JPH04506794A

JPH04506794A - 細菌からトランスフェリン及びラクトフェリン受容体タンパク質を分離及び精製する方法並びにこれらを含有するワクチンを調製する方法

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Publication number: JPH04506794A
Application number: JP50629690A
Authority: JP
Inventors: シュリヴァーズ　アンソニー　バーナード
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Current assignee: Individual
Priority date: 1989-04-27
Filing date: 1990-04-26
Publication date: 1992-11-26
Anticipated expiration: 2017-10-21
Also published as: ZA903234B; JP3335622B2; JP2002316942A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】細菌からトランスフェリン及びラクトフェリン受容体タンパク質を分離及び精製する方法並びにこれらを含有するワクチンを調製する方法生班夏皇量本発明は、細菌性病原体からトランスフェリン及びラクトフェリン受容体タンパク質を分離及び精製するための方法、並びに精製トランスフェリン及び／又はラクトフェリン受容体タンパク質及び／又はこれらの誘導体を含有するワクチンに関するものである。

ヒト及び動物に疾患を引き起こす多数の重要な細菌性病原体に対して、有効なワクチンが存在しないか又は不充分である。

これらの病原体のうち多くは、自然感染を引き起こす能力について、比較的宿主特異的である。髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇ−ｉｔｉｄｉｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）及び淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉｅａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）のような細菌は、髄膜炎、耳炎、喉頭着炎、淋疾及び尿道炎のようなヒトの風土病及び流行病の重要な原因であり続けている。同様に、ウシにおいては、パスツレラ　へモリティ力（Ｐａｓｔｅｕｔｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）　、ヘモフィルス　ソムヌス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｏｍｎｕｓ）及びパスツレラ　ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ａ＋ｕｌｔｏｃｉｄａ）が、肺炎性のパスツレラ症及び感染力を持つ血栓塞栓性の髄膜脳炎の重要な作因である。ブタにおいては、アクチッパシラス（ヘモフィルス）プルロニューモニア（Ａｃ　ｔ　１ｎｏｂａｃ　ｉ　Ｉ　ｌ　ｕｓ　（Ｈａｅｍｏｐｈ　ｉ　Ｉ　ｕｓ）　ｐ　Ｉｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎ　１ａｅ）が、感染力を持つ肺炎の重要な作因である。家禽類においては、トリへモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉ）、特にヘモフィルス　パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｌｉｌｕｓ　ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）が、感染力を持つコリーザの原因である。

インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）及び髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）は、幼児の細菌性髄膜炎の最も一般的な原因である。有効な抗生物質治療が得られるにもかかわらず、髄膜炎の感染から著しい死亡率と罹患率とがもたらされている。この感染の流行性が、年齢二歳以下の子供に存在する臨床的兆候が乏しいという性質と相まって、死亡率及び罹患率を継続するのに寄与する主要因子であろう。

抗莢膜抗体の存在と全身性髄膜炎感染に対する抵抗との間に相関が観察された後に、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の莢膜多糖に基づいたワクチンが開発された。これらの莢膜多糖ワクチンは、髄膜炎菌のＡ、　Ｃ，Ｙ及びＷ−１３５莢膜血清群からの微生物によって引き起こされた感染に対して有効である。しかし、最も普通の血清群Ｂ髄膜炎菌に対して有効なワクチンはない。流行病に対して最も感染の危険が高い年令二歳以下の子供においては、莢膜多糖ワクチンに対する液性応答は乏しい。更に、莢膜ワクチンは免疫記憶を与えず、免疫の持続は比較的短い。化学修飾と破傷風トキソイドへの結合とによって乏しい免疫原性を克服する試みは幾らかの有望性を示したが、これらの結果は、ヒト胎児及び乳児の神経組織と血清群Ｂ莢膜との免疫学的交差反応性が示されたという観点から考察すべきである。

この考察からみると、風土性の髄膜炎菌性疾患の予防を充分広範にカバーするような多価多糖ワクチンが開発されることは、ありそうにない。

淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）が引き起こす淋疾は、世界に流行性の割合で伝染している。淋菌性ワクチンの開発は高い優先度を持つ。

ウシ肺炎性パスツレラ症は、育生産業における経済的損失の主原因であるが、主としてパスツレラ　ヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕ−ｒｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）によっている。Ｐ、ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａを含有するワクチンを用いた実験的研究及びフィールド実験は、この疾患の発生及び激しさを低減するという点では一定しなかった。感染力を持つ血栓塞栓性の髄膜脳炎は、牛の飼育単位に死亡をもたらす重要な原因であるが、ヘモフィルス　ソムヌス（Ｈａｅｍｏ −ｐｈｉｌｕｓ　ｓｏｍｎｕｓ）によって引き起こされる。現在のところ、この疾患を予防する有効なワクチンはない。アクチッパシラス（ヘモフィルス）プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は豚に伝染性肺炎を引き起こし、世界中の養豚産業にとって重大問題となっている。粗ワクチン調製物によるワクチン投与は、異種血清型の保護が制限されていることから成功しなかった。家禽に感染力を持つコリーザは、主としてヘモフィルス　パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｌｉｌｕｓ　ｐａｒａｇａｌｌｉ−ｎａｒｕｍ）によって引き起こされるが、家禽産業における生産性を著しく減少させている。

鉄を獲得することは、宿主における細菌性病原体の成長及び生存のために、また感染を引き起こすために不可欠である。哺乳類の宿主中の細菌性病原体は、鉄のレベルが極端に低いという環境に直面する。菌体外の部分では、血清及び粘液分泌中でそれぞれ優先する、タンパク質トランスフェリン及びラフ［・フェリンによって、鉄が分離される。鉄についてラクトフェリン及びトランスフェリンと競合する能力は、多くの細菌性感染の病原に不可欠であると考えられる。多くの細菌は、その環境からの鉄の獲得を容易にするため、シデロフォア（ｓ　１ｄｅｒｏｐｈｏｒｅｓ）として知られる鉄キレート化合物を製造する。しかし、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）及びインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のようないくつかの病原性細菌は、シデロフォアを製造せず、むしろ試験管中で成長のために直接にラクトフェリン鉄及びトランスフェリン鉄を獲得する。

Ｂ、Ｅ、ホルバイン（Ｈｏｌｂｅｉｎ）　、　１．Ｗ、デボ−（ＤｅＶｏｅ）及びＦ、Ｐ、スパーリング（Ｓｐａｒｌｉｎｇ）及び共同研究者による髄膜炎菌及び淋菌の初期の観察が示す所では、これらの細菌は、トランスフェリン及びラクトフェリンタンパク質の存在下に成長でき、成長用の′鉄の唯一の源としてこれらのタンパク質からの鉄を使用しうる。更に確認されたところでは、透析膜によって細胞からこれらのタンパク質を分離すると、トランスフェリン又はラクトフェリン鉄の使用が排除され、ラクトフェリン又はトランスフェリンから鉄を除去する可溶性因子が含まれないことが示されており、従って細胞の接触が必要なことが示唆された。Ｆ、Ｐ、スパーリング（Ｓｐａｒｌｉｎｇ）及びり、−、ダイア−（Ｄｙｅｒ）による研究の示すところでは、トランスフェリンから鉄を獲得するのに特異的に欠損した突然変異体は、結合においても欠損している。

細菌であるパスツレラ　ヘモリティカ、ヘモフィルス　ソムヌス、パスツレラ　ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アクチッパシラス（ヘモフィルス）ブルロニューモニア（八ｃｔｉｎｏｂａｃｉ１１ｕｓ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）　＋　ブタインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　５ｕｉｓ）、ヘモフィルス　パラガリナルム（Ｈａｅ−１ｌｌｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｉ）又はヘモフィルス　アビウム（Ｈａｅｍｏ−ｐｈｉｌｕｓ　ａｖｉｕｍ）において、トランスフェリン及びラクトフェリンから鉄を獲得する機構は、従来研究されなかった。

これらの作用の効力によって、トランスフェリン及びラクトフェリン受容体タンパク質は宿主中で細菌の表面上に位置し、大タンパク質に近づきうる。従って、この受容体は、抗体に媒介された宿主防衛機構に近づきうるであろう。このトランスフェリン及びラクトフェリンタンパク質受容体は、成長のため及び生存のために鉄を得るのに不可欠である。従って、この病原体は、そのトランスフェリン及び／又はラクトフェリン受容体を失って、こうした受容体タンパク質を含有するワクチン抗原によって与えられる免疫を逃れることはできない。こうした逃避技術についていかに試みても、宿主中での生存は失敗に終わるであろう。

この鉄摂取プロセスの性質は従来知られておらず、ラクトフェリン及びトランスフェリン受容体タンパク質の同定と特徴付けとは従来不可能であった。ラクトフェリン及びトランスフェリン受容体タンパク質は、従来分離も精製もされなかった。更に、これらの受容体タンパク質を含有するワクチンは、従来開発されなかった。

２Ｉ茂１斐本発明は、ラクトフェリン及びトランスフェリン受容体タンパク質を分離及び精製し、これによりラクトフェリン及び／又はトランスフェリン受容体タンパク質を含有するワクチンの製造を容易にするための方法を提供することによって、従来技術の問題点と不利益とを克服するものである。

本発明の目的は、細菌性病原体中のラクトフェリン及びトランスフェリン受容体タンパク質を同定し、これを分離及び精製するための方法を提供することである。

また、本発明の目的は、ラクトフェリン及びトランスフェリン受容体タンパク質を含有する細菌性病原体によって引き起こされる疾患の予防に有効な単成分ワクチン抗原を提供することである。

更に、本発明の目的は、幼児における細菌性病原体疾患を予防するのに有効なワクチン抗原を提供することである。

本発明の更なる目的は、現在の多糖莢膜ワクチンよりも優れた免疫記憶を示すワクチン抗原を提供することである。

本発明の更なる目的と利益とは、続く記述に一部は記載されるであろうし、一部はその記述から明らかであろうし、また本発明の実施によって学びうる。本発明の目的と利益とは、特に添付した請求の範囲内に指摘したような手段と組み合わせとによって実現され、達成されるであろう。

本発明の目的を達成するため及び本発明の目的に従い、ここで体現され広く記載されているように、本発明は、ここで記載したアフィニティークロマトグラフィー法によって、ラクトフェリン及び／又はトランスフェリン結合活性を形質発現する菌株からの脱調製物中のラクトフェリン及びトランスフェリン結合タンパク質を分離及び精製するための方法を提供する。

また、本発明は、精製されたラクトフェリン及び／又はトランスフェリン受容体タンパク質の調製物からなるワクチン抗原を提供する。

（１）クローニングされたラクトフェリン受容体遺伝子を発現する細菌又は微生物から分離された精製ラクトフェリン受容体タンパク質、（２）精製ラクトフェリン受容体タンパク質の誘導体、（３）ラクトフェリン受容体遺伝子の暗号配列の全部又は一部を含む融合タンパク質、及び（４）合成ペプチドのアミノ酸配列が、精製ラクトフェリン受容体のアミノ酸配列か又はクローニングされた受容体遺伝子のヌクレオチド配列に基づいている合成ペプチドからなる群より選ばれた調製物を含有するラクトフェリン受容体ワクチン抗原を提供する。この調製物は、典型的には、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、０．０５Ｍのリン酸ナトリウム、約７．４のｐｔｔを有する緩衝液、チメロサール及び必要に応じて補助剤中に懸濁される。

また、本発明で提供するトランスフェリン受容体ワクチン抗原は、（１）少なくとも一種のクローニングされたトランスフェリン受容体遺伝子を発現する細菌又は微生物から分離された一種以上の精製トランスフェリン受容体タンパク質、（２）精製トランスフェリン受容体タンパク質の誘導体、（３）少なくとも一種のトランスフェリン受容体遺伝子の暗号配列の全部又は一部を含む融合タンパク質、及び（４）合成ペプチドのアミノ酸配列が、精製トランスフェリン受容体タンパク質のアミノ酸配列が又はクローニングされた受容体遺伝子のヌクレオチド配列に基づいているところの合成ペプチドからなる群より選ばれた調製物を含有する。この調製物は、（１，１５Ｍの塩化ナトリウム、０．（１５門のリン酸ナトリウム、約７．４のｐＨを有する緩衝液、チメロサール及び必要に応じて補助剤中に懸濁させることができる。

本発明の単成分ワクチン抗原は、トランスフェリン及び／又はラクトフェリン受容体を通し２で直接に鉄を獲得する細菌性病原体に対して有効である。また、このワクチン抗原は、幼児に免疫を付与するのに適している。

添付図面は、この明細書中に包含されてその一部をなすものであり、本発明の実施例を図示し、その説明と共に本発明の詳細な説明するためのものである。

辺１ｊ４１１狛ｌ肌図面は、本発明によるアフィニティークロマトグラフィー法の流れ図である。

好盪皇旦盪坐脱里ここで本発明の好適な本態様を詳細に参照する。

ラクトフェリン受容体は、表面に近接しろる外膜タンパク質である。淋菌及び髄膜炎菌においては、約１０６，０００の分子量を有していることを発見した。この受容体は、結合ラクトフェリンに対して特異的である。これは、トランスフェリン又は他のいかなる鉄結合タンパク質にも結合しない。更に、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）及びブランハメラ（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ）種からの受容体は、ヒト・ラクトフェリンには高い親和性をもって結合するが、他種からのラクトフェリンには特異的に結合しない。この受容体の形質発現は、この受容体を有する細菌に入手可能な鉄のレベルによって調節される。充分な鉄の存在下では、非常に少量のタンパク質が製造される。鉄が制限されるときには、製造される受容体タンパク質の量が大きく増大する。この受容体は、他の種から得られるラクトフェリンからの鉄獲得又は鉄に依存した成長を媒介しないであろう。これは、鉄が飽和したヒトラクトフェリン及びヒトアポラクトフェリンに同等の親和性をもって結合する。髄膜炎菌中のラクトフェリン受容体は、次のうクトフェリン受容体特異的モノクローナル抗体に結合することを発見した：　Ｎｏｓ、３３− １５−４．３３−１８８−２．３３−７５−６．３３−３６−１６及び３３−１９−３゜トランスフェリン受容体は、この受容体を有する細菌に入手可能な鉄のレベルによって形質発現がやはり調節されるタンパク質からなる。充分な鉄の存在下では、非常に少量のタンパク質が製造される。鉄を制限したときには、製造される受容体タンパク質の量が劇的に増大する。ヒＩ・病原体である髄膜炎菌、ｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）中のトランスフェリン受容体は、ヒトトランスフェリンからの鉄の獲得と鉄に依存した成長とは媒体するが、他の種から得られるトランスフェリンからは媒介しないであろう。ウシ病原体であるパスツレラ　ヘモリティカ、ヘモフィルス　ソムヌス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　Ｓｏｍｎｕｓ）及びパスツレラ　ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）においては、トランスフェリン受容体は、ウシトランスフェリンからの鉄に依存する成長は媒介するが、他の種から得られるトランスフェリンからは媒介しないであろう。ブタ病原体であるアクチッパシラス　プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｃｉｌｕｓ　ｐｌｅｕｒｏｎｅｕｍｏｎｉａｅ）＋　アクチッパシラス　スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｃｉｌｕｓ　５ｕｉｓ）及びブタインフルエンザ菌においては、トランスフェリン受容体はブタトランスフェリンからの鉄に依存した成長を媒介するが、他の種から得られたトランスフェリンからは媒介しないであろう。家禽においては、病原体であるヘモフィルス　パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ　）　（ヘモフィルス　ガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｇａｌｌｉｎａｒｕｍ））及びヘモフィルス　アビウム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ａｖｉｕｍ）が有するトランスフェリン受容体は、家禽（鶏又は七面鳥）トランスフェリンを用いた鉄に依存する成長を媒介するが、哺乳類種、即ちヒト、ウシ又はブタについてのトランスフェリンによっては媒介しない。

トランスフェリン受容体は、二つの外膜タンパク質からなる。

（１）髄膜炎菌、淋菌及びインフルエンザ菌中の約１００．０００の高分子量タンパク質；及び（２）種々の菌株及び種牛の約６５．０００〜約９０．０００の、分子量が小さい方のタンパク質。髄膜炎菌のようないくつかの種においては、分子量が小さい方のタンパク質が、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動及びエレクトロブロッティングの後に、トランスフェリン結合活性を部分的に再構成しうる。髄膜炎菌からの精製受容体タンパク質は両方共に、グアニジン塩酸塩を用いたアフィニティーカラムからの溶出及びこのグアニジン塩酸塩の除去の後に、トランスフェリン結合活性を部分的に再構成しうる。

トランスフェリン受容体はトランスフェリンに結合するが、他の鉄結合タンパク質には結合しない。ヒト病原体である髄膜炎菌、淋菌、プランハメラ　カタラーリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａ−ｒｒｈａｌｉｓ）及びインフルエンザ菌においては、受容体は、ヒトトランスフェリンに高い親和性をもって結合するが、他の種からのトランスフェリンには特異的に結合しない。ウシ病原体であるパスツレラ　ヘモリティカ、ヘモフィルス　ソムヌス（Ｈａｅｍ。

ｐｈｉｌｕｓ　ｓｏｍｎｕｓ　）及びパスツレラ　ムルトシダ（Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａｎ＋ｕｌｔｏｃｉｄａ）においては、受容体はウシトランスフェリンには結合子るが、他の種からのトランスフェリンには結合しない。ブタ病原体であるアクチッパシラス　プルロニューモニア、アクチッパシラス　スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｃｉｌｕｓ　５ｕｉｓ）及びブタインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　５ｕｉｓ）においては、受容体はブタトランスフェリンと結合するが、他の種からのトランスフェリンには結合しない。家禽の病原体であるヘモフィルス　パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ　）　（ヘモフィルス　ガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｇａｌｌｉｎａｒｕｎ＋　））及びヘモフィルス　アビウム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ａｖｉｕｍ）においては、受容体は、家禽（鶏又は七面鳥）トランスフェリンには結合するが、哺乳類種からのトランスフェリンには結合しない。ヒト病原体からのトランスフェリン受容体は、ヒトアポトランスフェリンと結合するよりも約１０倍も高い親和性をもって、鉄が飽和したヒトトランスフェリンと結合し、部分的に及び充分に脱グリコジル化されたヒトトランスフェリンに同等の親和性をもって結合するが、穏やかな過ヨウ素酸酸化で処理したヒトトランスフェリンとは結合しない。このトランスフェリン受容体は、次のモノクローナル抗体と結合する：　Ｎｏｓ、３６−４．３６−６、３６−１０４及び３２−５８−５゜幾つかの髄膜炎菌の菌株、淋菌、ナイセリア　ラクタミカ（Ｎ、　Ｉａｃｔａｍｉｃａ）及びプランハメラ　カタラーリス（Ｂ、ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）中のラクトフェリン結合活性を、固相結合ア・ンセイを用いて西洋弓サビペルオキシダーゼ接合ヒトラクトフェリンによって測定するか、又はその代わりに、ビオチニル化されたヒトラクトフェリンに続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ストレブタビジン（ｓ　ｔｒｅｐ　ｔａν１ｄｉｎ）を用いることによって測定した。ラクトフェリン結合活性が、試験したすべての髄膜炎菌の菌株中に存在していることを発見した。ラクトフェリン結合活性の形質発現は、トランスフェリン結合活性の形質発現に密接に並行している。結合はヒトラクトフェリンに対して特異的である。ウシラクトフェリンも、ヒトトランスフェリンも、ヒトヘモグロビンも、西洋ワサビペルオキシダーゼの接合されたヒトラクトフェリンの結合をブロックしない。鉄が飽和したラクトフェリン及びアポラクトフェリンは、競合結合アッセイにおいてＨＲＰ−ラクトフェリンの結合を阻害するのに同程度に有効であるので、ラクトフェリンの結合は、鉄飽和のレベルに依存しない。

幾つかの細菌菌株において、ビオチニル化されたヒトラクトフェリン及びストレブタビジンーアガロースを用いたパッチアフィニティークロマトグラフィーによって、ラクトフェリン結合タンパク質を同定した。ビオチニル化されたラクトフェリンを手つかずの金膜に結合させ、次いで遠心分離によって遊離ラクトフェリンを分離した。次いで、ラクトフェリン受容体複合体を膜から溶解させ、不溶解物質から分離し、ラクトフェリンに符いているビオチン部分の作用によってストレプタビジンーアガロース樹脂に結合させた。この樹脂を洗浄した後、試料緩衝液中で煮沸して結合タンパク質を溶出させ、５Ｏ５−ＰＡＧＥで分析した。代わりに、グアニジン塩酸塩の濃度を増大させることによって、ラクトフェリン受容体タンパク質を溶出させることができた。

鉄に飢えた髄膜炎菌Ｂ１６Ｂ６　、群Ｘ及び群−１３５からの金膜を使用したとき、約１０５．０００の分子量を有するタンパク質をラクトフェリン親和性樹脂に結合させた。

髄膜炎菌中のトランスフェリンから鉄を獲得する機構は、細菌の表面上の受容体によって結合することを含み、′２５）−トランスフェリンの蓄積が欠けているのは、摂取がトランスフェリン−受容体複合体のインターナリゼーシゴンによるものでないことを示している。トランスフェリンからの鉄の除去とアポトランスフェリンの放出とは、摂取機構において引き続いて起こる過程であると考えられる。アポトランスフェリンに対してよりも鉄飽和トランスフェリンに対して、トランスフェリン受容体の親和性が高い。ラクトフェリンから鉄を獲得することもまた表面受容体を含むので、ラクトフェリン受容体に対しても類似の摂取機構が存在しているものと考えられる。

試験した髄膜炎菌、インフルエンザ菌、淋菌、ナイセリアラクタミカ（Ｎ、　Ｉａｃｔａｍｉｃａ）及びブレンハメラ　カタラーリスのすべての菌株において、トランスフェリン結合活性を検出した。

試験したすべての分離体におけるトランスフェリン結合活性は、西洋ワサビペルオキシダーゼの接合されたヒトトランスフェリンの結合をヒトトランスフェリンのみが有効にブロックできるようなヒトトランスフェリンに対して特異的であった。

このトランスフェリン受容体は、５Ｏ５−ＰＡＧＥ及びウェスタンプロット分析によって、約７５．０００〜約８８，０００の分子量を有するタンパク質として既に同定した。しかし、純粋なトランスフェリン受容体は、この手順によっては分離されなかった。また、より高い分子量のトランスフェリン結合タンパク質は、この手順によっては同定されなかった。本発明者は、ビオチニル化されたトランスフェリンおよびストレプタビジンーアガロースを用い、純粋なトランスフェリン受容体の分離をもたらすアフィニティー分離法を開発した。トランスフェリン結合タンパク質は、約５８，０００〜約９８．０００に亘る低い方の分子量と約９４．０００〜約１０６、０００の高い方の分子量のタンパク質とを有し、上記の菌株中で分離された。ｒＮｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ　ｊ属においては、ビオチニル化されたトランスフェリンを用いたアフィニティー分離により、すべての試験種において少なくとも二つのタンパク質がもたらされ、ナイセリアのすべての分離体において高い力の分子量のタンパク質が約９８Ｋａであり、プランハメラ　カタう−リスにおいては約１０５Ｋｄであった。

本発明者が発見した所では、試験したすべてのインフルエンザ菌分離体においてはヒトトランスフェリン受容体が存在していたが、他のへモフィルス種や、パスツ１／う又はアクチッパシラス種からの代表的な分離体においては検出されなかった。他のへモフィルス種において、またアクチッパシラス及びパスツレラにおいてヒトトランスフェリン受容体が存在しないのは、これらの細菌がヒトに侵入性疾患をまれにしか引き起こさない理由に関連があるかもしれない。同様に、本発明者は、試験したＡｌ型のパスツレラ　ヘモリテ、イカ及びヘモ′フィルス　ソムヌス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｏｍｍｕｓ）のずべての分離体において及びパスツレラ　ムルトシダＣＰａ５ｔｅｕｒｅ１１ａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）の分離体のうち幾つかにおいて、ウシトランスフェリン受容体を検出した。また、本発明者は、試験したアクチッパシラス　ブルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）のすべての分離体において、ブタトランスフェリン結合を検出した。このように、受容体の存在が、それらの受容体宿主中に疾患を引き起こすそれらの微生物の能力と良く相関している。

本発明のワクチン抗原は、疾患を引き起こす細菌性病原体から分離したラクトフェリン及び／又はトランスフェリン受容体タンパク質から調製できる。もし調製物が充分に免疫原性ではないことを見出したなら、水酸化アルミニウムのような適当な補助剤をワクチン調製物中に含有させることができる。

ラクトフェリン及び／又はトランスフェリン受容体タンパク質の分離体を、本発明のワクチン抗原中に、充分な免疫原性を達成するのに薬剤掌上有効な量で含有させる。

本発明のワクチン抗原は、本技術分野において通常の技術を有する者に良く知られた有効な投与方法、例えば、皮下的又は筋肉内的に、投与することができる。

本発明は、本発明を例示することのみを意図した次の実施例によって、更に明らかにされるであろう。

例１：髄膜炎菌からのヒトラクトフェリン結合タンパク質の同定及び特徴付け細菌菌株及び成長条件髄膜炎菌（Ｎ９ｍｅｎｔｎｇｉｔｉｄｉｓ）８１６Ｂ６　、標準免疫型菌株を、Ｃ，フラッシュ（Ｆｒａｓｃｈ）から得た。群Ｘ及び群臀１３５の髄膜炎菌菌株を、アルバータ州カルガリーのフーシルス（Ｆｏｏ　ｔｈ　ｉｌ　Ｉｓ）病院から得た。５％ＣＯｔを含有する雰囲気中で、ＣＶＡ強化荊（ＧＩＢＣＯラボラトリーズ、グランド　アイランド　ニューヨーク）を追加したチョコレート寒天平板上で、髄膜炎菌を成長させた。チョコレート平板からの新しい成長面を、通例のように用いて液状ミュラー−ヒントン培養液（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ　ｂｒｏｔｈ：ＭＨＢ）に０．０４の初期Ａ６゜。まで植菌し、集菌に先立って１６時間振盪して培養した。

鉄に飢えたＭＨＢは、通常３５μｍＭのＥＤＤＡ　（エチレンジアミン　ジ−オルソ−ヒドロキシフェニル酢酸）を含有する。形質発現実験に用いた培養液及び培養条件を表１に示す。

化学物質西洋ワサビペルオキシダーゼの接合されたヒトラクトフェリンを、ペンシルバニア州アヴオンデール（Ａνｏｎｄａｌｅ）のジャクソン　イムノ　リサーチ　ラボラトリーズから得た。ウシラクトフェリンをニューヨーク州、ウェストベリー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ）のアキュレート　ケミカルス（Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から得、ヒトラクトフェリン（Ｌ−８０１０）、ヒトトランスフェリン（Ｔ２２５２）　及びヒトヘモグロビン（Ｈ７３７９）をミズーリ州セントルイス（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ）のシグマケミカルコーポレーション（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から得、ビオチン−Ｘ−ＮＨ３（ビオチニル−ε −アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド　エステル）をカリフォルニア州すンディエゴのカルバイオケム（Ｃａ　１　ｂ　ｉｏｃｈｅｍ）から得、ストレブタビジンーアガロースをメリーランド州ベテスダのベテスダ　リサーチ　ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から得、アクリルアミドゲル排除カラムを、カリフォルニア州フラートン（Ｆｕｌ、］ｅｒｔｏｎ）のベツタマン　インスツルメント（ＢｅｃｋｍａｎＩ　ｎｓ　ｔｒｕｍｅｎ　ｔｓ）から得た。

鉄結合タンパク質の調製ヒトトランスフェリン及びラクトフェリンの鉄飽和及びアポタンパク質の調製を、既に記述された方法によって達成した（Ａ。

Ｂ、シュライバーズ（Ｓｃｈｒｙｖｅｒｓ）及びし、モリス（Ｍｏｒｒｉｓ）　＋　モルキュラー　マイクロバイオロジー（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ旧ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）　。

２：２８１〜２８８頁）。ただし、アポラクトフェリンを更に調製するときは、マズリエ及びスビク（Ｍａｚｕｒｉｅｒ　ａｎｄＳｐｉｋ）（ｒＢｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　」６２９　：　３９９〜４０８頁）によって用いられた緩衝液で調製した。タンパク質調製物を０．２μｍ膜を通して無菌濾過するのに先立って、「アミコン　セントリフロ（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｅｎｔｒｉｆｌｏ）　Ｊ膜コーン（アミコン社、ミネソタ州デンハース（Ｄａｎｖｅｒｓ））を用いて、限外濾過によって濃縮した。この調製物の鉄の飽和を、４６５ｎｍの吸収を測定することによってチェックした。

ラクトフェリンのビオチニレーションー鉄が飽和したヒトラクトフェリンの調製物を、ゲル濾過及び限外濾過のサイクルによって、５０ｍＭ　トリス塩酸塩（ｐＨ７，５）緩衝液で平衡させ、１　ｍｇ／ｍｌに希釈した。ジメチルホルムアミド１６μＩ中に２５０μｇのビオチン −Ｘ−ＮＨＳを溶解させたものを、タンパク質溶液各１ミリリッター毎に加え、この混合物を穏やかに撹拌しなから４°Ｃで２時間培養した。１００μｌの１０ｍｇ／ｍｌグリシンを各１ｍ１部分毎に添加して反応を停止させ、この混合物を撹拌しなから４°Ｃで２時間更に培養した。この試料を、５０１のトリス塩酸塩、ｐＨ８，０，１００ｍＭのＮａＣＩを３回交換して、５０ｍＭのトリス塩酸塩、ｐＨ７，５を１回交換して透析し、「アミコンセントリフロ」膜コーンを用いた限外濾過で濃縮し、４°Ｃで貯蔵した。

膜の調製菌体を集菌し、５０ｍＭのトリス塩酸塩、ｐＨ７，５の緩衝液中で洗浄し、１ｍｌ当す５０μｇのフエニルメチルスルホニルフｌレオライドを含有する緩衝液中で、１ｍｌ当り０．２ｇの菌体濃度で再懸濁した。この菌体を１１２５Ｋｇ／ｃｍ”（１６，０００ｌｂ／１ｎ２）でフレンチプレッシャーセルを通して２回通過させることで溶菌させた後、菌体残滓を８．　ＯＯＯｘｇで１５分間遠心分離して除去した。粗金膜を１４０゜０００ｘｇで１時間遠心分離して回収し、上記の緩衝液中に懸濁させた。「サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）ＮＬ　９７　Ｊを用いた選択的洗剤抽出によって、粗金膜から外膜を調製した。金膜を１ｍｌ当り５ｒａｇのタンパク質となるまで希釈し、「サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）　Ｊを０．５％まで加えた。この混合物を氷上で３０分間培養し、外膜を、遠心分離によって１８０．　ＯＯＯｘｇで１０分間回収した。このペレットを緩衝液中で再懸濁し、上記のように再抽出し、最後の洗浄済みベレットを単独で緩衝液中に再懸濁させた。

結合タンパク質のバッチアフィニティー分離２０μｇのビオチニル化されたヒトラクトフェリン又はトランスフェリンを、５０ｍ？ｆのトリス塩酸塩、１１００ｔａのＮａＣｌ、　ｐ）ｆ８．０の緩衝液１ｍｌ中の０．７５ｍｇの全膜タンパク質と混合し、３７°Ｃで６０分分間中かに撹拌しながら培養した。この膜を、エッベンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）微遠心分離機中で１０分間１６，０００ｘｇで遠心分離によってベレット化し、１ｍｌの緩衝液中で再懸濁した。ＥＤＴＡを１０ｍＭまで加え、サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）を０．７５％まで加え、続いてストレプタビジン〜アガロース（ベテスダ　リサーチ　ラボラトリーズ、メリーランド州ベテスダ）の１７２希釈物１００　μＩを加えた。２２℃で６０分間培養した後、この混合物を７５０ｘｇで３分間遠心分離し、その上澄液を除去した。この親和性樹脂ペレットを、３つの異なる洗浄レジメンス（ｒｅｇｉｍｅｎｓ）のうちの１つに供し、ここで異なる組成の緩衝液をベレットへと加え、１０分間２２℃で培養し、この混合物を上記のように遠心分離し、この上澄液を除去した。異なる洗浄方法についての洗浄工程の回数と緩衝液組成とは、次のとおりであった。洗浄方法１：１０ｍＭのＥＤＴＡ及び０．５％の「サルコシル（ＳａｒｋｏｓｙＩ）　Ｊを含有する、５０ｎ＋Ｍのトリス塩酸塩、１００ｍＭのＮａＣ１、ＰＨ８，０の緩衝液で３回洗浄し、続いてＥＤＴＡや洗剤のない緩衝液で２回洗浄する。洗浄方法２：１０１のＥＤＴＡと０．５％の「サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）　Ｊを含有する、５〇一台のトリス塩酸塩、ＩＭのＮａＣｌ、ＰＨ８，０の緩衝液で３回洗浄し、続いてＥ’ＤＴＡや洗剤のない上記緩衝液で１回洗浄し、最後に５０ｍＭのトリス塩酸塩、１００ｍＭのＮａＣ１，Ｐ）１８．０で洗浄した。洗浄方法３　：　１０ｍＭのＥＤＴＡ及び０．５％の「サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）　Ｊを含有する、５０ｍＭのトリス塩酸塩、ＩＭのＮａＣ１，２５０ｍＭのグアニジン塩酸塩、ｐｕｓ、　０で３回洗浄し、続いてＥＤＴＡや洗剤のない緩衝液で１回洗浄し、最後に５０ｍＭのトリス塩酸塩、、　１００ｍＭのＮａＣ１，、ｐＨ８，０の緩衝液で洗浄した。最後の洗浄工程の後、２００μｌの試料緩衝液（０，２Ｍのトリス塩酸塩、ｐＨ６，８１，２％のドデシル硫酸ナトリウム、３０％のグリセロール、０．１％のブロモフェノールブルー）中に試薬を減少させずにベレットを懸濁させ、１００℃で５分間加熱し、結合タンパク質を溶出させた。煮沸の後、試料を１分間氷上で急速に冷却させ、次いで７５０ｘｇで３分間遠心分離した。この上澄液を直ちに分離管に移し、ベータメルカプトエタノールを１．４Ｍの最終濃度となるまで添加した。この試料の５０μｍ分を１０％５Ｏ５−ＰＡＧＥゲルに適用し、ラエンムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法に従って電気泳動を実施した（ネイチャー、　２２７：６８０〜６８５頁、１９７０年）。この５ＯＳ−ＰＡＧＥゲルを、オークレー（Ｏａｋ　１ｅｙ）等の方法（’Ａｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ　１０５　：　３６１〜３６３頁、１９８０年）に従って、次の若干の変更を加えて銀色に染色した。

最初に、ゲルを２５％イソプロパツール、７％酢酸の溶液で終夜固定した。

展開液を除去した後、０．３５％の酢酸溶液で１時間展開を停止し、次いでゲルを水で洗浄した。

ラクトフェリン結合アッセイ基本的にトランスフェリン結合活性用に既に記述されたようにして、ラクトフェリンのドツト結合アッセイを実施した（Ａ、Ｂ。

シュライバーズ（Ｓｃｈｒｙｖｅｒｓ）及びり、モリス（Ｍｏｒｒｉｓ）　、モルキュラー　マイクロバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、２　：２８１〜２８８　頁、　１９８８年）、但し、接合されたラクトフェリン（２５０〜５００ｎｇ／ｍｌ）を結合混合物中に含有させた。商業的に入手したヒトラクトフェリンは、ペルオキシダーゼ対ラクトフェリンの比率が１：１．５である。従って、使用する接合ラクトフェリンの濃度は、通例約１．８〜３．６％Ｍで変動する（接合ラクトフェリンの平均分子量は１４０，０００である。）。競合実験においては、膜への適用に先立って、非接合タンパク質と接合ヒトラクトフェリンとの混合物を調製した。

定量が必要な形質発現実験のためには、菌体懸濁液を１０のＡ６゜。に調製し、一連の９個の２倍希釈液を調製し、紙の上へとスポットさせた。顕著な結合タンパク質の形質発現が予期される試料においては、最初の希釈液を１０倍希釈液とした。接合ヒトラクトフェリンの希釈系列もまた、同し紙に直接に適用した。

基讐による展開と紙の乾燥との後に、スボ・ントを、反射率設定を用いることによって「バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）モデル６２０ビデオデンシトメーター」で測定し、「ノ＼イオラ・ンド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）　１−Ｄアナリストソフトウェア　パッケージ」（バイオラ・ンド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ラボラトリーズ、カリフォルニア州す・ンチモンド）を用し）てマイクロコンピュータにインターフェースした。接合体の希釈に対するピークの下にある面積（エリア）から標準曲線を構成した。試料の希釈に対するピークの下側にある測定面積を用い、結合された接合体の量を決定した。標準曲線を構成するのに用いた値の範囲内にその面積が入るピークのみを、計算のために用いた。ローリ−（Ｌｏｗｒｙ）等のアツセイ（ｒＪ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ。

１９３：２６５〜２７５頁、　１９５１年）によって測定した、菌体懸濁液のタンパク質濃度を用いて、全菌体タンパク質１ミリグラム当りに結合した結合タンパク質の量を計算し、初期Ａ６゜。指数を用いて、培養菌容量１ミリリットル当りで形質発現された結合タンパク質の量を計算した。

タンパク質濃度の測定ローリ−（Ｌｏｗｒｙ）等の方法によって、ウシ血清アルブミンを用いて通常のようにタンパク質を評価した。予備タンパク質濃度を、ライラット（Ｒｙｌａｔｔ）等によって記載された迅速法（’Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ　１２１：２１３〜２１４頁、１９８２年）によってウシ血清アルブミンを用いて通常のように測定し、後にローリ−（Ｌｏｗｒｙ）等のアッセイによって検証した。

表１：ラクトフェリン結合活性の形質発現なし　３．８　＜２２　＜４３ＥＯＤＡ　（４０）　１．８　５．８００　３．３００ＥＤＤＡ　（６０）　１．４　７．０００　４．１００ＥＤＤＡ（８０）　１．１　７，３００　３．４００ＥＤＤＡ（１００）　０．９　７，６００　２．７００＋ＦｅＣ１ｚ（１２０）　３．６　＜３０　、　＜５０＋ＨＨｂ（０，１）　１．７　７，６００　５．２００＋ＨＨｂ（０，５）　２．３　７．８００　６．４００＋ｔ（Ｉ（ｂ　（２，０）　２．６　２８０　３３０÷ｔ（ｔｔｂ　（５，０）　３．７　＜２９　＜４３→ＨＨｂ　（２０）　３．８　＜２４　＜４４＋ＨＴｒ（１，０）　１．８　７．１００　４．１．００ａ、成長培地は、表示された添加物を有するプレインハートインフュージョン培養液からなる。Ｉ（ＨＢ、ヒトヘモグロビン＋　ＨＴｒ。

鉄が飽和したヒトトランスフェリン。

ｂ、培養菌を、新鮮な成長から再懸濁した菌体によってチョコレート平板上に初期Ａ６゜。０．０４まで植菌し、３７°Ｃで１６時間培養した。最終のＡ６゜。

を、ブランクとして表示された添加物を含有する培地によって１６時間成長させた後に測定した。

Ｃ１全菌体タンパク質１ミリグラム当り、又は原培養菌容量１ミリリットル当りに結合された接合ラクトフェリンのナノグラム数として表示された結合活性を、本テキストに記載したようにして測定した。

持−来ラクトフェリン結合活性の形質発現髄膜炎菌中のラクトフェリン結合活性の形質発現の調節を評価するために、菌体Ｂ１６Ｂ６を、種々の異なる添加物を含有する培養液中で成長させた。ペルオキシダーゼに接合されたヒトラクトフェリン（ＨＲＰ−ラクトフェリン）を用いて、生存中の髄膜炎菌菌株のラクトフェリン結合活性を検出した。表１に示したように、ラクトフェリン結合活性の形質発現のレベルは、培養液中で単独で成長する菌体において低いが、合成鉄キレート剤ＥＤＤＡを添加すると顕著に増大した。過剰の鉄を添加すると形質発現のレベルかもとの低１ノベルに戻る結果となったことから、形質発現が増加したのは鉄のレベルが減少したことによるように見えた。ラクトフェリン結合活性の形質発現は、トランスフェリン結合活性の形質発現に密接に並行していた。

前の研究（Ａ、Ｂ、シュライバーズ（Ｓｃｈｒｙｖｅｒｓ）及びＩｌ、モリス（Ｍｏｒｒｉｓ）、’モルキュラー　マイクロバイオロジー（Ｍｏｌｅｃ、ｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」、２　：２８１〜２８８頁、１．９８８年）に報告されたトランスフェリン結合活性の形質発現の時間経路に基づく実験を、重複して実施し、このラクトフェリン結合アッセイから基本的に同じ結果を得た（データは示し′ζいない）。これらの条件下に、１２〜１６時間の培養の後に最高の結合活性を達成した。

また、表１の結果が示すところでは、添加したＥＤＤＡが中間レベルで、最高に近いし・ベルの形質発現を達成した。この実験で観察したラクトフェリン結合活性のレベルは、菌体が第２の鉄制限成長サイクルに曝されるときに起こるような（テ゛−夕は示していない。）、もっと緊縮された鉄制限条件下に達成されたし・−・ルに匹敵していた。表１に示しメ、−ように、パ、モグロビン又はヒ）！ −ランスフェリンの形で複合鉄を貯蔵すると、高レベルのＨＤＯＡによ、）で課される成長制限が、結合活性を劇的に減少させることなしに部分的に逆転する。

しかし、より高いしノベルのへモグし】ビンを添加すると、結合活性の形質発現が検出不能なレベルにまで抑制される。

試験し、た２０の髄膜炎菌菌株のうち２０において、ラクトフェリン結合活性を検出しくデータは示Ｌ２ていない）、これは、試験したすべての髄膜炎菌苗種が成長のためにラクトフェリン鉄を用いうるという前記の観察と符号している。

ラクトフェリン結合タンパク質の同定ビオチニル化されたヒトラクトフェリン及びストレブタビジンーアガロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーのバッチ法を使用して、幾つかの異なる髄膜炎菌菌株中のラクトフェリン結合タンパク質を同定した。鉄に飢えたＵ膜炎菌Ｂ１６Ｂ６からの金膜を用いた場合は、約１０５，０００の分子量を有するタンパク質がラクトフェリン親和性樹脂に特異的に結合した。ビオチニルされたラクトフェリンをこの手順から省略したときは、バンドは存在せず、ラクトフェリンへの特異的結合が含まれていたことを示す。また、鉄が充分な菌体からの金膜を使用したときにはバンドは存在せず、これは、ラクトフェリン結合活性の形質発現が鉄によって強力に抑制されるという観察（表１）と符号し、ている。また、穏やかな洗浄を実施したときには、７０．０００及び３８．０００の分子量のクンバク質が１０５，０００の分子量のノ仁／ドと共に精製されているのが観察されたけれども、続く一層集中的な洗浄手順によってこれらは除去された。この溶出条件の下では、非常に少量のビオチニル化ラクトフェリンが樹脂から放出されたが（分子１ｔ８０，０００）　、煮沸に先立って試籾混合物中に還元剤を含ませることにより、５０５−ＰＡＧＥによって観察してこのバンドの増大がもたらされた。実質的にすべての試料において、分子量３７，０００の小さなバンドを観察した。群Ｘ及び群−１３５の髄膜炎菌菌株からの金膜を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、同様の分子量のラクトフェリン結合タンパク質を同定した。これらの試料のうち７０，０００Ｍ＋で観察されるバンドは、洗浄が不充分なことに起因し、３７．０００のバンドは、対照例を含むすべての試料において見られる通常の汚染バンドであった。

アフィニティークロマトグラフィーによって金膜から分離された分子量１０５．０００のタンパク質は、鉄が欠損した８１６Ｂ６から調製した外膜中に観察される高分子量タンパク質に対応する。

このタンパク質は、８１６Ｂ６中及び群Ｘ中で鉄調節されていた。

１０５キロドルトンのラクトフェリン結合タンパク質と共に精製された７０キロドルトン（ＫＤａ）のタンパク質は、鉄が欠損したＢ１６Ｂ６から外膜中に見出される優勢なタンパク質の位置に移動した。このタンパク質は、８１６Ｂ６中及び群Ｘ中で鉄調節されていた。このタンパク質は、ビオチニル化トランスフェリンを用いて分離された低い方のタンパク質バンドであった、既に同定した８１６Ｂ６中のトランスフェリン結合タンパク質とは異なっていた。この低い方の分子量のトランスフェリン結合タンパク質は、異なる髄膜炎菌菌株の間で分子量が変動し、また５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びエレクトロブロッティングの後でも結合活性を保持する唯一のタンパク質であった。ビオチニル化されたトランスフェリンと分離された分子量が低い方の結合タンパク質に加え、これらの試料は高分子量結合タンパク質と、点沸工程の間に放出されたビオチニル化トランスフェリン（８０ＫＤａにバンド）とを含有していた。菌株８１６Ｂ６における分子量が低い方のトランスフェリン結合タンパク質と７ＱＫＤａのタンパク質との分離は、８〜１０％の勾配でゲル中で最適化されたが、これらのタンパク質は標準の１０％アクリルアミド５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で共に移動した。

例２：ヒトトランスフェリン又はヒトラクトフェリン受容体の精製及びワクチン調製物中への移入（ａ）鉄が欠損した金膜の調製チョクレート平板上で新しい培養菌から再懸濁した髄膜炎菌菌株を使用して、１００μ門のＥＤＴＡを初期Ａｇｏ。０．０２まで含有する予熱されたプレインハートインフュージョン培養液に植菌した。得られた培養菌を３７°Ｃで振盪しながら１６時間培養した後、９、　ＯＯＯｘｇで１５分間遠心分離によって集菌した。この菌体を、５０μｇ／ｍｌのフェニルメチルスルホニルフルオライドを含有する、５０ｍＭのトリスＨＣ１，ｐ）１８の緩衝液中に０．２ｇｍ／ｍｌまで再懸濁した。

１１２５ｋｇ／ｃｍ２（１６，０００ｌｂ／ｉｎ”）でフレンチプレッシャーセルに懸濁液を通過させることによって菌体を溶菌し、９．　ＯＯＯｘｇで１５分間遠心分離によって菌体残滓を除去した。粗金膜を、１４０，０００ｘｇで１時間の遠心分離によって回収し、５０ｍＭのトリスＩＣ１、ｐＨ８の緩衝液中に再懸濁させた。

（ｂ）受容体タンパク質のアフィニティー分離例１に記載したようにして調製した、０．９ｍｇのビオチニル化されたヒトトランスフェリン又はビオチニル化されたヒトラクトフェリンを、５０ｍＭのトリスＨＣＩ、　１００ｍＭのＮａＣ１，ｐＨ８の緩衝液６０ｆｆ１１中の７２ｍｇの粗金膜タンパク質と混合し、２２ °Ｃで１時間培養した。この混合物を９．　ＯＯＯｘｇで１５分間遠心分離して膜を収集し、このペレットを６０ｍ１の上記緩衝液中に再懸濁し、２２°Ｃで１０分間培養した。ＥＤＴＡを１０ｍＭまで添加し、「サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）　Ｊを０．７５％まで添加し、この混合物を室温で更に１０分間培養し、次いで９．０００ｘｇで１５分間遠心分離した。この上澄液を、５ｍｌのストレプタビジンーアガロース（樹脂１ｍｌ当り１〜２ｍｇのストレブタビジン）と混合し、室温で穏やかに混合しながら１時間培養した。この樹脂を、５００ｘｇで１０分間の遠心分離によって回収し、５０　ｍＭのトリスＩＩｃＩ、　ＩＭのＮａＣ１，１０ｍＭのＥＤＴＡ、　０．７５％の「サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）Ｊ　、　ｐＨ８の緩衝液８０ｍ　ｌ中に再懸濁させた。この樹脂を再び遠心分離によって収集し、上記の緩衝液中で２回以上洗浄した。最後の洗浄の後に、樹脂を上記緩衝液２０ｍ１中に再懸濁し、１ｃｍ直径のクロマトグラフィーカラム中へと注いだ。充填した樹脂を、５０ｍＭのトリスＨＣＩ、　ＬＭのＮａＣ１，１０ｍＭのＥＤＴＡ、　０．５％の「サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）　Ｊ　１０ｍ１で更に洗浄し、受容体タンパク質を、５０　ｍＭのトリスＨＣ１，ＬＭのＮａＣ１，１０ｍＭのＥＤＴＡ、　０．０５％の［サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）　Ｊ中に０〜３Ｍ勾配でグアニジン塩酸塩を含む６０ｍ　ｌを適用することによって溶出させた。受容体タンパク質を含有する留分をプールし、５０ｍＭのトリスＨＣＩ、　ｐＨ７，５の緩衝液３リツトルを２回変えて透析し、リン酸緩゛衝溶液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣ１，ｐＨ７，４）を１回変えて透析し、限外濾過によって最終容量１ｍｌまで濃縮した。

（ｃ）ワクチンの調製１ｍｌのリン酸緩衝溶液中の１００μｇの精製受容体タンパク質を、０．０１％のチメロサールを含有するリン酸緩衝溶液中で２．５ｍｌまで希釈し、０．２μ ｍのフィルターを通過させることによって無菌化し、無菌ガラスびんへと無菌的に移した。リン酸緩衝溶液中の２０ｍｇの水酸化アルミニウムからなる無菌調製物を、使用に先立って各ガラスびんへと添加した。代わりに、動物研究用には、５０μｌの通常の生理的食塩水中の５０μｇのムラミルジペプチドを添加した。

例３：髄膜炎菌からのヒトトランスフェリン用の細菌性受容体が有効なワクチン抗原であることの予備的証拠重量的２０ｇ、年齢６〜７週間の１６匹の雌のスイスウェブスタ一種のマウスを、無作為に４つの処理群に分け、下の表３に示した免疫化プロトコルに供した。表示された物質を含有する１ｍｌの無菌の生理的食塩水（１５０ｍＭ、　ＮａＣ１）を、１日日、９日日、１６日目及び２６日目に腹腔内？主射した。３０日目に、３５μＮのＥＤＤＡを含有するミュラー−ヒントン（＋＋＋ｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ）寒天平板上の終夜成長体からｌＸｌ０’の髄膜炎菌を再懸濁し、各マウス中へと腹腔内注射した。２０分後、１ｍｌの無菌生理的食塩水中の２０ｍｇの充分に鉄が負荷されたヒトトランスフェリンを、挑戦細菌に既に曝されたのと同じマウスへと腹腔内注射した。これらのマウスを７２時間の全期間に亘って観察し、死亡したマウス及び生き残ったマウスの数を記録した。

ｎ１　な　し　な　し　あ　リ　０／４２　ＭＤＰ　な　し　あ　リ　Ｏ／４４　ＭＤＰ＋ＯＭ　Ｏ門　あ　リ　４／４＊ＭＤＰ−５０μｇのムラミルジペプチド、受容体−例２で記載したようにして髄膜炎菌菌株８１６Ｂ６から分離された約１０μｇのトランスフェリン受容体、叶−「サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）Ｊ　ヲ用いた選択的洗剤抽出によって髄膜炎菌から分離された、５０μｇの鉄が欠損した外膜。

＊＊３５μＨのＥＤＤＡを含有するミュラー−ヒントン（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ）寒天平板上で成長した髄膜炎菌菌株Ｂ１６Ｂ６の菌体１×１０’個に、マウスが挑戦された。この挑戦細菌を注射して２０分本発明の他の態様は、本技術分野に習熟した者であれば、明細書を考慮すれば、またここで開示した本発明の実施から明らかであろう。本明細書と例とは単なる例として考えるべきことを意図しており、本発明の真の範囲と精神とは、続く請求の範囲によって示される。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成３年ＩＯ月２８日

Claims

【特許請求の範囲】

１．トランスフェリン受容体タンパク質を含有する細菌性病原体からトランスフェリン受容体タンパク質を分離及び精製する方法であって、トランスフェリン結合活性を形質発現する菌株から鉄が欠損した膜調製物を分離し、トランスフェリンのビオチニル化誘導体を前記の膜に結合させ、固定化ストレプタジン及び固定化アビジンからなる群より選ばれた化合物を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって前記トランスフェリン受容体タンパク質を分離する方法。
２．髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ），インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ），淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ），ナイセリアラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｌａｃｔａｍｉｃａ），ブランハメラカタラーリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ），パスツレラヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ），パスツレラムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ），ヘモフィルスソムヌス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｏｍｎｕｓ），アクチノバシラスプルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ），アクチノバシラススイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｉｓ），ブタインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｕｉｓ），ヘモフィルスパラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ），ヘモフィルスガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）及びヘモフィルスアビウム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ａｖｉｕｍ）菌株からなる群より、前記細菌菌株が選択されている、請求項１の方法。
３．前記細菌菌株が、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ），インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ），淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ），ナイセリアラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｌａｃｔａｍｉｃａ），ブランハメラカタラーリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）菌株からなる群より選択されている、請求項１の方法。
４．請求項１の方法によって分離及び精製されたトランスフェリン受容体タンパク質。
５．ラクトフェリン受容体タンパク質を含有する細菌性病原体からラクトフェリン受容体タンパク質を分離及び精製する方法であって、ラクトフェリン結合活性を形質発現する細菌菌株から膜調製物を分離し、この腹調製物からアフィニティークロマトグラフィーによって前記ラクトフェリン受容体タンパク質を精製する方法。
６．ビオチニル化ヒトラクトフェリン及びストレプタビジン−アガロースを用いてアフィニティークロマトグラフィーを実施する、請求項５の方法。
７．前記細菌菌株が、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ），淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ），ナイセリアラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｌａｃｔａｍｉｃａ），ブランハメラカタラーリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）菌株からなる群より選択されている、請求項５の方法。
８．請求項５の方法によって分離及び精製されたラクトフェリン受容体タンパク質。
９．トランスフェリン受容体タンパク質調製物を含有するワクチン抗原。
１０．更に塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、緩衝液及びチメロサール（ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）を含有する、請求項９のワクチン抗原。
１１．少なくとも一種のクローニングされたトランスフェリン受容体遺伝子を形質発現する微生物から分離された精製トランスフェリン受容体タンパク質、精製トランスフェリン受容体タンパク質の誘導体、少なくとも一種のトランスフェリン受容体遺伝子の暗号配列の少なくとも一部を有する融合タンパク質、少なくとも一種の精製トランスフェリンタンパク質のアミノ酸配列に基づいたアミノ酸配列を有する合成ペプチド、及びクローニングされたトランスフェリン受容体遺伝子のヌクレオチド配列に基づいたアミノ酸配列を有する合成ペプチドからなる群より、前記トランスフェリン受容体タンパク質調製物が選択されている、請求項９のワクチン抗原。
１２．更に補助剤を含有する、請求項９のワクチン抗原。
１３．前記補助剤が水酸化アルミニウムである、請求項１２のワクチン抗原。
１４．髄膜炎菌（（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ），インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ），淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ），ナイセリアラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｌａｃｔａｍｉｃａ），ブランハメラカタラーリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ），パスツレラヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ），パスツレラムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ），ヘモフィルスソムヌス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｏｍｎｕｓ），アクチノバシラスプルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ），アクチノバシラススイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｉｓ），ブタインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｕｉｓ），ヘモフィルスパラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ），ヘモフィルスガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｇａｌｌｉｎａｕｍ）及びヘモフィルスアビウム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ａｖｉｕｍ）菌株からなる群より選択された菌株から、前記調製物が調製されている、請求項１１のワクチン抗原。
１５．前記調製物が、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ），インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ），淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ），ナイセリアラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｌａｃｔａｍｉｃａ），ブランハメラカタラーリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）菌株からなる群より選択された菌株から選択されている、請求項１１のワクチン抗原。
１６．ラクトフェリン受容体タンパク質調製物を含有するワクチン抗原。
１７．更に塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、緩衝液及びチメロサール（ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）を含有する、請求項１６のワクチン抗原。
１８．クローニングされたラクトフェリン受容体遺伝子を形質発現する微生物から分離された精製ラクトフェリン受容体タンパク質、精製ラクトフェリン受容体タンパク質の誘導体、ラクトフェリン受容体遺伝子の暗号配列の少なくとも一部を有する融合タンパク質、精製ラクトフェリン受容体のアミノ酸配列に基づいたアミノ酸配列を有する合成ペプチド及びクローニングされたラクトフェリン受容体遺伝子のヌクレオチド配列に基づいたアミノ酸配列を有する合成ペプチドからなる群より、前記調製物が選択されている、請求項１６のワクチン抗原。
１９．前記調製物が、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ），淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ），ナイセリアラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｌａｃｔａｍｃａ），ブランハメラカタラーリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）菌株からなる群より選択された菌株から選択されている、請求項１８のワクチン抗原。
２０．更に補助剤を含有する、請求項１６のワクチン抗原。
２１．ここで前記補助剤が水酸化アルミニウムである、請求項２０のワクチン抗原。
２２．ラクトフェリン受容体タンパク質調製物及びトランスフェリン受容体タンパク質調製物を含有するワクチン抗原。
２３．更に塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、緩衝液及びチメロサール（ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）を含有する、請求項２２のワクチン抗原。
２４．更に補助剤を含有する、請求項２２のワクチン抗原。
２５．前記補助剤が水酸化アルミニウムである、請求項２４のワクチン抗原。
２６．前記ラクトフェリン受容体タンパク質調製物及び前記トランスフェリン受容体タンパク質調製物が、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ），淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉｅａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ），ナイセリアラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｌａｃｔａｍｉｃａ），ブランハメラカタラーリス（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ），インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ），パスツレラヘモリティカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ），パスツレラムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ），ヘモフィルスソムヌス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｏｍｎｕｓ），アクチノバシラスプルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ），アクチノバシラススイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｉｓ），ブタインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｓｕｉｓ），ヘモフィルスパラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ），ヘモフィルスガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）及びヘモフィルスアビウム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ａｖｉｕｍ）菌株からなる群より選ばれた少なくとも一種の菌株から調製されている、請求項２２のワクチン抗原。