JPH073417B2 - 接眼毒性の試験管内試験 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は人間の眼に対する物質の刺激性を試験する分野
に関する。より詳しくは、本発明は、特定の物質を人間
の眼に接触させた場合にそれが一時的または永久的な損
傷を生じさせる能力の予想を可能ならしめる試験管内試
験に関する。

背景技術 米国その他の技術先進国では、一般大衆が眼を保護する
ことなしに取り扱う傾向のあるシャンプー、洗剤、化粧
品その他の消費者製品が人間の眼に一時的または永久的
な損傷をどの程度生じさせる能力があるかを評価するこ
とが通常行われており、またしばしばこれが法的に要求
されている。眼球組織は敏感で危険に曝されやすいた
め、眼に対する刺激性の弱い一時的な刺激物質の場合に
は適当なラベル表示を行うとか、また極めて眼を傷めや
すい成分を含んでいる組成物の場合には、その商業化を
規制することが望ましく且つ必要なことは明らかであ
る。米国では、各種化粧品や家庭用製品について、人間
の眼に対するその有害性を調べるため年間100万回以上
もの試験が行われていると推定される。特定の性質を調
べるため多数の回数にのぼる試験の実施を必要とする場
合、迅速、安価で、信頼できる手順をもつことが望まし
い。確かに、試験管内試験が最も好ましいと思われる。

かかる試験管内試験は、眼を刺激する恐れのある物質に
ついては現在用いられていない。現在最も普通に用いら
れている選別法は、生体内試験法、すなわち、Draizeの
兎眼試験法（Draize,J.H.,et al J Pharmacol Exptl Th
erap（1944）82:377）である。この試験法の難点は多々
ある。まず第一に、生体内試験法であるため、ある程度
実験動物の酷使を伴い、また費用が高くつくことであ
る。第二に、時間が長くかかることである。この方法
は、被試験物質を3-9匹の白兎の眼に入れ、3-21日間後
に結膜、角膜および虹彩への刺激効果の度合を記録する
ことからなる。勿論、結果の記録はある程度主観的なも
のとなる。また、実験動物間の個体差により、結果は自
ずから再現性のないものとならざるをえない。従来、Dr
aize試験法を改良してその欠点を少なくしようとする多
くの試みがなされてきた（例えば、Batista,S.P.,et a
l,Soc Cosmet Chemists（1965）16:119;Kay,J.H.,et a
l,Am Perfumer Cosmetics（1965）80:61;Gaunt,I.F.,et
al,J Soc Cosmet Chemists（1964）15:209参照）。し
かし、この試験法には固有の欠点があり、これが眼に対
する刺激性についての安価で信頼性、再現性、予知性の
ある試験法を得ようとする目的の達成を不可能ならしめ
ている。

すなわち、すべての動物試験の場合と同様、人体への物
質の影響との相関が不完全である。しかしながら、Drai
ze試験と同じ結果を出す、より簡単な試験法が見出され
れば、技術の現状に向上をもたらすことになるであろう
という点で、Draizeの試験法は充分高く認識されてお
り、そのような試験法を評価する目的にDraizeの結果と
の相関を合理的に用いることができる。

明らかに試験管内試験法が望ましいことから、多くの研
究者らは全動物試験に対して細胞培養による試験法を考
案するにいたった。例えば、Ferguson,T.F.M.,et alの
方法（Food and Cosmet Toxicol（1974）12:359）は培
養したマウスの繊維芽細胞を用い、この細胞による三重
水素化ウリジンの摂取に対する物質の抑制能力を該物質
の眼に対する刺激性の尺度として用いている。またStar
k,L.,et alの方法（Chemical Week（1983）May26:27）
は、マウスの細胞培養体を刺激性物質に暴露し、この培
養体からの液が大食細胞の移動に対しどのような効果を
もつかを評価するというものである。またChar Jumblat
t,M.の方法（Vision Res（1981）21:45）は、培養液中
の兎の角膜細胞中のプラスミノゲン活性化因子のレベル
を物質の眼に対する刺激性の尺度として用いる。最後
に、Litterst,C.L.,et alは繊維芽細胞またはHeLa細胞
における培養体成長の抑止効果を基準として用いている
（Arch Environ Health（1971）22:454）。以上のほ
か、マウスまたは兎の回腸を用いる二つの方法があり、
それぞ被試験物質の浸透性（Muir,C.K.,Toxicol-ogy Le
tters（1983）19:309）とニワトリの胚の漿尿膜の反応
（Leighton,J.,et al,Proc of the Symposium,Product
Safety Evaluation,A.M.Goldberg,Editor,Mary Ann Lie
bert Publications,New York（1983））を評価してい
る。

上記の試験管内試験はすべて、組織培養下の活細胞また
は組織培養下の分離膜の何れかを必要とする。これらは
すべて、Draize法の場合と同様、再現性に欠けるととも
に、客観性に欠け、また測定対象である性質との相関性
に欠けるという難点がある。これらは、厳密に生体内ア
プローチであるドレイズ法の代替法を提供する反面、製
造と貯蔵が可能な化学的試薬を使用して正確に再現され
た試験から期待され得る簡易化と標準化を実現するにい
ったっていない。本発明の方法はこのような試験を提供
する。この方法は、物質が人間の眼を刺激する能力を測
る標準的で迅速性、再現性、客観性のある尺度を提供す
る。そして、この方法は小動物を使用しないので小動物
を維持、入檻、飼養する費用を必要としない。

発明の開示 本発明は、物質が人間の眼に一時的または永久的な刺激
を生じる能力を評価するための試薬および方法を提供す
る。本発明の試薬試験方式により得られる応答の大きさ
は被試験物質により眼に生じる刺激の強度に相関する。
ここに言う試薬は、標準化学試薬の長所と特性を有する
物質の規定または準定混合物である。手順は簡単かつ迅
速性の高いものである。試薬と被試験物質とは混合で
き、また結果は計装を用いずに目視評価することがで
き、また所望なれば、分析実験室で通常用いられる各種
の実験用計測器を用いて定量することも可能である。

従って本発明は、一態様において、人間の眼に対する物
質の毒性の予測に有益な試薬であって、接眼刺激性物質
の存在に対して定量的応答可能な蛋白質物質の混合物か
ら成る試薬に関する。また本発明は、他の態様におい
て、本発明の試薬を用いて物質の接眼毒性を予測する方
法、ならびに前記方法の実施に有益なテストキットに関
する。

図面の簡単な説明 第１図は、BACを標準として用いた代表的な検量曲線を
示す。

実施例 A.定義 本明細書において、人間の眼に対する物質の「毒性」、
または「接眼毒性」とは、該物質が眼の組織への一時的
または永久的損傷の形をもって人間の眼に負性反応を生
じさせる能力をいう。この毒性は痛みや、角膜または虹
彩もしくはその両方の白濁、虹彩の充血、膨張、出血、
または破壊、あるいは結膜の充血または拡張、あるいは
分泌物の発生等を惹起することから証明される。従っ
て、この意味における「毒性」または「有毒」とは、広
くは物質が人間（または他の哺乳綱動物）の眼と接触し
て存在することから生じる一切の不快感や傷害を含むも
のと定義される。

「透明水性液」とは、実質的部分が水であり、且つ可視
範囲の光に対して機能的に透明な液体、通常には混合物
であるものをいう。「可視範囲の光に対して機能的に透
明な」とは液の成分の沈澱時に試料が可測吸光を検知す
るに足る十分な光を透過させる状態をいう。例えば、1c
mのキュベット中で約0.8吸光単位量という可視波長の吸
光であっても、前記沈澱により生じた付加吸光について
も読み取り可能な範囲が得られる。勿論、かかる機能的
に透明な試料の許容吸光度は与えられた路程と、利用可
能な計測器の可測吸光範囲に依存する。

「接眼刺激性物質」とは、人間の眼と接触させた際に眼
に対して毒性を示す能力を有する物質をいう。

pHおよび／またはイオン強度の「適合」条件とは、接眼
刺激性物質の存在下にのみ沈澱する試薬の性質に対する
これらパラメータの適合範囲をいう。

「試薬」とは、試験対象サンプルと接触させる反応混合
物をいう；また「調合物」とは、溶剤およびサンプルで
希釈すると試薬となる材料をいう。

B.一般的説明 B.1試験手順の一般パラメータ 本発明は、接眼毒性を試験される物質と混合した場合に
サンプルの毒性に応じて定性的または定量的に測定可能
な応答を与える試薬を提供する。サンプルを試薬と混合
することによる直接の応答は沈澱物の形成であり、その
大きさは以下に詳細説明する各種の方法を用いて評価す
ることができる。沈澱物の形成は、大まかに言えば、刺
激性物質により眼に生じる反応を示す擬態的応答であ
る。従って、被試験物質への試薬の応答を該物質に対す
る眼球組織の反応の予測値として用いることができる。

B.2試薬 試薬は、被試験物質と混合される透明水性液として使用
する。しかし、これら物質の試薬混合物の活性成分は固
形物として調整することができ、この場合には、調整後
に溶解して透明水性液を形成したときに、接眼刺激性物
質の存在下に沈澱その他の反応が行われる。従って、所
望量の成分の混合物を既に溶解された完成試薬の形態で
供給することが可能であるのみならず、固体の形態で、
粉体、凍結乾燥固形物、またはゲルとして供給し、これ
を後で再液状化して試薬を形成させるこもできる。

いずれの場合においても、試薬は好ましくは所望成分の
最終濃度のものよりも幾分濃度の高い形態で供給し、こ
れを希釈剤および試験対象サンプルと共に反応混合物に
加えるのがよい。

混合物それ自体は蛋白質物質と、アミノ酸と、炭水化物
とイオン化合物の組成物であり、ある意味において被試
験物質と接触した際の人間の眼球組織の反応にあたる擬
態的応答を行うものである。

本発明の透明水性液試薬は、接眼刺激性物質が加えられ
るまで溶液状態またはコロイド状態を保持する溶質また
はコロイド粒子を含むもので、該物質が加えられたとき
に沈澱を生じる。このため、試薬は少なくとも１種の沈
澱剤と少なくとも１種の安定剤を含み、適合したpHおよ
びイオン強度条件に維持されている。好ましくは、少な
くとも１種の増感剤を含ませるとともに、抗体と酵素抑
止剤を供給して試薬を劣化から保護する。

沈澱剤は接眼刺激性物質への試薬の反応を代表する。す
なわち、沈澱して濁度を生じ、あるいは混合物から分離
可能な固形分を沈澱させるものである。効果的な沈澱剤
は球状蛋白質を含み、これは最も好適には卵白グロブリ
ンG1,G2,G3等数種の異なったグロブリンの混合物または
それらのサブコンビネーシヨンとして用いられる。単一
のグロブリンでも作用は得られるが、感度は劣る。完成
試薬におけるグロブリン全体の濃度は使用するグロブリ
ンのクラスにより0.001〜10％の範囲、好ましくは0.01
〜５％である。本発明の試薬に好適な沈澱剤としては、
例えばマクログロブリン、ある種のグリコサミノグリカ
ン、およびムコ蛋白質がある。

（前項および以下の項において、濃度範囲は（特に指定
のないかぎり）完成試薬の量に対する重量／容量比の数
値である。典型的な調合物では、上述のごとく希釈が可
能なように濃度は５〜10倍たかくなる。） 安定剤は沈澱剤の早期の凝集を防止するとともに、凝集
の程度及び形態をより再現可能ならしめる。好適な安定
剤としては、例えばグリシン、グルタミン、バリン、リ
ューシン等のアミノ酸、200〜5000ダルトンのペプチ
ド、およびアルブミン等の非グロブリン蛋白質が含まれ
る。濃度と、安定剤の組み合わせとについては、実施可
能な範囲は広範囲にわたる。一好適実施例では、グリシ
ンを濃度範囲約0.005〜0.5％において唯一の安定剤とし
て使用することができる。一般に、全体としての安定剤
濃度は選択した安定剤の性質に応じて0.001％〜10％、
好ましくは0.1％〜５％の範囲である。

適合pH範囲およびイオン強度は上記の要求される二つの
成分、すなわち沈澱剤および安定剤の緩衝能力とイオン
状態を調整することにより、好ましくは適当なイオン化
合物または緩衝剤を用いることにより得られる。適合pH
範囲は約１〜10であるが、好ましくは約２〜９である。
pH価がこれより高くなると、沈澱剤の特性を失わせ、接
眼刺激性物質の存在下であってもこれを溶液のままに止
まらせ、またpH値が低くなると、早期沈澱を生じる恐れ
がある。この範囲での好適緩衝剤としては、燐酸塩、酢
酸塩、トリス−C1、ビカーボネート、その他公知の各種
化合物が含まれる。イオン強度は約0.05Mから0.5Mまで
広範囲にわたり、一般的に（沈澱剤および安定剤中に荷
電半体が存在するため）付加塩の不存在下でも効果を示
すに充分な程度に高い。しかし、このパラメータは、所
望なれば、NaCl,KCl,NaNO₃等の通常得られる塩を加える
ことにより増大させることができる。

また、絶対に必要というわけではないが、試薬中に増感
剤を含めることが望ましく、これは接眼刺激性物質の存
在下で沈澱剤の凝集を大にする如く沈澱剤の分子と相互
作用する。

かかる増感剤としては、最も代表的には、オボムコイ
ド、ムコ多糖類等の糖蛋白質；ムシンおよびグルコース
等の炭水化物、ならびに燐脂質等の脂質である。勿論、
所望の濃度範囲は増感剤の性質により変わるが、一般的
には０〜10％の範囲である。

試薬は、アジ化ナトリウム等の制菌剤または殺菌剤を加
えることにより、またＮ−エチルマレイミド等の酵素抑
止剤を用いることにより劣化を一層防止することができ
る。

上記の文節中で、出願人は得られる物質の所定量を用い
た規定薬剤としての試薬を構成するに必要なパラメータ
を記載した。しかし、適切な濃度の沈澱剤と安定剤のほ
か、例えばグロブリン、ペプチド、アルブミンその他所
望の試薬成分を含む天然物質の抽出物を利用することに
より増感剤等の選択的成分の適当な量を含有させて有効
な試薬としての結果を得ることも可能である。かかる抽
出物が得られる特に好適な二つの天然物質として、卵白
とタチナタマメその他の豆類があり、これらとその組み
合わせはすべてグロブリンを含んでいる。調合物は水ま
たは塩溶液を希釈剤として用いて調製することができる
が、しかし好ましくは、例えばイオン化合物と緩衝剤、
および／またはEDTA等の補助成分を含む抽出溶液を沈澱
剤に影響するイオン濃度の調整のために用いて調製する
のがよい。前記のような天然の材料を用いる場合には、
沈澱剤や安定剤はそれらの材料自体の中に見出されるた
め、特に沈澱剤、安定剤を抽出溶液中に含有させる必要
はない。

B.3方法 本発明の方法の大きな長所はその単純性にある。手順の
要点は単に本発明の試薬を被試験物質と接触させること
だけである。結果は沈澱物の量を直接定量測定すること
により、または沈澱物の量を例えば比色定量装置によ
り、またはサンプルに試薬を添加して順次希釈する方法
を用いて設定した定量的応答の有無を確認して間接的に
測定することにより定量化することができる。沈澱物
は、例えば遠心分離、乾燥、秤量により混合物から分離
することにより得ることができる。しかし、より好まし
くは濁度を測定することであり、この方法はより迅速
で、かつ乾燥中における沈澱物の物理的変化による煩わ
しさが少ない。生じた濁りの量は分光光度計または比色
計で得られた標準吸光度の読み取り値を用いて測定する
ことができる。この手順では、試薬自体に高分子種が存
在することにより、またはサンプルにより若干の吸光ま
たは光散乱が生じるので、試薬とサンプルの両方をブラ
ンクとして用いることが重要である。一部のサンプルで
は、サンプルと試薬の各別による全吸光は路程cm当り0.
8 OD単位以上の程度であり、従って吸光度測定値を用い
る場合には路程を短くするか、もしくはより高い吸光範
囲に検量された専用計測器を使用することが望ましい。
勿論、サンプルと試薬の双方の吸光度は試験サンプルの
吸光度から差し引かれる。濁りによる光散乱は最も好適
には340nmまたは430で定量できる。狭い波長の解像は不
必要である。

別法として、吸光度読み取りに代えて濁度測定法を用い
ることができる。事実、場合によっては、この方法は好
適である。この定量法は、概して、吸光度測定よりも感
度が高く、濃度範囲が広い。しかし、比色定量が極めて
広く用いられていることからみて、この方法は大抵の商
業用途向けに好適である。

沈澱物の量はまた蛋白質の量を測定することにより定量
することができる。例えば、上澄み遠心分離することに
より沈澱剤を混合物から分離し、分離した沈澱剤を例え
ば、Lowry法（Lowry,O.H.et al,J.Biol Chem（1957）19
5:265）のような公知の標準蛋白質測定法で測定する。
あるいは、ポリアクリルアミドのゲル上で分離して診断
バンドにCoomassieブルーまたはシルバーの染みをつけ
る方法により分離する。

別法として、試薬の成分にラベルをつけ、沈澱物に随伴
した物質の量を沈澱物に存在する、または上澄みに残存
するラベルの量で評価することにより定量評価すること
ができる。このラベルは、例えば、放射性物質、発色
団、または発螢光団でよい。いかなる場合にも、上澄み
および沈澱物は分離され、ラベルの量はラベルの性質に
適した手段により所望の部分中で読み取られる。

沈澱物中のラベルを定量するときは、その存在量がサン
プルの接眼毒性の直接の尺度となる。また、ラベルが上
澄み中で定量されるときは、その量は毒性に反比例す
る。

蛋白性沈澱物は、14_C，3_H等の通常えられるβ放射性同
位元素を用いる各種の手段により容易に標識ずけするこ
とができる。沈澱物中の放射能はその上でガイガー計数
管を使用して測定できる。また、上澄み中のそれはシン
チレーシヨン計数器を用いて測定できる。他の同位体、
例えば125_Iまたは131_I等も蛋白質沈澱剤に共役させ、同
様な方法を用いて算定することができる。共役発色団お
よび発螢光団は、上澄みの部分中で極めて好便に測定さ
れる。もっとも、これらも分離した沈澱物から可溶化し
て測定することも可能である。好便な発螢光団として
は、ダンシル、フルオレセイン、ロダミン染料等があ
る。また、好便な発色団としては、例えばｐ−ニトロア
ニリンがあり、これは405nmで吸光する。

ラベルはまた酵素触媒反応の基質となるもので、この反
応は標準適手段を用いて定量することができる。例え
ば、ペルオキシダーゼ反応の基質はいずれも標識として
用いることができ、酵素は沈澱物の分離後、上澄みに加
えられて、残存基質の濃度が評価される。

B.4結果の評価 上述したように、本発明の方法によりなされた試験の結
果と物質が人間の眼を刺激する能力との間に完全な相関
が得られることが望ましい。しかし、試験の実施が望ま
れる多数の刺激性物質に関する人間の経験の結果は検索
可能な様式では容易に得られない。多数の物質につい
て、Draizeの試験結果がある。したがって、本発明の試
験法の予測効果の限界基準は、その試験結果と同じ物質
についてのDraize試験の結果との相関性である。

したがって、本発明の方法で試験物質により生じた濁度
の評価に際して340nmを用いて得た吸光度の読み取り値
とドレイズ試験の結果との関係を示す検量線図表を作成
した。他の主要結果基準、例えば他の波長での吸光度、
濁度測定値、カラー試薬による吸光度、放射能等の検量
にも同様の手順をもちいることができる。

典型的には、340nmでの吸光は、個々の物質の特徴的レ
ベルでの高原部を除けば、試験物質の濃度が増大傾向を
とった線型パターンを示している。これは、吸光度測定
では予想された挙動であり、従って吸光度曲線上に試験
された各物質について、読み取られるポジシヨンを定め
ることが可能である。これらのデータを用いて、特定の
物質につき線型性の範囲で試験を行うことが可能で、こ
れにより当該物質が試験法の一般検量線に確実に適合す
る保証がえられる。

各被試験物質を、例えば、総容量1ml中でのサンプルサ
イズ100μｌ、200μｌ、500μｌについて読み取り値を
確認することにより線型範囲内に示したときは、これら
のサンプルで得られた吸光度をDraizeの試験結果の範囲
と相関ずけるように分類することができる。340nmでの
吸光度値を主要試験基準として用いて得られた特定の相
関に関するより詳細な説明はC.2.b項に示してある。

C.実施例 以下の実施例は本発明を説明するために例示したもので
あって、本発明を限定するものではない。

C.1試薬混合物の調製 次のものは、緩衝溶液を用いて調製したものであり、場
合により、卵白またはジャックビーン粉、またはその両
者を抽出するため、植物または動物性グロブリンを含む
ものを用いた。卵白を用いた場合は、分離された白味
を、緩衝剤2mlに対し卵白1mlの割合により緩衝剤で希釈
した。ジャックビーン粉を用いた場合は、ビーン微粉末
2gを100mlの緩衝剤中に２時間浸漬し、Whatman ＃40紙
で２回濾過し、残分を除去した。

調合物Ａ−Ｃは示された調合物中の成分を濃縮したもの
であり、成分は典型的には２〜10回希釈して所望の完成
試薬濃度を得た。

調合物 Ａ 最初の16の成分は抽出緩衝剤より得、最後の６はジャッ
クビーン粉より得た。

化合物 濃度 − CaCl₂ 0.02％ KCl 0.04％ MgSO₄ 0.01％ NaH₂PO₄:H₂O 0.01％ NaCl 0.2M イソロイシン 0.002％ グルタミン 0.03％ ロイシン 0.002％ リシン:HC1 0.004％ チロシン 0.002％ バリン 0.002％ NaCAc 0.1M EDTA 0.1％ Ｎ−エチルマレイミド 0.01％ NaN₃ 0.02％ グルコース 0.1％ グロブリン G₁ 0.1−0.2％ ムコ多糖類 0.1−0.15％ アルブミン 0.1−0.3％ 炭水化物 0.2−0.3％ 脂質 0.3−0.5％ サポニン 0.001−0.01％ 調合物 Ｂ 最初の14成分は抽出緩衝剤から、残り９は卵白から得
た。

化合物 濃度 NaOAc 0.07M NaCl 0.15M EDTA 0.07％ Ｎ−エチルマレイミド 0.07％ NaN₃ 0.015％ CaCl₂ 0.014％ KCl 0.028％ MgSO₄ 0.007％ NaH₂PO₄：H₂O 0.007％ リシン:HC1 0.007％ イソロイシン 0.001％ チロシン 0.001％ グルタミン 0.021％ バリン 0.001％ コナルブミン ３％ オバルブミン 22％ 脂質 0.4％ 炭水化物 0.3％ オボムコイド ４％ グロブリン G₁ 0.5−１％ グロブリン G₂ 0.5−２％ グロブリン G₃ 0.2−２％ グルコース 0.1％ 調合物 Ｃ 最初の16成分を抽出緩衝剤から、最後の10成分を卵白お
よびジヤックビーン粉から得た。

化合物 濃度 CaCl₂ 0.02％ KCl 0.04％ MgSO₄ 0.01％ NaH₂PO₄：H₂O 0.01％ NaCl 0.15M イソロイシン 0.001％ グルタミン 0.02％ ロイシン 0.001％ リシン:HC1 0.002％ チロシン 0.001％ バリン 0.001％ NaOAc 0.8M EDTA 0.05％ Ｎ−エチルマレイミド 0.1％ NaN₃ 0.02％ グルコース 0.1％ グロブリン G₁ １−２％ グロブリン G₂ １−３％ グロブリン G₃ １−４％ コナルブミン ２％ オバルブミン ５％ オボムコイド ２％ 粘液素 １％ サポニン 0.10％ 脂質 0,5％ 炭水化物 0.5％ 調合物 Ｄ この実施例は適当な試薬調合物を得るための手順を含
む。

試薬１を調整するため、次の固体をフラスコまたはビ
ーカーで混合する。

粉砕したジャックビーン 10g 塩化ナトリウム 10g EDTA 500mg アジ化ナトリウム 100mg 蒸留水１リットルを固体成分に加え、混合物を攪拌棒を
用いて室温で１時間攪拌した。シーライト3gを加えた
後、攪拌を10分間継続した。

混合物をシーライトで濾過し、清澄な又はやや乳濁光色
の溶液を得た。この溶液は４℃で貯蔵できるものであっ
た。硼酸ナトリウムデカヒドレート3.8gを濾液１に加
え、硼酸塩が溶解するまで攪拌して、シーライトで濾過
し、清澄な黄色の濾液を得た。この濾液は４℃で貯蔵で
きるものであった。正負のコントロール溶液を次の通り
得た。負のコントロール用として、蒸留水500mlに溶解
した硼酸2.5gと塩化ナトリウム4.25gを含むシミュレー
トしたオプタルミック溶液（opthalmic solution）を調
製した。正のコントロールようとして、塩化ベンザルコ
ニウム（BAC）500mgを500mlの蒸留水に溶解した。

C.2.結果 C.2.a予備試験 一記録では、総容量1ml中に調合物A200μｌを用いた。
逐次サンプル量500μｌ、250μｌ、100μｌ、50μｌを
用い、340nmの光学的濃度をBeckman DV-8B分光光度計で
読み取った。得られた吸光度を接眼毒性の基準として用
いた。約1.0 ODユニット以上の吸光度は接眼毒性を示す
ものと認められた。結果を次の広範囲なカテゴリに配し
た。

非刺激性物質（Ｎ） ＜1.0 緩刺激性物質（Mi） 1.0−2.0 中度刺激性物質（Mo） 2.0−2.5 過酷刺激性物質（Ｓ） ＞2.5 次の表１の結果はサンプルサイズ500μｌについての吸
光度値を示す。結果のカテゴリ区分にいては、示された
通りの任意の吸光度範囲基準を用いた。（欄１の濃度は
試薬混合物に加えられた500μｌ部分中のサンプルの濃
度を示す。） C.2.B検量調査結果 C.2.aで得られた予備結果を、Draizeの眼体試験結果に
対する相関基準を作成することにより更に拡大した。

まず、従来のDraize区分に対応する任意の区分スケール
を以下のごとく考案した。

格付け スケール Draizeスケール Ｎ 1.0 0 N-Mi 1,5 1-10 Mi 2.0 10-20 Mi-Mo 2.5 20-40 Mo 3.0 40-60 Mo-S 3.5 60-80 Ｓ 4.0 80-110 かくして、例えば、3.5のスケール格付けにもとずく平
均吸光を受けた試験物質はMo-Sと区分された。2.0の平
均スケール値のものはMiと区分される。

区分平均は、三つのサンプル容量レベルで得られたクラ
ス、即ち1mlの反応混合物中のサンプル容量50μl,100μ
l,200μｌの平均をとり、次の最高に丸めた。各サンプ
ル容量について得られたクラスは、次のごとく定めたス
ケールにしたがって決定した。

これらのクラスを用いて次の結果が得られた。

C.2.C Draize法と本発明法との比較 表２は,C.2.bの検量系を用いた本発明の試薬，ドレイズ
眼試験および一般の人的経験の結果の比較を示す。ドレ
イズ試験結果と人的経験に対するそれらの結果の比較は
Griffith,J.F.,et al,Tox＆Appl Pharmacol（1980）55:
501により報告されている。

さらに，家庭用化学物および通常の実験室用化合物（例
えば，アイボリイ リキッド（Ivory Liquid;商標）タ
イド（Tide;商標），アセトン，ソディウムボレート，
セタルコニウム クロライド，チメロサル，およびクロ
ロックス（Chlorox;商標））の45試料が試験された。こ
のとき,500μｌの試験試料が上記調合物Ｂの500μｌに
添加されたとき得られた結果の視覚的評価を用いた。結
果を，上記分類に従って，上記文献で報告された標準ド
レイズ試験の結果と比較した。その結果は35試料の場合
について実質的に同一であった。他の５試料についての
唯一の差は分類（例えば，ある試験においてはMo,他の
試験においてはＳ）にあることがわかった。５つの場合
においてのみ，バラツキがあり，ある試験で毒性が示さ
れ他の試験では示されなかった。DMSO,セルサンブルー
およびプレル（Prell;商標）は本発明の試験では中程度
の毒性を示したが,Applied Biological Scienceにより
行われたドレイズ試験では非刺激性であった。アジャッ
クス（Ajax;商標）は，本発明の試験では非毒性結果を
示したが，ドレイズ試験では中程度の毒性を示した。

表２の結果は，本発明方法により得られた結果が人的経
験とほぼ相関し，かつより多大な時間を要し高価でかつ
非定量的なドレイズ試験から得られた結果と相関する。

C.2.d 調合物Ｄに関する標準試験 種々の物質が調合物Ｄおよび標準報告書を用いて本発明
方法にて試験された。標準試料を含む全試料を調製する
に際し，試薬が試料容器へまず添加され，次いで，必要
に応じて，稀釈水そして試料が添加された。添加の順序
が重要である。

各試験は正のコントロールとしての0.1％ベンサルコニ
ウムクロライド（BAC）に対して標準化されている。そ
の標準曲線は一連の1ml試料量を用いて得られた。各試
料量は調合物Ｄで調製された試薬の0.5mlと0.1％BACの
種々の量とを含む。最も濃厚な標準試料は0.1％BAC0.5m
lを含み，最も稀薄な標準試料は0.1％BAC0.05mlを含
む。攪拌後，これら試料は340nmにて読みとられ，そし
て各々について正味のOD₃₄₀が0.5mlオプタルミック溶液
と0.5ml試薬との一体物のOD₃₄₀を除去することにより得
られた。この正味のOD₃₄₀は，第１図に示された刺激性
物質の種類を特定するために用いられた0.1％BACの量に
対してプロットされた。これらの種類は下記表３に示さ
れたドレイズのスコアーに対応している。

表３^＊ 刺激性の予測度合い 等価なドレイズスコアー 非刺激性物質 0- 0.9 極微刺激性物質 1- 4.9 極緩刺激性物質 5-19.9 緩刺激性物質 20-29.9 中ないし過酷刺激性物質 30 ＊極緩刺激性物質範囲を極微刺激性物質範囲と極緩刺激
性物質範囲とに分離することにより修正。

そこで，各試験物質の刺激性を次の通り測定した。

標準曲線を得るため用いたシリーズと同様の試験物質の
量を種々変更して用いて試料を作成した。各試料の吸光
度からブランクのOD₃₄₀（試薬プラス模擬オプタルミッ
ク溶液）とサンプルブランク（対応する試験物質量を水
で希釈して1mlとしたもの）を差し引いて正味のOD₃₄₀値
を得た。試験物質0.25mlを使用した場合，OD₃₄₀の正味
読み取り値が0.1〜1.0の範囲にあるときには，試験物質
0.25mlを含むサンプルのOD₃₄₀を用いて，第１図の検量
線から刺激性を直接読み取った。しかし，より大きい量
または小さい量が必要とされる場合には，標準曲線から
結果を読み取るための“0.25ml"値を得るため直線0.1〜
1.0 OD範囲で得た数値について，相関係数を正味OD₃₄₀
値に適用した。これらの相関を下記の表４の示す。

従って，たとえ試験物質が所望の0.25mlを含まない物質
量の時にのみ0.1〜1ml読み取り範囲にあっても，適切な
係数を適用することにより適当な数値を得ることができ
る。

すべての試料は，不正確な結果に導くことのないよう
に，試薬の応答を阻止する能力について試験された。こ
の試験で,0.50ml試薬を含む総容量1ml中の試験物質につ
いて，上記の通り量を種々変えて用いた。しかし，各管
には0.100mlBACを加えて，正味OD₃₄₀を測定した。非阻
害物質の正味OD₃₄₀曲線は該試験物質のみに関する正味
のOD₃₄₀曲線のわずか上方でかつそれに平行に位置す
る。阻害物質は0.1％BACが添加されたとき正味OD₃₄₀と
なる。これは，試験物質のみの場合に観察される正味OD
₃₄₀よりも低濃度ではより高くそして高濃度ではより低
い。

50以上の物質が上記報告書を用いて試験された。これら
の結果とドレイズ試験で得られた結果との間に高い相関
関係が認められた。

要約すれば，本発明は，ある物質の接眼毒性に関し予備
データを得るための便利で低価な検索法を提供する。そ
の結果は全動物を含む比較的非定量的・非再現的そして
高価な方法から得られる結果にもしくはより複雑な生体
内試験から得られる結果に比較に値する信頼性をもつ。

フロントページの続き (72)発明者 ゴードン，バージニア シー アメリカ合衆国 カリフオルニア 90272, パシフイツク パリセイズ，エンブリイ クリーク 1150

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】人間の眼に対する物質の毒性を予測するた
   めに有益な試薬であって、該試薬は接眼刺激性物質の存
   在下に濁度を生じるか、あるいは分離可能な固形分を形
   成し得る、少なくとも一種の蛋白質または多糖類を含
   み、該蛋白質または多糖類が球状蛋白質、マクログロブ
   リン、グリコサミノグリカン、およびムコ蛋白質からな
   る群から選択される、試薬。
2. 【請求項２】接眼刺激性物質の不存在下に前記蛋白質ま
   たは多糖類の沈澱を防止する効果を有する濃度の少なく
   とも一種の安定剤を含む、特許請求の範囲第１項に記載
   の試薬。
3. 【請求項３】さらに増感剤を含む特許請求の範囲第１項
   に記載の試薬。
4. 【請求項４】前記球状蛋白質が卵白グロブリンG₁、グロ
   ブリンG₂、グロブリンG₃、これらの混合物、およびこれ
   らのサブコンビネーションからなる群から選択される、
   特許請求の範囲第１項または第２項に記載の試薬。
5. 【請求項５】前記安定剤がアミノ酸、ペプチド、および
   アルブミンからなる群から選択される、特許請求の範囲
   第２項に記載の試薬。
6. 【請求項６】透明な水性液体混合物の形態にある、特許
   請求の範囲第１項または第２項に記載の試薬。
7. 【請求項７】水性溶剤中に再懸濁可能な固体である、特
   許請求の範囲第１項または第２項に記載の試薬。
8. 【請求項８】水性溶剤中に再懸濁可能なゲルの形態をな
   し、透明な水性液体混合物を形成し得る、特許請求の範
   囲第１項または第２項に記載の試薬。
9. 【請求項９】人間の眼に対する物質の毒性を測定する方
   法であって、 該物質を、人間の眼に対する物質の毒性を検出するのに
   有益な試薬と接触させる工程、ここで、該試薬は接眼刺
   激性物質の存在下に濁度を生じるか、あるいは分離可能
   な固形分を形成し得る、少なくとも一種の蛋白質または
   多糖類を含み、該蛋白質または多糖類が球状蛋白質、マ
   クログロブリン、グリコサミノグリカン、およびムコ蛋
   白質からなる群から選択され；そして、 該接触により生じる濁度あるいは該分離可能な固形分の
   大きさを記録する工程、 を包含する、方法。
10. 【請求項１０】前記試薬が、接眼刺激性物質の不存在下
    に前記蛋白質または多糖類の沈澱を防止する効果を有す
    る濃度の少なくとも一種の安定剤を含む、特許請求の範
    囲第９項に記載の方法。
11. 【請求項１１】前記試薬が、さらに増感剤を含む、特許
    請求の範囲第９項に記載の方法。