JPH04505805A

JPH04505805A - インビトロにおける皮膚毒性の試験

Info

Publication number: JPH04505805A
Application number: JP2503278A
Authority: JP
Inventors: バーグマン，ハイマン　シー．; ゴードン，バージニア　シー．; ケリー，クリストファー　ピー．
Original assignee: ロパック　ラボラトリーズ
Priority date: 1989-02-24
Filing date: 1990-01-30
Publication date: 1992-10-08
Also published as: AU5093990A; WO1990010224A1; AU646798B2; US5053340A; EP0460005A4; EP0460005A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】インビトロにおける　の試１亙立旦本発明は、ヒトの皮膚を刺激する物質の能力を試験する分野に関する。特に、本発明は、ヒトの皮膚と接触させると、一時的または永久的な損傷を与えるような特定の物質の能力を、予想し得るインビトロにおける試験のための装置および方法に関する。

１１芝工米国および技術先進国では、一般大衆によって取り扱われる化粧品、洗剤または他の物質のような消費音間けの製品の、ヒトの皮膚に一時的または永久的な損傷を与える能力を評価することが習慣的およびしばしば法律的に要求されている。

侵食性皮膚刺激物を適切に表示し、皮膚に著しい損傷を与える成分を含む生産物の商品化を制限することが所望され、必要とされている。米国では、様々な化粧品および家庭用製品の、ヒトの皮膚に対する潜在的な有害性を調べるために、１年に２百万回より多くの試験が実施されていると見られている。特定の特性をスクリーニングするために多くの試験を実施しなければならない場合には、迅速で、低コストで、信頼のおける試験手順が所望される。インビトロにおける試験は、最も適切であろう。

皮膚を刺激するような物質のための、このようなインビトロにおける試験は、現在のところ得られていない。最も通常使用されるスクリーニング手順は、ドレーズラビット皮膚試験（Ｄｒａｉｚｅ　ｒａｂｂｉｔ　５ｋｆｎ　ｔｅｓｔ）　（Ｄｒａｉｚａ、Ｊ、）！、ら、Ｊ　Ｐｈａｒｍｕ弧」」ビｌ旺Ｂ　（１９４４） ■：３７７）である。この試験の欠点は多数ある。（例えば、Ｗｅｉｌ、　Ｃ，Ｓ、および５ｃａｌａ、　Ｒ，Ａ、、　ＴｏｘｉｃｏＩ　Ａ　］　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　（１９７１）　ｕ：２７６−３６０；　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ、Ｌ、ら、１ｏｘｊｃｏｌ　Ａ　ＩヱｈａｒｍａｃｏＩ　（１９７２）　２１：３６９−３８２を参照のこと）。

第１に、インビボにおける手順であるため、試験動物をある程度酷使することと、かなりの費用がかかることである。第２に、時間がかかることである。この手順は、試験される物質を小さな正方形のガーゼに塗り、これをウサギの毛を刈り取った胴体にあてがうことから構成される。２４時間後、刺激の程度を主観的に測定する。

異なる適用条件、適用時間および異なる動物モデルを使用してこの方法を精錬および改善するために多くの試みがなされてきた。　（例えば、Ｒｏｕｄａｂｕｓｈ、　Ｒ，Ｌ、ら、Ｔｏｘｉｃｏｌ　Ａ　Ｉ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　（１９６５）ヱ：５５９；　Ｗｏｏｄｉｎｇ、　Ｗ、Ｍ、および０ｐｄｙｋｅ、　Ｄ、Ｌ、。

Ｊ　Ｓｏｃ　Ｃｏｓｍｅｔ　Ｃｈｅｍ　（１９６７）　１８：８０９＋　Ｋｌｉｇｍａｎｎ、　Ａ、Ｍ、およびＷｏｏｄｉｎｇ、　Ｗ、Ｍ、、　Ｊ　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ　（１９６７）　４９ニア８−９４；　Ｍａｒｚｕｌｌｉ、Ｆ、Ｎ、、丁ｏｘｉｃｏｌ　Ａ　］　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　（１９６５）　にジ止ｚ込１ニー主＋７９−８５を参照のこと）。しかし、このインビボにおける試験アプローチでは、その本質的欠点のために低コストで迅速な再現性のよい、そして予測できる皮膚刺激特性を予想する試験を成し遂げることはできない。

すべての動物試験と同じく、ヒト被検者における物質の効力との相関関係は不完全であるが、ドレーズ皮膚試験は、標準になっており、インビトロにおけるすべての新しい試験は、ドレーズと同様の結果を生み出さなければならない。従って、ドレーズ皮膚試験の結果との相関関係は、このような新しい試験の効力を評価するのに使用され得る。

インビトロにおける手順が所望されたことから、多くの研究者が動物自体に対抗するものとして細胞および器官培養物を含む試験を考案するに至った。例えば、Ｂａｎｏｉｔ、　Ｊ、ら、ｎｘｉｃ　ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　（１９８７）　１：９１の方法は、培養されたヒト繊維芽細胞を使用し、皮膚刺激潜在力を測定するものとして、細胞毒性効力を生みだす物質の能力を使用する。皮膚刺激を測定するものとしての細胞培養物での細胞毒性効力についてはまた、Ｂｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄ、　Ｅ、およびＢｏｒｒｅｒｏ、　Ｏ，、Ｃｅ１ｌ　Ｂｆｏｌ　Ｔｏｒｆｃ。

上（１９８４）　ｊ＋５５−６５；　Ｃｈｏ＋ｍａｎ、　Ｂ、Ｒ，、Ｊ　Ｉｎｖｅｓｔ　Ｄｅｒｍａｔ　（１９８４）ｕｎｄおよびＡ　Ｉ　Ｔｏｘｉｅｏｌ　（１９１１４）ヱ：９４−１００は、マウスの皮膚の培養されたディスクにおける細胞酵素の漏れを測定し、様々な化学薬品に潜在する皮膚刺激を評価した。さらに、Ｅｄｍｏｎｄ、Ｊ、ら、ＦｕｎｄおよびＡ　Ｉ　Ｔｏｘｉｃｏｌ　（１９８６）　？：４４４−４５３によって開発された方法では、皮膚刺激の測定に、単離され潅流した皮膚弁を使用している。

これら上記の方法では、組織培養物における生きた細胞または組織培養物における生きた器官が必要である。これらの方法は、再現性、客観性、およびドレープ性との十分な相関関係を欠如している。

界面活性剤による皮膚刺激を研究するために、生きた細胞を使用しない、いくつかの他のインビトロにおける方法が開発されている。これらの方法のいくつかは、膨張および浸透のような角質層の生物物理的特性を評価する。他の方法は、界面活性剤による潜在的な皮膚刺激の指標として、タンパクの変性を決定する。Ｂｌａｋｅ４ａＳｋｉｎｓ、　Ｊ、Ｃ，ら、Ｊ　Ｓｏｃ　Ｃｏｓｍｅｔ≧（１９８６）　３７：１９９−２１０は、界面活性剤による刺激を、コラーゲンマトリックスを膨張させたり、これに水を含ませたりする能力と関連づけた。Ｅｒｎ５ｔ、　Ｒ，、Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｎ＋　Ｓｏｃ　（１９８０）旺：９３は、酵素活性の変化（すなわち、変性）を測定し、活性の低下を界面活性剤の潜在的皮膚刺激に関連させた。この方法が、い（っかの界面活性剤について関連した結果をもたらしたのに対して、多くの刺激性の溶剤および防腐剤は、酵素活性を変化させなかった。アニオン界面活性剤によって引き起こされた皮膚の荒れは、それらのタンパク物質を変性させる能力に関連していることが発見された（Ｉｍｏｋａｗａ、　Ｇ、ら、止Ａｍ　Ｏｊｌ　Ｃｈｅｍ　Ｓａｃ　（１９７５）　５２：１７５＞。この方法は、アニオン界面活性剤に対しては関連した結果をもたらしたが、カチオンおよび非イオン界面活性剤に対しては関係した結果をもたらさなかったため、すべての界面活性剤の皮膚刺激特性を予想するものではなかった。最後に、Ｋｌｉｇｍａｎら、Ｊ　Ｓｏｃ　Ｃｏｓｍｅｔ　Ｃｈｅｍ　（１９８ｇ＞　３９：２６７は、界面活性剤で処理されたウシ血清アルブミン溶液のｐＩ（が皮膚刺激と相関関係していることを示した。しかし、この関係は、アニオン界面活性剤においては適用されたが、非イオンまたはカチオン界面活性剤においては適用されなかった。

これらの方法は、従来技術で認識された皮膚刺激のモデルである、簡単な３区分モデルと正確に対応しない。繊維状ケラチンおよびコラーゲン分子の網状組織である外皮または角質層である区分１は、化学的攻撃から表皮および真皮を保護し、皮膚に的確な水和作用を提供する役割を果たす。角質層の膨張のような、この層の変化は、単にこの区分１の乱れとして示される。細胞および内細胞成分を有する表皮である区、　分２は、外皮に侵入して外皮を損傷させる化学刺激剤に反応する。真皮である区分３は、表皮の下に存在し、血管化および代謝活動を提供して、区分１および２に栄養を与え、角質層および表皮を破壊する著しく侵食性の強い物質を除いてめったに刺激には関与しない。紅斑および浮腫として表されている皮膚刺激は、化学刺激剤に刺激されると、区分１および／または２に典型的な高分子の構造および組織が変化することが必要である。

上記のインビトロにおける手順は、ドレーズ試験の完全なインビボアプローチにとって代わるものであるが、これらからは新しいインビトロ試験として、期待されるような容易性と標準化は達成されない。本発明による方法は、このような試験を提供する。本発明の方法は、ヒトの皮膚に刺激を与えるすべての物質の能力を迅速に、標準的に、再現性をもって、そして客観的に測定する。この方法では、動物を使用しないため、動物を維持し、拘束し、飼育する費用も必要ではない。

ｌ丑二阻丞本発明は、膜支持体、試薬およびヒトの皮膚に一時的または永久的な刺激を与える物質の能力を評価する方法を提供する。本発明における膜／試薬試験システムによって得られたすべての反応の程度は、ヒトの皮膚に対する試験物質によって引き起こされる皮膚の刺激の程度と相関関係にある。膜支持体および試薬は、標準的な化学試薬の利点および特性を有する物質の限定的または半限定的な組合せである。手順は、簡単で迅速である。試験物質は、膜支持体に直接付与される。

インキ二ベーション後、その結果は、器具を使用せずに視覚的に評価され得、または所望されるなら、分析実験室において通常得られる様々な実験器具を使用して定量され得る。

従って、１つの局面において、本発明は、試験物質を膜／試薬システムに付与する工程を含む、試験物質の皮膚毒性を決定する方法に関する。膜／試薬システムは、架橋されたコラーゲンおよび／またはケラチンが結合し得る膜支持体を含む。さらに、指示色素が膜支持体に共有結合し得る。本発明の膜／試薬システムにおいて、沈澱剤および安定剤を含有し得る試薬は、試験物質が付与される膜支持体と接触する。試験されるサンプルは、試薬が接触しているのと反対側の膜支持体上に付与される。皮膚刺激剤である試験サンプルは、膜支持体から色素を遊離させおよび／または試薬に沈澱物を生じさせる。色素が遊離される場合には、皮膚または膜刺激剤は、膜に結合したコラーゲンおよび／またはケラチンの網状組織を攻撃する。色素が、コラーゲンおよび／またはケラチンに結合しない膜支持体に直接結合される場合には、色素は、その膜支持体への結合が破壊された場合に遊離される。沈澱物が形成されるとするならば、それは、試験物質が膜支持体に浸透し、沈澱剤を含む高次タンパクの乱れを引き起こす場合である。次いで、色素の遊離および／または試薬中の沈澱物から生じる複合吸収度が測定される。

他の局面において、本発明は、試験物質のサンプルに光を照射し、次いでこのサンプルを膜／試薬システムに付与する工程を含む、試験物質の光毒性を決定する方法に関する。あるいは、サンプルは、膜／試薬システムに付与され、システム全体が照射される。

他の局面において、本発明は、共存結合指示色素を含み得る、本発明の方法に使用される膜／試薬システムに関する。

１１ユ見皇呈翌皿図１は、本発明の膜／試薬システムの分解、部分切欠図である。

図２は、膜支持体ウェルの部分切欠斜視図である。

図３は、インビトロにおける皮膚毒性を示す、図工に示す装置の動作を示す５つの一連の断面図である。

図４は、ドレーズラビット皮膚試験に関連した、本発明の方法の結果を示す。

Ｂを　るための〉熊Ａ０足五本願で使用されるように、ヒトの皮膚に対する物質の毒性、すなわち「皮膚毒性」とは、組織に対する一時的または永久的な損傷という形態をとり、ヒトの皮膚において良好でない反応を起こさせる物質の能力をさしていう。この毒性は、皮膚の痛み、腫れまたは浮腫、および皮膚の赤みまたは紅斑を引き起こすことによって証明される。腐食（ｃｏｒｒｏｓｉｏｎ）と呼ばれる深刻な刺激は、ひびの入うたまたはあかぎれになった皮膚、および水ぶくれによって証明される。従って、本願における用語、毒性または「有毒なＪとは、ヒトの皮膚に接触する物質から生じるすべての不快感または創傷を含むものとして広く定義されている。

本願で使用されるように、ヒトの皮膚に対する物質の「光毒性」すなわち「光皮膚毒性」とは、適量の、光によい活性される化学薬品にさらすと共に、十分な強度の光に皮膚をさらすことによって引き起こされる「皮膚毒性」で説明したような、皮膚における毒性反応を引き起こす物質の能力をさしていう。この反応の２つの必須条件は、皮膚に毒性反応を引き起こさない３２０　ｎｍの光と光毒性試薬である。

本願で使用されるように、「抗刺激剤」は、皮膚刺激剤または光皮膚刺激剤による「皮膚毒性」または「光皮膚毒性」から器官または組織を保護するのに使用され得る物質のことである。「抗刺激剤」は、刺激剤と錯体を形成するが反応するかしてその「毒性」を変化させ、および／または分子、細胞または器官の反応部位を物理的および／または化学的に妨害することによって、その効力を発揮し得る。

「透明の水様液」とは、実質的に水であり、可視範囲において機能的に光を透過する、液体、通常は混合物のことをさしていう。「可視範囲において機能的に光を透過する」とは、十分な光がサンプルを通過して、示数が十分に測定できるこ手　とを意味する。

本願で使用されている、「膜支持体」とは、試験サンプルが付与される調製された膜をさしていう。膜支持体は、結合ケラチン、コラーゲンおよび／またはこれらのタンパクの混合物と共にまたはそれらの非存在下でベース支持体膜から調製され得、指示色素をそれに結合させ得るまたはさせ得ない。

部分的に加工された天然膜または動物の皮膚もまた、膜支持体として使用され得る。

「試薬」とは、サンプルが付与される膜に接触させる反応混合物のことをさしていう。

ｐＨおよび／またはイオン強度の「適合性ｊ条件とは、皮膚刺激剤が存在するときに色素分子のみを遊離する膜支持体の特性と皮膚刺激剤が存在するときにのみ沈澱する試薬の特性とが一致するこれらのパラメーターの範囲をさしていう。

「皮膚刺激剤」とは、ヒトの皮膚に接触すると、皮膚に毒性をもたらす能力があり、ヒトの皮膚のおいて観察される紅斑および浮腫の程度によって測定される物質のことをさしていう。

本発明は、皮膚毒性が試験される物質にさらされると、試験されるサンプルの皮膚毒性に比例して質的にまたは量的に測定可能な反応を引き起こす膜／試薬システムを提供する。

サンプルを膜／試薬システムに付与したときの直接的な反応は、試験物質が膜支持体を実質的に攻撃することによってすべての結合している色素分子を試薬中に遊離させること、および／または膜支持体に浸透して試薬中に沈澱物を生じさせることのいずれかによる試薬の着色および／または沈澱である。反応の程度は、以下に詳述される様々な方法を用いて評価され得る。色の形成は、広い意味で、皮膚に紅斑が形成される反応に対応する。沈澱物の形成は、広い意味で、皮膚に浮腫が形成される反応に対応する。従って、試験される物質に対する膜／試薬システムのすべての反応は、皮膚組織または他の膜の反応を予想するものとして使用され得る。

Ｂ、２．鼠図１および図２に示されるように、膜支持体１０は、着色または未着色の柔軟な膜から形成される。膜は、刺激剤によって刺激される特定の皮膚または膜を模倣するように選択される。膜支持体は、リング２０によって保持される個別の小さなウェルの形に形成され、これによりこの膜ウェル内部に付与される試験物質が、試薬を含む牛ユベノト３ｏに挿入され得る。止め栓４０は、キニベｙ）の頂部に挿入され得、試鎗物質を含む膜支持体ウェルを密閉する。

膜それ自身は、例えば、ジメチルスベルイ！　ｆ’−）　（Ｄような二個性架橋試薬を使用して、ケラチンおよび／またはコラーゲンが任意に結合され得るセルロースまたはニトロセルロースのような半透性支持膜の組合せである。次いで、カルボキシル基をもつ色素は、エステルまたは他の適切な結合を介してケラチンおよび／またはコラーゲンまたは露出したベース支持膜に任意に共有結合され得る。得られた膜支持体は、皮膚の角質層バリアーを模倣している。

本発明によると、膜支持体はまた、結合ケラチン／コラーゲンを使用しないで、口内の、膣の、または陰茎の膜のような粘膜を模倣するように構築され得る。

上記の合成膜に加えて、ヘビまたはブタの皮膚のような動物の膜および／または皮膚は、ベース支持膜として使用され得、所望される場合、色素が共有付着され得る。

本発明の使用に適する色素には、膜支持体に共有結合し得るカルボキシル基をもつ色素が含まれる。その例としては、サフラニンＱ、カルミン、エリトロンンＢおよびマラカイトグリーンオキサレート（Ａｌｄｒｊｃｈ）があり、これらはすべて、例えば二価性試薬を使用することによって、エステルまたは他の適切な結合を介して膜支持体に共有結合され得る。例えば、蛍光色素であるローズベンガルはまた、膜支持体に共有結合され得る。このように膜支持体に結合した色素はまた、腐食性皮膚刺激剤と接触後遊離され得る。なぜなら、高次マトリックスそしてケラチンおよび／またはコラーゲンマトリックスの完全性が刺激剤のために破壊されたり分解されたりして、別々の量のコラーゲンおよび／またはケラチンおよび付随色素分子が遊離されるからである。膜支持体がセルロースのようなベース支持膜のみを含む場合には、皮膚刺激剤と接触するとセルロースの共有結合が壊され、すべての付随色素分子が遊離され得る。

脂質成分もまた、架橋された膜支持体に脂肪酸またはコレステロールまたはアシルセラミドを共有付着、カップリングおよび／または結合させることによって、ケラチン／コラーゲンが架橋された合成膜支持体に付加され得る。すべてのヒトの皮膚に存在するこの付加成分は、合成膜支持体の浸透特性を変化させる。ヒトの皮膚における脂質の量および種類は、体の位置、食事、民族の可変性および他のパラメーターに応じてかなり異なる。従って、すべての脂質は、皮膚におけるこの成分の重要性が評価されている場合に、基本的な単純な合成膜中においてのみ含めるようにすべきである。

本発明の方法によって評価され得る皮膚刺激剤が膜支持体ウェルに付与されるときには（図３ｃ、図３６）、刺激剤は、膜支持体を通じて放散し得、刺激が十分である場合には、膜または架橋されたすべての色素ケラチン／フラーゲンマトリノクスを分解させて、膜物質の一部をすべての共有結合された溶解性色素分子と共に試薬に遊離させ得る。膜の分解が大きければ、カルボ牛シル基をもつ色素の試薬への遊離も多くなり、試験物質によって生じた皮膚刺激性も大きくなる。

Ｂ、３１区基膜支持体に試験物質が浸透する場合には、試薬は、膜支持体ウェル内に含まれる試験物質にさらされ得る透明な水様液の形態で使用される。このような場合には、試薬の活性成分が、皮膚刺激剤の存在下で沈澱する。

試薬混合物それ自体は、試験される物質と接触されるときに生じるヒトの皮膚組織の表皮層の反応を模倣するような、タンパク物質、アミノ酸、炭水化物およびイオン化合物の組成物である。

本発明の透明な水様液試薬には、皮膚刺激剤が溶液中に膜を通して分散し、沈澱物を形成するまで、溶液中に残存する溶質またはコロイド状の粒子が含まれる。

これを成し遂げるために、試薬は、少なくとも１種の沈澱剤および少なくとも１種の安定剤を含み、融和するｐＨおよびイオン強度で維持される。

沈澱および／または膜からｔ！離された色は、皮膚刺激剤に対する膜／試薬システムの望ましい反応を示す。

効果的な沈澱剤として有用な物質には、球状タンパクが含まれ、Ｇ１、Ｇ２およびＧ３のようないくつかの異なるグロブリンの混合物として最適に使用される。

完全な試薬中のグロブリンの総量は、好ましくはグロブリンの由来およびクラスに応じて約０．００１％から１０％の範囲内である。例えば、他の沈澱剤には、マクログロブリン、グリコサミノグリカンおよびムコタンパク質が含まれる。

安定剤は、沈澱剤の未成熟凝集を防止し、程度および形態を沈澱剤より再現可能にし得る。例えば、適切な安定剤には、グリシン、グルタミン、プロリン、ペプチドおよびアルブミンのような非グロブリンタンパクなどのアミノ酸が含まれる。

広範囲な濃度および組合せの安定剤が、本発明と共に使用され得る。一般に、安定剤の全濃度は、好ましくは約０．００１％から１０％の範囲内である。

融和するｐＨの範囲およびイオン強度は、使用される沈澱剤および安定剤の緩衝能力およびイオン強度を調整することによって維持され得る。融和するｐＨおよびイオン強度はまた、イオン化合物または緩衝液を使用して成し遂げられ得る。

融和するｐＨの範囲は、約２と９との間である。この範囲の適切な緩衝液には、リン酸塩、酢酸塩、Ｔｒｉｓ−ＣＩ、ホウ酸塩および当該技術において既知の様々なその他の化合物が含まれる。

イオン強度は、約０．０５　Ｍから０．５Ｍの広い範囲にわたって変化し得る。

必ずしも必要ではないが、沈澱剤の分子と作用して皮膚刺激剤の存在下でその集合を高めるエンハンサ−が試薬に含まれることが望ましい。このようなエンハンサ−は、通常、糖タンパク、ムコ多糖類、炭水化物および脂質である。これらのエンハンサ−の望ましい範囲は、通常約０から約１０％である。

上記までのバラグラフにおいて、出願人は、膜支持体および所定量の市販の物質を使用する試薬の材料を定義するために必要なパラメーターを提示した。試薬を調製するのに使用され得る２つの天然物質は、卵白およびタチナタマメである。

これらの物質からの試薬の調製物は、希釈液として塩溶液を使用して作成され得る。このような天然物質が使用されるな場合、抽出溶液には、安定剤の沈澱剤を含む必要がない。なぜなら、これらは天然物質自体に含まれているからである。

また、天然源からの膜を使用することによって動作可能なシステムの結果を達成することも可能である。皮膚膜は、ヘビから剥いだ皮膚を染色することによって製造され得、このような皮膚膜は、上記のように染色され調製された膜と非常に類似した働きをする。この場合、天然に存在するケラチンタンパクを架橋する必要がない。なぜなら、これはすでに天然の状態で広い範囲にわたって架橋されているからである。

さらに、角質層における皮膚刺激剤の効力を評価するために、沈澱剤および安定剤を使用せずに試薬を調製することも可能であり、また所望されることもある。

Ｂ、４．甚本発明の方法の最大の利点はその容易性である。この手順の最重要点は、試験される物質を合成または天然膜支持体に付与することと、化学刺激剤に敏感な試薬に膜支持体をさらすことである。その結果は、遊離された色素および／または形成された沈澱物の量を直接測定することによって量的に読み取ることが可能である。

遊離された着色色素の量および／または形成された沈澱物の雪は、可視光源３５０および７１０　ｎｍとの間での比色計または分光光度計により得られた標準吸光度水数を使用して測定され得る。試薬およびサンプルの「ブランク」は、試薬それ自体またはサンプルそれ自体の存在によってもたらされた吸光度を補正するために使用され得る。サンプルおよび試薬ブランクの吸光度は、試験サンプルの吸光度から引算される。

混濁による光の分散は、３４０から７１０　ｎｎの吸光度として定量され得る。

３５０から７１０　ｎｍの波長は、ケラチン化された膜に付着された色素の波長強度分布と一致するように選択された。

遊離された色素は、この波長領域において最良に定量される。

膜支持体が染色され、試薬が沈澱剤を含む場合には、膜からの色素の遊離は、形成された沈澱物の量から個別に定量され得る。３４０　ｎｍの吸光度は、試薬の混濁または沈澱のみを測定するが色の変化は測定しない。一方５８０　ｎｍにおける吸光度は、試薬の全体の混濁と、膜から遊離された色のおよそ６０％を測定する。３４０　ｎｍおよび６１０　ｎｍの両方における吸光度を測定し、６１０　ｎｍの吸光度（混濁および染色）から３４０　ｎｍの吸光度（混濁）を差し引くことによって、膜から遊離される色素が定量され得る。あるいは、試薬が沈澱剤および安定剤を使用せずに調製される場合には、遊離された色素は直接測定され得る。

沈澱物の量は、遠心分離によって、または色が混濁の水数に貢献しない比濁分析によって直接沈澱物の体積を測定することにより遊離された色素の量から個別に定量され得る。あ子　るいは、沈澱物を形成する成分は、放射性同位元素または蛍光体で標識され得、沈澱物が分離された後、沈澱物の量が標識の特性に適切な手段によって定量される。さらに、色素を含まない膜支持体が使用される場合には、沈澱物は直接測定され得る。

遊離された色素の量はまた、放射性同位元素または蛍光標ｌ　識によって標識された色素を使用して定量的に評価され得る。

士　蛍光色素もまた、この目的のために使用され得る。上澄み液および沈澱物は分離され得、標識の量は、標識の特性に適切な手段によって所望の画分において読み取られる。

本発明の方法はまた、光毒性物質の皮膚刺激を決定するのにも使用され得る。光毒性の効力を決定するのには、２つのアプローチがある。第１のアプローチでは、まず試験物質を本発明の膜／試薬システム外で特定の強度および特定の間隔で紫外線にさらす。次いで、露光された物質は、本発明の膜／試薬システムを使用して、色および／または沈澱物の生成で評価される。露光されなかった光毒性物質によって引き起こされた刺激もまた測定される。紫外線にさらされた物質が刺激または光毒性を増加させるのは、試験サンプルの、光による分解された生成物に起因する。

光毒性物質の皮膚刺激を測定する第２のアプローチでは、光毒性物質のサンプルは膜／試薬システムに付与され、次いでシステム全体が異なる量の紫外線にさらされ、色および／または沈澱物の生成の変化が定量される。露光されなかったサンプルの刺激もまた測定され、色の形成および／または沈澱物の生成が定量される。露光されなかった場合の刺激反応に比べて、露光された場合の刺激反応の増加的な変化は、試験物質の「光毒性皮膚刺激」として定義される。

本発明の方法はまた、物質の抗刺激性を同定し定量するのにも使用され得る。抗刺激剤は、組職、器官または分子を試験物質の刺激効力から保護する。膜／試薬システムの膜支持体は、未知の潜在性抗刺激剤質により前処理され得る。次いで、既知の刺激剤は、膜支持体ウェルに付与され、色および／または沈澱物が定量される。膜支持体の処理に抗刺激剤を使用しなかった場合の試験物質の反応と比較して、刺激剤によってもたらされた反応が減少していることは、潜在性抗刺激性物質による保護およびその抗刺激性を示している。物質の抗刺激性はまた、潜在性抗刺激剤および既知の刺激剤を含有するサンプルを予め混合し、次いで得られた混合物を膜／試薬システムに付与することによって決定され得る。刺激剤／抗刺激剤によってもたらされた反応が、刺激剤のみによってもたらされた反応に比べて減少していることは、抗刺激剤の潜在性抗刺激剤を示している。抗刺激剤および刺激剤の最適な組合せは、これらの物質の配合割合を変化させることによって決定され得る。

粘膜の刺激を引き起こす試験物質の潜在力もまた、本発明の方法によって決定され得る。膜は、皮膚角質層とは構造的に異なるため、ベース支持体膜は、それに結合したケラチン／コラーゲンまたは色素を用いないで使用される。この膜は、試験サンプルを試薬に分散させ、混濁の形成は刺激の程度を示す。

Ｂ、５．結１」１１価上記のように、本発明の方法によって行われた試験結果と、ヒトの皮膚を刺激する物質の能力との間に直接的な相関関係をもたせることが所望される。しかし、試験が所望される多くの刺激剤に対するヒトの体験結果を得ることはできない。

多くの物質に対するドレーズ試験の結果は、容易に得ることができる。従って、本発明の試験手順の予想される有効性のしきい値標準は、その結果が同一の物質に対するドレーズ試験結果と相関関係があることである。

従って、図４の標準曲線は、本発明の膜／試薬システムおよび５ｇＯｎ＋ａの光を使用して、試験物質によって生じた色および混濁を評価し、得られた吸光度小数と、ドレーズ試験の結果との関連を示すために用意された。同様の手順が、他の波長、比濁水数、放射能および蛍光における吸光度のような標準を用いて、他の主要な結果を測定するのに使用され得る。

通常、膜／試薬システムに付与される試験物質の反応による５８０　ｎｒａにおける吸光度は、試験物質の濃度を増加させるにつれて吸光度が増加するという用量応答パターンをとる。各試験物質に特徴的なレベルにおいて、吸光度測定値の安定状態が観察される。これは、吸光度測定値において予想される性質であるため、各試験物質について読み取られた吸光度曲線に参照点を設けることが可能である。本発明の方法を使用する試験は、希釈がドレーズラビットパッチ試験において研究されていないならば、希釈されていない物質を使用して行われる。

各試験物質は、例えば３０μｍ、５０μｍおよび１００μｌのサンプルサイズについての吸光度水数を測定することによっていくつかのレベルにおいて試験される。これらのサンプルサイズにおいて得られた吸光度は、確立された皮膚刺激に関して、既知の刺激剤の吸光度と比較することによって分類され得る。

これらの分類は、得られた結果をドレーズラビ’ｙ　）パッチ試験の結果と相関関係づけるために使用され得る。

Ｃ−Ｌ立見以下の実施例は、本発明を例示することを目的としており本発明を限定するものではない。

Ｃ１１３区１１１島二且１脱イオン水から再結晶化され凍結乾燥されたククルビタビボ（ｃｕｅｕｒｂｊｔａ　ｐｅｐｏ）から抽出されたグロブリンを、試薬の開始源として使用した。この粉末を、氷酢酸で緩衝されｐＨが８．０になるようにした、１０％の塩化ナトリウム、３％のホウ酸ナトリウムおよび０．１％のエチレンジアミン四酢酸を含有する緩衝食塩水中に溶解させた。得られた溶液を、Ｗｈａｔｍａｎ　＃１濾紙を通して濾過し、貯蔵溶液として使用した。使用する直前に、ｐＨを７．０に調製し、この溶液を試薬混合物として使用した。

その他、タチナタマメ粉から得られた試薬混合物の調製は、表１に示される。

その他、卵白から得られた試薬混合物の調製は、表２に示される。

（以下余白）艮主Ｃ・　２・　膿ヌ遇」Ｌ逼！製最初に、１２．０００から１４．０００　ＭＷより大きい分子を除く膜透析シートを、０．１％のグルタルアルデヒドを含むブタの皮膚から抽出した２０％のケラチン溶液に浸水させる。次いで、膜ンートを、２５°Ｃで２時間インキュベートして脱イオン水ですすぐ。得られたケラチン化膜支持体を、０．１％のグルタルアルデヒドまたはジメチルスペルイミデートのような二価性の架橋試薬を含む５％のサフラニン○溶液に浸水する。膜支持体を２０分間染色し、蒸留水で一晩すすぐ。次いで、染色されケラチン化された膜支持体を、４’Ｃの防湿コンテナー中で乾燥および貯蔵する。２　ｃｍＸ２　ｃｍの正方形を切取り、図工および図２に示されるような高さ１　ａｍのプラスチックリングを通して挿入する。

試験サンプルを図３（Ｃ）に示されるように膜支持体ウェルの頂部開口部を通して挿入する。

粘膜の反応を模倣するように使用される膜支持体は、上記のようにケラチンまたは色素で処理せずに膜透析シートから直接調製され得る。

０．３６　扛呈Ｃ，３，ａ、乱虱延笈旦亙！１つのプロトコールでは、全ｊ１１ｍｌの試薬に懸濁された１つの膜に１００μ 】の試験サンプルを使用した。２時間後に５８０μｍでの光学密度をベックマンＤＵ−８Ｂ分光光度計にて測定し、皮膚毒性のための基準として使用した。図４に示す結果はドレーズ試験結果との直線的な相関関係を示している。

十分に確立されまた十分に研究された皮膚刺激剤である、ラウリル硫酸ナトリウムの希釈液（Ｗｏｏｄ、　Ｄ、　Ｃ，ＦおよびＢｅｔｔｌｅｙ、　Ｆ、Ｒ，、Ｂｒ１ｔ）、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ　（２９７１）旦：３２０）により生成される吸光度に基づき、試験物質を以下のカテゴリーに分類した。

刺激性なしおよび僅かな刺激性　＜０．８０．Ｄ。

緩やかな刺激性　０．８−１．２０．Ｄ。

中位の刺激性　１．２−１．８９０．Ｄ。

激しい刺激性　＞１．９０．Ｄ、３％のラウリル硫酸ナトリウムは、インビボにおいては中位の／激しい皮膚刺激、および本発明の方法によれば１．９０．Ｄ。

の吸光度数を示した。０．５％のラウリル硫酸ナトリウムは、インビボにおいては穏やかな／中位の皮膚刺激、および本発明の方法によれば１．２０．Ｄ、の吸光度数を示した。０．３％のラウリル硫酸ナトリウムは、インビボにおいては僅かな／穏やかな皮膚刺激、および本発明の方法によれば０．８０．Ｄ、の吸光度数を示した。

下記の表３の結果は、１００μｍ（液体）または１００　ｍｇ　（固体）の大きさのサンプルに対する吸光度値、およびその結果を上記に示した測定方法を使用して分類した区分を示す。これらの区分は、インビボにおけるドレーズラビ・ノドパッチ試験を使用した様々な研究により報告された区分と比較される。調製した希釈液をサンプル名の次に示している。

容易に分かるように、これらの３２のサンプルのうち２９サンプルにおいて、本発明の方法により得られた結果は、インビボ試験により得られた結果と実質的には同じであった。残りの３サンプルのうち２サンプルにおいては、結果は１区分段階の相違だけであった。ただ１例において２区分段階の相違は、ドレーズ皮膚試験により得られた結果と相関すると共に、ヒトのデータとも相関することが示される。

（以千奮峠轟立Ｃ，３，ｃ、±１」１１窓王口り里上述の着色膜／試薬システムにコールタールを塗布し、２４時間紫外線にさらした。５８０　ｎｕ＋で生成された光学密度を測定した。また、紫外線にさらされていない着色膜／試薬システムにもコールタールを塗布し、５８０　ｎｍでの光学密度を測定した。この実験はメトキシサレン、クロルプロマジン、およびＮａＣ］に対しても繰り返した。最初の３試験物質は露光に対して反応を強めた。光毒性物質ではないＮａＣ１は光の存在に対して反応を強めることはなかった。

表４に見られるように、この方法により３つの光毒性物質と光毒性ではない材料とが区分された。

玉」− Ｃ，３，（＋、　束１激剤研７の結果５％のペンゾイルペルオ牛シト、５％のＰＥ０４００．および９０％の水を含有する調製物Ａを、抗刺激剤であると思われる二量体酸エステルを混入したものと、混入しないもの２種類調製した。調製物Ａに混入された二量体酸エステル抗刺激剤は、ドレーズラビノト皮膚試験においてｍ型物Ａの刺激を減少させた。両調製物を膜／試薬システムに直接付与した。試験は上述のように行われ、２４時間のインキニベーション後、５８０　ｎｍでの光学密度を測定した。表５に見られるように、抗刺激剤を混入しない場合の刺激は穏やかであった。調製物Ａに抗刺激剤を添加した後の刺激は僅かであった。

表」− ブン７うし　ＱユＱユ　落　父ｇｍ四ｓ　Ａ　−ｃｈ、５６１１１ｒｐ−７’；’ｘ孕ＪＥ＆ｔＪすｔｉｏ、ｓｌｔＭＡ　０．０８４　ｆＬ＊、第２の実験は、穏やかな刺激から僅かな刺激へと低減させるために必要な抗刺激剤の量を決定するために行った。二量体酸エステル抗刺激剤を調製物Ａに、全量の０．１１％から０．２％、０．４％、０．８％、および１．０％の量を混入した。表６に示すように、０．８％の抗刺激剤が調製物の刺激を実質的に減少させた。

紅Ａ　＋　０．２％　ｆ’ｎ、ｉ’Ｊ未到　０．４３３　縁ｐｔｙ〜Ａ　＋　０．４％　？Ｓｌ’Ｊｌλｋｒ　ｏ　、２１２　イＩ９、Ａ　＋　０．８％　９七纜１番り５１１＊Ｊ　Ｏ，１０６４％ｂ。

Ａ　＋　１．０％　７’ｎＪ’Ｊ”、ＩＬＪｌｒＪ　Ｏ，０９１４％＃１　。

要約すれば、本発明は、物質の皮膚刺激に関する予備データを得るための簡便で安価なスクリーニング方法を提供する。

得られた結果は、動物全身に関わる方法により得られた結果に比較し得るものであった。

ＦＩＧ、ＩＦＩＧ、３Ａ　ＦＩＧ、３８　ＦＩＧ、：３ＣＦＩＧ、３Ｄ国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒトの皮膚または膜に対する物質の毒性を決定する方法であって、（ａ）試験される皮膚または他の膜を模倣する、架橋されたケラチンおよび／またはコラーゲンを任意に含有するベース膜支持体を含む膜支持体の一方の面に該物質を付与する工程であって、核膜または該任意の架橋されたケラチンおよび／またはコラーゲンに、色素が共有結合され、該膜支持体は、その反対側の面において、皮膚刺激剤の存在の下で沈澱し得る濃度の少なくとも１種の沈澱剤と、融和するｐＨおよびイオン強度を有する水様媒体中に皮膚刺激剤が存在しない場合は沈澱剤の沈澱を妨げ得る濃度の少なくとも１種の安定剤とを含有する試薬と接触している、工程；（ｂ）該試薬へ遊離される色素の量および／または該試薬中に形成される沈澱物の量を測定する工程；および（ｃ）色素および／または沈澱物の量を、同等量の既知の皮膚刺激剤を使用した場合に遊離される色素および沈澱物の量と比較する工程；を包含する方法。
２．ヒトの皮膚または膜に対する物質の毒性を決定する方法であって、（ａ）試験される皮膚または他の膜を模倣する、架橋されたケラチンおよび／またはコラーゲンを含有し、色素が共有結合されるベース膜支持体を含む膜支持体の一方の面に、該物質を付与する工程であって、核膜支持体はその反対側の面において、融和するｐＨおよびイオン強度を有する水様媒体中の試薬と接触している工程と；（ｂ）該試薬に遊離される色素の量を測定する工程；および（ｃ）遊離される色素の量を、同等量の既知の皮膚刺激剤を使用した場合に遊離される色素の量と比較する工程；を包含する方法。
３．ヒトの皮膚または膜に対する物質の毒性を決定する方法であって、（ａ）試験される皮膚または他の腹を模倣する、架橋されたケラチンおよび／またはコラーゲンを含有するベース膜支持体を含む膜支持体の一方の面に該物質を付与する工程であって、核膜支持体は、その反対側の面において、皮膚刺激剤の存在の下で沈澱し得る濃度の少なくとも１種の沈澱剤と、融和するｐＨおよびイオン強度を有する水様媒体中に皮膚刺激剤が存在しない場合は沈澱剤の沈澱を妨げ得る濃度の少なくとも１種の安定剤とを含有する試薬と接触している、工程；（ｂ）該試薬中に形成される沈澱物の量を測定する工程；および（ｃ）形成される沈澱物の量を、同等量の既知の皮膚刺激剤を使用した場合に遊離される沈澱物の量と比較する工程；を包含する方法。
４．ヒトの皮膚または膜に対する物質の光毒性を決定する方法であって、（ａ）該物質を紫外線にさらす工程；（ｂ）試験される皮膚または他の膜を模倣する、架橋されたケラチンおよび／またはコラーゲンを含有し、カチオン色素が共有結合されるベース膜支持体を含む膜支持体の一方の面に該物質を付与する工程であって、該膜支持体は、その反対側の面において、皮膚刺激剤の存在の下で沈澱し得る濃度の少なくとも１種の沈澱剤と、融和するｐＨおよびイオン強度を有する水様媒体中に皮膚刺激剤が存在しない場合は沈澱剤の沈澱を妨げ得る濃度の少なくとも１種の安定剤とを含有する試薬と接触している、工程；（ｃ）該試薬へ遊離される色素の量および／または該試薬中に形成される沈澱物の量を測定する工程；および（ｄ）色素および／または沈澱物の量を、同等量の既知の皮膚刺激剤を使用した場合に遊離される色素および沈澱物の量と比較する工程；を包含する方法。
５．ヒトの皮膚または膜に対する物質の毒性を決定する方法であって、（ａ）試験される皮膚または他の膜を模倣する、架橋されたケラチンおよび／またはコラーゲンを含有し、カチオン色素が共有結合されるベース膜支持体を含む膜支持体の一方の面に該物質を付与する工程であって、該支持体はその反対側の面において、皮膚刺激剤の存在の下で沈澱し得る濃度の少なくとも１種の沈澱剤と、融和するｐＨおよびイオン強度を有する水様媒体中に皮膚刺激剤が存在しない場合は沈澱剤の沈澱を妨げ得る濃度の少なくとも１種の安定剤を含有する試薬と接触している、工程；（ｂ）該処理された膜支持体を紫外線にさらす工程；（ｃ）該試薬へ遊離される色素の量および／または該試薬中に形成される沈澱物の量を測定する工程；および（ｄ）色素および沈澱物の量を、同等量の既知の皮膚刺激剤を使用した場合に遊離される色素および／または沈澱物の量と比較する工程；を包含する方法。
６．皮膚毒性を示す刺激剤の能力に対する試験物質の効力を決定する方法であって、（ａ）該試験物質を該刺激剤と組み合わせて混合物を得る工程；（ｂ）試験される皮膚または他の膜を模倣する、架橋されたケラチンおよび／またはコラーゲンを含有し、色素が共有結合されるベース膜支持体を含む膜支持体の一方の面に該混合物を付与する工程であって、核膜支持体はその反対側の面において、皮膚刺激剤の存在の下で沈澱し得る濃度の少なくとも工種の沈澱剤と、融和するｐＨおよびイオン強度を有する水様媒体中に皮膚刺激剤が存在しない場合は沈澱剤の沈澱を妨げ得る濃度の少なくとも１種の安定剤とを含有する試薬と接触している、工程；（ｃ）核試薬へ遊離される色素の量および／または該試薬中に形成される沈澱物の量を測定する工程；および（ｄ）色素および沈澱物の量を、同等量の既知の皮膚刺激剤を使用した場合に遊離される色素および／または沈澱物の量と比較する工程；を包含する方法。
７．ヒトの粘膜に対する物質の毒性を決定する方法であって、（ａ）該物質を膜試薬システムに付与する工程であって、該システムが、試験される皮膚または他の膜を模倣した腹支持体であり、これを通して該物質が拡散または透過し得、またはこれを通して試薬の成分が拡散し該試験物質と相互作用し得る膜支持体と、粘膜に対する刺激剤の存在の下で沈澱し得る濃度の少なくとも１種の沈澱剤と、粘膜刺激剤が存在しない場合は沈澱剤の沈澱を妨げ得る濃度の少なくとも１種の安定剤、とを含んでいる、工程；および（ｂ）生成される沈澱物の量を測定し、これを既知の刺激剤により形成される沈澱物の量と比較する工程、を包含する方法。
８．膜／試薬システムであって、試験される皮膚または他の膜を模倣した、架橋されたケラチンおよび／またはコラーゲンを任意に含む膜支持体であって、リングにより固定されたウェルの形態とされ、該ウオルに皮膚刺激性または抗刺激性を試験するサンプルが付与される膜支持体、および核膜支持体ウェルを受容する試薬容器、とを含む、システム。
９．色素が前記膜に、または前記膜支持体内に含有されるケラチンおよび／またはコラーゲンに共有結合される、請求項８に記載の膜／試薬システム。
１０．請求項８に記載の膜／試薬システムであって、試薬をさらに含み、該試薬が、前記膜支持体に皮膚刺激剤が付与されると沈澱し得る濃度の少なくとも１種の沈澱剤と、皮膚刺激剤が存在しない場合は沈澱剤の沈澱を妨げ得る濃度の少なくとも１種の安定剤、および融和するｐＨおよびイオン強度を有する透明な水様液を提供するための水様媒体とを含有する、膜／試薬システム。
１１．前記沈澱剤が球状タンパクである、請求項１０に記載の膜／試薬システム。
１２．試験物質の皮膚毒性をインビトロにおいて決定する装置であって、互いに接触し、そして膜支持体により互いに隔てられた２つのチャンバーを備え、第１のチャンバーは試験物質のサンプルを受容するために備えられ、腹は架橋結合されたコラーゲンまたは架橋結合されたケラチンを含有しまたサンプルと接触することにより生成される該コラーゲンまたはケラチンの分解産物を透過させ、また第２のチャンバーは該分解産物が該膜を通って該第２のチャンバーへ至ったことを示し得る試薬を含有する、装置。