がRh陽性の胎児を宿
す胎児の陽性因子により母体が免疫されて抗Rh
抗体を作ることが多く、この抗Rh抗体は次のRh
陽性の胎児の血中に入り、その赤血球を破壊して
胎児の発育障害や新生児溶血性疾患の原因になる
ことが多い。 また、Rh陽性の血液をRh陰性の人に輸血する
と、Rh陰性の人は免疫されて抗Rh抗体をつく
り、後にRh陽性血液を輸血したときの輸血副作
用の原因となる。 このRh型には多数の抗原因子があることが知
られており、よく用いられるフイツシヤー
（Fisher）方式によれば原則としてＣ，ｃ；Ｄ，
ｄ；Ｅ，ｅの６個がある（これらの文字は、同時
に遺伝子を表わし、大小の文字はそれぞれ対立因
子であると想定されている。）。 そして、各抗原因子に対する抗体がそれぞれ存
在するが、通常、Rh陽性というのは抗Ｄ抗体と
反応する血液、つまりＤ抗原因子を有する血液
（Rh（Ｄ）陽性）をいう。これは、このＤ因子は
他の抗原因子よりも、上記不適合輸血、不適合妊
娠などのときに抗体を発生しやすいので、通常、
抗Ｄ判定用血清を用いて、その反応の有無から
Rh陽性か否かが分類されていることによる。 このような抗Rh（Ｄ）抗体は、たとえば、上記
第一子の出産直後に母体に投与することにより
Rh（Ｄ）抗原を中和して、Rh不適合による上記
症患を予防するのに用いられている。 本発明者らは、特異性の高い抗Rh（Ｄ）抗体を
大量に得るべく、種々検討した結果、本発明に到
達した。 すなわち、本発明の要旨は、Rh（Ｄ）陰性血球
を凝集させず、かつ、Rh（Ｄ）及びRh（Du）陽性
血球を凝集させるモノクローナル抗体にある。 以下、本発明を詳細に説明する。 まず、本発明に係るモノクローナル抗体は、次
のような方法により得られる。 すなわち、抗Rh（Ｄ）抗体陽性者の末梢血リン
パ球を、エプステイン パルEpstein−Barrウイ
ルス（EBウイルス）でトランスフオームするこ
とにより、抗Rh（Ｄ）抗体陽性の培養細胞を得、
ついで、これをクローン化して目的とする抗体を
産生する細胞株を得ることができる。 たとえば、抗Rh（Ｄ）抗体を保持するヒトの末
梢血をヘパリン加採血しフイコール コンレイ
（Ficol−Conray）比重遠心法でリンパ球を分離
する。一方、EBウイルスを産生放出している細
胞（たとえば、B95−８）を培地中で培養し、そ
の培養上清を分離し、ウイルス源（EBウイルス
液）を得る。ついで、このEBウイルス液と上記
リンパ球を接触させた後、種々の培養密度で、組
織培養用プレートに接種して培養する。 このトランスフオーメーシヨンの方法は適宜常
法を選ぶことができるが、少ない細胞密度で接種
するオリゴクローン法が好適に使用される。細胞
の増殖がみられる時期に、培養上清を集め、抗体
活性のスクリーニングを行ない、抗体活性陽性の
ものについて、クローニングを行なう。クローニ
ングに際しては、軟寒天（soft agar）法、限界
希釈（limiting dilution）法又はシングルセルマ
ニピユレーシヨン（single cellmanipulation）法
の常法を用いることができるが、主として軟寒天
法が用いられる。 この場合、たとえば、細胞をある密度で支持寒
天層上の接種寒天層に植え込み、増殖してきたコ
ロニーを分離し、再び浮遊培養にうつし、坑体陽
性のクローン株を取得する。クローン化された細
胞株が産生する抗体は常法により取得でき、次の
ような性質を有する。 (i) Rh（Ｄ）陰性血球を凝集しない (ii) Rh（Ｄ）及び不完全抗原であるRh（Du）陽性
血球を凝集する。 また、本発明で得られる抗体の活性は更に、
Rh（Ｄ）陽性血球で吸収され、陰性血球で吸収さ
れない。 得られる抗体は、常法によりたとえばセルロー
スイオン交換クロマトグラフイー等により精製し
て用いることもでき、精製抗体は免疫電気泳動か
ら得られる沈降線から抗ヒトIgG抗体であると認
められる。 本発明に係る抗体は、従来の抗体と同等の特異
性を有し、純度の高い単一の抗体であるので、輸
血に際してのRh（Ｄ）抗原型の検索に有用であ
り、そしてRh不適合による新生児溶血性疾患の
予防、さらには解析が余り進んでいないRh（Ｄ）
抗原の分子レベルでの解明等に有用である。 以下、実施例により本発明を具体的に説明する
が、本発明は、その要旨を超えない限り以下の実
施例に限定されない。 実施例 １ １ 抗Rh（Ｄ）抗体陽性のヒト末梢血リンパ球の
トランスフオーメーシヨン １） 培地 RPMI1640培地に、リラシリン100μg／ml、
ストレプトマイシン100μg／ml、グルタミン
2mM、炭酸水素ナトリウム1g／を加えた
後、二酸化炭素ガスを吹きこみPH7.0〜7.4と
し、牛胎児血清（FBS）を20％となるよう
に加えて使用する。 ２） EBウイルスの作成 EBウイルスを産生するB95−８細胞
（Proceedings of National Academy of
Science、70（１）、190−194（1973））を３×
105／mlの細胞密度でRPMI1640＋10％FBS
培地を用いて７日間培養し、0.3μmのミリポ
アフイルターで過した培養上清をウイルス
液として用いる。ウイルスの力価判定には、
臍帯血のトランスフオーメーシヨンを利用し
たTD50／mlを用いる。ウイルスは、その力
価が105TD50／ml以上のものを用いる。 ３） リンパ球の分離 ヘパリン加採血した抗Rh（Ｄ）抗体陽性の
ヒト静脈血から、フイコール コンレイ
（Ficol−Conray）比重遠心法（Ficol−
Conrayの比重1.077）で単核球を分取し、末
梢血リンパ球として用いる。上記の方法で末
梢血１ml当り約105個の末梢血リンパ球が分
離される。 ４） EBウイルスの吸着及び培養 遠心により沈渣とした末梢血リンパ球105
個当り１mlのEBウイルス（105TD50／ml以
上）を加え、37℃で１時間放置する。その
後、遠心によりウイルス液を除きRPMI1640
＋20％FCS培地を加え細胞密度を調整し、平
底マイクロタイタープレートに0.1ずつ細胞
を植えこむ。４日後に培地を0.1ml加え以後
４〜７日に１度培地の半量交換を行う。植え
こむ細胞数によつて異なるが、平底マイクロ
タイタープレート１ウエル当り105個では、
７〜10日で細胞が細胞集塊を形成し活発に増
殖してくる。通常、EBウイルスを吸着させ
た末梢血リンパ球を、平底マイクロタイター
プレート１ウエル当り103〜105個の細胞密度
で植えこむ。 ５） 培養上清中の抗Rh（Ｄ）抗体価の検出 細胞が増殖してきたら、培養上清を集め、
抗体価を測定する。その時期は、植えこむ細
胞数によつて異なるが、３週目から４週目に
かけて抗体活性陽性のウエルが認められる。
抗体陽性のウエルは、24穴マルチウエルプー
ト、35mmのシヤーレ、60mmのシヤーレと培養
量を拡大し、トランスフオーム６週目位から
クローニングを行う。 ２ クローニング 軟寒天法により行なつた。すなわち、支持層
0.5％、接種層0.3％のアガロース（マリーン
コロイズ）（Marine Colloids）社製 （シー
プラーク）（Sea Plaqueアガロース）を含む
RPMI1640＋20％FBG培地を用いる。細胞は
プレート当り100〜10000個植えこむ。培養開始
後10〜20日で肉眼で認められるコロニーが形成
される。この時点でパスツールピペツトを用い
てコロニーを吸い上げ、あらかじめ0.1mlの
RPMI1640＋20％FCS培地を入れたマイクロタ
イタープレートに細胞を移して培養し、クロー
ン株を得る。 ３ 抗体の取得及び精製 上記クローン株を上記と同一培地中で増殖さ
せ、培養上清を集め抗体を取得する。 この上清を1.33M硫安塩析後、DEAEセルロ
ースイオン交換クロマトグラフイー（DE52、
0.01Mリン酸緩衝液PH8.0）で精製し抗体を得
た。精製抗体は、免疫電気泳動で、抗ヒトIgG
抗体に対応する沈降線を示した。還元条件下の
SDS電気泳動分析では、IgGのＨ鎖とＬ鎖に相
当する２本のバンドがみられた。 参考例 １ (1) Rh（Ｄ）陰性血球との反応性 実施例１で得られた本発明の抗Rh（Ｄ）抗体
を表１に示すRh（Ｄ）陰性血球と反応させ、反
応性の有無を調べた。 結果を表１に示す。
を有し、血液型不適合が原因で新生児溶血性疾患
や輸血副作用が起こることがよく知られている。 すなわち、Rh陰性の婦人がRh陽性の胎児を宿
す胎児の陽性因子により母体が免疫されて抗Rh
抗体を作ることが多く、この抗Rh抗体は次のRh
陽性の胎児の血中に入り、その赤血球を破壊して
胎児の発育障害や新生児溶血性疾患の原因になる
ことが多い。 また、Rh陽性の血液をRh陰性の人に輸血する
と、Rh陰性の人は免疫されて抗Rh抗体をつく
り、後にRh陽性血液を輸血したときの輸血副作
用の原因となる。 このRh型には多数の抗原因子があることが知
られており、よく用いられるフイツシヤー
（Fisher）方式によれば原則としてＣ，ｃ；Ｄ，
ｄ；Ｅ，ｅの６個がある（これらの文字は、同時
に遺伝子を表わし、大小の文字はそれぞれ対立因
子であると想定されている。）。 そして、各抗原因子に対する抗体がそれぞれ存
在するが、通常、Rh陽性というのは抗Ｄ抗体と
反応する血液、つまりＤ抗原因子を有する血液
（Rh（Ｄ）陽性）をいう。これは、このＤ因子は
他の抗原因子よりも、上記不適合輸血、不適合妊
娠などのときに抗体を発生しやすいので、通常、
抗Ｄ判定用血清を用いて、その反応の有無から
Rh陽性か否かが分類されていることによる。 このような抗Rh（Ｄ）抗体は、たとえば、上記
第一子の出産直後に母体に投与することにより
Rh（Ｄ）抗原を中和して、Rh不適合による上記
症患を予防するのに用いられている。 本発明者らは、特異性の高い抗Rh（Ｄ）抗体を
大量に得るべく、種々検討した結果、本発明に到
達した。 すなわち、本発明の要旨は、Rh（Ｄ）陰性血球
を凝集させず、かつ、Rh（Ｄ）及びRh（Du）陽性
血球を凝集させるモノクローナル抗体にある。 以下、本発明を詳細に説明する。 まず、本発明に係るモノクローナル抗体は、次
のような方法により得られる。 すなわち、抗Rh（Ｄ）抗体陽性者の末梢血リン
パ球を、エプステイン パルEpstein−Barrウイ
ルス（EBウイルス）でトランスフオームするこ
とにより、抗Rh（Ｄ）抗体陽性の培養細胞を得、
ついで、これをクローン化して目的とする抗体を
産生する細胞株を得ることができる。 たとえば、抗Rh（Ｄ）抗体を保持するヒトの末
梢血をヘパリン加採血しフイコール コンレイ
（Ficol−Conray）比重遠心法でリンパ球を分離
する。一方、EBウイルスを産生放出している細
胞（たとえば、B95−８）を培地中で培養し、そ
の培養上清を分離し、ウイルス源（EBウイルス
液）を得る。ついで、このEBウイルス液と上記
リンパ球を接触させた後、種々の培養密度で、組
織培養用プレートに接種して培養する。 このトランスフオーメーシヨンの方法は適宜常
法を選ぶことができるが、少ない細胞密度で接種
するオリゴクローン法が好適に使用される。細胞
の増殖がみられる時期に、培養上清を集め、抗体
活性のスクリーニングを行ない、抗体活性陽性の
ものについて、クローニングを行なう。クローニ
ングに際しては、軟寒天（soft agar）法、限界
希釈（limiting dilution）法又はシングルセルマ
ニピユレーシヨン（single cellmanipulation）法
の常法を用いることができるが、主として軟寒天
法が用いられる。 この場合、たとえば、細胞をある密度で支持寒
天層上の接種寒天層に植え込み、増殖してきたコ
ロニーを分離し、再び浮遊培養にうつし、坑体陽
性のクローン株を取得する。クローン化された細
胞株が産生する抗体は常法により取得でき、次の
ような性質を有する。 (i) Rh（Ｄ）陰性血球を凝集しない (ii) Rh（Ｄ）及び不完全抗原であるRh（Du）陽性
血球を凝集する。 また、本発明で得られる抗体の活性は更に、
Rh（Ｄ）陽性血球で吸収され、陰性血球で吸収さ
れない。 得られる抗体は、常法によりたとえばセルロー
スイオン交換クロマトグラフイー等により精製し
て用いることもでき、精製抗体は免疫電気泳動か
ら得られる沈降線から抗ヒトIgG抗体であると認
められる。 本発明に係る抗体は、従来の抗体と同等の特異
性を有し、純度の高い単一の抗体であるので、輸
血に際してのRh（Ｄ）抗原型の検索に有用であ
り、そしてRh不適合による新生児溶血性疾患の
予防、さらには解析が余り進んでいないRh（Ｄ）
抗原の分子レベルでの解明等に有用である。 以下、実施例により本発明を具体的に説明する
が、本発明は、その要旨を超えない限り以下の実
施例に限定されない。 実施例 １ １ 抗Rh（Ｄ）抗体陽性のヒト末梢血リンパ球の
トランスフオーメーシヨン １） 培地 RPMI1640培地に、リラシリン100μg／ml、
ストレプトマイシン100μg／ml、グルタミン
2mM、炭酸水素ナトリウム1g／を加えた
後、二酸化炭素ガスを吹きこみPH7.0〜7.4と
し、牛胎児血清（FBS）を20％となるよう
に加えて使用する。 ２） EBウイルスの作成 EBウイルスを産生するB95−８細胞
（Proceedings of National Academy of
Science、70（１）、190−194（1973））を３×
105／mlの細胞密度でRPMI1640＋10％FBS
培地を用いて７日間培養し、0.3μmのミリポ
アフイルターで過した培養上清をウイルス
液として用いる。ウイルスの力価判定には、
臍帯血のトランスフオーメーシヨンを利用し
たTD50／mlを用いる。ウイルスは、その力
価が105TD50／ml以上のものを用いる。 ３） リンパ球の分離 ヘパリン加採血した抗Rh（Ｄ）抗体陽性の
ヒト静脈血から、フイコール コンレイ
（Ficol−Conray）比重遠心法（Ficol−
Conrayの比重1.077）で単核球を分取し、末
梢血リンパ球として用いる。上記の方法で末
梢血１ml当り約105個の末梢血リンパ球が分
離される。 ４） EBウイルスの吸着及び培養 遠心により沈渣とした末梢血リンパ球105
個当り１mlのEBウイルス（105TD50／ml以
上）を加え、37℃で１時間放置する。その
後、遠心によりウイルス液を除きRPMI1640
＋20％FCS培地を加え細胞密度を調整し、平
底マイクロタイタープレートに0.1ずつ細胞
を植えこむ。４日後に培地を0.1ml加え以後
４〜７日に１度培地の半量交換を行う。植え
こむ細胞数によつて異なるが、平底マイクロ
タイタープレート１ウエル当り105個では、
７〜10日で細胞が細胞集塊を形成し活発に増
殖してくる。通常、EBウイルスを吸着させ
た末梢血リンパ球を、平底マイクロタイター
プレート１ウエル当り103〜105個の細胞密度
で植えこむ。 ５） 培養上清中の抗Rh（Ｄ）抗体価の検出 細胞が増殖してきたら、培養上清を集め、
抗体価を測定する。その時期は、植えこむ細
胞数によつて異なるが、３週目から４週目に
かけて抗体活性陽性のウエルが認められる。
抗体陽性のウエルは、24穴マルチウエルプー
ト、35mmのシヤーレ、60mmのシヤーレと培養
量を拡大し、トランスフオーム６週目位から
クローニングを行う。 ２ クローニング 軟寒天法により行なつた。すなわち、支持層
0.5％、接種層0.3％のアガロース（マリーン
コロイズ）（Marine Colloids）社製 （シー
プラーク）（Sea Plaqueアガロース）を含む
RPMI1640＋20％FBG培地を用いる。細胞は
プレート当り100〜10000個植えこむ。培養開始
後10〜20日で肉眼で認められるコロニーが形成
される。この時点でパスツールピペツトを用い
てコロニーを吸い上げ、あらかじめ0.1mlの
RPMI1640＋20％FCS培地を入れたマイクロタ
イタープレートに細胞を移して培養し、クロー
ン株を得る。 ３ 抗体の取得及び精製 上記クローン株を上記と同一培地中で増殖さ
せ、培養上清を集め抗体を取得する。 この上清を1.33M硫安塩析後、DEAEセルロ
ースイオン交換クロマトグラフイー（DE52、
0.01Mリン酸緩衝液PH8.0）で精製し抗体を得
た。精製抗体は、免疫電気泳動で、抗ヒトIgG
抗体に対応する沈降線を示した。還元条件下の
SDS電気泳動分析では、IgGのＨ鎖とＬ鎖に相
当する２本のバンドがみられた。 参考例 １ (1) Rh（Ｄ）陰性血球との反応性 実施例１で得られた本発明の抗Rh（Ｄ）抗体
を表１に示すRh（Ｄ）陰性血球と反応させ、反
応性の有無を調べた。 結果を表１に示す。
【表】
(2) 本発明に係る抗Rh（Ｄ）抗体のRh（Ｄ）陽性
血球による吸収血球による吸収Rh（Ｄ）陽性血
球を常法によりフイシン処理し、ダルペツコリ
ン酸緩衝液（PBS）に懸濁した５％Rh（Ｄ）陽
性血球３mlを遠心（2000rpm5分）し、沈渣に、
HA（赤血球凝集）力価が32倍の抗Rh（Ｄ）抗
体を加え、４℃で１時間静置した。静置後、上
清の抗Rh（Ｄ）抗体活性はHA法で完全に消失
した。一方、同様にしてRh（Ｄ）陰性血球を吸
収に用いた場合は、抗Rh（Ｄ）抗体活性は、消
失せず、HA力価が32倍と全く吸収されなかつ
た。 (3) アルブミン、ブロメリン及び間接クームス
（Cooms）による反応試験 本発明に係る抗Rh（Ｄ）抗体のRh（Ｄ）及び
Rh（Du）陽性血球との反応性を検討するため、
(i)ウシアルブミン溶液を用いたアルブミン法、
(ii)ブロメリン（酵素）（0.5％をPBSに溶解）を
用いるブロメリン法、及び(iii)ヒト血清免疫グロ
ブリンに対するウサギの抗血清（クームス）
（Cooms）（血清）を用いる間接クームス法に
よる反応試験を常法により行なつた。結果を表
２に示す。
血球による吸収血球による吸収Rh（Ｄ）陽性血
球を常法によりフイシン処理し、ダルペツコリ
ン酸緩衝液（PBS）に懸濁した５％Rh（Ｄ）陽
性血球３mlを遠心（2000rpm5分）し、沈渣に、
HA（赤血球凝集）力価が32倍の抗Rh（Ｄ）抗
体を加え、４℃で１時間静置した。静置後、上
清の抗Rh（Ｄ）抗体活性はHA法で完全に消失
した。一方、同様にしてRh（Ｄ）陰性血球を吸
収に用いた場合は、抗Rh（Ｄ）抗体活性は、消
失せず、HA力価が32倍と全く吸収されなかつ
た。 (3) アルブミン、ブロメリン及び間接クームス
（Cooms）による反応試験 本発明に係る抗Rh（Ｄ）抗体のRh（Ｄ）及び
Rh（Du）陽性血球との反応性を検討するため、
(i)ウシアルブミン溶液を用いたアルブミン法、
(ii)ブロメリン（酵素）（0.5％をPBSに溶解）を
用いるブロメリン法、及び(iii)ヒト血清免疫グロ
ブリンに対するウサギの抗血清（クームス）
（Cooms）（血清）を用いる間接クームス法に
よる反応試験を常法により行なつた。結果を表
２に示す。
【表】
すなわち、アルブミン法及びブロメリン法にお
いて陰性であり、間接クームス法において陽性を
示すことから、本発明に係る抗Rh（Ｄ）抗体は不
完全抗原であるDu抗原とも反応性を有すること
が示された。
いて陰性であり、間接クームス法において陽性を
示すことから、本発明に係る抗Rh（Ｄ）抗体は不
完全抗原であるDu抗原とも反応性を有すること
が示された。
Claims (1)
- １ Rh（Ｄ）陰性血球を凝集させず、かつ、Rh
（Ｄ）及びRh（Du）陽性血球を凝集させるモノク
ローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58248865A JPS60136599A (ja) | 1983-12-26 | 1983-12-26 | モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58248865A JPS60136599A (ja) | 1983-12-26 | 1983-12-26 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60136599A JPS60136599A (ja) | 1985-07-20 |
| JPH048040B2 true JPH048040B2 (ja) | 1992-02-13 |
Family
ID=17184569
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58248865A Granted JPS60136599A (ja) | 1983-12-26 | 1983-12-26 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60136599A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8722020D0 (en) * | 1987-09-18 | 1987-10-28 | Central Blood Lab Authority | Human anti-rh(d)monoclonal antibodies |
| JPH021554A (ja) * | 1987-11-18 | 1990-01-05 | Internatl Reagents Corp | 杭ｄ血液型判定用試薬 |
| JPH0623760B2 (ja) * | 1988-03-03 | 1994-03-30 | 国際試薬株式会社 | 抗ｄ血液型判定用試薬 |
-
1983
- 1983-12-26 JP JP58248865A patent/JPS60136599A/ja active Granted
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| THE LANCET=1983 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60136599A (ja) | 1985-07-20 |
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