JPH04503301A

JPH04503301A - Synthetic interleukin-6

Info

Publication number: JPH04503301A
Application number: JP2501355A
Authority: JP
Inventors: フォーキーズ、ダナ、エム; タックニー、チャールズ、ティ
Original assignee: ImClone Systems Inc; University of North Carolina System
Current assignee: University of North Carolina System; ImClone LLC
Priority date: 1988-12-01
Filing date: 1989-11-30
Publication date: 1992-06-18
Also published as: CA2004261A1; EP0446283A4; WO1990006370A1; AU4801490A; IL92525A0; AU639428B2; GR890100799A; PT92479A; EP0446283A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Abstract] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

[Detailed description of the invention]

５１、細菌たる請求項５０の単細胞宿主。５２、（ａ）ＩＬ−６活性を有する第１ペプチド部分と、第１ペプチド部分と単細胞宿主によって発現され得る第３タンパク質部分との間の化学的に開裂可能なペプチドリンクを有する第２ペプチド部分と、を有する合成工性雑種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する組換え遺伝子であって、宿主内で複製、転写、および翻訳をされることができるものを含有している単細胞宿主微生物を培養し、（ｂ）上記宿主によって生成された三つに分かれたタンパク質を特定し、（ｃ）第２ペプチド部分を化学的に又は酵素的に開裂させ、そして（ｄ）　ＩＬ−６活性を有する第１ペプチド部分を取り出す、という工程を特徴とするＩ　Ｌ−６活性を持つペプチドを生成する方法。５３、第２ペプチド部分が、タンパク分解酵素に反応するペプチドリンクを有する請求項５２に記載の方法。５４、第２ペプチド部分がコラーゲナーゼ惑応部位を有する請求項５３に記載の方法。５５、第２ペプチド部分がエンテロキナーゼ感応部位を有する請求項５３に記載の方法。５６、第２ペプチド部分が因子Ｘａ感応部位を有する請求項５３に記載の方法。５７、第３タンパク質部分が、β−ガラクトシダーゼ配列又はその部分を有する請求項５３に記載の方法。５８、第３タンパク質部分が、ＴｒｐＥ遺伝子生成物を有する請求項５３に記載の方法。５９、第１ペプチド部分は、スルフヒドリル結合を形成できなく、第２ペプチド部分はコラ−ゲナーゼ感応部位を有するペプチドから成り、第３タンパク質部分は、β−ガラクトシダーゼ酵素活性を持つタンパク質から成ることを特徴とする請求項５３に記載の方法。ａｏ、第１ペプチド部分は、スルフヒドリル結合を形成できなく、第２ペプチド部分はエンテロキナーゼ感応部位を有するペプチドを有し、第３タンパク質部分はＴｒｐＥ遺伝子生成物またはその部分であるタンパク質を有する請求項５９に記載の方法。６１、第１ペプチド部分は、スルフヒドリル結合を形成できなく、・第２ペプチド部分は因子Ｘａ感応部位を有するペプチドを有し、第３タンパク質部分はＴｒｐＥ遺伝子生成物またはその部分であるタンパク質を有する請求項５９に記載の方法。５２、ｉｌｌペプチド部分はスルフヒドリル結合を形成できなく、第２ペプチド部分はエンテロキナーゼ感応部位を有するペプチドを有し、第３タンパク質部分はβ−ガラクトシダーゼ配列またはその部分を持つ請求項５９に記載の方法。６３、第１ペプチド部分はスルフヒドリル結合を形成できなく、第２ペプチド部分は因子Ｘａ感応部位を有するペプチドを有し、第３タンパク質部分は、β−ガラクトシダーゼ配列またはその部分を有する請求項５９に記載の方法。６４、第１ペプチド部分が第２ペプチド部分からの開裂後に、その第２ペプチド部分からの残基アミノ酸を保持しないものである請求項５９に記載の方法。６５、上記工性雑種タンパク質が上記宿主生物によって生成された全タンパク質の少なくとも約２０％を有するものである請求項５２〜６４のいずれか１つに記載の方法。６６、上記宿主生物が原核生物である請求項５２〜６４のいずれか１つに記載の方法。６７、上記宿主生物が細菌である請求項６６に記載の方法。６８、上記宿主が細菌である請求項６５に記載の方法。６９、上記第１ペプチド部分がスルフヒドリル結合を持たないものである請求項５２〜６４のいずれか１つに記載の方法。７０、上記第１ペプチド部分が、第５図に示されたＩ　Ｌ−６アミノ酸配列を有する請求項５２〜６４のいずれか１つに記載の方法。７１、上記工性雑種タンパク質が、上記宿主生物によって生成された全タンパク質の少なくとも約２０％を有する請求項７０に記載の方法。７２、アクセツションナンバーＡＴＣＣ４０５１６（ｐ３４０）を有する組換えプラスミド。７３、アクセツションナンバーＡＴＣＣ４０５１７（ｐ３６７）を有する組換えプラスミド。７４、ＩＬ−６活性を有する第１ペプチド部分と、開裂可能なペプチドを有する第２ペプチド部分と、及び選ばれた宿主生物によって発現され得る第３タンパク質部分と、を有する実質的に純粋な組換えタンパク質。７５、請求項１の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。７６、請求項２の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。７７、請求項３の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。７８、請求項４の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。７９、請求項５の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。８０、請求項６の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。８１、請求項７の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。８２、Ｍ３項８の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。８３、請求項９の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。８４、請求項１０の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。８５、請求項１１の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。８６、請求項１２の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。８７、請求項１３の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。８８、請求項１４の遺伝子によってコードされた組換えタンパク質。８９、第８ｂ図に示すｒＬ−６８よびコラーゲンアミノ酸配列を有する組換えタンパク質。９０、請求項７５〜８８のいずれか１つのタンパク質の化学的または酵素的な開裂生成物である所のＩ　Ｌ−６活性を有する組換えタンパク質。９１、システィンを含有せず、請求項７５〜７８のいずれか１つに記載のタンパク質の化学的又は酵素的な開裂の生成物であって、開裂後に第２ペプチド部分から導出される残基アミノ酸を保有しないことを特徴とするＩ　Ｌ−６活性を有する組換えタンパク質。９２、ＩＬ−６活性を有し、かつ実質的に不溶性である合成ペプチド。９３、スルフヒドリル結合を形成し得ない請求項５９項に記載のペプチド。９４、第５！のＩＬ−６アミノ酸配列を有し、該配列はシスティン、あるいはその同族体、類似体、又はそれらの活性部分を含有していないものである合成ペプチド。９５、配列がシスティンを含有していない第５図のＩ　Ｌ−６アミノ酸配列を有する合成ペプチドであって、コラーゲンリンカ−のアミノ酸が、部分的に又は全体的に削陳されていることを特徴とする合成ペプチド。９６、配列がシスティンを含有していない第５図のＩ　Ｌ−６アミノ酸配列を有する合成ペプチドであって、コラーゲンリンカ−のアミノ酸とそのコラーゲンをＩＬ−６タンパク質にブリッジするセリン残基の全部が削陳されている合成ペプチド。９７、請求項９４乃至９６のいずれか１つに記載の合成ペプチドであって、Ｎ− 末端配列の第２アミノ酸としてグリシンの代わりにプロリンを有している合成ペプチド。９８１？求項９４乃至９７のいずれか１つに記載の合成ペプチドであって、Ｎ− 末端配列に最初のメチオニンを欠いている合成ペプチド。９９．アミノ酸の削腺、置換、挿入、逆位、付加又は交換により請求項９４乃至９８のいずれか１つに記載のペプチドの誘導体である合成ペプチド。１００、アミノ酸２９からアミノ酸２１２までの天然Ｉ　Ｌ−６のアミノ酸配列の部分から成る合成ペプチドであって、上記配列はシスティンを含むが、上記アミノ酸２９はグロリンの代わりにグリシンであることを特徴とする合成ペプチド。１０１、最初のメチオニン残基を有する請求項１００に記載の合成ペプチド。１０２、請求項９２乃至１０１の合成ペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する組換え遺伝子。１０３、請求項１０２の組換え遺伝子を有するベクター。１０４、請求項１０２の組換え遺伝子を有する単細胞宿主。１０５、ｆｆ請求項１０のベクターを有する単細胞宿主。１０６、宿主中に抗体生成を刺激する方法であって、該宿主に請求項９０〜１０１のいずれか１つのペプチドの有効量を、有効な抗原と共に投与する方法。１０７、請求積項９０〜１０１いずれか１つに記載のペプチドの有効量を、宿主に投与することを含む、宿主におけるウィルス感染を予防または処置する方法。１０８、請求項９０〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドの有効量を、宿主に投与することを含む、宿主における肝性タンパク質の生成を刺激する方法。１０９．請求項９０〜］、　Ｏｌのいずれか１つに記載のペプチドの肴効量を、宿主に投与することを含む、宿主における天端Ｂ細胞の分化を刺激する方法。１１０８請求項９０〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドの有効量を、宿主に投与することを含む、宿主における造血幹細胞を刺激する方法。１１１、請求項９０〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドの有効量を、宿主に投与することを含む、免疫抑制宿主を処置する方法。１１２、請求項９０〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドと反応する単一クローン性抗体の有効量を、宿主に投与することを含む免疫グロブリン生成における機能障害を含む病気状態を処置する方法。１１３、薬学的に受容可能な担体と組合せた請求項９０〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドの有効量を含有する薬学的製剤。１１４、請求項１１３に記載の製剤において、上記ペプチドが、少なくとも１つの他のシトカイン［ｃｙｔｏｋｉｎｅ］又は造血成長因子と結合されていることを特徴とする製剤。１１５．請求項１１４に記載の製剤において、上記シトカイン又は造血成長因子が、エリスロボエチン、インターロイキン及びコロニー刺激因子から選ばれている製剤。１１６、請求項１１４に記載の製剤において、上記インターロイキンが、ＩＬ− １，ＩＬ−２又ハｒ　Ｌ　−３テあッテ、上記コロニー刺激因子が、Ｇ−Ｃ３Ｆ、ＧＭ−Ｃ５Ｆ、又はＭ−Ｃ５Ｆであることを特徴とする製剤。１１７、　請求積項１１４〜１１６記載のシトカイン又は造血成長因子と開時的又は連続的に共同投与して治療に使用する請求項９０〜１０１１項のいずれか１つに記載の合成ペプチド。１１８、請求項１１３に記載の製剤において、上記ペプチドが感染防御抗原の有効量と組合わされて、アジュバントとして存在していることを特徴とする製剤。１１９、誘導可能なプロモータである第１部分と、ミニシストロン配列である第２部分と、停止コドンを欠くタンパク質を有するＤＮＡ７ラグメントを挿入するためのクローニング部位である第３部分と、開裂可能なペプチドのヌクレオチド配列である第４部分と、該第４部分の開裂可能なペプチドに関してフレーム内にあるβ−ガラクトシダーゼのヌクレオチド配列である第５部分と、をコードしている核酸配列を有する組換え核酸ベクターであって、上記核酸配列の＠３部分クローニング部位が、β−ガラクトシダーゼの第５部分に翻訳読取り相外にあることを特徴とする組換え核酸ベクター。１２０、第８ｂ図に示されたＤＮＡ配列を有する請求項１１９に記載のベクター。１２１、ｍ３項９２〜１０１のいずれか１つに記載のペプチドをコードしているＤＮＡ配列を有する請求項１〜１４のいずれか１つに記載の組換え遺伝子。１２２、ｆｆ墓項１２１に記載の遺伝子を有する組換えベクター。１２３、請求項１２２に記載のベクターを含んでいる単細胞宿主。１２４、ｐ３４０プラスミドを有する組換えベクター。１２５、突然変異体ＩＡＢ　ＤＮＡ配列を有する組換え請求項１２５のベクターによって生成されたペプチド。１２７．１Ｌ−５活注を有するペプチドをコードしているＤＮＡ配列であって、上記ペプチドは突然変異体ＩＡＢによって形成された配列を有することを特徴とするＤＮＡ配列。１２８、請求項１２７のＤＮＡ配列によってコードされたペプチド。１２９．１Ｌ−６活性を有するペプチドであって、上記ペプチドは含有アミノ酸残基４−２３が除去された天然ＩＬ−６配列を有することを特徴とするペプチド。１３０、請求項１２９のペプチドをコードするＤＮＡ配列。明細書合成インターロイキン−６１、はじめに本発明は、遺伝子及び組換え成熟インターロイキン−６（以下ＩＬ−６）であるそれら遺伝子のコードされたタンパク質、並びにＴ　Ｌ−６活性を保持する合成システィンフリータンパク質に関する。これらのタンパク質は、開裂部位及び担体ＤＮＡの部分と共に、インターロイキン−６又はその修飾された合成態のいずれかから成るトリハイブリッド融合タンパク質のアミノ酸又はカルボキシ末端ペプチド部分として、単細胞宿主内に発現される。この組換え融合タンパク質は、開裂部位に対して特異的なタンパク分解酵素で、生体外で精製され消化されるもので、Ｉ　Ｌ−６の働きを持つペプチドを雇主させる。そのペプチドは、担体ＤＮＡによって発現された大きなβ−ガラクトシダーゼタンパク質から容易に分離される。精製されたペプチドは、免疫グロブリン及び肝性タンパク質を含むタンパク質の生成を刺激するため使用することができ、また、ウィルス感染を防止するためにも使用され得る。そのタンパク質は、また、アジュバントとしてワクチン調剤に添加することもできる。２、発明の背景２．１．ペプチド　レギュレータ遠隔細胞の代謝活性を調節する生理的作用物は、１９０９年、英国の科学者ＢａｙｌｉｓｓとＳｔａｒｌｉｎｇｅｒによって、ホルモンと命名された。これらの作用物は、アミノ酸誘導体、ステロイド及びペプチドから成る。さらに最近では、細胞の増殖を活発にし及び／又は抑制する種々のペプチドが特定され、刺激因子又は成長因子と名付けられている。そのような細胞因子に対する別の一般名称は、シトカイン［ｃｙｔｏｋｉｎｅｌであるが、さらに正確な名称は、リンパ球によって生成されるリンフ才力インという起源細胞である。りンフオカインは、また、免疫系における細胞の増殖を調節する分子のインターロイキンに属する。免疫系によって生成される他のペプチドは、特別な抗ウイルス性の作用をもたらす。そのようなペプチドはインターフェロンと呼ばれる。インターフェロンと見なすためには、因子は、ＲＮＡ及びタンパク質の両方の合成を含んでいる細胞代謝性プロセスを介して抗ウイルス性活動に作用するタンパク質でなければならない。（インターフェロン命名法委員会、　１９８０．Ｎａｔｕｒｅ　８６（２）：１１０）２．２　インターロイキン−６インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、多くの研究者によって、ＩＦＮβ２Ａ、ＢＳＦ−２，Ｈ３Ｐ、Ｇ−Ｃ５Ｆ、Ｃ５−３０９、ＨＰＧＦ、あるいは２６ＫＤａタンパク質として選択的に述べられたペプチドに対して与えられた用語である。今日ＩＬ−６として知られているこれらのオリジナル因子には、ｌ）インター７　ｚ　Ｏ７−β２　（Ｚｉ１ｂｅｒｓｔｅｉｎ他、１９８６．ＥＭＢＯＪ、５：２５２９）又はポリ（ｒ　Ｉ）ポリ（ｒＣ）刺激繊維芽細胞において初めて検出された２６ｋＤａタンパク質（Ｈａｅｇｅｍａｎ他、　１９８６．Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ＋＊、１５９：６２５）　、　２）　Ｂ細胞刺激因子−２（ＢＳＦ−２）と名付けられた強力なＴ細胞誘導リン７オカイン（Ｈｉｒａｎｏ他、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ　３２４ニア３）　、　３）　Ｂ細胞ハイブリドーマ／プラスマ細胞腫成長因子（ＨＰＧＦ又はＨＧＦ）と呼ばれる繊維芽細胞生１６８：５４３；Ｔｏｓａｔｏ他、１９８８．５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：５０２）　、及び４）肝細胞刺激因子（Ｈ３Ｐ）と呼ばれるペリ７工ラルブラ７ド単球タンパク質（Ｇａｕｌｄｉｅ他、　１９８７．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８４ニア２５１）がある。！Ｌ−６ペプチドの機能は、基本的には、人類病理学における炎症及び免疫応答の両方に対するものである。これらの機能は、多様であり、試験される細胞の型に依存する。ｒ　Ｌ−８は、白血球、上皮細胞、繊維芽細胞を処理したＩＬ−１、肝細胞、血管内皮細胞、噴門粘液腫組織、ある種の膀胱癌、ある種のけい部癌細胞及びダリア細胞において、発現される。Ｉ　Ｌ−６は、抗体生成細胞の増殖及び分化をもｔ；らすよう、Ｂ細胞とＴ細胞の相互作用において含まれるペプチドの一種である。Ｉ　Ｌ−６は、活性化されたＢ細胞における免疫グロブリンの分泌を非常インターフェロンとしてＩ　Ｌ−６の初期特定に対して応答し得る抗ウイルス性活動に関して、Ｉ　Ｌ−６の本質的発現を与えた組換えＴ　Ｌ−６プラスミドでの中国ハムスター卵巣細胞の変化は、媒体内のペプチドの検出においてだけでなく、抗ウイルス性活動の検出においても生じた（Ｚｉ　１ｂｅｒｓｔｅｉｎ他、１９８６．ＥＭＢＯＪ、５：２５２９）天然Ｉ　Ｌ−６が抗ウイルス性活動を有すか否かについて、科学誌で討論された。抗ウイルス性の特別な活動はＷｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ等によって初めて報告された（１９８０．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７７：７１５２）；また、この科学者グループのメンバーは、彼らの標本ニおける抗ウイルス性活動について報告を続けた（Ｃｏｎｔｅｎｔ他、１９８５、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５２：２５３；Ｍａｙ他、１９８８．Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｎ、２６３ニア７６０を参照）。抗ウイルス性活動に対して報告された値は、５−１０　Ｘ　１０　’Ｕ／ｍｇタンパク質から１−３　Ｘ　１０　”Ｕ／ｍｇと同程度の低い値までの範囲である。反対に、多数の他の研究者は、彼等の精製された組換えＩ　Ｌ−６標本に関連して、大きな抗ウィルＩ　Ｌ−６は、ＩＮＦの活動を抑制させることが明らかとなり？＝（Ｋｏｈａｓｅ等、］９８７．Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、ｚ：２７３）。しかし、ＥＢＶで影響を受けた人のＢ−リンパ芽球細胞の成長を刺激する（ＴｏｓａｔＯ等、１９８８．５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：５０２）。また、人の脚線細胞及び１９７８球の成長をも刺激する（Ｌｏｔｓ等、１９８８．Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６７（ｓ）：１２５３）する成長因子として特定された。ＩＬ−３と結合して、ｒＬ−６は、造血剤始原細胞の増殖を支え（Ｖａｎ　Ｄａｍｍｅ等、　１９８７．Ｐｒｏｃ。Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８４：９０３５）、さらに、傷や感染に応答して、肝細胞タンパク質のサブセットの合成を調節する（Ｇａｕｌｄｉｅ等、１９８７゜Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８４ニア２５１　；Ａｎｄｕｓ等、１９８７．ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、２２］：］８）。それ自体の作用の増大、及びＩＬ−１，ＴＮＦ、ＴＦＮＢ。及びＰＤＧＦのような他のペプチドレギュレータとの相互作用が、生体恒常性調節に必要な複合シトカイン網において中心的役割を演するという示唆があった（Ｋｏｈａｓｅ等、１９８７．Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ＋、７：２７３；Ｓａｈｇａｌ等、１９８７．５ｃｉｅｎｃｅ　２３５ニア３１；Ｂ１１１ｉａｕ、ｌ９８７．ｆｕｎｕｎｏｌ、Ｔｏｄａｙ　８：８４；　５ｐｏｒｎ　ａｎｄ　Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９８８．Ｎａｔｕｒｅ　３３２：２１７）２．３．インターロイキン−６タンパク質のＤＮＡ配列異なる生物的活動に基づいて、多くの研究者によって初めて特徴づけられた因子の基本構造を比較することによって、それらのアミノ酸配列の同一性が明らかにされ、それらのペプチドをインターロイキン−６（ＩＬ−６）として再命名することになった。ポリ（ｒｌ）（ｒＣ）又はシクロへキシミド及びアクチノマイシンＤのいずれか一方で処理した繊維細胞は、ＩＦＮβ２と呼ばれる抗ウイルス性活性を導くことのできるタンパク質に対してコードされた１　４５ｍＲＮＡ分子を生成した（Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ等、　１９８０．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　、７７：７１５２；英国特許第２．０６３゜８８２号）。この導かれたｍＲＮＡ７ラクシタンのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａコピーから生成されｔ；クローンは、ＩＦＮβｌ、ＩＦＮ７σＡ、ＩＦＮ７σ、及びＴ　Ｆ　Ｎ　ａ　Ｄとは明らかに異なったＩＦＮβ２部分配列を与えた（Ｃｈｅｒｎａｊｏｖｓｋｙ等、１９８４．ＤＮＡ　３：２９７；Ｒｓｖｅｌ等、１９８３゜Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　５：２０５１．Ｇｒｅｓｓｅｒ　ｅｄｌＡｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、）。多くのｃＤＮＡクローンから誘導された完全なＩＦＮβ２配列は、Ｓｌヌクレアーゼマツピングによって明らかにされたｍ　ＲＮ　Ａ）　開始部位、ＴＡＴＡボックス、ポリアゾニレ−シコン部位、ＡＴＧ開始配列に加えて、２１２アミノ酸長タンパク質を形成した（Ｚｉｌｂｅｒｓｔｓｉｎ等、ｌ９８６．ＥＭＢＯＪ、５：２５２９；ローヨッパ特許０２２０５７４Ａｌ、公開日１９８７年５月６日）。ＩＦＮβ２配列の別の解析において、Ｍａｙ等、　１９８６．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８３：８９５７もまた、Ｚｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ等、１９８６．ＥＭＢＯＪ、５：２５２９　；の部分ｃＤＮＡクローンではなく、全長ｃ　Ｄ　Ｎ　スクリーンを用いて、その２１２アミノ酸タンパク質配列を形成した。これらの研究者達は、ＩＦＮβ ２がＴＮＦによって導かれたことについても留意した。それらの２６ｋＤａタンパク質は、検出可能な抗ウイルス性活性を有しなかったが、Ｆｌａｅｇｅｍａｎｎ等、　１９８６．Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５９：６２５は、シクロへキシミド又はインターロイキン−１での処理によって繊維芽細胞内に導かれたそれらの２６ｋＤａタンパク質の配列が、Ｚｉ　１ｂｅｒｓｔｅｉｎ等、１９８６．ＥＭＢＯＪ、５：２５２９；のＩＦＮβ２と同一であうたことを認めた。そのタンパク質の５′末端は、ｃＤＮＡクローンコレクシ１ンにおいて失われていたので、２６　ｋＤａペプチドの内部ｃＤＮＡ配列との相補性を試験する人遺伝子ライブラリィのスクリーンは、人遺伝子の５′末端領域内の１６２ｂｐイントロンのＤＮＡ配列と同様に、完全な２１２アミノ酸配列を与えたゲノミッククローンを生み出しｔ；。３３０９個別ペプチド配列を含んでいるタンパク質データベース内のタンパク質との大きな類似性を見い出せなかった。別の研究（Ｈｉｒａｎｏ等、１９８６．Ｎａｔｕｒｅ　３２４ニア３）において、ＢＳＦ−２タンパク質が、その因子を構造的に生成しｆ＝人のＴ細胞株から精製され、かつＨＴＬＶ−１ウイルスを用いて確立された。９個のペプチドフラグメントからのアミノ酸配列データが、ｃＤＮＡライブラリィを探すために使用された合成オリゴマーを精製するために必要な情報を与えｔ；。ｃＤＮＡクローンは、精製Ｉ　Ｌ−６タンパク質のアミノ末端のごとく配列された。成熟タンパク質配列の端部は、核酸配列から予測された２１２アミノ酸プレペプチドが、天然成熟ＢＳＦ−２（ＴＬ−６）タンパク質を精製するために開裂される２８アミノ酸長信号ペプチドを含んだことを示すｐｒｏ−ｖａ　１− ｐｒｏ−ｐｒｏであった。完全ＢＳＦ−２（ＩＬ−６）ゲノミックＤＮＡの続いての配列解析は、染色体セグメントが、５個のエクソン及び４個のイントロンを含んでいることを証明した（Ｙａｓｕｋａｗａ等、１９８７．ＥＭＢＯＪ−６：２９３９）。ＢＳＦ−２（ＩＬ−６）遺伝子の組織は、２つの遺伝子が比較されると、Ｇ−Ｃ５Ｆの組織とまさに類似していた。ＨＧ　Ｆ　（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ等、１９８７．Ｊ、Ｉ＋＋＋ｍｕｎｏ１．１３９＝４１１６）の配列の完成後、ＨＧＦとＴ　Ｌ−６の同一性が確認された。さらに、（ＨＧＦ、ＩＦＮβ２．２６ＫＤａタンパク質すなわちＢＳＦ−２などの）ＩＬ−６遺伝子の全ての報告された解析における配列差の検討によって、僅かな単塩基変化が明らかにされた。ペプチド読取りフレーム内で生ずる２つ変化のいずれもアミノ酸変化を生じない、まＩ；、Ｖａｎ　Ｄａｍｍｅ等、１９８８．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４０：１５３１４は、ＨＧＦのアミノ末端配列が、ＩＦＮβ２．２６ＫＤａタンパク質及びＢＳＦ−２と同一であったことに注目した。Ｃ１ａｒｋ他（国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８７１０１６１１　、公開番号ＷＯ３８１００２０６゜１９８８年１月１４日公開）もまた、Ｔ　Ｌ−６のｃＤＮＡ配列を報告している。２．４．ＩＬ−６におけるシスティン残基の保存会てのシスティン残基位置は、２つのタンパク質、すなわちＢＳＦ−２（ＩＬ−６）及びＧ−Ｃ９Ｆ間に保存される。この類似性に注目して、Ｈｉｒａｎｏ等、１９８６．Ｎａｔｕｒｅ　３２４ニア３は、分子内のジスルヒド結合がＢＳＦ−２（ＩＬ−６）及びＧ−Ｃ５Ｆの構造に重要だろうことを示唆した。それらの示唆は、多くの成長因子すなわち、ＢＳＦ−２（ＩＬ−６）がＧ−Ｃ５Ｆと遠く関連することを明らかにしたインターロイキンとインターフェロンの個人のデータベースにおけるＢＳＦ−２（ＴＬ−６）配列と他の配列との比較に基づいていた。しかし、ナシ羅ナル・バイオメディカル・リサーチ基礎データベース又は遺伝子配列データバンクとの比較では、それらのデータバンクにおける他のタンパク質との大きな類似性が明らかにされなかつｔ；。システィンの保存は、また、Ｖａｎ　５ｎｉｃｋ等、１９８Ｂ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８３：９６７９によって示唆された。彼らはマウスのＨＰ−１を配列し、人Ｉ　Ｌ−６に関して保存された相同体を見出した。彼らは、まｔ二、ＨＰ−１，１Ｌ−６及びＧ−Ｃ５Ｆのシスティンの位置を調べ、システィン位置が３つのペプチド内で保存されたことに注目しｔ二。Ｙａｓｕｋａｖａ等によって上述されたように、ＢＳＦ−２（ＴＬ−６）遺伝子内のエキソン及びイントロンの組織は、２つの遺伝子が比較されたとき、Ｇ−ＣＳＦの組織とまさに類似したものであった。この発見は、２つのタンパク質のそれぞれ改革的歴史である（ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ、　１９８７．　Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、　Ｉ＋ｎｍｕｎｏ１．７（５）：３４３参照）。タンパク質内のシスティンの存在は、タンパク質が細菌宿主において組換え生成されるとき、プロセス上の問題を引き起こす。微生物的に生成されたシスティン含有タンパク質は、タンパク質生成物の精製を非常に複雑にする多量体を形成する傾向がある。組換えタンパク質の還元や再酸化など、競りかの付加的精製ステップが、適切な構造状態のタンパク質を得るために必要である。化学的に等価な中性アミノ酸によって同時置換して、１以上のシスティンを除去することが、Ｉ　Ｌ−６分子の単離及び精製を簡単にするために好ましい。しかし、微生物的に活発な分子からシスティンを連続的に除去することは、通常形成されたジスルヒド結合の存在しない三次元構造が実質的に変えられ得るという点で、予測できない。１以上のこれらの残基が、所望の活動を保持するために必要不可欠であることが度々ある。！　Ｌ−６のシスティ〉が保存されているので（上記参照）、天然システィン残基は、Ｉ　Ｌ−６などのシトカインに対して特に臨界的であることが期待される。さらに、他のシトカインの生物的活動が、システィンが除去される場合に影響を受けるであろうと報告されている。例えば、３つの内の１つのシスティン残基のみが、ＩＦＮ−βの生物的活動に影響を与えることなく除去され得る。（米国特許第４．７３７．４６２号　参照）。同様に、Ｉ　ＦＮＩｌｌの４個のシスティンの内の１個のみが、活動を完全に喪失することなく除去され得る（Ｍａｒｋ等＋　１９８４．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、８１：５６６２）。２．５１組換えタンパク質としての天然インターロイキン−６の生成２．５．１．組換えＤＮＡ技術ならびに遺伝子発現組換えＤＮＡ技術は、ＤＮＡビークル（ベクター）内に特別なりＮＡ配列を挿入し、宿主細胞内で複製できる組換えＤＮＡ分子を形成することを含む。一般に挿入されたＤＮＡ配列は、受容株ＤＮＡビークルに対して異物である。すなわち、挿入されたＤＮＡ配列及びＤＮＡベクターは、全く遺伝情報を交換しない生態から導かれる。または挿入されたＤＮＡ配列は、全体的に又は部分的に合成的に作られ得る。燈つかの組換えＤＮＡ分子の構成を可能にする一般的方法が開発された。構成に対して使用された方法に関係無く、組換えＤＮＡ分子は、宿主細胞と両立可能であらねばならない。すなわち、それは、宿主細胞内で自律複製できるか、又は１または２以上の宿主細胞染色体中に安定的に一体化されうるものでなければならない。組換えＤＮＡ分子は、また、所望の組換えＤＮＡ分子を選択できる識別機能も有していることが好ましい。さらに、もし全ての適切な複製、転写、及び翻訳の信号が、組換えベクター上に正確に配列されるなら、異物遺伝子は、例えば微生物発現プラスミドの場合には変形微生物細胞において、あるいは、複製の適切なオリジンを有する組換えプラスミドを有するか又は組換えウィルスで感染された自由細胞株若しくは宿主において、正しく発現される。異なる遺伝子信号及び処理結果は、ＤＮＡ転写やメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）翻訳などの遺伝子発現レベルを制御する。ＤＮＡの転写は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、それによってｍ　ＲＮ　Ａ合成を促進させるＤＮＡ配列であるプロモータの存在に依存する。真核性プロモータのＤＮＡ配列は、原核性プロモータのＤＮＡ配列とは異なっている。さらに、真核性プロモータ及び付随する遺伝子信号は、認められないか、又は原核性系では機能しない。また、さらに、原核性プロモータは認められず、真核性細胞において機能しない。同様に、ｙＫ楼性内のｍＲＮＡの翻訳は、真核性の信号とは異なる適切な原核性信号の存在に依存する。原核性内のｍＲＮＡの十分な翻訳は、ｍＲＮＡ上のＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎ。（Ｓ−Ｄ）配列と呼ばれるリポソーム結合部位を必要とする（Ｓｈｉｎｅ、Ｊ、及びＤａｌｇａｒｎｏ、Ｌ、、１９７５．Ｎａｔｕｒｅ　２５４：３４）。この配列は、タンパク質のアミノ末端メチオニンをコードする、通常ＡＵＧである開始コドンの前に配置されているｍＲＮＡの短ヌクレオチド配列である。Ｓ／Ｄ配列は、１６５ｒＲＮＡ（リポソーマルＲＮＡ）の３′末端に対して相補的であり、リポソームの正しい位置付けを与えるように、ｒ　ＲＮ　Ａと二重化することによって、ｍＲＮＡのリポソームへの結合をおそらく促進させるものである。１６５リポソームＲＮＡ及びｍＲＮＡ間の相補性の数少ないヌクレオチドから成る５ｈｉｎｅ／Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列は、リポソーム結合部位の重要な特徴として特定されたが（Ｓｈｉｎｅ及びＤａｌｇａｒｎｏ、１９７５．Ｎａｔｕｒｅ　２５４：３４；５ｔｅｉｔｚ、１９８０．リポソームにおける構造、機能、及び遺伝学、　ｅｄ、ｃｈａｍｂｌｉｓｓ等、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ、。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐａｒｋ　Ｐｒｅｓｓ　ｐｐ、４７９−４９５）、コンピュータ解析によって、ＡＵＧ開始コドンを取囲んでいる約百個のヌクレオチドが、翻訳開始信号の適切な予測によって支持されるように、リポソーム／　ｍ　ＲＮ　Ａ相互作用に含まれることが示された（Ｓｔｏｍｅｒ等。１９８２、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１０：２９７１；Ｇｏｌｄ等、　１９８４．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８１ニア０６１）。特定のタンパク質の最大翻訳に対して、何が現実に最良かつ完全なリポソーム結合部位を与えるのかの予測は、なされ得なイ（Ｊｏｙｃｅ等、　１９８３．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８０：　１８３０　参２ｂｐ配列のそれらの特徴化に８いて組換え発現ベクターの発展中に、完全なリポソーム／　ｍ　ＲＮ　Ａ相互作用領域の重要性を認識した（スコナー等の第１図、１９８６．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８３：８５０６）。「ミニシストロン」配列の第１のシストロンにおける１つの塩基欠失は、全細胞タンパク質の０．４％から２４％まで下流組換えタンパク質Ｍｅｔ　−［Ａｌａ）ｂＧＨの生成を増大させるに十分であっ！；（図４．ｐｃＺ１４５と比較しｌ；ｐＣＺ　ｌ　４３　、５ｃｈｏｎｅｒ等、　ｉｄ、を参照）。代替として、２つの塩基挿入もまた、第２シストロンによってコードされたコードするペプチドの大きな発現をもたらした。制御実験は、発現の差が翻訳の差によることを示した。これは、これらの構成のｍＲＮＡレベルが、（約５０７オールドであった）発現しｔ；タンパク質差と比較して（３７オールド違い以下の）必然的に同一であったためである。結論は、ミニシストロン配列の第１シストロンの翻訳を終わらせる停止コドンの位置が、組換えタンパク質のコードされた配列を含んでいる、第２シストロンの翻訳効率に影響を与えたいということであった。それらの働きの最も重要なものは、組換えタンパク質のコードされた配列にすぐ先行する配列の１つ又は２つの塩基変化が、下流発現に非常に大きな効果を持ち得ることを示した。クローン化遺伝子の好結果の発現は、ＤＮＡの充分な転写、ｍＲＮＡの翻訳そしである場合には、タンパク質の翻訳後の修飾を要する。発現ベクターが、適切な宿主における活性プロモータの制御下で遺伝子を発現するため、及びタンパク質生成を増大させるため、使用された。２．５．２　組換えインターロイキン−６の非細菌的生成Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈ等、　１９８０．Ｐｒｏｃ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７７：７１５２は、卵母細胞内のｃＤＮＡを翻訳し、生体外において組換えＴＦＮβ２を作ったが、Ｚｉ　１ｂｅｒｓｔｅｉｎ等、１９８６．ＥＭＢＯＪ、、ｑ：２５２９は、生体内のＩＦＮβ２Ａ　（Ｉ　Ｌ−６）ｃＤＮＡ発現の第１例を報告している。異なる一次クローンの融合したｃＤＮＡを含有している抑制フラグメントは、ｐｓＶｃＩＦＢ２プラスミドを生成するために、ＳＶ４０初期プロモータの下流に置かれｔ；。このプラスミドにおいて、完全ＩＦＮβ２　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列及びオリジナルクローニングベクターの幾つかの隣り合うヌクレオチドは、５Ｖ４Ｑ初期プロモータ及びＴアンチダンＲＮＡのヌクレオチドに続いた。ＩＦＮβ２Ａ配列は、Ｔアンチゲン分割領域及びポリアゾニレ−シコン部位を導いた。中国ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）組織培養細胞及びメトトレキセート増幅選択へのステップ終了後、〔Ｓ″Ｓ〕とラベルされたＣＨＯ細胞クローンが、非飽和量の抗体を用いて、イムノプレシテーシａンによる放射性ＩＦＮβ２タンパク質生成のためにスクリーンされた。同じ研究において、全ＩＦＮβ２ＡｃＤＮＡ配列がＴ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモータに融合された所のプラスミド構成が、生体外で転写され、続いてラビットの網状赤血球溶解産物内で転写されたｍＲＮＡを生成した。溶解産物のイムノプレシビテーションに続いて適切な大きさのＩＦＮβ２（ＩＬ−６）タンパク質が、５ＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲル上に検出され得る。ＢＳＦ−２（Ｉ　Ｌ−６）　は、ＳＶ４０初期プロ％　−タニ隣り合うＢＳＦ− ２の完全コード領域を含んでいるグラスミドの形質移入の後、ＣＯ３７細胞内で機能的に発現された（Ｈｉｒａｎｏ等。１９８６、Ｎａｔｕｒｅ　３２４ニア３）、　Ｂ　Ｓ　Ｆ　−２活性は、イムノアフイニティゲル方法を用いて、転写した細胞からの媒体の精製及び濃縮の後、検出され得る。この方法を用いて生成された組換えＩＬ−６は、ＦＡＯ細胞内のフィブリノーゲン及びアルブミンｍＲＮＡの調節を解析するために使用された（Ａｎｄｕｓ等、１９８７．ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｓ、ｚ２ｉ：１８）。Ｃ１ａｒｋ等（国際出願番号ｗｏ８８１００２０６　、１９８８年１月１４日公開）は、ＴＬ−６ＣＤＮＡ配列が、ＳＶ４０エンハンサ−１主要アデノイド遅れプロモータ、ＤＨＦＲコード配列、ＳＶ４０遅れメツセージポリ−Ａ付加部位及びＶＡ　ｒ遺伝子を含むｐ９１０２３Ｂプラスミド中に結合されたところのｐＣ５Ｆ３０９の構造を述べている。ＣｏＳ細胞がこのプラスミドを用いて形質転換されるとき、ＩＬ−６造血刺激活動がｌＯ〜４希釈の調節された組織培養細胞媒体で回復され得る。この型の組換え標本は、Ｆ２３．Ｉ　ＴｇＧ２ａ抗−〔マウスＴ細胞しセプターＢチェーン可変領域セグメント８．１．８．２及び８．３〕 −マウス抗体と結合したＣｏｎＡ又はアガロースビードのいずれかの存在下Ｉ；、Ｔ細胞増殖へのＩ　Ｌ−６の効果の解析に使用された（Ｇａｒｍａｎ等。１９８７、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　８４ニア６２９）。組換えＸ　Ｌ−６の標本は、またインターロイキン−２を存在させて、マウスの胸腺細胞からＬｙ−２１細胞溶解性のリンパ球の分化へのＩ　Ｌ−６の効果を研究するのに使用された（Ｔａｋａｉ等、１９８８．Ｊ、Ｉｍｍｕｎａｌ、１４０：５０Ｂ）。組換えＴ　Ｌ−６のより高い細胞生成の代替方法は、ラビットの網状赤血Ｂｔ二おけるＩＬ−６ｍＲＮＡの翻訳による（Ｐｏｕｐａｒｔ等。１９８７、ＥＭ１３０　Ｊ、６：１２１９）、又は酵母におけるｃＤＮＡ発現による（Ｌａ　Ｐｉｅｒｒｅ等、ｌ９８８．Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、Ｉ６７：７９４）　ｒ　Ｌ　−６ｍ　ＲＮ　Ａのカエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞への注入後の生体外合成を含む（ＷｅｉｓｓｅｎｂａｃｈｌＦ　、　１９８０　、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、７７：　７１５２　；Ｃｏｕ　ｌ　ｉｅ等、１９８V．Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７：　１４５３：Ｐｏｕｐａｒｔ等、１９８７．ＥＭＢＯＪ、６：１２１９）。　２゜５．３９組換えインターロイキン−６の細菌的生成りラーク等（＠際出願番号ＷＯ３８１００２０６、１９８８年１月１４日公開）は、ｐｃｓＦ３０９を使用してＥ、ｃｏｌｉにおける組換え■Ｌ−６の発現及び生成を報告した（受入れ番号ＡＴＣＣ６７１５３として１９８６年７月］りＥＩ寄託）。しかし、そこで報告された好適な実施例は、ｐｃｓＦ３０９の配列を選択的に調整し、ａ）その信号ペプチドリーダ配列及びその３′　ノンコード配列を削除し、そしてｂ）温度感応Ｃ＋抑制因子との関連で、タンパク質コード配列を温度誘導ＰＬプロモータに結合させている。プラスミドｐＡＬ３０９ｃｍ７８１を含むこの菌株はＡＴＣＣに寄託されなかった。この菌株では、細菌的に発現されたタンパク質が、初めに可溶化され、その後再びフォールドされなければならなかった不溶化形態で生成された（彼らの特許出願の実施例Ｖ参照）。代替的には、ｐＡＬ−５ｅｃ−ＩＬ−６−１８１と呼ばれるプラスミドがｓＰＬプロモータ制御下で、ＩＬ−６のｃＤＮＡ配列を合成信号ペプチドリーダ配列に結合することによってＩＬ−６を生成するように構成された。温度感応Ｃ１抑制因子菌株におけるＰＬプロモータの高温誘導の後、Ｔ　Ｌ−６が、信号ペプチドが途去される等質タンパク質として変形細胞の周縁質から隔離された。純粋タンパク質の産出は、報告されなかった。Ｂｒａｋｅｎｈｏｆ　ｆ等、１９８７．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ１．１３９：４１１６は、７個の特別なＩＬ−６ｃＤＮＡクローンのいずれか１個を含有している異なるＥ、ｃｏｌｉ菌株において、ＨＧＦすなわちハイブリドーマ成長因子（ＩＬ− ６）の発現を報告した。媒体は、Ｉ　Ｌ−６を生成するクローンを特定するために、！　Ｌ−６活性に対しスクリーンされた。その活動は、クローン間で少なくともｓ、ｏｏ。７オールド変化した。最も活性な構成（クローン７）は、ペプチドの第１の４３アミノ酸を失っていたが、その構成は、次に活性なりローンの２０倍以上の活性を生成した。ＨＧＦ（ＩＬ−６）の完全なアミノ酸コード領域を含有する構成は、最も小さな活性を示した（例えば、ＡＴＧスタート部位からポジション−６２で始まるクローン■５は、ｌ　０．０００ｋＵ／ｍｌを持ったクローン７に比べて１　、７　ｋＵ／ｍｌの活性を示した）。活性を検出するために、組換えＩＬ −６は、初めにクローン７及び１５のシトソリツクタンパク質から分離された。活性は、個々の５ＤＳ−ＰＡＧＥ切片の溶離後にのみ分析された。活性が検出されてさえも、Ｔ　Ｌ−６タンパク質は何も、ゲルタンパク質プロフィールにおいて明らかにされなかった。Ｔｏｓａｔｏ等、ｌ９８８．５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：５０２は、Ｅ、ｃｏｌｉにおいて生成された組換えＩ　Ｌ−６を用いて、免疫悠置後に抗血清の生成を報告している。しかし、抗血清生成方法並びに組換えＩＬ＝６タンパク質合成及び生成は公表されなかった（調整原稿中に文献ｌＯとされているものを参照のこと）。組換えＢＳＦ−２（ＩＬ−６）は、ｐＴＢＣＤ−１２を用いてＥ、ｃｏｌｉにおいて生成された（旧ｒａｎｏ等、１９８８．１ｍｍｕｎｏｌ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１７：４１）。このプラスミドの誘導は、組換えＩ　Ｌ−６ペプチドがＩ　Ｌ− ２ペプチドに融合されている融合タンパク質の生成をもたらした。カリクレイン及びアミノペプチダーゼ−Ｐを用いてのプロテアーゼ消化は、成熟！Ｌ−６タンパク質を得るために必要であった。しかし、説明を可能にさせるこれ以外の手順の詳細はどこにも公表されていない（上記調整原稿参照）。Ｍａｙ等、　１９８９．　Ｊ、Ｂｉｏｌ　、ｃｈｅｍ、２６３ニア７６０では、１８２アミノ酸の！Ｌ−６ペプチド部分に融合された原核性リーダペプチドの３４アミノ酸を含んでいる生成物を生成するために、ＲＥＶ発現ベクター（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ　ｃｏｒｐ、ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）におけるＩＬ−６ｃＤＮＡの融合の後に、細菌内にＩ　Ｌ−６の不溶化形態を生成することが報告されている。発現タンパク質は、Ｔｒｉｓ塩基化バッファにおける８Ｍ尿素、５ｍＭ　ＤＴＴ及び１０ｍＭβ−メルカプトエタノールで溶解された不溶化ペレット内に取り出された。融合生成物は、溶解バッファを持つ塩の勾配を用いているＤＥＡＥ −セファローズ　コラムのクロマトグラフィによって続いて、原核性リーダペプチドに対するモノクローン抗体を持つイムノアフイニティ・久ロマトグラフイ、又はモノＱコラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）を持つＦＰＬＣのいずれかによって、多数の他のＥ、ｃｏｌｉペレットタンパク質から部分的に精製された。精製タンパク質の産出は報告されていない。ＤＥＡＥ−セファローズピーク７ラクシ羅ンは、ＦＳ−４細胞培養及び水胞性０炎ウィルスにおいて、サイト７アテイツク効果低減分析を用いて、０−５　１１０／ｍｌの抗ウイルス性活動を示した。組換え融合されたＩ　Ｌ−６タンパク質は、ポリクローン抗血清を精製するために、ラビットに注射された。そのポリクローン抗血清は、人の単核細胞において、ＴＮＦ及び又はＩ　Ｌ−６のシクロへキシミド誘導後の繊維芽細胞ＦＳ４細胞において、天然Ｔ　Ｌ−６タンパク質を特徴づけるために使用された。ＦＳ４細胞媒体を持つ抗血清のインキュベージコンは、ＣＥＳＳ細胞内の免疫グロブリンの誘導を妨げた。多くの研究者は、Ｅ、ｃｏｌｉ内に作られｔ；組換えＩ　Ｌ−６タンパク質を報告したが、組換えＩ　Ｌ−６精製の方法論については開示がなかった（Ｔａｇａ等、　１９８７．Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６６（４）：９６７；Ｇａｕｌｄｉｅ等、１９８８．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８４ニア２５１；Ｌｏｔｇ等、１９８８．Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１６７（３）　：　１２５３　；Ｍｕｒａｇｕｃｈ　ｉ等、１９８８．Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６７（２）：３３２：Ｒｅ１ｓ等、　１９８８　、　Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎｏ　ｌ　、　１４０（５）　：１５６６）。２．５．４．組換えインターロイキン−６の高生産困難性細菌内に天然Ｉ　Ｌ−６の生成を可能にする報告は見当たらないが（セクション２．５．３を参照）、細菌内の天然タンパク質の高生産は、組換えＤＮＡ生物工学法を用いても成功しなかった（Ａｓａｇｏｅ等、１９８８．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：８０６）　（本願の５．１．も参照）。Ａｓａｇｏｅの研究は、上述の２．５．３　、に報告された構成に近いプラスミド構成を用いて誘導細胞エキス内で検出可能なタンパク質として天然Ｉ　Ｌ−６を生成することはできないことを報告している。不成功のＡｓａｇｏｅの発現プラスミドは、Ｐ　ＴＡＣプロモータ及びＡＴＧスタート配列を持つフレーム内で、かつそれに隣接する成熟旭理ＢＳＦ−２（ＩＬ−６）タンパク質コード配列を含んでいた。そのプラスミドは、種々の菌株背景において解析されたが、Ｉ　Ｌ−６タンパク質は融合後に検出されなかった。多量の不溶化組換えＩ　Ｌ−６活性が、次の１）〜３）の状態にある多雑種融合タンパク質を含有しているプラスミドの誘導後にのみ、Ａｓａｇｏｅによって生成された。すなわち、１）Ｐ７１．プロモータ及びＡＴＧスタート部位が大成長ホルモンコード配列に融合された、２）大成長ホルモン配列がＸａ因子ペプチド認識部位（ｉ　ｌｅ−ｇｌｕ−ｇｌｙ−ａｒｇ）を生成するオリゴヌクレオチド配列に融合された、モして３）Ｘａ因子認識部位が、その後、ｇｌｕ−ｐｈｅ−ｍｅｔ−ＢＳＦ−２配列又はａｌａ−ＢＳＦ−２コ一ド配列のいずれかに融合された。したがって、この組換えＩＬ−６（すなわちＢＳＦ−２）ペプチドは、この構造における大成長ホルモン／Ｘａ因子配列／ＢＳＦ−２ハイブリッド融合生成物のカルボキシ末端部分であった。一方のペプチド構造内にｇｌｕ−ｐｈｅ−ｍｅｔ −ＢＳＦ−２として、又は他方にａｌａ−ＢＳＦ−２ペプチドとして存在している組換えＩ　Ｌ−６活動は、８Ｍ尿素までの融合タンノ（り質の溶解化後にのみ精製され得た。Ｘａ因子を持つ融合タンパク質の開裂は、粗放透析による精製融合タンパク質を再フォールドすることを要した。融合タンパク質標本がＸａ因子によって不完全に消化されただけであったので、再７オールドされたプロセスは、不完全であった。Ｘａ因子開裂は、他の部分開裂生成物に加えて、無傷融合タンパク質、組換えＩ　Ｌ−６ペプチド、及び大成長ホルモンペプチドを含んでいる異種起源混合物を生成した。精製生成物内にＴ　Ｌ−６活性を得るために、Ｘａ因子／開裂混合物が、６Ｍグアニジニウム塩酸基で変性されなければならなかった。組換えＩＬ− ６ペプチドのクロマトグラフィ精製後に、それは、再７オールドされた活性ペプチドを回収するために、さらに組数透析を受ける。ｇｌｕ−ｐｈｅ−ｍｅｔ−ＢＳＦ−２又はａｌａ−ＢＳＦ−２のいずれかである結果としての組換えペプチドは、Ｂ細胞刺激因子分析におけるそれらの活動に対してのみ試験される。その生成プロセスに対して報告された生産高は、約５％であった（精製活動の３＋ｎｇが、最初の１００ｍｇの融合タンパク質から回収されたが、そのうち５８ｍｇはＩ　Ｌ−６ペプチドである。したがって、３１５８−５．１７％）。従って、今なお、Ｉ　Ｌ−６の高生産を与える便利で、比較的安価な方法が必要とされている。哺乳類細胞を用いる組換え方法は、かなり高価となる傾向がある。細菌精製は低コストではあるが、変換細菌においてＩ　Ｌ−６を生成するための従前の試みは、商業的に好適な生産法をもたらさなかった。本発明は、高いタンパク質生産すなわち、代替的には全部の細胞質ゾルタンパク質の約２０％を与える、細菌におけるＩＬ−６を生成する方法、及びＤＮＡ構成を提供する。本発明は、また、天然ｒ　Ｌ−６分子の生物的活動を保持するシスティン７リー形態のＩ　Ｌ−６を提供するものである。３、発明の概要本発明は、タンパク質のそれぞれの活性ペプチドフラグメントと罰様に、細菌によって生成された組換え合成システィン７リーＴ　Ｌ−６タンパク質の経済的生成に関するものである。生成されるタンパク質は、システィン含有又はシスティンフリーのいずれかであり、Ｉ　Ｌ−６生物的活動を保持する。細菌培養は、高百分率すなわち一般に全可溶性細胞質ゾルタンパク質の少なくとも２０％はどの組換えタンパク質を発現する。組換えＩ　Ｌ　−６タンパク質は、ペレットからタンパク質を溶解させるために、８Ｍ尿素又はβ−メルカプトエタノールのような粗い変性剤での処置を必要としない。本明細書及び特許請求の範囲を通して使用されているように、「実質的に水に可溶である」という句は、この特性を示す。本発明では、Ｉ　Ｌ−６は、３部分の融合タンパク質を発現させることによって、単細胞宿主内に組換え生成される。その融合タンパク質は、第１、第２及び第３ペプチド部分から構成され、第１ペプチド部分は、Ｔ　Ｌ−６活性を有し、第２ペプチド部分は、化学的にあるいは酵素的に開裂可能な配列を有し、その配列は第１ペプチド部分を第３ペプチド部分に結び付は七いる。また、第３ペプチド部分は、単細胞宿主によって発現され得、かつ好ましくは検出可能な機能を有するタンパク質又はその部分である。それらの３つのペプチド部分は、便宜上「第１」「第２」又は「第３」と呼ばれるが、タンパク質のプロモータ制御発現に関して、特定の順序になっているものとして読まれるべきではない。第１及び第３ペプチド部分の位置は交換可能である。第３ペプチド部分は、タンパク質または胤細胞宿主細胞が作ることができるタンパク質の部分を与える。第３ペプチドを発現する担体ＤＮＡの存在は、真核性Ｔ　Ｌ−６タンパク質の生成を容易にする。その検出可能な機能において、（例えば、酵棄的活性）、＠３ペプチドが容易に特定されかつ隔離される手段を与える。所望の生物的活性を持つ第１ペプチ）′部分は、第２ペプチド部分の開裂によって融合タンパク質の残部から分離される。その後、組換えＩ　Ｌ−６ペプチＶは、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）などによる公知の方法によってタンパク質混合物から分＊＝ａ、そして精製され、ｒ　Ｌ−６アツセイにおいて活性である純粋なタンパク質を産出する。本発明は、後述のベクターで交換された単細胞宿主に加えて、融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列、これらのヌクレオチド配列から成る組換えベクターをも考慮している。特別な実施例では、Ｔ　Ｌ−６活性を有する合成ペプチＶが、セリン残基によって置き換えられた未変性Ｉ　Ｌ−６配列の全４個のシスティンで精製される。特にことわっていない場合には、合成システィンフリーＩ　Ｌ−６又は組換えシスティンフリー丁Ｌ−６という用語が、セリン残基によって置き換えられた未変成Ｉ　Ｌ−６配列の全４個のシスティンを持つＴ　Ｌ−６活性の合成ペプチドを指すものとして本明細書及び特許請求の範囲において使用される。そのようにして精製されたペプチドは、驚くほどにその生物的活性を保持する。例えば、Ｉ　Ｌ −６のシスティンシリ−形態は、肝細胞活動化及びＢ細胞刺激を示すことがわかった。本発明のタンパク質は、抗ウィルス活性を有し、細胞のウィルス感染を防止し得る。システィンフリー合成タンパク質は非発熱性であり、あるいは少なくとも未変性Ｉ　Ｌ−６タンパク質よりも非常に小さな発熱性のものである。本発明のタンパク質は、また、ＩＬ−６７ミノ末端から２７個のアミノ酸残基までを削除し、及び／又はアミノ末端に５０個までアミノ酸襞基を加え、及び／またはＩ　Ｌ−６配列のカルボキシ末端に３５０個までアミノ酸を加え、かつ、適切な生物的活性を保持している異なるシスティン７り−及びシスティン含有ＩＬ −６ベプチＶをも含んでいる。従って、驚くことには、また多くの他の生物的挙動のペプチドとは違って、塩基ＩＬ−６配列が、実質的な活動を大きく失うことなしに修飾することがでさる。従って、本発明は、Ｉ　Ｌ−６活性を保持する、トランケートされ伸びた、システィン７り−又はシスティン含有ペプチドに加えて、そのシスティンフリーペプチドをコードする遺伝子配列を包含している。本発明の方法は、Ｉ　Ｌ−６を調製するための公知の組換え法の改良であり、本発明では、組換え／ベクターシステムにおいて商業酌量のＴ　Ｌ−６を調製する手段を提供するものである。Ａｓａｇｏｅによって述べられたものなど、前述のＩＬ−６融合タンパク質構成は、大量のタンパク質の発現を得るのに成功してい　、ないし、それらは機能的タンパク質を得るために、膨大な粗放精製工程及び再フォールド工程を必要とする。しかし、この粗雑な変性剤での処理は本方法では必要なく、また、融合タンパク質又は開裂タンパク質のいずれかの再７オールドも必要としない。これらの組換え宿主を培養することによって精製されたペプチドは、免疫系治療細胞活性へのそれらの刺激効果において特徴的Ｉ　Ｌ−６活性を保持する。本発明は、また、請求の範囲に記載された合成Ｉ　Ｌ−６ペプチドの投与によって、免疫応答の全体的モジュレータ１ンに加えて、ウィルス性疾患、免疫不全、及び肝性疾患の治療法についても考慮している。３．１．定義Ａ　Ｔ　ＣＣ：　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｂｐ　：　塩基対ＢＳＦ−２：　Ｂ細胞刺激因子ｃＤＮＡ　：　相補的ＤＮＡＣＨＯ：　中国ハムスター卵巣Ｃ５Ｆ　：　コロニー刺激因子ＤＨＦＲ：　ジヒドロ葉酸レダクターゼＤＮａｓｅ　：　デオキシリポ核酸分解酵素ＥＬＩＳＡ　：　酵素結合イミューノソーベント　アッセイＧ−Ｃ５Ｆ　：　顆粒球コロニー刺激因子ＨＧＦ　：　肝細胞成長因子ＨＰＧＦ：　ハイブリドーマ　プラマサイトーマｒＰｌａｍａｃｙｔｏｍａコ成長因子ＨＰＬＣ：　高速液体クロマトグラフィＨ５Ｆ　：　肝細胞刺激因子ＩＧＦ　：　インシュリン類似成長因子ＩｇＧ、ＩｇＭ　：　免疫グロブリンＧ、免疫グロブリフＭＩＬ−１，ＩＬ−３又はＩＬ−６：　インターロイキン−１，インターロイキン−３又はインターロイキン−６１ＰＴＧ　：　イソプロピルチオガラクトシドＩＮＦ　：　インターフェロンｋＤａ　：　キロダルトンｋｂ　：　キロベースＬＢ　：　ルリア　ブロスｊＬｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ］ｍ　ＲＮ　Ａ　：　メッセンジＪＦ−ＲＮＡＰＡＧＥ　：　ポリアクリルアミド　ゲル　電気泳動ＰＢＳ　：　リン酸塩緩衝生理食塩水ＰＤＧＦ　：　血小板誘導成長因子Ｐｏ　ｌ　ｙ　（ｒ　ＩＸｒＣ）：リポシトシン鎖で２重化されたりポイノシン鎖を持つＲＮＡＰＬ　：　ラムダの左のプロモータＰＲ：　ラムダの右のプロモータＰｔＡｃ’Ｐｔｖｃ　：　）リプトファンと乳との結合の合成プロモータＲＮａｓｅ　：　リボ槙酸分解酵素 ’３ＤＳ　：　硫酸ドデシル基ナトリウムＳ−Ｄ配列　：　シャインーダルガーノｒ、ｓｈ　１ｎｅ−Ｄａ　Ｉｇａｎｏ］配列ＳＨ：　スルフヒドリルＴＮＦ　：　１１１１壊死因子Ｘ−ｇａｌ：　ブロモ−クロロ−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドＹＴ　：　酵母−トリプトン成長因子４、 51. The unicellular host of claim 50, which is a bacterium. 52, (a) a first peptide portion having IL-6 activity; a second peptide portion having a chemically cleavable peptide link between it and a third protein portion capable of being expressed by a cellular host; (b) identifying the tripartite proteins produced by said host; (c) ) chemically or enzymatically cleavage the second peptide portion; and (d) removing the first peptide portion having IL-6 activity. Method. 53. The second peptide portion has a peptide link that reacts with proteolytic enzymes. 53. The method of claim 52. 54. The method of claim 53, wherein the second peptide moiety has a collagenase-measuring site. 55. The method of claim 53, wherein the second peptide portion has an enterokinase-sensitive site. 56. The method of claim 53, wherein the second peptide moiety has a Factor Xa sensitive site. 57. The method according to claim 53, wherein the third protein portion has a β-galactosidase sequence or a portion thereof. 58. The method of claim 53, wherein the third protein portion comprises a TrpE gene product. 59. The first peptide portion cannot form a sulfhydryl bond, the second peptide portion consists of a peptide having a collagenase sensitive site, and the third protein portion consists of a protein having β-galactosidase enzyme activity. 54. The method according to claim 53. ao, the first peptide portion is incapable of forming a sulfhydryl bond, the second peptide portion has a peptide having an enterokinase-sensitive site, and the third protein portion has a protein that is a TrpE gene product or a portion thereof. 59. 61, the first peptide moiety cannot form a sulfhydryl bond, and the second peptide moiety 60. The method of claim 59, wherein the third protein portion comprises a peptide having a Factor Xa sensitive site and the third protein portion comprises a protein that is the TrpE gene product or a portion thereof. 52. The method of claim 59, wherein the peptide portion is incapable of forming sulfhydryl bonds, the second peptide portion has a peptide having an enterokinase-sensitive site, and the third protein portion has a β-galactosidase sequence or a portion thereof. . 63, the first peptide part cannot form a sulfhydryl bond, and the second peptide part cannot form a sulfhydryl bond. The second protein part has a peptide with a factor Xa sensitive site, and the third protein part has a 60. The method of claim 59, comprising a lactosidase sequence or portion thereof. 64. The method of claim 59, wherein the first peptide moiety retains no amino acid residues from the second peptide moiety after cleavage from the second peptide moiety. 65. The engineered hybrid protein comprises at least about 20% of the total protein produced by the host organism. How to put it on. 66. The method according to any one of claims 52 to 64, wherein the host organism is a prokaryote. 67. The method of claim 66, wherein said host organism is a bacterium. 68. The method of claim 65, wherein said host is a bacterium. 69. The method according to any one of claims 52 to 64, wherein the first peptide moiety does not have a sulfhydryl bond. 70, the first peptide portion has the IL-6 amino acid sequence shown in FIG. 65. A method according to any one of claims 52 to 64. 71. The engineered hybrid protein is a total protein produced by the host organism. 71. The method of claim 70, having at least about 20% of the quality. 72, recombinant plasmid with accession number ATCC40516 (p340). 73, recombinant plasmid with accession number ATCC40517 (p367). 74, a first peptide portion having IL-6 activity, a second peptide portion having a cleavable peptide, and a third protein capable of being expressed by the selected host organism. a substantially pure recombinant protein having a quality portion; 75. A recombinant protein encoded by the gene of claim 1. 76. A recombinant protein encoded by the gene of claim 2. 77. A recombinant protein encoded by the gene of claim 3. 78. A recombinant protein encoded by the gene of claim 4. 79. A recombinant protein encoded by the gene of claim 5. 80. A recombinant protein encoded by the gene of claim 6. 81. A recombinant protein encoded by the gene of claim 7. 82, recombinant protein encoded by the M3 term 8 gene. 83. A recombinant protein encoded by the gene of claim 9. 84. A recombinant protein encoded by the gene of claim 10. 85. A recombinant protein encoded by the gene of claim 11. 86. A recombinant protein encoded by the gene of claim 12. 87. A recombinant protein encoded by the gene of claim 13. 88. A recombinant protein encoded by the gene of claim 14. 89, a recombinant protein with the rL-68 and collagen amino acid sequences shown in Figure 8b. protein. 90, chemical or enzymatic opening of the protein of any one of claims 75 to 88. A recombinant protein with IL-6 activity that is a cleavage product. 91, containing no cysteine, the protein according to any one of claims 75 to 78. the product of chemical or enzymatic cleavage of a peptide, which after cleavage leaves a second peptide moiety IL-6 activity characterized by not possessing residue amino acids derived from recombinant protein. 92, a synthetic peptide that has IL-6 activity and is substantially insoluble. 93. The peptide of claim 59, which is not capable of forming sulfhydryl bonds. 94, 5th! The IL-6 amino acid sequence is cysteine or its amino acid sequence. Synthetic peptides that do not contain homologs, analogs, or active moieties of Chido. 95, having the IL-6 amino acid sequence of Figure 5, which does not contain cysteine. A synthetic peptide in which the amino acids of the collagen linker are partially or completely A synthetic peptide characterized by being physically reduced. 96, having the IL-6 amino acid sequence of Figure 5, which does not contain cysteine. It is a synthetic peptide in which all of the amino acids of the collagen linker and the serine residue that bridges the collagen to the IL-6 protein have been deleted. Chido. 97, the synthetic peptide according to any one of claims 94 to 96, having proline instead of glycine as the second amino acid in the N-terminal sequence. Petite. 981? 98. A synthetic peptide according to any one of claims 94 to 97, which lacks the first methionine in the N-terminal sequence. 99. 99. A synthetic peptide which is a derivative of the peptide according to any one of claims 94 to 98 by deletion, substitution, insertion, inversion, addition or exchange of amino acids. 100, a synthetic peptide consisting of a portion of the amino acid sequence of natural IL-6 from amino acid 29 to amino acid 212, which sequence contains cysteine, but does not contain the above amino acid. A synthetic peptide characterized in that amino acid 29 is glycine instead of gloline. 101. The synthetic peptide of claim 100 having an initial methionine residue. 102. A recombinant gene having a nucleotide sequence encoding the synthetic peptide of claims 92 to 101. 103. A vector comprising the recombinant gene of claim 102. 104. A unicellular host carrying the recombinant gene of claim 102. 105, ff. A unicellular host carrying the vector of claim 10. 106. A method of stimulating antibody production in a host, comprising administering to said host an effective amount of the peptide of any one of claims 90-101 together with an effective antigen. 107. A method for preventing or treating a viral infection in a host, comprising administering to the host an effective amount of the peptide according to any one of claims 90 to 101. 108. A method of stimulating hepatic protein production in a host comprising administering to the host an effective amount of a peptide according to any one of claims 90 to 101. 109. 91-], A method of stimulating differentiation of apical B cells in a host, the method comprising administering to the host a snack-effective amount of the peptide according to any one of OL. 1108. A method of stimulating hematopoietic stem cells in a host, comprising administering to the host an effective amount of a peptide according to any one of claims 90-101. 111. A method of treating an immunosuppressed host comprising administering to the host an effective amount of a peptide according to any one of claims 90-101. 112, a single compound reacting with a peptide according to any one of claims 90 to 101. in immunoglobulin production comprising administering to a host an effective amount of a human antibody. A method of treating disease conditions involving functional impairments. 113. A pharmaceutical formulation containing an effective amount of a peptide according to any one of claims 90 to 101 in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. 114. The formulation of claim 113, wherein the peptide comprises at least one A preparation characterized in that it is combined with other cytokines or hematopoietic growth factors. 115. 115. The formulation of claim 114, wherein the cytokine or hematopoietic growth factor is selected from erythroboetin, interleukin, and colony stimulating factor. formulation. 116. The formulation of claim 114, wherein the interleukin is IL-1, IL-2 or HarL-3, and the colony stimulating factor is G-C3F, GM-C5F, or M-C3F. A formulation characterized in that it is C5F. 117. The synthetic peptide according to any one of claims 90 to 1011, which is used for treatment by co-administering periodically or continuously with the cytokine or hematopoietic growth factor according to claims 114 to 116. 118. The formulation according to claim 113, wherein the peptide has an infectious protective antigen. A formulation characterized in that, in combination with an effective amount, it is present as an adjuvant. 119, a first part that is an inducible promoter, a second part that is a minicistronic sequence, a third part that is a cloning site for inserting a DNA7 fragment with a protein lacking a stop codon, and a cleavable peptide. A recombinant nucleic acid vector having a nucleic acid sequence encoding a fourth portion that is a nucleotide sequence of β-galactosidase and a fifth portion that is a nucleotide sequence of β-galactosidase in frame with the cleavable peptide of the fourth portion. @3 partial clone of the above nucleic acid sequence The loning site is located outside the translational reading phase in the fifth part of β-galactosidase. A recombinant nucleic acid vector characterized by: 120. The vector of claim 119 having the DNA sequence shown in Figure 8b. 121. The recombinant gene according to any one of claims 1 to 14, which has a DNA sequence encoding a peptide according to any one of items 92 to 101. 122, ff. A recombinant vector having the gene described in Section 121. 123. A unicellular host comprising the vector of claim 122. 124, recombinant vector carrying p340 plasmid. 125, a peptide produced by a recombinant vector of claim 125 having a mutant IAB DNA sequence. A DNA sequence encoding a peptide having a 127.1L-5 activity, characterized in that said peptide has a sequence formed by a mutant IAB. 128, a peptide encoded by the DNA sequence of claim 127. 129.1 A peptide having L-6 activity, characterized in that the peptide has a natural IL-6 sequence from which amino acid residues 4-23 have been removed. 130, a DNA sequence encoding the peptide of claim 129. Description Synthetic Interleukin-6 1. Introduction The present invention provides genetic and recombinant mature interleukin-6 (hereinafter referred to as IL-6), proteins encoded by those genes, and synthetic cysteine that retains TL-6 activity. Concerning free protein. These proteins have cleavage sites and carriers. interleukin-6 or any of its modified synthetic forms, together with parts of the body's DNA. The amino acid or carboxy-terminal chain of the trihybrid fusion protein consisting of either Expressed in a unicellular host as a peptide moiety. This recombinant fusion protein can be purified and digested in vitro with a proteolytic enzyme specific for the cleavage site. Therefore, we use a peptide that has the function of IL-6. The peptide is easily separated from the large β-galactosidase protein expressed by the carrier DNA. Purified peptides contain proteins including immunoglobulins and hepatic proteins. It can be used to stimulate protein production and can also be used to prevent viral infections. It can also be used to The protein can also be used as an adjuvant in vaccines. It can also be added to the preparation. 2. Background of the invention 2.1. Peptide Regulators Physiological agents that regulate the metabolic activity of distant cells were named hormones by British scientists Bayliss and Starlinger in 1909. These agents consist of amino acid derivatives, steroids and peptides. More recently, various peptides that activate and/or suppress cell proliferation have been identified, and stimulating factors have been identified. They are called growth factors. Another common name for such a cellular factor is cytokinel, but the more accurate name is the cell of origin, lymphocytes, which are produced by lymphocytes. Lymphokines also belong to the interleukins, molecules that regulate cell proliferation in the immune system. Other peptides produced by the immune system provide special antiviral effects. vinegar. Such peptides are called interferons. To be considered an interferon, a factor must be a combination of both RNA and protein. Proteins that exert antiviral activity through cellular metabolic processes that include It must be of good quality. (Interferon Nomenclature Committee, 1980. Nature 86(2):1 10) 2.2 Interleukin-6 Interleukin-6 (IL-6) has been classified by many researchers as IFNβ2A, BSF-2, H3P, The term given to peptides selectively described as G-C5F, C5-309, HPGF, or the 26KDa protein. These original factors, known today as IL-6, included l) inter7zO7-β2 (Zi1berstein et al., 1986. EMBOJ, 5 :2529) or poly(rI)poly(rC)-stimulated fibroblasts. (Haegeman et al., 1986.Eur. Hirano et al., 1 986, Nature 324 Near 3), 3) B-cell hybridoma/plasma Fibroblast cell growth factor called lasma cell growth factor (HPGF or HGF) 168: 543; Tosato et al., 1988.5science 239:502), and and 4) a peripheral monocyte protein called hepatocyte-stimulating factor (H3P). quality (Gauldie et al., 1987. Proc, Natl., Acad, Sci. 84 Near 251). ! The function of L-6 peptide is basically against both inflammatory and immune responses in human pathology. These functions are diverse and depend on the cell type being tested. rL-8 is found in IL-1 treated leukocytes, epithelial cells, fibroblasts, hepatocytes, vascular endothelial cells, cardia myxoma tissue, certain bladder cancers, certain groin cancer cells, and dahlia cells. , expressed. IL-6 is a peptide involved in the interaction of B and T cells to induce proliferation and differentiation of antibody-producing cells. It is a type of de. IL-6 confers essential expression of IL-6 with respect to its antiviral activity, which may be responsive to the initial identification of IL-6 as an interferon with the secretion of immunoglobulins in activated B cells. Recombinant T L-6 Changes in Chinese hamster ovary cells with lasmids in detecting peptides in the medium as well as in the detection of antiviral activity (Zi 1berstein et al., 1986. EMBOJ, 5:2529).The question of whether natural IL-6 has antiviral activity has been debated in scientific journals. It was done. Special antiviral activity was first reported by Weissenbach et al. (1980. Proc, Natl. Acad, Sci. 77:7152); members of this group of scientists also continued to report on antiviral activity in their specimens (Content et al., 1985, Eur. J, Bioch em, 152:253; May et al., 1988. J, Biol, Chen, 263 near 760). Reported values for antiviral activity range from 5-10 X 10'U/mg protein to as low as 1-3 X 10'U/mg protein. The range is up to a low value. Conversely, a number of other researchers have shown that, in conjunction with their purified recombinant IL-6 preparations, large antiviral IL-6 suppresses INF activity. = (Kohase et al., ]987.Mo1.Cel Biol, z:273). However, it stimulates the growth of B-lymphoblast cells in people affected by EBV (TosatO et al., 1988.5science 239: 502). It is also a growth factor that also stimulates the growth of human leg line cells and 1978 bulbs (Lots et al., 1988.J, Exp, Med, 167(s):1253). was identified. In combination with IL-3, rL-6 supports the proliferation of hematopoietic progenitor cells (Van Damme et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. 84:9035) and also in response to wounding and infection. , regulates the synthesis of a subset of hepatocyte proteins (Gauldie et al., 1987° Proc, Natl. Acad, Sci., 84 Near 251; Andus et al., 1987. FEBS Lett, 22:]8). increase in its own action, and and IL-1, TNF, and TFNB. and interactions with other peptide regulators such as PDGF contribute to homeostatic regulation. There have been suggestions that it plays a central role in the complex cytokine network required for cell division (Kohase et al., 1987. Mo1. Ce1l Bio+, 7:273; Sah gal et al., 1987. fununol, Today 8:84; 5porn and Rob erts, 1988. Nature 332:217) 2.3. Interloiki Based on the different biological activities, many researchers have By comparing the basic structures of factors that were first characterized as The identity of the amino acid sequences was revealed, leading to the renaming of the peptides as interleukin-6 (IL-6). Fiber cells treated with either poly(rl)(rC) or cycloheximide and actinomycin D were coated against a protein capable of directing antiviral activity called IF Nβ2. (Weissenbach et al. 1980. Proc. Natl. Acad. Sci. 77:7152; British Patent No. 2.063.882). The clones generated from this derived cDNA copy of mRNA7laccitan gave an IFNβ2 subsequence that was distinctly different from IFNβ1, IFN7σA, IFN7σ, and TFNaD (Chernajovsky et al., 1984 DNA 3:297; Rsvel et al., 1983° Interferon 5:2051. Gresser edlAca demic Press, N, Y,). The complete IFNβ2 sequence, derived from a number of cDNA clones, was revealed by Sl nuclease mapping. (Zilber stsin et al., 1986. EMBOJ, 5:2529; Rojoppa Patent 0220 574 Al, published May 6, 1987). In another analysis of the IFNβ2 sequence, May et al., 1986. Proc, Natl, Acad, Sci, 83:89 57 also Zilberstein et al., 1986. EMBOJ, 5:2529; a full-length cDN screen rather than a partial cDNA clone was used to generate the 212 amino acid protein sequence. These investigators also noted that IFNβ2 was induced by TNF. Although their 26 kDa protein had no detectable antiviral activity, Flaegmann et al., 1986. Eur, J. Biochem, 159:625. The sequences of those 26 kDa proteins that were introduced into fibroblasts were described by Ziuberstein et al., 1986. EMBOJ, 5:2529; I admitted that I sang it. The 5' end of the protein was lost in the cDNA clone collection, so the 26 kDa peptide was not compatible with the internal cDNA sequence. A screen of a human gene library testing for complementation yielded a genomic clone that gave a complete 212 amino acid sequence, as well as the DNA sequence of a 162 bp intron within the 5' terminal region of the human gene. No significant similarities were found to proteins in the protein database containing 3309 individual peptide sequences. In another study (Hirano et al., 1986. Nature 324 Near 3), it was determined that the BSF-2 protein produced the factor constitutively and was purified from human T-cell lines. was produced and established using the HTLV-1 virus. Amino acid sequence data from nine peptide fragments provided the information necessary to purify the synthetic oligomers used to probe the cDNA library. The cDNA clone was sequenced as amino terminus of purified IL-6 protein. The ends of the mature protein sequence indicate that the 212 amino acid prepeptide predicted from the nucleic acid sequence contained a 28 amino acid long signal peptide that was cleaved to purify the native mature BSF-2 (TL-6) protein. It was pro-va 1-pro-pro. Subsequent sequence analysis of the complete BSF-2 (IL-6) genomic DNA (Yasukawa et al., 1987. EMBOJ-6:2939). The organization of the BSF-2 (IL-6) gene was exactly similar to that of G-C5F when the two genes were compared. After completion of the sequence of HG F (Brakenhoff et al., 1987.J, I+++ muno1.1 39=4116), the identity of HGF and T L-6 was confirmed. Furthermore, consideration of sequence differences in all reported analyzes of IL-6 genes (such as HGF, IFNβ 2.26 KDa protein or BSF-2) revealed that only a few Kana single base changes were revealed. Neither of the two changes that occur within the peptide reading frame result in an amino acid change; Van Damme et al., 1988. J. Immunol, 140:15314, noted that the amino-terminal sequence of HGF was identical to the IFNβ 2.26 KDa protein and BSF-2. C1ark et al. (International Application No. PCT/US87101611, Publication No. WO3 8100206, published January 14, 1988) also reported that the cDNA sequence of TL-6 was Reporting columns. 2.4. Conserved cysteine residue positions in IL-6 The cysteine residue positions are conserved between the two proteins, namely BSF-2 (IL-6) and G-C9F. It will be done. Noting this similarity, Hirano et al., 1986. Nature 324 Near 3 suggested that intramolecular disulfide bonds may be important in the structure of BSF-2 (IL-6) and G-C5F. Those suggestions are supported by a number of growth factors, namely, an inhibitor that revealed that BSF-2 (IL-6) is distantly related to G-C5F. It was based on a comparison of the BSF-2 (TL-6) sequence with other sequences in the tarleukin and interferon personal databases. However, in comparison with the National Biomedical Research Basic Database or Gene Sequence Data Bank, have not revealed significant similarities with other proteins in their databank; Cysteine conservation has also been described in Van 5nick et al., 198B, Nat1. Acad, Sci, 83:9679. They sequenced mouse HP-1 and found a conserved homolog with respect to human IL-6. They examined the position of cysteine in Matt, HP-1, 1L-6, and G-C5F and noted that the cysteine position was conserved within the three peptides. As described above by Yasukava et al., the organization of exons and introns within the BSF-2 (TL-6) gene was exactly similar to that of G-C SF when the two genes were compared. . This discovery is based on the fact that two proteins Each is a revolutionary history (see Kishimoto, 1987.J, CI in, I+nmuno1.7(5):343). The presence of cysteine in proteins poses processing problems when the proteins are produced recombinantly in bacterial hosts. Microbially produced cysteine-containing proteins tend to form multimers that greatly complicate the purification of protein products. There is a tendency to Competitive additional purification steps such as reduction and reoxidation of recombinant proteins step is necessary to obtain the protein in the proper structural state. Removal of one or more cysteines with simultaneous substitution by a chemically equivalent neutral amino acid is preferred to facilitate isolation and purification of the IL-6 molecule. However, the continuous removal of cysteine from microbially active molecules is difficult because the normally formed disulfide unpredictable in that the three-dimensional structure in the absence of bonding can be substantially altered. stomach. One or more of these residues is essential to retain the desired activity. There are many times. ! Since the cysteine of L-6 is conserved (see above), natural cysteine residues are expected to be particularly critical for cytokines such as IL-6. Additionally, it has been reported that the biological activities of other cytokines will be affected if cysteine is removed. For example, only one cysteine residue out of three can be removed without affecting the biological activity of IFN-β. (See U.S. Pat. No. 4,737,462). Similarly, IFNIll's four systems Only one of the pins can be removed without complete loss of activity (Mark et al. + 1984. Proc, Natl. Acad, sci. 81:5662). 2.51 Production of Natural Interleukin-6 as a Recombinant Protein 2.5.1. Recombinant DNA Technology and Gene ExpressionRecombinant DNA technology involves the insertion of special NA sequences into a DNA vehicle (vector) to form a recombinant DNA molecule that can replicate within a host cell. Generally, the inserted DNA sequence is foreign to the recipient strain DNA vehicle. That is, the inserted DNA sequences and DNA vectors are derived from organisms that do not exchange any genetic information. Alternatively, the inserted DNA sequence may be wholly or partially synthetically produced. A general method has been developed that allows for the construction of recombinant DNA molecules. Regardless of the method used for construction, recombinant DNA molecules must be compatible with the host cell. That is, it must be capable of autonomous replication within the host cell or stably integrated into one or more host cell chromosomes. Preferably, the recombinant DNA molecule also has an identification function that allows selection of a desired recombinant DNA molecule. Furthermore, if all the appropriate replication, transcription, and translation signals are correctly sequenced on the recombinant vector, the foreign gene can be transmitted in a modified microbial cell, e.g. is correctly expressed in a free cell line or host that has a recombinant plasmid with the appropriate origin or is infected with a recombinant virus. Different genetic signals and processing results control gene expression levels, such as DNA transcription and messenger RNA (mRNA) translation. Transcription of DNA depends on the presence of a promoter, a DNA sequence that directs the binding of RNA polymerase, thereby promoting mRNA synthesis. eukaryotic pro The DNA sequence of a motor is different from that of a prokaryotic promoter. Sara Additionally, eukaryotic promoters and associated genetic signals are either absent or non-functional in prokaryotic systems. Furthermore, prokaryotic promoters are not recognized and do not function in eukaryotic cells. Similarly, translation of mRNA within the yK complex depends on the presence of appropriate prokaryotic signals that are distinct from eukaryotic signals. Sufficient translation of mRNA within prokaryotes is the Shine-Dalgarn on mRNA. (S-D) sequence (Shine, J. and Dalgarno, L., 1975. Nature 254:34). This sequence is an open sequence, usually an AUG, that encodes the amino-terminal methionine of the protein. It is a short nucleotide sequence of mRNA that is placed before the start codon. S/D distribution The column is complementary to the 3' end of the 165 rRNA (liposomal RNA) and likely facilitates the binding of the mRNA to the liposomes by duplexing with the rRNA to provide correct positioning of the liposomes. be. 165 liposomal RNA and mRNA consist of a few complementary nucleotides. The 5hine/Dalgarno sequence is an important feature of the liposome binding site. (Shine and Dalgarno, 1975. Nature 254:34; Teitz, 1980. Structure, function, and genetics in liposomes, ed. Chambliss et al., Baltimore, Md., University Park Press pp. 479-495) , con Computer analysis showed that approximately 100 nucleotides surrounding the AUG start codon are involved in the liposome/mRNA interaction, as supported by a good prediction of a translation initiation signal (Stomer et al. et al. 1982, Nucl, Ac1ds Res, 10:2971; Gold et al., 1 984. Proc, Natl, Acad, Sci, 81 Near 061). specific type No prediction can be made as to what will actually provide the best and most complete liposome binding site for maximal protein translation (see Joyce et al., 1983. Proc, Natl. Acad, Sci. 80:1830). Their characterization of 2bp sequences During the development of recombinant expression vectors, the complete liposome/mRNA phase The importance of the interaction region was recognized (FIG. 1 of Skorner et al., 1986. Proc, Natl. Acad, Sci, USA 83:8506). A single base deletion in the first cistron of a "minicistronic" sequence accounts for 0.4% of all cellular proteins. increased the production of the downstream recombinant protein Met-[Ala)bGH by 24%. That's enough! (Fig. 4. Compare with pcZ145; see pCZ143, 5choner et al., id). Alternatively, a two base insertion can also be inserted into the code encoded by the second cistron. This resulted in significant expression of the peptide that encoded the protein. Control experiments showed that the differences in expression were due to differences in translation. This is because the mRNA levels of these constructs (which were approximately 507 years old) were expressed and compared to protein differences. This is because they were necessarily the same (with a difference of less than 37 olds). The conclusion was that the position of the stop codon that terminates translation of the first cistron of a minicistronic sequence may influence the translation efficiency of the second cistron, which contains the encoded sequence of the recombinant protein. . The most important of these actions showed that changes of one or two bases in the sequence immediately preceding the coding sequence of a recombinant protein can have a profound effect on downstream expression. Successful expression of the cloned gene requires sufficient transcription of the DNA, translation of the mRNA, and, in some cases, post-translational modification of the protein. Expression vectors were used to express the gene under the control of an active promoter in a suitable host and to increase protein production. 2.5.2 Non-bacterial production of recombinant interleukin-6 Weissenbach et al., 1980. Proc, Acad, Sci, 77: 7152 translated cDNA in oocytes and produced recombinant TFNβ2 in vitro, but Zi 1berstein et al., 1986. EMBOJ, q:2529 reports the first example of IFNβ2A (IL-6) cDNA expression in vivo. Suppression fragments containing fused cDNAs of different primary clones was placed downstream of the SV40 early promoter to generate the psVcIFB2 plasmid. This plasmid contains the complete IFNβ2 A c DNA sequence and several adjacent nucleotides of the original cloning vector. The code was followed by the nucleotides of the 5V4Q early promoter and T antidan RNA. The IFNβ2A sequence led to the T antigen partition region and the polyazonyresicon site. Chinese Hamster Ovary Cells (CHO) Tissue Culture Cells and Methotrexate After completion of the steps to amplification selection, CHO cell clones labeled [S″S] were radioactivated with immunopresitase a using non-saturating amounts of antibody. IFNβ2ta Screened for protein production. In the same study, a plasmid construct in which the entire IFNβ2Ac DNA sequence was fused to the T7 RNA polymerase promoter generated mRNA that was transcribed in vitro and subsequently transcribed in rabbit reticulocyte lysates. Immunoprecipitation of the lysate followed by appropriate 5DS-polyacrylamide gel can be detected on the file. BSF-2 (IL-6) was functionally expressed in CO37 cells after transfection of Grasmid containing the complete coding region of BSF-2 flanked by SV40 early proteins (Hirano et al. BSF-2 activity can be detected after purification and concentration of media from transferred cells using immunoaffinity gel methods. Recombinant IL-6 produced using this method was used to analyze the regulation of fibrinogen and albumin mRNA in FAO cells (Andus et al., 1987. FEBS Letts, z2i:18). C1ark et al. (International Application No. wo88100206, published on January 14, 1988) ), the TL-6 CDNA sequence contains the SV40 enhancer-1 major adenoid delayed promoter, DHFR coding sequence, SV40 delayed message poly-A addition site, and The structure of pC 5F309, which has been ligated into the p91023B plasmid containing the VA r gene. When CoS cells are transformed with this plasmid, IL-6 hematopoietic stimulating activity is expressed in regulated tissue culture cell media at a dilution of 10~4. It can be recovered by the body. This type of recombinant specimen is F23. ITgG2a anti-[mouse Sceptor B chain variable region segments 8.1.8.2 and 8.3] - in the presence of either ConA conjugated to mouse antibodies or agarose beads; IL-6 to T cell proliferation; (Garman et al. 1987, Proc, Natl, Acad, Sci 84 Near 629). Preparations of recombinant was used to study the effect of IL-6 on the differentiation of Ly-21 cytolytic lymphocytes from lymphocytes (Takai et al., 1988.J, Immunal, 140:50B). Alternative methods for higher cellular production of recombinant T L-6 are by translation of IL-6 mRNA in rabbit reticulocyte Bt2 (Poupart et al. 1987, EM130 J, 6:1219) or by cDNA expression in yeast. (La Pierre et al., 1988.J, Exp, Med, I67:794) and involves in vitro synthesis of rL-6m RNA following injection into frog (Xenopus) oocytes (Weissenbachl F, 1980, Proc. Nat 1. Acad, Sci, 77: 7152; Coulie et al., 198 V. Ur, J. Immunol, 17: 1453: Poupart et al., 1987. EMBOJ, 6: 1219). 2゜5.39 Recombinant interleukin-6 details Bacterial production Lark et al. (@ International Application No. WO38100206, published January 14, 1988) reported the expression and production of recombinant L-6 in E. coli using pcsF309 (1986 as accession number ATCC67153). Deposited with EI in July 2013). However, the preferred embodiment reported therein selectively modulates the sequence of pcsF309 and includes a) its signal peptide leader sequence and its 3' b) in the context of the temperature-sensitive C+ repressor; The code sequence is linked to the temperature-inducible PL promoter. This strain containing plasmid pAL309 cm781 was not deposited with the ATCC. In this strain, bacterially expressed proteins are first solubilized and then unfolded. (See Example V of their patent application). Alternatively, a plasmid called pAL-5ec-IL-6-181 is engineered to generate IL-6 by joining the IL-6 cDNA sequence to a synthetic signal peptide leader sequence under the control of the sPL promoter. Configured. Temperature sensitive C1 suppression After high-temperature induction of the PL promoter in a factor-limiting strain, T L-6 is activated by the signal peptide. It was isolated from the periplasm of modified cells as a homologous protein. Pure Ta No protein production was reported. Brakenhof et al., 1987. J, Immuno1.139:4116 is a unique gene containing any one of seven special IL-6 cDNA clones. reported the expression of HGF, or hybridoma growth factor (IL-6), in E. coli strains. To identify clones that produce IL-6, the medium is tested! Screened for L-6 activity. Its activity is less among clones. Tomo s, oo. 7 old changed. Although the most active construct (clone 7) was missing the first 43 amino acids of the peptide, that construct produced more than 20 times more activity than the next active clone. Constructs containing the complete amino acid coding region of HGF (IL-6) showed the least activity (e.g., clone 5, starting at position -62 from the ATG start site, compared to clones with l0.000 kU/ml). showed an activity of 1.7 kU/ml compared to 7). To detect activity, recombinant IL-6 was first isolated from the cytosolic proteins of clones 7 and 15. Activity was analyzed only after elution of individual 5DS-PAGE sections. activity detected Even though the TL-6 protein was not present in the gel protein profile, no It was not made clear. Tosato et al., 1988.5science 239:502 reported the generation of antiserum after immunization using recombinant IL-6 produced in E. coli. I'm telling you. However, the antiserum generation method and recombinant IL=6 protein synthesis and production were not published (see reference 10 in the coordinated manuscript). Recombinant BSF-2 (IL-6) was injected into E. coli using pTBCD-12. (formerly rano et al., 1988.1 mmunol Letters 17:41). Derivation of this plasmid resulted in the production of a fusion protein in which the recombinant IL-6 peptide was fused to the IL-2 peptide. Protease digestion with kallikrein and aminopeptidase-P matures! L-6 tongue It was necessary to obtain the desired quality. However, the details of the other steps that would allow for the explanation have not been published anywhere (see the adjusted manuscript above). May et al., 1989. J, Biol, chem, 263 near 760, of 182 amino acids! After fusion of the IL-6 cDNA in the REV expression vector (Repligen corp, Cambridge, MA) to generate a product containing 34 amino acids of the prokaryotic leader peptide fused to the L-6 peptide moiety. It has been reported that an insoluble form of IL-6 is produced in bacteria. Ru. The expressed protein was captured in an insolubilized pellet dissolved in 8M urea, 5mM DTT and 10mM β-mercaptoethanol in Tris-based buffer. was taken out. The fusion product is purified by prokaryotic leader peptide followed by chromatography on a DEAE-Sepharose column using a salt gradient with lysis buffer. It was partially purified from a number of other E. coli pellet proteins by either immunoaffinity chromatography with a monoclonal antibody directed against the enzyme, or FPLC with a monoQ column (Pharmacia). Refined Ta No protein production has been reported. DEAE-Sepharose Peak 7 Lacsilane showed antiviral activity of 0-5 110/ml in FS-4 cell culture and vesicular inflammation virus using the cyto7 attack effect reduction assay. The recombinant fused IL-6 protein was injected into rabbits to purify the polyclonal antiserum. The polyclonal antiserum inhibited fibroblast FS4 cells after cycloheximide induction of TNF and/or IL-6 in human mononuclear cells. was used to characterize the native TL-6 protein. Incubation of antisera with FS4 cell media prevented the induction of immunoglobulins within CESS cells. Many researchers have reported that recombinant IL-6 protein produced in E. coli. However, the methodology for recombinant IL-6 purification was not disclosed (Taga et al., 1987. J, Exp, Med, 166(4):967; Gauldie et al., 1988. Proc, Natl. Acad, Sci. , 84 Near 251; Lo tg et al., 1988. J, Exp, Med, 167(3): 1253; Muraguchi et al., 1988. J, Exp, Med, 167(2): 332: Rels et al., 1988, J , Immunol, 140(5):1566). 2.5.4. Difficulties in high production of recombinant interleukin-6 Although no reports have been found that enable the production of natural IL-6 in bacteria (see section 2.5.3), high production of the natural protein in bacteria is difficult. , recombinant DNA biotechnology (Asagoe et al., 1988.Biotechnology 6:806) (see also 5.1. of this application). Asagoe's study used a plasmid configuration close to that reported in section 2.5.3, above. It is not possible to produce natural IL-6 as a detectable protein within the cell extract. It is reported that there is no. The unsuccessful Asagoe expression plasmid contained the mature Asagoe BSF-2 (IL-6) protein coding sequence in frame with and adjacent to the PTAC promoter and ATG start sequence. That plastic The Smid was analyzed in various strain backgrounds, but no IL-6 protein was detected after fusion. Large amounts of insolubilized recombinant IL-6 activity were produced by Asagoe only after induction of plasmids containing hybrid fusion proteins in the following conditions 1)-3). That is, 1) P71. 2) the promoter and ATG start site were fused to the large growth hormone coding sequence; 2) the large growth hormone sequence was fused to an oligonucleotide sequence that generated a Factor Xa peptide recognition site (ile-glu-gly-arg); 3) The factor Xa recognition site It was then fused to either the glu-phe-met-BSF-2 sequence or the ala-BSF-2 cod sequence. Therefore, this recombinant IL-6 (ie, BSF-2) peptide was the carboxy-terminal portion of the large growth hormone/Factor Xa sequence/BSF-2 hybrid fusion product in this structure. Present as glu-phe-met-BSF-2 in one peptide structure or as ala-BSF-2 peptide in the other. Recombinant IL-6 activity could only be purified after solubilization of the fusion protein up to 8 M urea. Cleavage of the fusion protein with factor It was necessary to refold the combined protein. The reaging process was incomplete because the fusion protein preparation was only incompletely digested by Factor Xa. Factor Xa cleavage produced a heterologous mixture containing the intact fusion protein, recombinant IL-6 peptide, and large growth hormone peptide in addition to other partial cleavage products. In order to obtain T L-6 activity in the purified product, the Factor Xa/cleavage mixture had to be modified with 6M guanidinium hydrochloride groups. After chromatographic purification of the recombinant IL-6 peptide, it was reconstituted as an active peptide. To recover the titanate, undergo further series dialysis. The resulting recombinant peptides, either glu-phe-met-B SF-2 or ala-BSF-2, are tested only for their activity in the B cell stimulator assay. that life The reported yield for the synthesis process was approximately 5% (3+ng of purification activity was recovered from the initial 100 mg of fusion protein, of which 58 mg is IL-6 peptide. 3158-5.17%). Therefore, there remains a need for a convenient and relatively inexpensive method that provides high production of IL-6. Recombinant methods using mammalian cells tend to be quite expensive. Although bacterial purification is low cost, previous attempts to produce IL-6 in transformed bacteria have not resulted in commercially suitable production methods. The present invention provides high protein production, or alternatively total cytosolic protein production. Provided are methods and DNA constructs for producing IL-6 in bacteria that yield approximately 20% of the quality. The present invention also provides a system that retains the biological activity of the natural rL-6 molecule. The IL-6 is provided in a Tin7 Lee format. 3. Summary of the Invention The present invention provides a method for treating bacteria with each active peptide fragment of a protein. Economical Production of Recombinant Synthetic Cystine 7-Lee T L-6 Protein Produced Accordingly It is about growth. The proteins produced are cysteine-containing or cysteine-containing. is free of IL-6 and retains IL-6 biological activity. Bacterial cultures express a high percentage of any recombinant protein, generally at least 20% of the total soluble cytosolic protein. Recombinant IL-6 protein does not require treatment with harsh denaturants such as 8M urea or β-mercaptoethanol to dissolve the protein from the pellet. As used throughout this specification and claims. As used, the phrase "substantially soluble in water" indicates this property. In the present invention, IL-6 is produced recombinantly in a unicellular host by expressing a three-part fusion protein. The fusion protein is composed of a first, second and third peptide portion, the first peptide portion having T L-6 activity and the second peptide portion being chemically or enzymatically cleavable. The peptide has a sequence that connects the first peptide moiety to the third peptide moiety. Additionally, the third peptide moiety can be expressed by a unicellular host and preferably has a detectable function. protein or part thereof. These three peptide moieties, referred to as "first," "second," or "third" for convenience, are related to the promoter-controlled expression of the protein. and should not be read as being in any particular order. The positions of the first and third peptide moieties are interchangeable. The third peptide portion is a protein or a protein that the seed cell host cell can make. Give it some crunchy parts. The presence of carrier DNA expressing the third peptide facilitates production of eukaryotic TL-6 protein. In its detectable features (e.g. (e.g., enzymatic activity), provides a means by which peptides can be easily identified and isolated. The first peptide moiety with the desired biological activity is obtained by cleavage of the second peptide moiety. is separated from the rest of the fusion protein. Thereafter, the recombinant IL-6 peptiV was purified by known methods such as high performance liquid chromatography (HPLC). minutes*=a from the protein mixture and purified, r L-6 assay. yields pure protein that is fully active. The present invention can be replaced with the vectors described below. In addition to isolated unicellular hosts, nucleotide sequences encoding fusion proteins and recombinant vectors comprising these nucleotide sequences are also considered. In a particular embodiment, the synthetic Pepti V with TL-6 activity is All four cysteines of the native IL-6 sequence were replaced. Special synthetic cysteine-free IL-6 or recombinant cysteine-free IL-6. The term Tinfree Ding L-6 refers to a synthetic peptide of T L-6 activity that has all four cysteines of the native IL-6 sequence replaced by serine residues. It is used in this specification and claims as such. Peptides so purified surprisingly retain their biological activity. For example, the cysteine form of IL-6 has been shown to exhibit hepatocyte activation and B cell stimulation. It was. The protein of the present invention has antiviral activity and prevents viral infection of cells. It can be stopped. Cysteine-free synthetic proteins are non-pyrogenic or less Both are much less pyrogenic than native IL-6 protein. The protein of the present invention also contains 27 amino acid residues from the amino terminus of IL-67. and/or add up to 50 amino acid fold groups to the amino terminus, and/or or add up to 350 amino acids to the carboxy terminus of the IL-6 sequence and It also contains different cysteine- and cysteine-containing IL-6 peptides that retain significant biological activity. Therefore, it is surprising that many other biological Unlike dynamic peptides, the base IL-6 sequence can be modified without significant loss of net activity. Accordingly, the present invention encompasses truncated, extended cysteine- or cysteine-containing peptides that retain IL-6 activity, as well as gene sequences encoding such cysteine-free peptides. The method of the present invention is an improvement on known recombinant methods for preparing IL-6, and the present invention provides a means to prepare commercial quantities of T L-6 in a recombinant/vector system. It is. The aforementioned IL-6 fusion protein constructs, such as those described by Asagoe, have been successful in obtaining expression of large amounts of protein, or they require extensive crude purification steps and re-purification steps to obtain functional protein. Requires folding process Ru. However, treatment with this crude modifier is not necessary in the present method, and There is no need for reconstitution of either proteins or cleaved proteins. Peptides purified by culturing these recombinant hosts retain characteristic IL-6 activity in their stimulatory effect on immune system therapeutic cell activity. Main departure The patent also provides methods for treating viral diseases, immunodeficiencies, and hepatic diseases, as well as global modulators of immune responses, by administering the claimed synthetic IL-6 peptides. I am considering it. 3.1. Definition AT CC: American Type Culture Co11ectionbp: Base pair BSF-2: B cell stimulating factor cDNA: Complementary DNA CHO: Chinese hamster ovary C5F: Colony stimulating factor DHFR: Dihydrofolate reductase DNase: Deoxylipo Nucleic acid degradation enzyme ELISA: Enzyme Binding Immunosorbent Assay G-C5F: Granulocyte Colony Stimulating Factor HGF: Hepatocyte Growth Factor HPGF: Hybridoma Plamacytoma Composition Long factor HPLC: High performance liquid chromatography H5F: Hepatocyte stimulating factor IGF: Insulin-like growth factor IgG, IgM: Immunoglobulin G, immunoglobulin MIL-1, IL-3 or IL-6: Interleukin-1, Interleukin-3 or interleukin-61PTG: isopropyl thiogalactoside INF: interferon kDa: kilodalton kb: kilobase LB: Luria Broth]m RNA: message Senji JF-RNAPAGE: Polyacrylamide gel electrophoresis PBS: Phosphate buffered saline PDGF: Platelet-inducing growth factor Poly (rIXrC): RNA duplicated with lipocytosine chains or having poinosine chains PL: Lambda Left promoter PR: Right promoter of lambda PtAc'Ptvc: )Synthetic promoter for the binding of liptophan to milk RNase: Riboformate degrading enzyme '3DS: Dodecyl sulfate group sodium S-D sequence: Shine-Dalgar Nor, sh 1ne-Da Igano] Sequence SH: Sulfhydryl TNF: 1111 necrosis factor X-gal: Bromo-chloro-indolyl-β-D-galactopyranoside YT: Yeast-tryptone growth factor 4,

[Brief explanation of the drawing]

＠１図は、ｐ３６０の構成図である。プラスミドｐ３６０は、Ｅ、ｃｏｌｉにおけるほぼ２２〜２３ＫＤａのタンパク質として、システィン７り一合成Ｔ　Ｌ− ６類似のペプチドを発現するように構成されたプラスミド発現ベクターである。オリゴヌクレオチド７３７　ＦＡＧＣＴＧＡ　ＴＴＡ　ＡＡＴ　ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＴＡＡ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　ＣＴＧ　Ｃ＾３′］及び７３８　［Ｇｃｃ　ＡＴＧ　ＧＴＴ　ＡＴＴ　ＣＣＴ　ＣＣＴ　ＴＡＴ　ＴＴＡ　ＡＴＣ３′］が融合され、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　５ｙｓｔｅｒａｓから購入した７アジミドであるｐＢＳ（＋）のＴ（ｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｐｓｔ　Ｔフラグメントで置き換えられ、ｐＢＳ０を形成した。ペプチド終止コドンを含有するプラスミドｐ３３７− １から合成システィン７リーＩＬ−６類似ペプチドに対する配列が、ｐＢＳ０のＮｃｏ　Ｔ−Ｅｃ。Ｒ１７ラグメントを置き換え、プラスミドｐ３６０を生成した。ｐ３６０において、ミニシストロン配列を介して及び合成システィンフリーＴ　Ｌ−６類似配列を介しての誘導性乳プロモータからの発現は、Ｅ、ｃｏｌｉのエキスにＩＬ−６の大きさのペプチドを生成できない（発現したタンパク質のゲルにつき第３図を参照）ＩＦ５図は、ｐ３６９の構造図である。ペプチド終止コドンを含有していない、プラスミドｐ３６５の合成システィン７リーＩ　Ｌ−６類似ペプチドの配列を含有している７ラグメントは、プラスミドｐ３６９を形成するために、（第１図に記載された）ｐＢＳ０のＮｃｏ　Ｉ−Ｂａｍ　Ｈｌフラグメントを置換したこの構造である。ここで、合成システィンフリーｒＬ−６１１似ペプチド配列は、β −ガラクトシダーゼのα−補体フラグメントに対するフレーム中で融合された。ｐ３６９の乳プロモータの誘導は、合成Ｉ　Ｌ−６類似ペプチドと、β−ガラクトシダーゼのσ−補体部分との間の融合生成物である検出可能なペプチドを生産できない（発現したタンパク質のゲルにつき第３図を見よ）。第３図は、合成システィン７リーＩ　Ｌ−６ペプチドの配列を含んでいるプラスミド構成の発現及び非発現である。異なるプラスミドを持っているＥ、ｃｏｌｉ細胞の培養液がＩ　ＰＴＧで誘導された。細胞培養液のサンプルが溶解され、５Ｄｓ−ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動された。このゲルは、タンパク質を目に見えるようにするために、コオマジーブルーで染められた。列ａ及びｂは、同一培養液の異なる管からの複製分別部分である。列１ａ及びｂは、プラスミドｐ３６９を有する細胞からのものである。予想されている誘導タンパク質は、β −ガラクトシダーゼのσ−補体部分及び合成Ｉ　Ｌ−６類似ペプチドの融合タンパク質である。その融合を表している大きな分子重量タンパク質は存在しない。列２ａ及びｂは、プラスミドｐ３６７すなわち、合成Ｉ　Ｌ−６類似ペプチド／コラーゲン／β−ガラクトシダーゼの融合生成物に対する好結果の発現ベクターを有する細胞からのものである。ゲルのおよそ！　３０　ｋＤＡ位置における多量の高分子重量融合タンパク質に留意されたい。２２〜２３μＤａすなわち非グリコジル化Ｉ　Ｌ−６の大きさのペプチドを生家すると予想された列３ａ及びｂは、プラスミド２３６０を有する細胞からのものである。矢印は予想される小さなペプチドの位置を示す。＄４図は、ｐ３４０−１の構成図である。ｐ３４０−１構成の工程については、５．２で述べる。オリゴヌクレチド２３７は、［ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＡＡＴ　ＡＣＧ　ＡＣＴ　ＣＡＣＴＡＴ　ＡＧＧ　ＧＴＡ　ＡＧＧ　ＡＧＧ　ＴＴＴ　ＡＡＣＣＡＴ　ＴＡＴ　ＧＧＡ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　３′］であった。オリゴヌクレチド２３８は、　ＦＧＡＴ　ＣＣＡ　ＣＡＴ　ＣＴＣＣＡＴ　ＧＧＴ　ＴＡＡ　ＡＣＣＴＣＣＴＴＡ　ＣＣＣＴＡＴ　ＡＧＴＧＡＧ丁ＣＧ　ＴＡＴ　ＴＡＧ　３’］であっに。オリゴヌクレオチド７０３は［Ｃ＾丁ＧＴＡ　ＴＣＧ　ＡＴＴ　ＡＡＡ　ＴＡＡ　ＧＧＡ　ＧＧＡ　ＡＴＡ　ＡＣＣ３’ｌであっｔ；。オリゴヌクレチド７０４は、ＥＣＡＴ　ＧＧＧ　ＴＴＡ　ＴＴＣＣＴＣＣＴＴ　ＡＴＴ　ＴＡＡＴＣＧ　ＡＴＡ　３すであった。Ｐ　ＴＲＣは、ハイブリッドプロモータトリプトファン／乳である。ｒＴｅ　ｒｍＪは、先行する開始メチニオニンフドンと同一の読取り枠内にある終止コドンを表す。ＡＰ、は、バクテリオ７アージ　ラムダからの右方向グロモータを表す。Ａｍｐ ’は、ｐＢＲ３２２からのアンピリジン抵抗標識を表す。Ｏｒｉは、ｐＢＲ３２２からのＤＮＡ複製のプラスミドオリジンを表す。β−ｇａｌは、Ｅ、ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子領域を表す。第５図は、合成組換体Ｔ　Ｌ　−６遺伝子及びその予測されたアミノ酸配列の完全ヌクレオチド配列（５’−３’）である。融合された遺伝子のコード配列は、ヌクレオチド３（Ｍｅｔ）で始まる。組換体Ｔ　Ｌ−６タンパク質のアミノ酸配列は、ヌクレオチド５５７（Ｍｅｔ）まで延び、そこで、それはセリン残基を介して融合タンパク質のコラーゲンリンカ−に融合される。＊印は、天然ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列において見いだされる。ＴＧＡ停止コドンの位置を示す。修飾アミノ酸残基は、その配列よりも下方箇所に示されている。第６図は、合成システィン７リーＩ　Ｌ−６類似ペプチドの遺伝子の集合である。合成オリゴヌクレチドは、アニーリングされ、連結されて合成遺伝子の４つの合成二重鎖サブフラグメントを形成する。ｐ３３３に含まれる挿入物は、２対の相補的オリゴヌクレチドを連結することによって形成された。ここで、それぞれは、内向きの５塩基５′相補的オ一バハング部を有する（図５のヌクレオチド５９−６３）。４１１１成ｐ３３４は、残基１６２−１６７及び２２０−２２５で結合された３対のアニーリングされたオリゴヌクレチドから構成された。ｐ３３１の組立てられた相補的オーバハング部は、ヌクレオチド３１２−３１５及び３５ｇ−３６１に位置していた。構成ｐ３３２は、位置４５７−４６１及び５１２ −５１７で連結された。合成７ラグメントは（斜線を引かれたボックスで示される）合成４−６塩基オ一バハング部経由で、環状ベクターの多重クローニング部位に挿入することによって、修飾されたｐＢＳＭ　ｌ　３　＋Ｓｔｒａｔｏｇｅｎｅベクター中にクローンされた。合成システィン７リーｒｔ−−６１１１似遺伝子のコード配列は黒で示されている。空白のボックスは、修ｆｌｐＢｓ　Ｍ１３＋配列を表す。７ラグメントは適当な酵素で消化し、アガロースゲルから電気溶出によって所望の結合を精製し、そして再び連結することによって、組み立てられた。ｐ３３７の終止コドンの除去は、セリン残基及び両立性Ｅｃｏ　ＲＩオーバハング部（Ｒｒ）を含有している第２合成７ラグメントを置き換えることによって行われた。構成ｐ３６５を得るためのこのフラグメントの連結は、他のＢｇ１１１部位の付加及びＥｃｏ　ＲＩ部位の喪失をもたらした。ヌクレオチド５６４は、ｐ３６５の挿入物を発現ベクターのコラーゲンりン力−と融合させるために必要なりｇ１１１部位に含まれた最終塩基の位置を特定する。制限部位は次のようにして特定される。すなわちＢ、Ｂａｍ　ＨＩ；Ｂｇ、Ｂａｌ　ＩＩ；ＲＩ、Ｅｃｏ　ＲＴ　；ＲＶ、Ｅｃｏ　ＲＶ；Ｈ，ＨｉｎＤ　ＩＩＩ：Ｎ、Ｎｅｏ　Ｉｔｓ、Ｓｔｕ　Ｉ；Ｘ、Ｘｂａ　Ｉ。第７図は、プラスミドｐ３６７の構成、すなわち合成システィン７リーＩ　Ｌ− ６ペグチドを調製するために好都合な発現ベクターを示す図である。ｐ３６７を構成する工程は、本文の５゜２、〜５．５．に説明されている。第８ａ図は、Ｔ　Ｌ−６配列（指定されたＨＳＦ）の位置を示す組換体プラスミドｐ３６７のプラスミドマツプである。（Ｎｃｏ　Ｉ−Ｂｇｌ　ＩＩ）挿入物に含有された組立て合成システイン７リー組換体ｒ　Ｌ−６遺伝子が、ベクターのＮｃｏ　ＩとＢａｍ　ＩＩ制限部位との間に導入された。空白のボックス（Ｃ）は、組換体Ｔ　Ｌ−６がβガラクトシダーゼに融合される所の６０アミノ酸コラーゲンリンカ−の配置を示す。完全融合遺伝子ノ発現は、１３０ｋＤａハイブリツドタンパク質を調製する。第８ｂ図は、合成システィン７リーＩ　Ｌ−６類似ペプチド（指定されたＨＳＦ）の配列位置を示している組換体プラスミドｐ３６７のプラスミドマツプである。示されたベクターは、本文５、で説明されているようにｐＪＧ２００の多大に修飾された変形例である。（Ｎｃｏ　Ｉ−ＢＧＩ　ＩＩ）挿入物に含有された組立て合成Ｉ　Ｌ−６類似遺伝子は、ベクターのＮｃｏ　ＩとＢａｍ　ＨＩ制限部位との間に導入された。空白のボックス（Ｃ）は、６０アミノ酸コラーゲンリンカ−の配置を示す。そのりンカーを介して合成Ｉ　Ｌ−６類似ペプチドがβ−ガラクトシダーゼに融合される。完全な融合遺伝子の発現は、およそ１３０ｋＤａのハイブリッドタンパク質を調製する（誘導されたＥ、ｃ。１１におけるプラスミドの発現につき第３図を見よ）。第９図は、合成システィン７リーＴ　Ｌ−６タンパク質精製のＮａＤ。ｄｓＯ，−ＰＡＧＥ分析である。精製の様々な段階で集められたサンプルは、図示の如く還元条件下で１０％ポリアクリルアミド−ＮａＤｏｄＳＯ，ゲルで電気泳動化された。タンパク質分子重量標識は、列Ｍに示されている。ＩＯＬバッチ培養液で成育されたＥ、ｃｏｌｉ細胞は、リゾチームを加えて溶解され、その後、簡単に音波処理された（列１）。普通でない疏水性融合タンパク質は、ＰＢＳ −５ａｒｋｏｓｙｌでの可溶化後に、硫酸アンモニウム沈降反応を繰り返すことによって精製された（列２）。その後、部分的に精製されｔ；融合タンパク質がコラ−ゲナーゼで消化され、２３ｋＤａ組換体ＴＬ−６成分を放出した（列３）。開裂した、可溶性β−ガラクトシダーゼの多くを４０％硫酸アンモニウムにおける沈降反応によって取り腺いた後、合成Ｔ　Ｌ−６が、硫酸アンモニウム濃度を７０％飽和まで増した上で、薄嗅としてほぼ均質の状態で回収された（列４）。逆相ＨＰＬＣが、精製の最終段階で使用された。タンパク質が、５４％アセトニリルで溶出されている単一ピークフラクションにおいて回収された（列５）。１１０図は、本文５．２．から５．８．に記載された方法によって作られた合成システィンフリー組換体！Ｌ−６によるフィブリノーゲン合成の刺激作用である。集密的ＦＡＺＡ細胞の単層が１０−’Ｍデキサメタシンの存在下で、精製された組換体システィン７リーＴ　Ｌ−６の濃度を！えて処理された。刺激作用の５時間後、細胞媒体が取り出され、ドツト・プロット装置を用いてニトロセルロース膜でフィルタにかけた。分泌フィブリノーゲンレベルは、−次抗体として多クローン性フィブリノーゲン抗血清を、そして二次抗体としてアルカリリン酸塩共役抗−ＩｇＧ抗血清を、それぞれ用いて、固相イムノアッセイによって判別された。墳界抗体は、色素基質（ＢＣＩ　Ｐ及びＮＢＴ）をプロットに加えることによって、目で観察された。分泌したタンパク質の濃度は、レーザデンジトメトリを走査し、精製ラットフィブリノーゲン基準の希釈度に対する信号強度の比較で決定されｔ二。第１１図は、Ｂ細胞鑑別定量法である。ＣＨ１２，ＬＸ細胞（２ＸＩＯ’細胞／ウエル）は、本文５．２．から５．８．に述べられる方法によって作られる、組換体合成システィン７リーＩＬ−８の種々の濃度での処理前に、抗ｊｌ［（ＳＲＢＣ）の存在下または不存在下で共に培養された。４８時間後に処理されたＣＨ１２，ＬＸ分別部分が、モルモット補体を含む５ＲＢＣの新たに洗浄された懸濁液と混合され、３７℃でインキュページ田ンするためにカニンガム室に移された。３０分後に、細胞は、室温に戻され、溶血ブレークが作れるようにされた。アッセイの結果は、（ｙ軸にＰｆｃとして示された）百万個の生きた細胞ごとにブレーク形成コロニーとして表される。正の刺激制御としてアッセイに含まれた細菌リポ多糖体は、ＩＯ，７２６ｐｆｃ／細胞百万個の応答をした。示された結果は、二重アッセイの平均値を表す。第１２ａ図及び第１２ｂ図は、ｐＴｒｐＥ／ＥＫ／ｃｆＩＬ−６の構成の概念図である。その構成の詳細は本文の５．１０゜１、で述べられている。第１３図は、様々な成長因子及びそれらの組合せによる前駆細胞の刺激作用についての時間−コロニーアッセイをグラフで示すものである。第１４図は、液体培養７日間経過後の非粘着性細胞の数である。このアッセイは、実施例１１に述べられている。第１５図は、？　ｔ　ｄ、１におけるイムクｏ　−７［ｔｍｃｌｏｎｅｌ対工ンドーゲン［Ｅｎｄｏｇｅｎｉ　Ｉ　Ｌ　−６である。第１６図は、７　ｔ　ｄ、１におけるイムクローン対ｂｍＴＬ−６である。第１７図は、７ｔｄ、１を用いているイムクローン対ゲンザイム’、Ｇｅｎｚｙｒｎｅ３　Ｔ　Ｌ　−６である。第１８図は、エンテロキナーゼ部位から、システィン７リーＩＬ−６のアミノ末端配列を介して、３つの停止コドンが続くＩＬ−６の天然カルボキシ末端までのｐＴｒｐＥ／ＥＫ／ｃｆＩ　Ｌ−６における配列である。５、発明の詳細な説明５．１．最初の発現構成細菌細胞内でインターロイキン−６の高レベルを発現させる最初の試みは、検出不可能か、または商業的に無効な量のタンパク質を製造する二とに終わった。商業的にも有用な量のタンパク質を製造する試みは、プラスミドｐ３６０の合成となった。この発現ベクターにおいては、ｐ３３７−１からの合成システィン７リーＴＬ− ６配列が、オリゴ７３７　［ＡＧＣＴＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＡｃｃＡＡｒＡＡｃｃＡＴｃｃｃｔｃｃ人−３゛３とオリゴ７３８　ＥＧＣＣＡＴＧＧＴＴＡＴＴＣＣＴＣＣＴＴ＾ＴＴＴＡＡＴＣ−３’　Ｅとの融合によって製造されたミニシストロン配列からのすぐ下流に挿入された。この構造では、合成ＩＬ−６ペプチドは１つの終止コドンを有しており、β−ガラクトシダーゼタンパク質には融合されていなかった。誘導は、非グリフシル化の合成Ｉ　Ｌ−６ペクチドを２２ＫＤａより僅かに多量に生成することが期待されていた。プラスミドｐ３６０の構造は図解的に第１図に示されているが、しかしながら、測長することは出来ない。ｐ３６０を有する細胞にＩ　ＰＴＧを加えることにより合成Ｉ　Ｌ−６ペプチｒの発現を誘導することは、検出可能なペプチドを何等生じなかった（第３図において、矢印箇所ではタンパク質が列３ａ、３ｂに欠落している）。同様に、第２図に示された構成のプラスミドｐ３６９を有する株の誘導は、ここでは合成Ｉ　１．−６に類似のペプチドがβ−ガラクトシダーゼのアルファー相補７ラグメントと共にフレーム内で融合されているが、何等の検出可能なタンパク質も生じなかった（＊３図の列１ａとｂを参照）。合成！Ｌ−６を製造しようとしたこれらの不成功であった試みは、以下に述べられる成功した合成システィン７リーＩＬ−６／コラーゲン／β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質（第３図の列２ａと２ｂにおける大量の１３０ＫＤａのタンパク質を参照）の製造と比較することができる。５．２．ＩＬ−６発現ベクターの構造５．２．１．最初のベクターｐＪＧ２００プラスミドｐＪＧ２００は、成功したＩ　Ｌ−６発現ベクターを製造するために修飾された出発物質であった。最初のプラスミドのｐＪＧ２００は、ターゲットのシストロンを含有しており、このシストロンが、正しい読み取りフレーム内で、タンパク分解酵素感応リンカ−ペプチドをフードするＤＮＡの一片を介して検出可能な活性を持つ標識ペプチドに融合された（Ｇｅｒｍｉｎｏ　ａｎｄ　Ｂａ５ｔｉａ、　１９８４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８１：４６９２：　Ｇｅｒｍｉｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　［］ＳＡ　８０：６８４８）。オリジナルのベクターｐＪＧ２００におけるプロモータはファージラムダのＰ、プロモータでありｌ＝。このプロモータに隣合ってｃ＋８５７不耐熱性抑制因子があり、リポソーム結合部位と７アージラムダのｃｒｏ遺伝子のＡＵＧイニシエータの二部連鎖とがこれに統いている。Ｇｅｒｍｉｎｏ　ａｎｄ　Ｂａ５ｔｉａはチキンｐｒｏ−２コラーゲン遺伝子の三重螺旋領域を含む７ラグメントを、正しい翻訳相においてコラーゲン配列が乳Ｚβ−ガラクトシダーゼ遺伝子配列に融合されたベクターを製造するために、ＡＴＧイニシエータの次のＢａｍ　Ｈ１抑制部位中に挿入した。１個のＢａｍ　Ｈ１抑制部位が再生され、そしてプラスミドＲ６に複製イニシエータタンパク質コード配列を挿入するｔ二めに使われｔ二。プラスミドｐＪＧ２００は、Ｒ６に複製イニシエータタンパク質を、ハイプリント融合生成物として発現し、続いてＣｌ８５７抑制因子を不活性にしてＰ、プロモータからの転写を始めることを可能にする温度変化が起こった。隣接してＡＴＧイニシエータを備えかつ７レームにおいてコラーゲン／β−ガラクトシダーゼ融合体（非挿入ベクター）を備えた親ベクター、と、Ｒ６に複製イニシエータタンパク質を含むｐＪＧ２００の双方力、フレームに８いてＡＴＧイニシエータコドン（５’　）、！：コラーゲン／β−ガラクトシダーゼ融合物（３’）（挿入ベクター）とに連鎖し、プラスミドによって変形された細菌細胞内でβ−ガラクトシダーゼ活性を生じる。その結果、挿入物と共にプラスミドを有する株は、挿入物を含まない親ベクターを有する株から区別することが出来ない。５．２．２．Ｐ、Ｃｌ８５７抑制因子とｃｒｏアミノ末端の除去本発明における最初のｐＪＧ２００の改造は、Ｐ、プロモータと、Ｃｌ８５７抑制因子と、融合タンパク質のＡＴＧ開始部位を提供するｅｒａタンパク質のアミノ末端とを有するＥｃ。ＲＩ−ＢａｍＨＩ７ラグメントを除去して置き換えることであった。オリゴヌクレオチドリンカーがｐ２５８プラスミドを製造するために挿入された。これは、Ｅｃｏ　ＲＩ部位を保持し、また、Ｎｃｏｌ、ＢｇｌｌｌそしてＢａｍ　ＨＴ抑制エンドヌクレアーゼによって認識される追加のＤＮＡ配列をもコードする。この変形により、コラーゲン／β−ガラクトシダーゼ融合を持つフレームから外れる新規なＡＴＧ開始コドンを提供した。結果として、ｐ２５８プラスミドで変形した細胞内では、β−ガラクトシダーゼ活性はない。加えるに、この変形によりｃｒｏタンパク質ア二アミノ末端去され、それ故、ＡＴＧ開始コドンに隣接して挿入されｔ；結果的に生成の如何なる組換え融合物も、それらのアミノ末端にｃｒｏをコードするアミノ酸を持たないようになる。反対に、オリジナルなｐＪＧ２００ベクターから発現された組換えタンパク質は、全てがｃｒｏをコードするアミノ酸をそれらのアミノ末端に持つことになる。５−　２−　３−　ｐｔＡｃプロモータ、５ｈｉｎｅ　Ｄａ１ｇａｒｎｏ配列及びＡＴＧコドンの追加Ｉ　Ｌ−６発現ベクターを構成する第２工程においては、プラスミドｐ２７７を製造するために、抑制７ラグメント、すなわちｐＫＫ２３３−２のＥｃｏ　Ｒ１−Ｎｃｏ　＋７ラグメント（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｍｉｌｖａｕｋｅｅ、　Ｗｌ）がプラスミドｐ２５８のＥｃｏ　ＲＩ−Ｎｃｏ　Ｉ抑制部位に挿入された。その結果ｐ２７７プラスミドはｐＫＫ２３３−２のＰ　ｙＡｃ　（Ｐ　ｔｉｃとしても知られている）プロモータと、１ａｃＺリポソ一ム結合部位と、そしてＡＴＧ開始コドンとを備えた。このｐ２７７プラスミドにおいて、ターゲットのタンパク質配列の挿入は、ＩＰＴＧを誘導することができるプロモータから適切な株を背景にその転写をすることを可能にする。この適切な株の背景が、誘導されていないＰ　ＴｋＣプロモータからの転写を禁止するに十分な乳抑制因子タンパク質を提供している。細胞は小量の化学物質ＩＰＴＧの添加によって誘導され得ることから、ｐ２７７プラスミドは、例えばｐＪＧ２００のＰ、プロモータのように誘導するのに温度変化を要求するプロモータに比べて十分商業的な利点を有する。温度誘導可能なプロモータを含む商業量の細胞培養の誘導は、さもなくば、誘導のために必要な熱変化を発生するため大量の細胞や媒体の加熱を要求する。例えば、Ｐ、プロモータによる誘導は、ｐＪＧ２００プロモータを禁止するＣｌ８５７抑制因子を不活発にするために、温度の変化を要求する。プロモータを変換することによる付加的な利益は、細胞が高温あるいは温度変化に１されないということである。高温あるいは温度変化は、熱シヨツク反応と、宿主タンパク質と同様に組換えタンパク質を低下させる能力のある熱ショック反応タンパク質分解酵素を生じる（Ｇｒｏｓｓｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　１９８４．　Ｃｅ１ｌ　３８：３８３；Ｂａｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８１：６７７９を参照）。５．２．４．リポソーム結合部位の改良ｐ２７７発現ベクターは、２９の塩基対を挿入することによってさらに変形された。すなわち、５゛ＣＡＴＧ丁ＡＴＣＧＡＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＡＧＧＡＡＴＡＡＣ３’をプラスミドｐ３４０を製造するためにｐ２７７のＮｃｏ　丁部位に挿入した。この配列は、ショックナーの「ミニシストロン」配列（本文２．５．１．に記載）の一部に関連している。もっともそれとは異なる。それらの２９の塩基対を含むことにより、リポソマル／　ｍ　ＲＮ　Ａ相互反応のための最適な５ｈｉｎｅ／Ｄａ１ｇａｒｎｏ部位を提供する。最後のｐ３４０ベクターは、商業的調製に必要とされる高生産性に適した、高度に誘導可能なプロモータを含み、そして、翻訳改良のための改良された合成リポソーム結合部位領域を有しており、そして、フラグメントを挿入するための可視的インジケータを提供することを意味していることから、ｐＪＧ２００とは十分に異なるものである。ベクターｐ３４０−１の構成における工程は＠４図に示す。５．３．インターロイキン−６の配列の変形合成システィン７リー組換えＴ　Ｌ −６の発現に使用されるコードの配列はヒトＩ　Ｌ−６のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列に基づいている。このコード配列は、１１対の相補的合成オリゴヌクレオチド対を用いて構成された。一方で、遺伝子のサブ７ラグメントの適当な組立を可能にし、他方で、その組立られｔ：遺伝子の効果的な発現を確保するために、幾らかの突然変異がオリゴヌクレオチド合成中に組換えＩ　Ｌ−６コ一ド配列中に誘導された。ヌクレオチド配列の修飾は、遺伝子のサブフラグメントを連鎖するために使用する新規な抑制部位を誘導するように設計されており、コード配列内に、天然のＩ　Ｌ−６タンパク質配列に関して合成遺伝子のアミノ酸組成を変えないように組み込まれた。この修飾は：ｉ）天然のＩ　Ｌ−６遺伝子内に通常見られる２８アミノ酸信号配列をコードする５゛末端１１８ヌクレオチドをメチオニンコドン（ヌクレオチド３−５）で置き換えること、ｉｉ）天然Ｉ　Ｌ　−，６タンパク質配列中の［Ｐｒｏ３残基を合成ＩＬ−６配列中の［Ｇ１ｙ！（ヌクレオチド６−８）で置き換えること、１ｉｉ）合成Ｉ　Ｌ　−６タンパク質のコラーゲンリンカ−との融合を行うため、通常ＴＡＧ停止コドンをセリンコドン（ヌクレオチド５５８−５６０）で置き換えること；そして、ｉｖ）ジスル７アイド結合を形成することができない合成Ｉ　Ｌ−６タンパク質を製造するために、４つの内向システィン残基をセリン（ヌクレオチド１３５−１３７，１５３−１５５．２２２−２２４．２５２−２５４）で置き換えることを含んでいる。修飾された合成システィンフリータンパク質の配列を第５図に示す。当業者であれば、合成ペプチドの配列における他の変形も本発明において有用であるということを認識するであろう。企図された発明は、ペプチド配列の他のアミノ酸、あるいは、ＤＮＡ配列の他のヌクレオチドの変形を含むものである。５．４．オリゴヌクレオチドの合成と組立合成オリゴマーの組立は３つの工程によって行われた。最初に、相補的オーバーハング部を持つオリゴヌクレオチドがアニーリングされ、そして、４つの別々の２重鎖７ラグメントを生成するために連結され、その１つは４つのオリゴヌクレオチド（ｌ鎖に２個）、他の３つは６個のオリゴヌクレオチド（ｌ鎖に３個）からそれぞれ構成された。組立前に、合成オリゴマーはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼのｌＯ単位でキナーゼ化された。連結反応中の連結を防止するため、いずれかの鎖の５°末端オリゴマーはリン酸化されなかった。これらの２重鎖オリゴヌクレオチドのサブセットは、４つのサブフラグメントを調製する！こめに個別のアニーリングと連結反応において組み立てられ、それぞれは、組換え合成システィン７リーＩＬ−６のコード配列の約１／４を成した。修飾されたプラスミドは、ＤＮＡの増幅を可能にし各オリゴマーの配列を蘭単にするように構成された。ｐＢＳ　Ｍ１３＋クローンベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）は２８塩基オリゴヌクレオチドアダプター（５°ＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＧＴＣＧＣＧＡＣ丁ＣＧＡＧＣＴＧＣＡ−３’　）をその複合クローニング領域のＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉ１１部位とＰｓｔ１部位との間に挿入することによって修飾された。その結果、企図されたｐ２８７である修飾プラスミドは、もはやその最初の５ｐｈ１抑制部位は含まず、Ｎｃｏ　Ｉ、　Ｎｒｕ　Ｉ、モしてＸｈｏ　Ｉの追加部位をコードする。合成オリゴマーは、ＤＮＡ増幅とジデオキシヌクレオチド配列化による配列照合１ｓａｑｕｅｎｃｅ　ｖｅｒｉｆｉｃａｆ−１Ｏｎ’ ４を可能にするため、変形されたｐＢＳ　Ｍ１３＋ベクターｐ２８７に個別にクローンされた。組立てられたフラグメントを変形されたベクターに挿入することによって、組換えプラスミドｐ３３３、ｐＢＳ４、ｐ３３１．モしてｐＢＳ２を製造し、それぞれは、それぞれアミノからカルボキシ末端に進化する合成システィン７リーＩ　Ｌ−６タンパク質フード領域の部分を含んでいた。連結反応に続いて、それぞれのプラスミドＤＮＡは、個別に、的確なＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩに変形された。組立の第２のステップは、アミノとカルボキシルを合成システィン７リーＩ　Ｌ −６の半分にコードする２つのベクターを構成することである。これらは、Ｎ− 末端コードベクターｐ３３６を製造するｐＢＳ３とｐＢＳ４の挿入を連結反応させることによって、そして、Ｃ末端コードベクターｐ３３５を形成するｐＢＳ２とｐ３３１の挿入物を結合することによって行われた。この構成の第３及び最終のステップにおいては、挿入物が次いで結合され、組換え合成システィン７リーＴ　Ｌ−６遺伝子の配列を完全にコードする。プラスミドｐ３３５から分離された挿入物は、ｐＢＳ６に連結反応させられる。結果として生じたプラスミドｐ３６５は、変形されたｐＢＳ　Ｍ１３＋ベクターｐ２８７のＮｃｏ１部位とＥｃｏ　Ｒ１部位との間に挿入された合成Ｔ　Ｌ−６の完全なコード配列を含んでいた。この構成は第６図に示されている。５．５９合成ＴＬ−６／コラーゲン／ β−ガラクトシダーゼ融合生成物を発現するｐ３６７ベクターの構成組立てられたシスティンフリー組換えＩ　Ｌ−６遺伝子は、ｐ３６５によって励起され、開始メチオニンを取り囲むＮｅｏ　１部位と、図７に示されたコラーゲンリンカ−に隣接するＢａｍＨ１部位との間でプラスミドル３４０中に挿入される。第８図に測長なしに概略図示されている結果として生じたベクターｐ３６７が、Ｅ、Ｃｏ１１　ＪＭＩＯＩを変形するために使用された。組換えコロニーは抗生物質の抵抗に基づき、Ｘ−Ｇａ１の存在下における青色着色現象によって選択された。挿入Ｄ　Ｎ　Ａのサイズは、ミニライゼート抽出によって確認され、次いでポリアクリルアミドゲルの電気泳動が行われた。合成システィン７リーＩ　Ｌ−６と、６０アミノ酸コラーゲンリンカ−と、モしてβ−ガラクトシダーゼとから構成される３部分から成る融合タンパク質が、形質転換された細菌内で製造された（第３図、第９図参照）。遺伝子配列から予測されたように、修飾ＩＬ−６発現プラスミドを有するアンピシリン耐性形質転換細胞が、誘導剤Ｉ　ＰＴＧと発色性β−ガラクトシダーゼ基質Ｘ−Ｇａ１との添加によって、青色コロニーを生じた。Ｉ　ＰＴＧ誘導形質転換細胞による融合タンパク質の合成は、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ社から得られるモノクロナール抗β−ガラクトシダーゼ抗体を使用してＥ、ｃｏｌｉライゼート全体のウェスタンプロット分析を行うことにより独立に確認された。ウェスタンプロットで使用されたこのモノクロナール抗β−ガラクトシダーゼ抗体は、見かけの分子重量１３，０００ｋＤａのバンドを認めた。５．６．修飾インターロイキン−６の融合タンパク質の大量誘導プラスミドｐ３６７を含む形質転換ＪＭＩＯＩが、Ｍａｇｎａｆｅｒｍ　ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＩＯＬバ７チ培養器内で膚冑された。細胞は、１００　ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含んだ２ｘＹＴにおいて成育され、５ｍＭのイソプロピルチオ−Ｂ−Ｄ− ガラクトピラノサイド（Ｉ　ＰＴＧ％Ｓ　ｉ　ｇｍａ）の添加によってＡ３５５ −１．５で誘導された。接種後８〜１２時間で、細胞数とβ−ガラクトシダーゼ活動が最大レベルに達し、細胞は５０００　ｘｇの遠心力でペレット化され、マイナス２０℃で冷凍され、必要となるまで保存された。５．７．融合タンパク質の精製冷凍されたＥ、ｃｏｌｉ細胞ベレットは、１００ｇ（含水重量）の分別部分に、ＴＮＳＮＳパー７７−　（３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ＣＩ、ｐＨ７，４：３０ｍＭ　ＮａＣ１，０，０５％ラウロイルサルコシンナトリウム）で洗浄することにより処理された。洗浄された細胞は、１．５ｍＭのＥＤＴＡと０　、５　ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含む４５０＋ｎ＋のＴＮＳ中で分離された。浮遊物を氷上で３０分インキユベーシゴンした後、完全な分離が、細胞を３サイクルの冷凍−溶解と短い音波処理とにさらすことによって確保された。β−ガラクトシダーゼ活性を剥奪された溶解性タンパク質は、ＴＮＳ中で３回繰り返して洗浄し、次いで２０分間の１０，０００　ｘｇの遠心分離にかけることで取り除かれた。約４０ｇ重量の最終ベレットは、１０％サルコシルの６０ｍ１中で再懸濁され、リン酸でバッファされたサリーン（ＰＢＳ）で２．４リツトルに希釈された。非溶融性物質は、遠心分離で取り除かれ、上澄みはリン酸アンモニウムの飽和溶剤に対して４０％に希釈された。抽出物を氷上で３０分培養しｔ；後、沈降したタンパク質は、再び遠心分離によって回収され、付加的な２度のリン酸アンモニウム沈降にさらされｔ；。最終抽出物は、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ＣＩ、　ｐＨ７，４と１５０ｍＭ　ＮａＣＩの２０ｍＭ中で再懸濁され、４ｍｌの分別部分に分けられ、マイナス２０℃で、次の処理の準備をするまで保存された。５．８．融合タンパク質の開裂と合成システィンフリーインターロイキンＩ　Ｌ −６の精製組み換え合成システィンフリーＩ　Ｌ−６タンパク質が、逆相のＨＰＬＣを使用して相同体へと精製された。溶解された抽出物（４ｍｌ）が、集合物を分散するために短く音波処理され、前処理されたコラゲナーゼに付加され、そして室温で４５５分間インキュページンされた。開裂されたβ−ガラクトシダーゼの大部分は、飽和したリン酸アンモニウムの０．５ボリユームを付加することによって取り除かれ、氷上で３０分間インキュベーションして非溶融性物質をペレット化した。開裂されｔ；組換えシスティンフリーＩＬ−６は、上澄みの全量を飽和したリン酸アンモニウムで１３ｍ１ｓにすることによって濃縮され、氷上で３０分間インキュベーションし、そして非溶融性タンパク質を浮遊薄膜に詰めるために遠心分離した。液体はチューブを破裂させることによって排水し、そして残った薄膜はＴｒｉｓバッフアサリーン０．５ｍ１ｓ中で再懸濁された。再懸濁されｔ；組換えシスティンフリーＩ　Ｌ−６が、６０％のアセトニトリルと、０．１％のトリフルオロ酢酸の等量を加えることによって、逆相ＨＰＬＣ用に準備された。非溶融性物質はペレット化され、澄んだ上澄みが２５０ｍｍ、４．６闘のＴＤ逆相コラム（Ｖｙｄａｃ、　２１８Ｔｐ、　ｃｌｇ、１０μｍ−Ａ１１ｔｅｃｈ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）上に、０．５から１ｍｌの注入体積で載せられた。移動相は、溶剤Ａ（０゜１トリフルオロ酢酸）に対して溶剤Ｂ（６０％のアセトニトリルと０．１％のトリフルオロ酢酸）の変化する濃度で構成された。流速は０−５ｍ１−’分で、５分間に２５％から８０％のＢへ、そして５４分で８０％から１００％のＢへ、２つの連続的な直線勾配をプリバーするようにシステムがプログラムされｔ；。５４％のアセトニトリルでコラムから溶解され単一のビーク留分に集められ！＝タンパク質は、精製された合成システィン７り −インターロイキンー６ペプチドであり、これは５ＤＳ−ＰＡＧＥに続いて２３ｋＤａで移動した。精製工程は第９図に示し、それぞれの工程で得られた生産物は表１に示す。・ト２３ｋＤａタンパク質の同一性を確認するため、ＨＰＬＣで精製された物質が、Ｎ−末端自動タンパク質配列を指示するようにされた。７凹の逐次分解［５ｅｑｕｅｎｔｉａｌ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ３後に特定されたアミノ酸残基（ＭＧＶＰＰＧＥＤ）は、合成組換えンステインフリ−Ｉ　Ｌ−６遺伝子から誘導された組換えタンパク質の予測されたＮ−末端アミノ酸成分と一致した。タンパク質配列の確認によって、その製品は末端メチオニン残基を持つ組換えシスティン７リーＩ　Ｌ−６タンパク質の小さなフラクシヨンを含有することが明らかにされた。ある実施例では、単離された活性７ラクシヨンが、アミノ末端メチオニン含有とアミノ末端メチオニン弗素をの合成システィン７リーＩＬ−６タンパク質の混合物から構成された。アミノ酸配列解析は、その混合物の１つの製品において、その混合物の９０％がアミノ末端でメチオニン非含有であり、１０％がアミノ末端メチオニンを含んでいることを示した。この実施例では、システィンフリータンパク質の活性標本は、次の点で天然ＩＬ−６とは異なる。ｌ）分子内ジスルヒド結合が発生せず、２）生物工学タンパク質において位置ｌにあるメチオニンアミノ酸が天然の処理されていないタンパク質の信号配列アミノ酸１−２８を置換し、３）生物工学タンパク質、すなわちグリシン内のアミノ酸２が天然のＩ　Ｌ− ６タンパク質内にあるプロリンアミノ酸を置換し、４）カルボキシ末端が、付加アミノ酸を含むことである。コラゲナーゼは一般的に配列Ｐ−Ｙ−Ｇ−Ｐ内のＹの後で開裂する。ここでＹは中性アミノ酸である。Ｋｅｉｌ等、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　５６：２９２− ２９６（１９７５）を見よ。ＩＬ−６配列を持つ融合タンパク質の本例では、Ｙによって表わされた中性アミノ酸は、バリンである。従って、コラゲナーゼを持つ融合タンパク質の消化後にｐ３６７ベクターによってコードされた融合タンパク質によって生成されたタンパク質のカルボキシ末端は、主に１９．。Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｖ−Ｇ−Ｐ−Ｖ及び／又は、、、Ｐ−Ｇ−Ｐ−Ｖであると思われる。もし充分なコラゲナーゼが充分に論理的条件下で存在する場合には、カルボキシ末端は１．、、Ｐ−Ｇ−Ｐ−■に違いない。もし、第５図における第３アミノ酸（すなわちＶ）で始まり、端部（すなわちＭ）から１４番目のアミノ酸で終わるアミノ酸配列がペプ（ｐｅｐ）と呼ばれるとすれば次のペプチドが本発明によって考えられる。Ｇ−ｐｅｐ−５ＤＰＧＰＶＧＰＶ　Ｃ９ンパク質工）Ｇ−ｐｅｐ−３ＤＰＧＰＶ　、　（タンパク質Ｉｆ）ＭＧ−ｐｅｐ−５ＤＰＧＰＶＧＰＶ　（タンパク質■ ）ＭＧ−ｐ　ｅ　ｐ−５ＤＰＧＰＶ　（タンパク質■）この標本は、本文の７．８及び９において述べられた実施例で使用されている。アミノ末端におけるメチオニンの有無、及びカルボキシ末端におけるＧ−Ｐ−Ｖの有無は、Ｉ　Ｌ−６の活性に影響しない。５．９９合合成システィン７リーＩＬ−６の代替製法前述した所は、本発明の合成システィンフリーＩ　Ｌ−６ペプチドが製造される有用な方法の唯一の特別な例である。しかし、当業者であれば、他の単細胞宿主と同様に他のベクター構造もまた本発明の方法で有効であることを認識する。一般的に言えば、例えば、専門家は、挿入した遺伝子の転写及び翻訳を得るために、その遺伝子は、選択された宿主細胞と両立し得るプロモータの制御下に置かれなければならないと認識するであろう。プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼが付加されて転写を開始するＤＮＡの領域である。選択されたプロモータは、宿主細胞生物から単離されたもののいずれの１つでもよい。例えば、通常使用される宿主系であるＥ、ｃｏｌｉは、それと関連したり、そのバクテリオファージと関連したり、あるいはそのプラスミドと関連する上ａＣ又はｒｅｃＡプロモータのような多数のプロモータを持っている。また、λ７アージＰＬ及びＰ８プロモータなどの合成又は組換え的に生成されたプロモータは、それに隣接するＤＮＡのセグメントの高レベル生成を指示するために使用することができる。また、類似のプロモータも、他の細菌及び真楼性細胞に特定された。遺伝子の充分な転写及び翻訳を達成するには信号もまた必要である。例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ　ｍＲＮＡでは、リボンーム結合部位は、翻訳開始コドン（ＡＵＧ又はＧＵＧ）及び１６ＳリポソームＲＮＡの３°末端の塩基に相補的な他の配列も含む。これら後者の配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏすなわち５−Ｄ）の蜆ツかは、Ｅ、ｃｏｌｉ及び他の適切な宿主細胞型において特定された。宿主細胞系と両立し得るいかなる５Ｄ−ＡＴＧ配列も採用り旦遺伝子又はＮ遺伝子の５Ｄ−ＡＴＧ配列、又はＥ、ｃｏ＋±トリプトファンＥ、Ｄ、Ｃ，Ｂ又はＡ遺伝子を含むが、それらに制限されるわけではない。ＤＮＡフラグメントを生体外でクローンベクターに挿入する方法は数多く存在する。ＤＮＡリガーゼは、二重ＤＮＡチェーンにおける隣り合うヌクレオチド間に単一鎖ニックを封する酵素である。この酵素は、従って、ある抑制酵素によって生成されたアニーリングした相補末端をしっかり継ぐために使用される。代替案として、ＤＮＡリガーゼが、プラントエンド７ラグメント間のホスホジェスタ結合の形成を触媒反応させるために使用され得る。最後に、酵素末端デオキシヌクレオチディル・トランスファラーゼが、７ラグメントの末端にホモポリメリック３′−単一鎖テールを形成するために採用され得る。オリゴ（ｄＡ）配列を１個体群の３′末端にそして複数のオリゴ（ｄＴ）ブロックを第２個体群の３′末端に加えることによって、２つの型の分子がアニーリングされ、ジメリックサークルを形成する。これらの方法のいずれも、レギュレータをベクターの特定部位に結び付けるために使用され得る。従って、システィン７り−又はシスティン含有のＩ　Ｌ−６融合タンパク質に対する配列コードは、ベクタープロモータ及びレギュレータに対して特別な関係で選択ベクターに結び付けられる。従つて、その配列は、ベクターＡＴＧ配列に関して正しい読み取りフレーム内にある。採用されるベクターは、典型的には、アンピシリン抵抗性又はテトラサイクリン抵抗性などの標識機能を有するもので、その結果、形質転換細胞を特定することができる。採用された方法では、公知の発現ベクター又はその誘導体のいずれかが用いられ、最も頻繁に使用されるものは、ｐＢＲ３２２゜ｐＡＣ１０５，ｐＶＡ　５．ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＫＨ４７゜ｐＡＣＹＣ１８４，ｐＵＢ　ｉｌｏ、ｐｍＢ９．ｐＢＲ３２５゜ｃｏｔ　Ｅｌ、ｐＳＣｌｏｌ、ｐＢＲ３１３，ｐＭＬ２１．Ｒ５Ｆ２１２４．ｐＣＲＩ又はＲｐ４などのプラスミドベクターか、あるいはラムダｇｔ１１．ラムダｇｔ−ＷＥＳ−ラムダＢ、チェーン２８．チェーン４．ラムダｇｔ−Ｉ−ラムダ　ＢＣ，ラムダ−ｇｔ−１ラムダ　Ｂ、Ｍ１３ｍｐ７．Ｍ　１３ｍｐ８．Ｍ１３ｍｐ９　；ＳＶ４０及びアデノウィルスベクター；そして酵母ベクターである。そのベクターは、選択した宿主細胞系との両立性で選択される。細菌、特にＥ、ｃｏｌｉは、合成Ｉ　Ｌ　−６ペプチドの高生産生成に非常に有効であり、好ましい宿主であることがわかったが、本発明はそのようなものに制限されるものではない。本発明では、宿主として、培養可能ないかなる単細胞生物も考慮している。例えば、酵母やインセクトなどの真核性宿主である。また、哺乳類細胞もＩ　Ｌ−６生成に対して有能な宿主である。宿主細胞の選択に基づいて、適切な発現系の選択が専門家の知識内で行われる。当業者であれば、ここに述べられた融合タンパク質の変形もまた可能であることがわかる。例えば、第１及び第３ペプチドの順序を逆にしても良い。その結果、第３ペプチドセグメントはアミノ末端に配置され、Ｉ　Ｌ−６活動を持つペプチドに対する配列コードは、カルボキシ末端にある。第２の開裂可能なペプチド部分は、それら２つのセグメントのリンクとして残されている。これらのセグメントのそれぞれの特定もまた変えられ得る。例えば、実質的な変形は、基本的なＴ　Ｌ−６ペプチド配列内部及びその周囲で可能である。特に興味ある観察は、アミノ末端の実質的部分が、活性を失うことなく、システィン含有及びシスティンフリーのＩ　Ｌ−６配列の両方の活性を結果として２−３７オールド増加した状態で、削除され得るということである。しかし、その配列における最終の２０残基の除去は、システィン７り−及びシスティン含有形とともに、活性の完全な喪失をもたらす。またＩ　Ｌ−６のカルボキシ末端上の付加アミノ酸残基の存在は、分子の生物的活動に影響を与えない、　ＩＬ−６の公知の配列のアミノ酸が、化学的に等価なアミノ酸で置き換えられ得ることは、当業者によって容易に理解され得る。換言すれば、全体として分子の活動に影響を与えることなく、「沈黙の変更」がアミノ酸配列になされ得る。例えば、示されたように、全てのシスティン残基セリン残基で置換することは、精製したＩ　Ｌ−６分子に生物的活動を保持させ得る。システィンに対する置換などの代替選択は、バリン、プロリン、インロイシン及びグリシン、セリン又はチロリンなどの他の中性アミノ酸である。例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸などの負に荷電した残基は、リシンやアルギニンなどの正に荷電した残基と同じように、相互交換可能である。トリプトファン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン及びアラニンを含んでいる疎水性残基もまた交換可能である。生物的活動が保持されるかどうかを決めるための結果としての分子の試験及びアミノ酸置換、削除、又は付加は、余計な実験を必要とせず、当業者の能力の範囲内で実施可能である。開裂リンカ−ペプチド配列の特定もまた、単なる設計事項であり、化学的、酵素的手段を用いて実行され得る。採用された配列は、化学的に開裂され得るところのものであり、Ｉ　Ｌ−６の生物活性を持つペプチドは、融合タンパク質の残部から解放され得る。好適な実施例では、開裂可能な配列は酵素的に分解可能［ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ］なものである。コラ−ゲナーゼ感受配列は、はんの−例である。他の部位は、エンテロキナーゼ−又は因子Ｘａ−開裂可能部位を含んでいるものである。例えば、エンテロキナーゼは、配列Ａｓ　ｐ−Ａｓ　ｐ−Ａｓ　ｐ−Ｌｙ　ｓにおけるリシンの後を開裂する。因子Ｘａは、配列１１ｅ−Ｇｌｕ −ＧＩｙ−Ａｒｇを有する部位、および、アルギニンの後の開裂に特異的である。その他の有効な開裂部位は、配列Ｌｅｕ−Ｖａ］−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ− ５ｅｒ−Ｐｒｏを認識するトロンビンの部位である。トロンビンは、ＡｒｇとＧｌｙの残基を開裂する。べつな酵素開裂可能部位もまた、臭化シアンによって開裂可能な部位を含むように選択され得る。臭化シアンは、ペプチド配列内のメチオニン残基をアタックする。不可欠ではない好ましいことは、開裂されるとき、Ｉ　Ｌ−６配列に付いている最小数の残基を残すリンカ−配列を選択することである。従って、解放されたＩ　Ｌ−６活性ペプチドの末端は、できるだけ未変性の配列に近い。ある実施例においては、ＩＬ−６活性部分が、融合タンパク質のカルボキシ末端の位置にある。また、開裂部位は、天然ｐｒｏ−ｖａｌ−ｐｒｏアミノ末端ペプチド配列を残し得るタンパク質分解酵素に対して特別効果がある。そのような開裂部位の例は、エンテロキナーゼによって開裂されるものである。第３ペプチド配列の特定法もまた種々ある。３部分構成のこの部分は、次ぎの２つの目的を果たす。（１）選ばれた宿主内に発現され得る正しく選択したタンパク質用途は、Ｉ　Ｌ−６活性を有するペプチドの生成を強いプロモータの制御下に置き、それらのペプチドの精製を容易にすること、及び（２）それは融合タンパク質を精製する変換クローンを特定するために便利な手段を提供し得る。例えば、上述の検討においては、β−ガラクトシダーゼをコードしている完全配列が使用された。このタンパク質は適当な基質を加えることによって、視覚検出できる手段を与える。代替案として、残っている部分が宿主細胞によって容易に発現される場合には、第３ペプチド部分は、そのようなタンパク質の７ラクシヨンであり得る。この部分は、また、必ずしも視覚的に検出可能である必要のないペプチドであり得る。しかし、その存在は、例えば、融合タンパク質の期待分子重量の計算又は検出可能なマーカをベクター内に挿入するなどの別の手段で検出され得る。原核性宿主内の使用に対する他の有用な代替配列は、ｔｒｐＥ遺伝子生成物、又はその部分である（Ｋｌｅｉｄ　ａｔａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　２１４：１１２５（１２９，１９８１）。付加選択は、ヒト細菌ウィルスのｃｒｏ遺伝子に対してコードする配列又はβ−ガラクトシダーゼに対してコードする１ａｃＺ配列よりはＩａｃ遺伝子の他の部分を含む。当業者であれば、請求の範囲に記載された融合タンパク質の第３ペプチド部分に対して基本を与える付加的選択を認識することができる。５、ｌＯ代替ＤＮＡ構成次の例は、３部分融合タンパク質の第１及び第３ペプチド部分の位置が逆転されているＤＮＡ構成の標本を示している。また、代替リンカ−及び第３ペプチド部分が表されている。この構成を用いているＩ　Ｌ−６タンバク質の生成量もまた大きなものであり、全可溶性細胞タンパク質の約１−２０％の範囲にある。５．１０．ｌ　ＴｒｐＥ−エンテロキナーゼ開裂部位−ＩＬ−６突然変異タンパク質融合タンパク質（ａ）酵素的開裂部位を従え、天然Ｉ　Ｌ−６ペプチドのＣ末端及びＮ末端部及びセリンによって置換された全４個のシスティンを有する合成Ｉ　Ｌ−６ペプチド配列を直後に従えた、ＴｒｐＥ遺伝子、アントラニレートシンターゼの生成をコードする融合タンパク質は、新しい組換えプラスミドｐＴｒｐＥ／ＥＫ／ｃｆＩＬ６によって発現される。ｐＴｒ　ｐＥ／ＥＫ／ｃ　ｆ　Ｉ　Ｌ６を製造するために、（本文５．５及び第６図に述べられた）プラスミドｐ３６５は、（５’Ｎｃｏ１部位から１４塩基を配置されているＥｃｏＲＩＩ部位を切るために）酵素ＥｃｏＲＩＩで、また（ＢｇｌＩＩ’　として第１３図に示されているＢｇｌｌｌを切るために）Ｂｇｌｌｌで消化される。プラスミドは、３７℃で２時間、１０＋ｕｇプラスミドについて５ユニツトの各酵素で消化される。０．４９２Ｋｂ　ＥｃｏＲＩＩ／Ｂｇｌ　１１７ラグメントは電子溶出などの標準手順によって隔離される。この０゜４９２Ｋｂ７ラグメントは配列Ａと呼ばれる。この配列Ａ及びこのセクションの次ぎのテキストに記される次の配列は、第１２図の説明を参照する。（ｂ）プラスミドｐ３６５の付加部分標本（約１０μｇ）は、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ、１００ｍＭ　ＭｇＣ１ｘ、１０ｍｇ／　ｍ　Ｉ　Ｂ　Ｓ　Ａ及び２ｍＭ　ＢＭＥのバッファにおいてｐＨ７゜５で、上述の如＜　Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌ及びＢｇｌｌｌで消化される。ＢｇＩ　１１’として第１３図において参照されたＢｇ１１１部位及び新規なＨｉｎｄｌ１１部位を切ることから生ずる大きな（３，０Ｋｂ）７ラグメントは、配列Ｂと呼ばれる。（Ｃ）合成二重−鎖オリゴヌクレオチド（配列Ｃ）が作られ、配列Ａ及び配列Ｂに結ばれる。オリゴヌクレオチドは、重なり合っているＨｉｎｄ　Ｉｌｌ及びＢｅ１１部位で開始し、天然Ｉｎ、−６の第１の３アミノ酸、Ｐｒｏ−Ｖａ　Ｉ− Ｐｒｏ　（ＰＶＰ）をすぐ後に従えたエンテロキナーゼ開裂部位を含んでいるアミノ酸の配列をコードし、ＥｃｏＲ１１部位で終わる。オリゴヌクレオチドの配列は、Ｂｅ１Ｉ　ＤＣ５ｉｔｓ５’ＡＧ　ＣＴＴ　ＣＡＴ　ＣＡに　ＧＣＧ　ＧＡ、Ｔ　ＣＣＧ　ＧＡＡ　ＧＧＴ　にＧ’ｌ’　ＡＧＣＱＣＣＡＣ（：ＡＣＱＣＡＡＡｓｌＡ　Ｃｕ　ｃｘｃ　ｃｃｃ　ＧＴＡ　ＧにＣｃｒｒ　ｃｃａ　ｃｃａ　ｘｃｃ　ｃｒｃ　ｃｒｃ　ｃｒｃ　ｃｔｃ　１ｒｎＰＶＰ３’ ＣＣＧ　Ｇｒｒ　ＣＣＧｃｃｃ　ＣＡＡ　ＧＯＣｃｃ’ｒ　ｃｃ　ｓ”Ｅｃｏ尺１１オリゴヌクレオチドの各鎖は、分離して作られ、３７〜Ｃで３０分間適切な反応バッファにおいて１ｍ　Ｍ　ｒ　Ａ　Ｔ　Ｐの存在でポリヌクレオチドキナーゼで処理され、８５〜Ｃまで５分間加熱してアニーりングされ、続いて２５〜Ｃまでゆっくり冷却される。配列Ｃを配列Ａ及びＢに結合させるため、およそ１Ｉｇの合成システィン７リーＩ　Ｌ−６ＥｃｏＲＴ　Ｉ／Ｂｇ　Ｉ　Ｉ　７ラグメント（配列Ａ）が、２００ｎｇの合成オリゴヌクレオチド（配列Ｃ）と共潤沈降反応させられ、そして、ｐ３６５のＨｉｎｄｌｌｌ／ＢｇｌｌＩベクター成分（配列Ｂ）に結合させられる。結合は、２０ｍＭ　Ｔｈ１ｓ　Ｈｃｌ、ｐＨ７，６，０，５ｍＭ　ｒＡＴＰ、ｌｏｍＭ　Ｍｇｃ１２．５ｍＭ　ＤＴＴを含有する２０μ１反応体積において、１６℃で夜通し実行される。新プラスミドはｐＡＢＣである。ｐＡＢＣは、反応混合物の５μｍ部分部分管応答能のあるＨＢ　Ｉ　Ｏ１細菌に加えることによってクローン化される。アンピシリン抵抗コロニーが、３７℃での夜通しのインキュベーション後に選択される。（ｄ）ｐ３６５において発現された組換え合成システィン７リーＩＬ−６遺伝子の３′端部は、メチオニンで終わるＩ　ｎ、−６カルボキシ末端をコードするために、再構成される。これを実行するため、次のオリゴヌクレオチドが上述の如く合成される。５’　ＧＡ　ＴＣＴ　ＴＴＣＡＡＡ　ＧＡＡ　ＴＴＣＣＴＧ　ＣＡＧ　ＴＣＣＴＣ（：　ＣＴＧ　ＣＧＴ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　Ｃ０丁３１　入　入入ＧＴＴτ　ＣＴＴ　λＡＧ　ＣＡＣＧＴＣ入ＧＧ　入ＧＧＧ入ＣＧＴλＣＧ入　ＣＡＣＧＣＡｃＡＧ　ＡＴＧ　ＴＡＡ　ＴＧλ、τ入Ｇ　ＧＴＡ　Ｃ３’ＧＴＣτＡＣ入ＴＴ　λＣＴ　入ＴＣ５’左から右へ読み比す、このヌクレオチドは、Ｂｇ１１１部位で始まり、３６５のＢｇｌｌｌ’に従うＩ　Ｌ−６の天然アミノ酸をコードし、そして３個の停止コドン及びＫｐｎＩ部位（配列Ｄ）をすぐ後に従えるメチオニン残基で終わる。（ｅ）　ｐＡＢＣ（ステップＣ）は、Ｈｉｎｄｌｌｌ及びＢｇｌｌｌ（配列Ｅ）で消化される。（ｆ）　（Ａ、　Ｔｚａｊａｌｏｆｆ、コロンビア大学、ニューヨーク市から出されている）ＰＴＨ２３は、Ｈｔｎｄｌ１１部位を含むポリアンカーに隣接しかつそれに関するその３°端部における読み出しフレームにある（アントラニレートシンターゼ成分）ＴｒｐＥのアミノ天端３３７アミノ酸をコードする遺伝子を含むアンピシリン抵抗プラスミドである。ＴｒｐＥオペロンは、Ｍｉｌｌｅｒ及びＲｅｚｎｉｋｏｆｆ、ｅｄｓ、Ｔｈｅ　０ｐｅｒｏｎ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。ｐｐ、２６３−３０２（１９７８）に見出される。ｔｒｐＥ及び１ａｃＺの全て又は一部をコードする他のＤ　Ｎ　Ａ源は、容易に利用可能である。そのような他のＤ　Ｎ　Ａ源は、例えばＰｏｕｖｅｓ等、　Ｃｌｏｎｏｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　１９８５に見出せる。例えば、ｔ　ｒｐＥ配列は、Ｐｒｏｖｅｌｓ等のマニュアル内の次の特定コードを有すプラスミドから分離され得る。二〇／１ｇＰＡＴＨ２３は、３７℃で２時間、それぞれ５ユニツトのＢｉｎｄｌｌ＋及びＫｐｎ　ｌで消化される。大きな７ラグメントは、ゲルクロマトグラフィ、次に電子溶出及びエタノール沈降反応によって分離される（配列Ｆ）。（ｇ）およそ２００ｎｇの配列りは、およそ１μｇの配列Ｅと混合される。その結果の混合物は、配列Ｆを存在させて、エタノールで共同沈降反応させられ、上述の如く結合される。その結果の７ラグメントは、ｐＴｒｐＥ／ＥＫ／Ｃｆ　ＩＬ−６と呼ばれる。（ｈ）応能力のあるＥ、ｃｏｌｉ宿主細胞は、ｐＴｒｐＥ／ＥＫ／ｃｆＩＬ−６で変換される。例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｈ８１０１菌株が、一実施例において変換用宿主細胞として使用される。アンピシリン抵抗コロニーが集められる。これらのコロニーは、ＴｒｐＥセグメント、エンテロキナーゼによって認識されかつ開裂されるアミノ酸セグメント、及びＰＶＰで始まりＭで終わっている、天然Ｉ　Ｌ−６のカルビキシ及びアミノ酸末端の双方にターミニ：ｔｅｒｍｉｎｉ３を有する合成システィンフリーＩ　Ｌ−６アミノ酸配列から成る融合タンパク質を発現する。５．１０．２　ベーターガラクトシダーゼ−エンテロキナーゼ開裂部位−合成システィン７り−Ｉ　Ｌ−６突然変異タンパク質融合タンパク質ＴｒｐＥエンテロキナーゼ−開裂部位合成システィン７り−ＩＬ−６融合タン融合タンパ酸質るための、５．１０．１に述べられたプロトコルは、ｐＥｘ−１ベクターがステップｆでＰＡＴＨ２３と置換されることを途いて、次の通りである。ｐＥｘ−１はＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで消化される。ＢａｍＨＩ及びＢｃｌＩは、両立し得る抑制部位を有する。結果としての構成は、クローニングポリアンカーを従えた熱誘導性β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む。切り取った遺伝子は、およそ４８Ｋｄのベータガラクトシダーゼタンパク質であるペプチドを生成する（ＳｔａｎｌｅｙＪ、に、及びＬｕｚｉｏ、Ｊ、Ｐ、、１９８４．ＥＭＢＯＪ、Ｖｏｌ、３．ｐｐ１４２９−１４３４）。結果としての構成は、ｐβｇａ　Ｉ／ＥＫ／ｃ　ｆ　Ｉ　Ｌ−６と呼ばれる。他のベータガラクトーゼＤＮＡ源は、５．２．１．で述べられたｐＨｇ２０００を含む。融合タンパク質は、ｐβｇａｌ／ＥＫ／ｃｆｌＬ　６及び熱誘導によって、Ｅ、ｃｏｌｉ薗株Ｎ９９において複製される。Ｎ９９及びＮ４８３０は、Ｐｈａｒｍａｃｉａから利用可能である。融合タンパク質は、公知の方法を用いてエンテロキナーゼによって開裂される。エンテロキナーゼで、エンテロキナーゼ認識部位を有するタンパク質を開裂することは、慣例的なやり方である。例えば、Ｈｏｐｐ等、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１２ｌ２Ｏ４−１２１０（１９８を参照。５．１０．３．因子Ｘａ開裂部位を持つ融合タンパク質因子Ｘａ部位は５．２０．１．及び２．のステップＣを調整することによってエンテロキナーゼ部位を置換される。５．１０．１゜のステップＣで示された合成オリゴヌクレオチド（配列Ｃ）は、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ａｓｐ、Ａｓｐ、ＬｙｓをコードするＤＮＡ配列から成る。このＤＮＡ配列は、因子Ｘａ開裂認識部位ＩＩｅ、Ｇｉｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇをコードするように調整される。その結果である構成は、ｐβｇａ　ｌ／Ｘａ／ｃ　ｆ　Ｉ　Ｌ−６と呼ばれる。プラスミドｐＴｒｐＥ／ＥＫ／ｃｆ　ＩＬ−６及びｐβｇａ　ｌ／Ｘａ／ｃ　ｆ　Ｉ　Ｌ−６は、５−１０−１−及び５．１０．２゜に述べられた如くに発現される。その結果である融合タンパク質は、因子Ｘａで開裂される。その因子は、公知の方法によってその認識部位内のａｒｇの後を開裂する。例えば、Ｎａｇａｌ＆Ｔｈｏｇｅｒｓｏｎ　、〜ａｔｕｒｅ　３０９：８１０−８１２（１９８４）。５．１ｔ、合成システィンフリータンパク質の活動分析５、ｉ　１．１．　肝細胞刺激分析ＦＡＺＡ　９６７ラツト肝細胞が、１０％ＮｕＳｅｒｕｍ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｓｅａｒｃｈ）、ペニシリン、及びストレプトマイシンで補足されたＤＭＥＭ／Ｆ　ｉ　２で成長された。分析は、４８ウエルグレート内で成熟された一日おいｔ；合流性単層上で実行された。５．２から５．８に述べられた方法によって作られるように、システィン７り一組換えＩ　Ｌ−６、及び他の調整媒体を用いて処理する前に、細胞が１０７Ｍデキサメタシンを含むセラムフリー媒体で洗浄された。処理された細胞は、次に分析の間甲セラムフリー／デキサメタシン媒体内に維持された。細胞は、細胞培養インキュベータ内で３７℃で５時間システィン７り一組換えｒ　Ｌ−６及び他の調整媒体を存在させて、インキュベートされた。処理後、細胞の上澄みが取り途かれ、−２０℃に保管された、すなわち次のごとくフィブリノーゲンに対して直接分析された。細胞上澄みの２倍の連続希釈液が、分割９６−ウニルマイクロタイタプレート内に準備され、ドツト−プロット装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、０．４５γｍニトロセルロースフィルタ上に点滴された。フィブリノーゲンのレベルは、固相酵素結合免疫学的検定によって決定された。フィブリノーゲンは、（スタッフォード大学、Ｃｒａｂｔｒｅｅ　Ｄｒ、Ｇｅｒａｌｄ　Ｒから入手した）ラビット抗−ラントフイブリノーゲンボリクローン抗血清の１：１０００希釈液を用いて検出された。第二次抗体は、親和精製アルカリ　リン酸塩−共役のやぎ抗−ラビット抗血清であった（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）。バウンド抗体は、基質二にローブルーテトラゾリウム（Ｎ　Ｂ　Ｔ）及び５−ブロモ− ４−クロロ−３−インドリル−リン酸塩、ｐ−）ルイジン塩（ＢＣＴＰ；Ｓｉ　ｇｍａ）を加えて、目に見えるようにされた。ＰＭＡから得られた上澄みで処理された細胞からなる正の制御は、ＭＲＣ−５繊維芽細胞を刺激した。分析の定量化は、レーザデンジトメトリを走査することによって実行された。ＣＶａｎ　５ｎｉｃｋ　像、Ｐｒｏｃ。Ｎａｔ’１．Ａｎｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ　８３：９６７９−９６８３．１９８６）において、ＩＬ−６配列からのアミノ酸残基の種々の欠失が試験された。表３は、組換えシスティン含有Ｉ　Ｌ−６（ｍｇｅ　ｎ）の等量と比較した百分率活動として表されたこれらの結果を示している。試験されたＩ　Ｌ−６配列は、全てシスティン含有のものである。プラスミドｐ４７８は、ｐ４７８においては、ＩＬ−６配列内のシスティンが置換されなかったということを途いて、プラスミドｐ３６７と同一のプラスミド構成である。Ｉ　Ｌ−６活性タンパク質７ラクシ望ンは、コラゲナーゼを有する融合タンパク質から切り取られたＩＬ−６ペプチド（表２におけるｒｐ４７８Ｊ分断）である。従って、試験された各欠失突然変異（ｍｕ　ｔ　ａ　ｔｉｏｎ）に対するこのペプチドフリクシコンは、ＩＬ−６ペプチド配列のカルボキシ端子に加えられた分離アミノ酸を有するシスティン含有Ｉ　Ｌ−６ペプチドの混合物である。さらに、試験されたタンパク質は、融合タンパク質自体（’ｐ４７８未分断」）である。ｐ４７８によって生成された野性型システィン含有天然Ｉ　Ｌ−６配列融合タンパク質は、コロニー（ｐ　ｆ　ｃ）を形成している鷹接溶血ブラックが決定された。５、１１．３　生体外骨髄分析５．２〜５．８で述べられた方法に従って作られた合成システィン７リーＩ　Ｌ −６もまた、技術的に認められた生体外の試験において、治療に対して有用性を持つことがわかった。骨髄細胞を取り扱ったフルオロウラシルに関するＩ　Ｌ− ６の効果に関するデルタ（Δ）分析では、合成システィンフリーＩ　Ｌ−６が、始原細胞に関して良好な刺激活動を有することが認められた。これらの分析に対するプロトコルは、第１ｍに見出せる。合成システィンフリーＩ　Ｌ−６が、ＩＬ−１と結合されるとき、さらにまた、これらの２つのシトカインがＭ−ＣＳＦ又はＩＬ−３のいずれか一方と結合されるときにも、特に効果的な刺激が観察された。Δ値を表に示したものが、表２である。時間−コロニー分析のグラフ表示が第１３図に示されている。５．１１．４　欠失突然変異の７７Ｄ１分析生物活動を定量化するためにＩ　Ｌ −６依存マウス雑種細胞株の増殖を用いている７ＴＤ１分析５．１１．２Ｂ細胞分化分析マウスのＢ−細胞り０−７ＣＨ１２，ＬＸ　（Ｎ”、ｄ”ＬＹ−１０）が成育され、５％の熱不活性の胎治性つシセウム、３０ＯＮｇ／ｍｌグルタミン、００４ｍＭ　２−メルカプトエタノール及びひつじの赤血球のホス７アチジルコリン成分（ＳＲＢＣ）に対して効果的な抗生物質ＣＨ１２，ＬＸ細胞ベアサーフイスＩｇＭを含有しているＲＰＭ１１６４０内に維持された。分化分析は、Ｃｏ５ｔａｒ　２４−ウェルプレート内の２ｍ１Ｂ−細胞媒体中で、５．２から５．８で述べた方法によって作られるように、種々の濃度の合成システィンフリーＩＬ−６の有無で２×ｌＯ″　Ｂ−細胞を培養することによって実行された。５ＲＢＣＣＡＳＡ　生物生成物、Ｅｉｎｓｔｏｒ−５ａｌｅｍ、ＮＣは、使用前にＲＰＭ１１６４０で３回洗浄された。ｌＸｌ０’赤血球が、各試験培養中に含まれた。５ＯＮｇ　／　ｍ　ｌのりポポリサッカリド（Ｄｉｒｃｏ）を用いている分裂促進因子−刺激されたＢ−細胞から成る正の制御が、５％ＣＯ８の雰囲気中で３７℃でインキュベートされた。ＣＨｉ　２　。ＬＸ培養内でそれから生成される正常されたシスティン含宵■Ｌ−６ペプチド（ｒ４７８４７８分断比較して、ＩＬ−６（３％活動）の生物活動を保持する。その４７８分断エプチド［ｅｐｔｉｄｅ］は、それに対して９個の欠失突然変異が試験され、それだけでも試験において１００％活性である。従って、表３では、４７８分断が、コラゲナーゼを有する融合タンパク質から開裂されたｒ　Ｌ−６をもった野性型プラスミド発現システィン含有Ｉ　Ｌ−６融合タンパク質を参照し、表３の４７８未分断は、未分断融合タンパク質を参照する。突然変異ＩＡＢは、ｍｅｔが第８ｂ図にある類似Ｉ　Ｌ−６システインフリーペプチドに対するペプチド配列のアミノ酸番号１であるシスティン含有ＩＬ−６ペプチド内で、アミノ酸４〜２３を欠失させることによって生成される欠失突然変異である。突然変異２ＡＢ、３ＡＢ他全てのものは、欠失されたアミノ酸残基と名付けられた第２欄で表３に特定されているように、その配列内の適切な位置にある対応する２０個のアミノ酸欠失を参照する。表２液体培養における　液体培養における相東作用コロニー刺激活動媒　体　ＩＬ−Ｉ　ＩＬ−６１Ｌ−１＋ＬＩ−６読出し値　読出し値　読出し値　読出し値Ｃ５Ａ　Ｃ５Ａ　Ｃ３Ａ　Ｃ５ＡＧ　Ｉ　Ｇ　５Ｇ　７Ｇ　１４９媒体　Ｍ　ｓＭ７Ｍ２Ｍ２７ＧＭ　Ｉ　ＧＭ　１５　ＣＭ　４　ＧＭ　３７ＩＬ−３１１Ｌ−３５ＩＬ−３１１Ｌ−３１５ｃｓｃ１９Ｇ１７Ｇ３４４Ｇ−Ｃ５ＦＭＩＭ７ＭＭ３Ｍ６５（Ｇ）　ＧＭ　Ｉ　ＧＭ　２５　ＧＭ　７　ＧＭ　５８ＩＬ−３１１Ｌ−３１１１Ｌ−３４１Ｌ−３２２ＧＩＣ１４０Ｇ３２Ｇ５１８Ｃ５Ｆ−Ｉ　Ｍ　Ｉ　Ｍ　２９Ｍ　２Ｍ　９７ＧＭ）ＧＭＩＧＭ４３ＧＭ９ＧＭ９９ＩＬ−３１ＩＬ−３２８ＩＬ−３３１Ｌ−３３７Ｇ　Ｉ　Ｇ　１２２Ｇ　３６２Ｇ　７０４ＧＭ−Ｃ３Ｆ　Ｍ　Ｉ　Ｍ　５５　Ｍ　１９　Ｍ　２３６（ＧＭ）　ＧＭ　Ｉ　ＧＭ　５４　ＧＭ　５３　ＧＭ　１５７ＩＬ−３１１Ｌ−３３４１Ｌ −３３７１Ｌ−３８５Ｇ　１４　Ｇ　５０９　Ｇ　１８６　Ｇ　１７８１Ｇ−Ｃ５Ｆ　Ｍ　１５Ｍ　２０８Ｍ　１３６Ｍ　６７５ＧＭ　１９　ｃＭ　１２９　ＧＭ　１３２　ＧＭ　４１５ＩＬ−３２４ＩＬ−３１０２ＩＬ−３６２ＩＬ−３１３１表３除去された　７ＴＤ１定量における突然変異名　アミノ酸残基　活動ＩＡＢ　４−２３　２８０％２ＡＢ　２４−４３　０．００１３ＡＢ　４４−６３　０．０００４ＡＢ　６４−８３　０．０００３５ＡＢ　８４−１０３　０．０００３６ＡＢ　ｌ　０４−１２３　０．００６７ＡＢ　１２４−１４３　（０，００００）８ＡＢ　１４４−１６３　（０，００００）９ＡＢ　ｌ　６４−１８３　（０，００００）４７８　切断　１００％４７８　非切断　３％６、実施例：材料と方法６．１　抑制酵素消化の条件酵素は、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓの市販品から入手し、製造元により指定された方法で、消化処理をおこなう。６．２　バクテリアの遺伝的傾向およびプラスミドＥ、　ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩ　（Ｐ−Ｌ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、論文（Ｈａｎｎａｎ　、　１９８３　、　Ｊ。ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　１６６、　Ｐ、５５７）に記載された方法で変換した。プラスミドｐＫＫ２３３−２は、Ｐ−Ｌ　Ｐｈａｒｍａｃｉａから得られる。プラスミドｐＢＳｔは、ストラドジーン（Ｓｔｒａｔｏｇｅｎｅ）から得られる。他のプラスミドの構成は、上記の論文に記載された通りである。６．３　オリゴヌクレオチド集合オリゴヌクレオチドは、ＣＨＤリン酸アミドとＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｉ。ｎｅｔｉｃｓ社のテトラシルとから合成した。オリゴヌクレオチドは、製造元（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）により指定された方法で、Ｔ４ポリヌクレオチド移転酵素Ｉこより移転された。移転は、６５℃に加熱することにより、止められた。オリゴヌクレオチドの混成物は、１５分間８５℃でアニーリング処理したのち、温度を室温にまで下げられた。アニーリング処理されたオリゴヌクレオチドは、＋０　Ｕ　Ｔ４リガーゼにより結合され、結合物は、６％のポリアクリラミドゲル中で分離され、分離後は、電気溶離によって回復された。６．４ＤＮＡ配列挿入されたフラグメントとオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は、Ｓａｎｇｅｒ他（１９７７、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｖｏｌ、７４　ｐ、５４６３記載）によるチェインターミネーション法（Ｃｈａｉｎ　丁ｅｒｍｉｎａｔｉ。ｎ　Ｍｅｔｈｏｄ）に、Ｂｉｇｇｅｎ他（１９８３，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｖａｔ。８０、　Ｐ、３９６３記１１りとＨａｔｔｏｒｉ、　５ａｋａｋａｊ（１９８６，Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。Ｖｏｌ、］５２．　ｐ、２３２記載）およびＢａｎｋｅｒ他（１９８８年出版、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｌｏｇｙ）の方法を改良して取り込むことによりめた。６．５　タンパク質プロット分析５０．１７Ｌ（７）細胞培養に等価なサンプルを、Ｌａｅｍｌｌｉ（１９７０，Ｎａｔｕｒｅ　Ｖｏｌ、２２７．　ｐ、６８０記載）の方法による条件を緩和したもののもとで、８％ＮａＤｏｄＳＯ４−ポリアクルラミドゲルに溶かしこんだ。ゲルのプロットを複製するために、ゲルは、クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ　Ｂｌｕｅ）で着色、あるいは、ニトロセルロースの２つの層の上での電気プロット法により処理された。あらかじめ１色された分子量マーカ（Ｂ　ＲＬ）を用いて、変換を観測した。ブロンドは、０．２５％のゼラチンで保護したのち、市販のβ−ガラクトシダーゼに対するＰｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃｂ社製造の抗体全製造て、インキュベート培養した。クロスリ　アクティングバンド（ｃｒｏｓｓ　ｒｅａｃｔｉｎｇ　ｂａｎｄ）は、ホスフェターゼを結合し、化学親和力を増した、７．５００倍希釈のＰｒｏｍｅｇａ　ＢｉｏｔｅｃＭ社製造のひつじ一抗マウスＩｇＧ抗血清により、可視化しＩ；。６．６　細胞の溶解と工性雑種アッセイ細胞の溶解は、Ｇｅｒｍｉｎｏ他（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　１９８３゜Ｖｏｌ、８０．　ｐ− ６８４８記１り）方法ニ基づキ実行シタ。Ｅ、ｃｏｌｉは、遠心分離により抽出し、セルベレットは、濃度０．０５ｍｏ１／Ｌ％ｐＨ８のトリ塩化水素と濃度０．０５ｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡと１ｍｇ／ｍ＋の比でリゾザイムを溶解した１５％サッカロースとを合わせた溶液甲に、溶液の１１５容積を占めるように浸した。室温で１５分間おいたのち、溶解物を一７０℃で凍結させ、急激に３７℃に温度上昇させた後、超音波を加えてＤＮＡ連鎖を切断した。三性雑種融合タンパク質をクロマトリックアッセイにより定量し、基盤に０−ニトロフェニール−β−Ｄ −ガラクトピラノサイドを用い、β−ガラクトシダーゼ活性をめた。６．７　融合タンパク質のコラゲナーゼ消化融合タンパク質の消化に先立ち、コラゲナーゼ調合試薬中のタンパク質加水分解活動を抑制するため、Ｌｅｃｒｏｉｓｅｙ他（１９７５゜ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　Ｖｏｌ、５９．　ｐ、１６７記載）の方法に従い、β　−ヒドロキシ−マークリベンゾエイトを加えた。Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　Ｉｏｐｈａｇｕｓ　（ＥＣ３，４−２４，８；　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）のコラゲナーゼ一単位を、ｐＨ７，４、濃度１００ｍＭのトリ塩化水素、濃度２５０ｍＭの塩化ナトリウム、濃度１ｍＭの塩化カルシウムおよび濃度４０μｇ／ｍｌのβ　−ヒドロキシ−マークリベンゾエイトに、緩衝剤ともに溶解した。溶解したコラゲナーゼは、容積１５ｍ１のシリコン塗布したポリプロピレン製チューブに移し、室温で３０分間培養した。溶解した細胞抽出液（４ｍｌ）に超音波を加え、一つ一つの細胞に分離し、溶解したコラゲナーゼに加え、室温でさらに４５分間培養した。開裂したβ−ガラクトシダーゼの大部分は、飽和硫化アンモニウムを容積の５０％加え、氷温で３０分間培養し、非溶解物質を凝集させることにより、途去された。開裂した組替え合成システィン７リーｒ　Ｌ−６は、うわずみ液に飽和硫化アンモニウム溶液１３ｍ１Ｓを加え、氷温で３０分間培養後、遠心分離により非溶解性のタンパク質を液表面に薄膜として浮遊させた。チューブ内の液体は、吸引して衆去し、残された薄膜を［Ｔｒｉｓ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ］塩０゜５ｍｌに浸した。７、実施例：肝細胞の刺激システィン７り一合成Ｉ　Ｌ−６は、パラグラフ５．２および５．８に記載された方法に従って調合すれば、図１１に示すように、肝細胞を刺激する。肝細胞に対する刺激力は、上述のパラグラフ５．９．２に記載された分析法に従って定量した。システィンフリー合成ＩＬ−６のもつ、肝細胞に対する刺激力は、その濃度が１０−８Ｍの時に起こり、その量は、１０４Ｕ／ｍｇである。この刺激量は、Ｍａｙ他（１９８８，Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　Ｖｏｌ、２６３゜ｐ、７７６０記載）による測定結果の１００倍である。我々のＦＡＺＡ細胞で観測された、フィブリノーゲン合成のレベルは、ＰＭＡ誘導の繊維芽細胞から得られた培養を用いた実験結果と同様である。１．ｕＭ以下の濃度では、ペプチドは、肝細胞数を減らす効果を与え、結果として、測定可能なフィブリノーゲンの量を減少させる作用をおよぼす。８、実施例：Ｂ細胞分化パラグラフ５．２および５．８に記載された方法に従って合成されたシスティン７リーＩＬ−６タンパク質の機能性を評価するための最も感度の高い方法は、Ｂ −細胞分化分析法である。溶血プラーク分析法は、合成Ｉ　Ｌ−６がＢ−細胞の甲でＩｇ分泌を誘発する力を評価するものである。溶血プラーク分析法は、細胞レベルで分化、増殖を調べる方法としては、優れたものである。（Ｇｒｏｎｏｗｉｃｚ他、　１９７６、　ＥＵＲ，Ｊ、　Ｔｍｍｕｎｏｌ、　Ｖｏｌ、６．　ｐ、５８８記載）。我々のタンパク質（合成ＩＬ−６）は、濃度的０゜ｌｏｇ／ｍ＋で、最大の刺激能力をもつことが、図１２に示されるように、判明した。この値は、自然の！Ｌ−６を用いた他の実験結果と同様な値である。他の実験結果は、以下文献に記載されている。（Ｖａｎ　５ｎｉｃｋ他、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｍａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。Ｖｏｌ、　８３．　ｐ、９６７９；　Ｂｒａｋｅｎｈｏｆｆ他＋　１９８７．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｖｏｌ、　１３９、　ｐ、４１１６；　Ｐｏｕｐａｒｔ他、１９８７．　ＥＭＢＯＪ、　Ｖｏｌ、　６．　ｐ、１２１９；　Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ、　１９８５．Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍ＋ｏｕｎｏ１．　Ｖｏｌ、３．　ｐ、１３３）　４３　ｐ　Ｍ以下の濃度では、合成されたシスティンフリーＩ　Ｌ−６は、分化するＢ−細胞の数を減少させる作用を及ぼす。９、実施例ニジスティンフリーＩ　Ｌ−６のもつ生物学的活性自然のシスティン７リーＩ　Ｌ−６タンパク質の３種類の異なった活性力をもつアッセイにより、システィン７リーＩ　Ｌ−６は生物学的活性力をもつことが判明した。本発明によると、ペプチド連鎖を活性形態にするために必要なのは、ペプチドの基本配列であることが示される。　ワクチンは、しばしば、各種のアジュバントの組合せの中で形成、増殖される。アジュバントは、免疫原を単独で用いた場合に比べ、より少量の抗原を用いてより高く長期間に及ぶ免疫効果を与えることを促す作用がある。アジュバントの作用機構は、複雑である。アジュバントの作用機構には、シトカインＩ　Ｌ−６のような細胞シトカインや、７アゴシトーシス（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓ　ｉｓ）の生成を促進する機構、その他線網内細胞の活動をはじめ、抗原の遅発や減成などが含まれる。アジュバントの例としては、Ｆｒｅｕｄアジュバント、Ａｄｊｕｖａｎｔ　６５　（ピーナツ油、マンニードモノオリエート［ｍａｎｎｉｄｅ　ｍ。ｎｏｏｌｅａｔｅ３とモノステアリン酸アルミを含む）や、リゾレシチン、プルロニツクボリオルスｊｐｌｕｒｏｎｉｃ　ｐｏｌｙｏｌｓ］、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジ２ンおよび水酸化アルミやリン酸アルミなどの金属ゲル等の表面活性物質がある。Ｆｒａｕｄアジュバントは、非代謝性鉱油を含み発癌性があるため、入用のワクチン材料としては今は用いられていない。本発明によるペプチドのような精製合成されたＩ　Ｌ−６は、免疫反応を変化させるため、すなわちアジュバントとして作用させるため、ワクチン原料に加えることができる。この免疫装置に用いられる生体は、マウス、ギニアビッグ、ウサギ、鶏、ウマ、羊、山羊、ウシ、チンパンジーやその他の霊長類やひとなとである。Ｔ　Ｌ−６などのペプチンを用いたアジュバントとしてのワクチンの生体内への注入は、経口、皮膚注射、筋肉注射、腹膜注射、静脈注射、皮下注射、鼻嗅やその他の免疫経路を通じて行なわれる。精製されたＩ　Ｌ−６活性ペプチドは、主免疫のための抗原として用いられ、ＩＬ−６単一クーロン性抗体を作る。このような抗体は、更に、Ｉ　Ｌ−６保有体として用いられ、免疫グロブリン生成における機能障害が起こっているような場合の装置に有効である。この機能障害には、多重性骨髄障害や自己免疫障害がある。−例として、上記の単一クーロン性抗体を関節注射して、リューマチ性の関節炎の治療に使用することが可能である。システィンフリーあるいは、システィン含有のペプチドのような精製された合成Ｉ　Ｌ−６は、適当な濃度に調整し、ほかの適切はシトカインペプチドやワクチンを加えて、一体化した薬剤として用いることが可能である。Ｉ　Ｌ−６活性をもつペプチドは、また、ワクチン材料のアジュバントやそれ自体を薬剤として用い、リポゾームの中に組み入れることも可能である。また、Ｉ　Ｌ−６活性をもつペプチドは、免疫治療に用いられる抗体に加えることも可能である。更に、他の実施例として、Ｉ　Ｌ−６活性をもつペプチドは、免疫刺激薬剤としても用いることが可能である。−例として、Ｉ　Ｌ−６活性をもつペプチドは、造血細胞の刺激や、特に、病気や薬あるいは放射線被爆による免疫不全の場合の細胞の抗体生成機能の活性化に有効である。また、これらのペプチドは、免疫機能不全状態にあるエイズ患者の治療にも有効である。また、肝機能の不全の場合の、肝性タンパク質の生成を促す効果もある。また、これらのペプチドは、体外で抗体を誘導するための試薬としても用いられたり、培養体の成長因子の特性を調整するためにも用いることが可能である。更に、他の実施例としては、これらのペプチドは、他の抗ビールス剤と組み合わせることにより、ＨＩＶやＨＢＶなどのウィルス性疾患の予防や治療に役立てることができる。更に、他の実施例として、ＩＬ−６活性をもつペプチドは、単独あるいはほかの精製されたシトカインと組み合わせて、白血病などの病気でＢ−細胞の分化を中断させるのに有効である。また、システィンフリーあるいは、システィン含有のペプチドのような精製された合成ＩＬ−６は、ペプチドの任意の部分に有効に作用する抗体を誘導する際にも、用いることが可能である。１０、実施例ニジスティンフリーＩ　Ｌ−６及び他の成長因子の生体内骨髄茎部細胞の増殖と分化に与える効果（デルタ分析）デルタ分析は、種々の成長因子により引き起こされる骨髄茎部細胞中の高増殖性固体群の発生の有無を確かめるために行なわれる。マウスには、増殖性ポテンシャルの低い細胞を消滅させるために、５７フ化ウラシルを投与する。高増殖性固体群の細胞は、成長因子のもとで、１２日間、第一の半固形アガロース培養体の中で培養される。成長因子は、インターロイキン−１（ｒＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及び、ＩＬ−１とｒ　Ｌ−６のｌ：１混合体である。ＢＭ茎部細胞は、他の成長因子が存在しない状態で、これらの成長因子のそれぞれのもとで成長し、さらに、白血球コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ５Ｆ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−Ｃ３Ｆ）　、出血Ｍマクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）８よびインターロイキン−３（ＩＬ−３）の成長因子の存在のもとでも成長する。これらの成長因子により増殖するコロニーの数は、二重層アガロースクローン定量分析法により定量測定され、第１６図では、 “初期コロニー分析”のデータで示されている。第１６図のグラフの縦軸は、マウスへの５７フ化ウラシル投与後２４時間後の、マウス骨髄細胞数２．３Ｘ１０５を１本位として、形成された全コ　ロニー数を示している。最初の４本の棒グラフデータは、他の成長因子が存在しない状態での、システィンフリーのＩＬ−１、Ｉ　Ｌ−６およびＩＬ−１とＩ　Ｌ−６のｌ：ｌ混合体の、コロニー増殖への効果を示している。次の、４本の棒グラフデータは、Ｇ−Ｃ５Ｆ単独、Ｇ−Ｃ５ＦとシスティンフリーのＩＬ−１、Ｉ　Ｌ−６８よびＩＬ＝１とＩ　Ｌ−６の１：１混合体との組合せの、４通りのコロニー増殖への効果を示している。更に、次の、３組の４本の棒グラフデータは、Ｍ−Ｃ９Ｆ％ＧＭ− Ｃ５ＦおよびＩ　Ｌ−６単独、Ｍ−Ｃ５Ｆ、ＧＭ−Ｃ５ＦおよびＩ　Ｌ−６とシスティンフリーのＩＬ−１、ＩＬ−６８よびＩＬ−１とＩＬ−６の１：１混合体との組合せの、１２通りのコロニー増殖への効果を示している。分析の結果、システィンフリーのＩＬ−ｉ、ＩＬ−６８よびＩＬ−１とＩ　Ｌ−６の１＝１混合体が、Ｍ−Ｃ３Ｆと組み合わされた時に、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−Ｃ３Ｆとの組合せ以上に、コロニー形成を促進することがわかる。分離分析では、高増殖性固体群細胞は、上記と同様の成長因子のもとでさらに液体培養体の中で、培養される。着性しなかった細胞の数を７日後に計数した結果を、第１５図に示す。第１５図では、′７＝間液体培養後の非着性細胞数”のデータで示されている。第′ｉ６ｍのグラフの縦−は、培養液１ｍｌあｔ；りの、全非着性細胞数を示している。最初の５組の４Ｘの棒グラフデータは、第１６図に示した“コロニー分析”の対応する棒グラフデータと点種の傾向を示している。全非着性細胞数の最大値は、ＩＬ−１とｒ　Ｌ−６の１：１混合体が、Ｉ　Ｌ −３、ＧＭ　−ＣＳ　Ｆ　８よびＭ−Ｃ５Ｆと組合せられた時に現われる。液体培養甲の細胞は、取り出し、洗浄され、再び、各成長因子のもとでＷｌ形アガロース培養体の中で培養され、二重層アガロースクローン定量分析法により定量測定される。この、第２回＝のアガロースクローン定量分析は、′読出分析“ と呼ばれる。デルタ値は、“読出分析”により計数された骨髄細胞コロニー数を、“初期コロニー分析“により計数された骨髄細胞コロニー数で割った値である。デルタ値の計算結果を、表２に示す。」　デルタ分析の結果は、“読出分析” に適用された各々の成長因子のうち、どの成長因子が液体培養の際に相乗効果をもたらすかを表している。液体培養を用いた場合には、コロニー形成を促進するために加えられたシトカインの効果は、ＩＬ−１またはｒＬ−６を単独に与えた場合よりも、ＩＬ、−１とＩ　Ｌ−６の１：１混合体を与えた場合に顕著に現われる。ＩＬ−１またはＩ　Ｌ−６を凰独に与えた場合よりも、ＩＬ−１とＩＬ− ６の１：１混合体を与えた場合に、シトカインの効果が顕著に現われることは、さらに、液体培養にＧ−Ｃ５ＦＳＧＭ−Ｃ５Ｆ、Ｍ−Ｃ５Ｆ８よびＩＬ−３を加えた場合に、相乗効果をもたらす。この相乗効果は、“読出分析”にＧ−Ｃ３Ｆを用いた際に、最も顕著に現われる。また、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３を液体培養口で、ＩＬ−１またはＩ　Ｌ−６と組み合わせて使用した場合には、Ｉ　Ｌ−６の方が、Ｉｒ−−１ｉ＝ｈべてより高いデルタ値をもたらす。しかし、Ｃ３Ｆ− １を液体培養甲で、■ＬｌまたはＩ　Ｌ−６と組み合わせて使用した場合には、ＩＬ−１の方が、Ｉ　Ｌ−６に比べてより高いデルタ値をもたらす。これらの分析結果より、ＩＬ−１とＩ　Ｌ−６の混合体を分離分析で液体培養口で、ＩＬ−３と組み合わせて使用し、読出分析では、Ｇ−Ｃ５Ｆを用いるのが最も最良の分析方法であると思われる。　以上の分析結果は、システィンフリーのＩ　Ｌ−６を他の成長因子と組み合わせて使用することが、骨髄移植やガン治療の際の、重要な手段となることを示している。高いデルタ値は、種々の成長因子のある組合せが、茎部細胞の増殖と消滅に結びつく可能住を示唆している。このような、成長因子の特徴は、生体口での骨髄の増殖と分化を制御するうえで必須な要件である。デルタ分析の手順１）ＢＤＦＩマウスに、体重ｉＫｇあたり１５０　ｍ　ｇの５７フ化ウラシルを投与する。２）５フツ化ウラシルを投与した２４時間後に、マウスを殺し、骨髄を取り出す。３）骨髄細胞を、２０％胎子ウシ血清（Ｆ　Ｂ　Ｓ）と抗生物質（ｇｅｎｔａｎｉｃｉｎ）を含むＩＭＤＭ溶液で洗浄する。４）骨髄細胞を、二重層アガロースクローン法で培養する。２０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ溶液の成長因子を、０．５％アガロース中の３５ｍｍ径のベトリ皿の上に、付着させる。骨髄細胞は、−皿あたり、Ｏ−５ｍＩｃｐに２．５Ｘ１０４から２Ｘ１０５の細胞数になるよう、層を重ねる。この方法が、“初期クーロン分析”である。細胞は、１２日間、約７％以下の酸素濃度中に、３７℃で保存する。５）骨髄細胞を、２４個の穴の開いたプレート上で、１ｍｌの液体培養（２０％胎子ウシ血清（Ｆ　Ｂ　Ｓ’）と抗生物質（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）を含むＩＭＤＭ溶液）中で増殖する。細胞を、１ｍｌあたり細胞数２．５Ｘ１０５を初期値として、７日間培養する。６）７日間培養後、非着性骨髄細胞のみを取り出す。細胞数を計数した後、：５ｙｔｏｓｐｉｎ］　１ａｉｒ置を施し、冷やしたＦＢＳ溶液５１で、不要な細胞を洗い流し、全ての成長因子を途去する。７）非着性骨髄細胞を希釈し、クローンアガロース培養に付着させる。培養体を、約７％以下の酸素濃度の十分湿った雰囲気中に、７日から１２日間、３７℃で保存する。この培養方法が、“読出分析”である。８）デルタ値を、“読出分析”により計数された骨髄細胞コロニー数を、“初期コロニー分析”により計数された骨髄細胞コロニー数で割った値としてめる。１１、例ニアｔｄ、１成育アッセイにおけるＩ　Ｌ−６の市販品との比較ｐ３６７を含む細胞から誘導された融合体を精製して得られたシスティンフリーＩ　Ｌ−６ペプチドの生物学的挙動は、７ｔｄ、１分析法を用いた市販品（流通試薬）のシスティン含有ＩＬ−６と比較されている。（Ｖａｎ　５ｔｉｃｋ他、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’ｌ。Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　Ｖｏｌ、８３．　ｐ、９６７９−９６８３）これらの市販品は、Ｅ。ｃｏｌ誘導型Ｉ　Ｌ−６を生み出す、ボーリンゲル　マンハイム、非岨換え生成物である工ンドーゲン及び、イースト誘導型Ｉ　Ｌ−６を生み出すゲンサイムである。細胞を含む誘導ｐ３６７から精製した、リンを緩衝剤として加えた塩中のシスティンフリー合成ペプチドを、ボーリンゲル　マンハイムのＩＬ−６，！− 比峻すると、ボーリンゲル　マンハイムのＩＬ−６は、ＩＩＥｌ　７１３Ｈに示すように、低濃度では、高い活性力を示し、一方、高濃度では、低い活性力を示す。最も高い活性力は、システイン７リー合ＩＲｒ　Ｌ−６が示す。システィン７り一合成Ｉ　Ｌ−６ペプチドとエンドーゲンのＩＬ−６とを比較すると、第１６図に示すように、システィンフリー合成ｒＬ−６ペプチドのほうが、分析されたＯ、ｌｎｇから５０ｎｇまでの全ての濃度にわたって、より高い活性力をもつことがわかった。同様に、システィン７り一合成ＩＬ−６ペプチドとゲンサイムのＩ　Ｌ−６とを比較すると、第１８図に示すように、システィンフリー合成Ｉ　Ｌ−６ペプチドのほうが、分析された０、１ｎｇから５０ｎｇまでの全ての濃度にわたって、より高い活性力をもつことがわかった。７ｔｄ、ｌ成長分析法の説明３．５０分析法は、９６個の穴をもつ培養プレートで行なわれる。ｒ　Ｌ−６の活性度をもつペプチドは、ＨＧＦ単位で計数される。１００ＧＦＨは、約Ｉ　ＰＣＴ−ＧＦ単位に相尚する。７ｔｄ、１特性をもつ約２０００の細胞を、５％−酸化炭素の高湿度雰囲気中で、Ｉ　Ｌ−６活注をもつペプチドの希釈液を含む培養液２００μｍの甲で培養する。８４時間経過後、４時間にわたり、テトラゾリウム塩（ｔｅｔｒａｚｏｒｉｕｍ　５ａｌｔ）３−　（４。５　ジメ　チルチアシル（ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ）−２ｙ　）　２　。５−ジメチル７オルマザン（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｚａｎ）プロミド（ｂｒ。ｍ１ｄｅ）　（Ｍ　Ｔ　Ｔ　）を注入し、５分間遠心分離後うわずみ液を取り出す。７オルマザン結晶をＤＭＳＯＩＯｏ　１μに溶解し、培養プレートを波長５７０ｎｍの光に投影する。反射光の強さは、生きている細胞の数に比例する。ＨＧＦ単位で測定されるＩＬ−６の量は、反射光の最大強度の５０％を与えるのに必要な希釈液の量の逆数の関係にある。７ｔｄ、１成長分析法の試薬希釈液は、１０％胎児性ウシセラムを含む、ＲＰＭＩ１６４０である。補助希釈液は、１０％胎児性ウシセラムを含む、ＲＰＭ１１６４０．０．１ｍＭの２−メルカト　エタノールｊｍｅｒｃａｔｏｅｔｎａｎｏｉ］と抗生物質を含む溶液である。ラベル試薬は、ＰＢＳｌｍＬにＭＴＴ　５　ｍ　ｇを溶解したものである。ＦＩＧ、　２特徴：ｔ？Ｃプロモータ　１〜２７５ミニシストロン　２７Ｇ〜：（０６組換えＩ＋、−Ｇ　：（ＯＧ〜１１６１コラーゲン　８Ｇ３〜１０４１１ＩＱ：：：ではｐ３６７配列の一部のみが示されている。ＦＩＧ、９Ｍｌ　２３４５ＭＦＩＧ、　１０゜工し−ら　櫃（力【　（ルＬン＆ｃＦＬ４−ｃ／２．うＸ１０”　＋１ｔｊｉ、＝ｒｎｐ１．　＞＜ｌｅｔ／ｂ ’）ｆｔ夕Ｆ々ｘ　ｉｏ−／４入フロ〜ン　ン償ＦＩＧ、　）５７　ｆｄ、　７　ｔ＝１．＋ｔａ　Ｂｈ　ｕ−ＩＦＩＧ、＋６国際調査報告ｔｘｔ＋ｍ＋ｍ＋＋＋＋＋　ａｓｓ工１ｈ６１、にゴ用郭９１０ξ２１ Figure @1 is a configuration diagram of p360. Plasmid p360 was introduced into E. coli. As a protein of approximately 22-23 KDa that synthesizes cysteine 6 is a plasmid expression vector constructed to express similar peptides. Oligonucleotide 737 FAGCTGA TTA AAT AAG GAG GAA TAA CCA TGG CTG C^3'] and 738 [Gcc ATG GTT ATT CCT CCT TAT TTA ATC3'] fused with 7azimide purchased from Stratagene 5ysteras. Replaced with T (ind III-Pst T fragment of a certain pBS(+)) to form pBS0. Plasmid p337-containing a peptide stop codon The sequence for the synthetic cysteine 7-ley IL-6 analog peptide from pBS0 Nco T-Ec. The R17 fragment was replaced to generate plasmid p360. p360 smell via minicistronic sequences and synthetic cysteine-free TL-6 analog sequences. Expression from the inducible milk promoter via the E. coli extract of IL-6 (See Figure 3 for a gel of the expressed protein.) reference) The IF5 diagram is a structural diagram of p369. does not contain a peptide stop codon, Synthesis of plasmid p365 containing the sequence of cysteine 7 Lee I L-6 analogous peptide. To form plasmid p369, the 7 fragments containing (see Figure 1) This replaced the Nco I-Bam Hl fragment of pBS0 (as described). It is a structure. Here, the synthetic cysteine-free rL-611-like peptide sequence is β - fused in frame to the α-complement fragment of galactosidase. Induction of the milk promoter of p369 was induced using synthetic IL-6-like peptides and β-galactin. Produces a detectable peptide that is a fusion product between the σ-complement portion of tosidase (See Figure 3 for the expressed protein gel). FIG. Expression and non-expression of mid configuration. E. coli carrying different plasmids Cultures of cells were induced with IPTG. A sample of cell culture medium is lysed and Electrophoresed in Ds-polyacrylamide gel. This gel contains protein To make it visible, it was dyed Coomassie blue. Columns a and b are Duplicate fractions from different tubes of the same culture. Columns 1a and b are plasmid From cells with p369. The predicted induced protein is β - A fusion protein of the σ-complement part of galactosidase and a synthetic I L-6-like peptide It's a good quality. There are no large molecular weight proteins representing the fusion. Columns 2a and b represent plasmid p367, i.e., synthetic IL-6-like peptide/ Successful expression vectors for collagen/β-galactosidase fusion products It is from cells with . Approximately of gel! 30 kDA position Note the amount of high molecular weight fusion protein. A peptide of the size of 22-23 μDa, i.e. non-glycosylated IL-6, was As expected, columns 3a and b are from cells with plasmid 2360. It is. Arrows indicate the predicted position of small peptides. Figure $4 is a configuration diagram of p340-1. Regarding the process of p340-1 configuration, 5. This will be explained in Section 2. Oligonucleotide 237 is [AAT TCT AAT AC G ACT CACTAT AGG GTA AGG AGG TTT AAC CAT　TAT　GGA　GAT　CTG　3′]. oligonucleotide 238 is FGAT CCA CAT CTCCAT GGT TAA AC CTCCTTA CCCTAT AGTGAG CG TAT TAG 3’] Oh ni. Oligonucleotide 703 is [C^Ding GTA TCG ATT AA A　TAA　GGA　GGA　ATA　ACC3'l;. oligonucle Chido 704 is ECAT GGG TTA TTCCTCCTT ATT TA It was ATCG ATA 3. PTRC is a hybrid promoter tree It is putophane/milk. rTe rmJ with the preceding initiation methinenymphdon Represents a stop codon that is in the same reading frame. AP represents the rightward glomotor from Bacterio 7Age Lambda. Amp ’ represents the ampyridine resistance label from pBR322. Ori is pBR32 Represents the plasmid origin of DNA replication from 2. β-gal is E, coli represents the β-galactosidase gene region. Figure 5 shows the complete synthetic recombinant TL-6 gene and its predicted amino acid sequence. Full nucleotide sequence (5'-3'). The coding sequence of the fused gene is Begins with nucleotide 3 (Met). Amino acid sequence of recombinant TL-6 protein The column extends to nucleotide 557 (Met), where it is linked via a serine residue. and then fused to the collagen linker of the fusion protein. *marked is natural cD Found in the NA sequence. The location of the TGA stop codon is shown. modified amino Acid residues are shown below the sequence. Figure 6 is a set of genes for synthetic cysteine 7 Lee I L-6 similar peptides. . The synthetic oligonucleotides are annealed and linked to form the four synthetic genes. Form synthetic duplex subfragments. p333 contains two pairs of inserts. formed by ligating complementary oligonucleotides. Here, each has an inward 5 base 5' complementary overhang (nucleotide 5 in Figure 5). 9-63). 4111 p334 contains residues 162-167 and 220-225. It was composed of three pairs of annealed oligonucleotides joined together. p33 The assembled complementary overhangs of 1 are nucleotides 312-315 and 3 It was located at 5g-361. Configuration p332 is located at positions 457-461 and 512 -517. The synthetic 7 fragment (indicated by the shaded box) is the synthetic 4-6 base monomer. by inserting into the multiple cloning site of a circular vector via the barhang region. and cloned into the modified pBSM13+Stratogene vector. was downloaded. The coding sequence of the synthetic cysteine 7 Lee rt--6111-like gene is shown in black. It is shown. Blank boxes represent modified flpBs M13+ sequences. 7 lugs The membrane is digested with appropriate enzymes and the desired conjugates are removed by electroelution from an agarose gel. assembled by purifying and religating. Termination of p337 Removal of the codon removes a serine residue and a compatible EcoRI overhang region (Rr). A second synthesis was carried out by replacing the containing 7 fragment. configuration p The ligation of this fragment to obtain 365 involved the addition of another Bg111 site and resulting in the loss of the EcoRI site. Nucleotide 564 is the insertion of p365 The g111 part is required to fuse the protein with the collagen phosphor of the expression vector. Identify the position of the final base included in the position. Restriction sites are identified as follows. . That is, B, Bam HI; Bg, Bal II; RI, Eco RT; R V, Eco RV; H, HinD III: N, Neo Its, Stu I; X, Xba I. FIG. 7 shows the structure of plasmid p367, i.e., synthetic cysteine 7-ly IL- FIG. 6 shows a convenient expression vector for preparing 6-pegtides. p367 The constituent steps are 5.2 and 5. of the main text. 5. is explained in. Figure 8a shows the recombinant plasmid showing the location of the TL-6 sequence (designated HSF). This is a plasmid map of p367. (Nco I-Bgl II) Assembled synthetic cysteine 7-ly contained in the insert The recombinant rL-6 gene is located between the Nco I and Bam II restriction sites of the vector. introduced in between. The blank box (C) indicates that the recombinant TL-6 is β-galactosida. Figure 2 shows the configuration of a 60 amino acid collagen linker as it is fused to the enzyme. complete fusion Gene expression produces a 130 kDa hybrid protein. Figure 8b shows the synthetic cysteine 7 Lee I L-6 analog peptide (designated HSF ) is a plasmid map of recombinant plasmid p367 showing the sequence position of . The vectors shown were derived from pJG200 as described in text 5. This is a modified example. (Nco I-BGI II) Groups contained in the insert The newly synthesized I L-6 analogous gene is inserted into the Nco I and Bam HI restriction regions of the vector. It was introduced between the Blank box (C) is 60 amino acid collagen phosphorus This shows the location of the car. Synthetic IL-6-like peptide is connected to β-glucose via the linker. Fused to lactosidase. Expression of the complete fusion gene is approximately 130 kDa Prepare a hybrid protein (induced E, c. (See Figure 3 for expression of plasmids in 11). Figure 9 shows the synthetic system 7 Lee T L-6 protein purification with NaD. dsO,-PAGE analysis. Samples collected at various stages of purification are shown in Figure 10% polyacrylamide-NaDodSO gel under reducing conditions as shown. migrated. Protein molecular weight labels are shown in column M. IOL badge E. coli cells grown in culture were lysed by adding lysozyme, and then , briefly sonicated (column 1). Unusual hydrophobic fusion proteins are - After solubilization with 5arkosyl, repeat the ammonium sulfate precipitation reaction. (column 2). The fusion protein is then partially purified. Digested with collagenase to release the 23 kDa recombinant TL-6 component (row 3) . Most of the cleaved soluble β-galactosidase was dissolved in 40% ammonium sulfate. Synthetic T was increased to 70% saturation and recovered in an almost homogeneous state with a faint odor (row 4). . Reversed phase HPLC was used in the final stages of purification. Protein is 54% acetonyl was recovered in a single peak fraction eluting with rill (column 5). Figure 110 is from text 5. 2. From 5. 8. synthetic made by the method described in Cysteine-free recombinant! This is the stimulating effect of fibrinogen synthesis by L-6. . A monolayer of confluent FAZA cells was purified in the presence of 10-'M dexamethacin. The concentration of recombinant cysteine 7-ley T L-6! and processed. Stimulant action 5 After an hour, the cell media was removed and the nitrocellulose was plotted using a dot plot device. filtered through a gas membrane. Secreted fibrinogen levels are roan fibrinogen antiserum and alkaline phosphate as a secondary antibody. determined by solid-phase immunoassay using anti-IgG antisera, respectively. Ta. Tombstone antibodies are produced by adding chromogenic substrates (BCIP and NBT) to the plot. Therefore, it was observed visually. The concentration of secreted proteins was determined by laser densitometry. and comparison of signal intensity against dilution of purified rat fibrinogen standards. Decided t2. FIG. 11 is a B cell differential quantification method. CH12, LX cells (2XIO' cells/ Well) is the main text 5. 2. From 5. 8. A set made by the method described in Anti-jl [(SR BC) were co-cultured in the presence or absence of. CH treated after 48 hours 12. The LX fractionated portion contains a freshly washed suspension of 5RBCs containing guinea pig complement. and transferred to the Cunningham chamber for incubation at 37°C. . After 30 minutes, cells were returned to room temperature and allowed to make a hemolytic break. a The results of the assay are expressed in blocks per million live cells (denoted as Pfc on the y-axis). Represented as rake-forming colonies. The sample included in the assay as a positive stimulus control. Fungal lipopolysaccharide gave a response of IO, 726 pfc/million cells. Results shown represents the average value of duplicate assays. Figures 12a and 12b are conceptual diagrams of the structure of pTrpE/EK/cfIL-6. It is. For details of its structure, see 5. It is stated in 10゜1. Figure 13 shows the stimulation of progenitor cells by various growth factors and their combinations. Fig. 3 is a graphical representation of the time-colony assay. FIG. 14 shows the number of non-adhesive cells after 7 days of liquid culture. This assay is , as described in Example 11. Figure 15 is? Imc o -7 [tmclonel vs. engineering in td, 1 It is Endogeni IL-6. FIG. 16 is immunoclone pair bmTL-6 at 7td,1. Figure 17 shows immunoclones using 7td, 1 versus Genzyme', Genzy. rne3　TL　-6. Figure 18 shows the amino terminal of cysteine 7-ley IL-6 from the enterokinase site. through the end sequence to the natural carboxy terminus of IL-6 followed by three stop codons. This is the sequence in pTrpE/EK/cfI L-6. 5. Detailed description of the invention 5. 1. Initial expression configuration Initial attempts to express high levels of interleukin-6 within bacterial cells This resulted in producing quantities of protein that were either impossible or commercially ineffective. quotient Attempts to produce commercially useful amounts of the protein involved the synthesis of plasmid p360. became. In this expression vector, the synthetic cysteine 7-ley TL- 6 sequences are oligo737 [AGCTGATTAAAATAAGGAccAArA AccATccctcc person-3゛3 and oligo738 EGCCATGGTTAT Mini manufactured by fusion with TCCTCCTT^TTTAATC-3'E It was inserted immediately downstream from the cistron sequence. In this structure, the synthetic IL-6 peptide has one stop codon, and the β-galactosidase protein has a fusion. It was not matched. Induction of non-glyphsylated synthetic I L-6 peptide at 22 It was expected that it would be produced in slightly larger amounts than KDa. plasmid p360 The structure is shown diagrammatically in Figure 1, but it is not possible to measure the length. stomach. Synthetic I L-6 peptide can be produced by adding I PTG to cells with p360. Inducing the expression of Chir did not result in any detectable peptide (Fig. 3). , proteins are missing from columns 3a and 3b at the arrow points). Similarly, the induction of a strain carrying plasmid p369 with the configuration shown in FIG. Now, synthesis I1. A peptide similar to -6 is present in the alpha phase of β-galactosidase. Although fused in frame with the complement 7 fragment, it does not contain any detectable tampering. No thickening was observed (see columns 1a and b in Figure 3). Synthesis! These unsuccessful attempts to produce L-6 are discussed below. Successfully synthesized cysteine 7-ly IL-6/collagen/β-galactosidar fusion protein (large amount of 130 KDa protein in rows 2a and 2b of Figure 3). (see quality). 5. 2. Structure of IL-6 expression vector 5. 2. 1. The first vector pJG200 plasmid pJG200 was successfully This was the starting material modified to produce the IL-6 expression vector. the first The plasmid pJG200 contains the target cistron; The strone is inserted into the proteolytic enzyme-sensitive linker peptide in the correct reading frame. fused to a labeled peptide with detectable activity through a piece of DNA that hoods the peptide. (Germino and Ba5tia, 1984. 　Proc, Natl, Acad, Sci, USA 81:4692: Germi no et al., 1983. Proc, Natl, Acad, S et, []SA 80:6848). To the original vector pJG200 The promoter used is the P promoter of phage lambda and l=. This promoter Adjacent to the c+857 thermostable suppressor, there is a liposome-binding site and a 7-arge This is connected to the AUG initiator bipartite chain of the lambda cro gene. Germino and Ba5tia is a chicken pro-2 collagen gene. 7 fragments containing the triple helical region, the collagen sequence is milked in the correct translation phase. To produce a vector fused to the Zβ-galactosidase gene sequence, A inserted into the Bam H1 repression site next to the TG initiator. 1 Bam H 1 repression site is regenerated and plasmid R6 is loaded with a replication initiator protein cofactor. t2 is used to insert the code array. Plasmid pJG200 contains replication initiator protein in R6 and hyperpurin Cl857 repressor is subsequently inactivated to generate P, protein. A temperature change occurred that allowed transfer from the motor to begin. Adjacent to AT Collagen/β-galactosidase with G initiator and in the 7 frame the parent vector with the fusion (non-insertion vector) and the replication initiator in R6. Bilateral power of pJG200 containing protein, 8 in frame and ATG initiator taco Don (5’),! : Collagen/β-galactosidase fusion (3’) (insert vector) and β-galactin in bacterial cells transformed by the plasmid. Generates tosidase activity. As a result, strains carrying the plasmid along with the insert cannot be distinguished from strains with a parent vector that does not contain the vector. 5. 2. 2. P, Cl857 inhibitor and removal of cro amino terminus The first modification of pJG200 in the present invention was to modify P, the promoter, and the Cl857 repressor. regulatory factor and the amino acid of the era protein that provides the ATG initiation site for the fusion protein. Ec with a terminal end. The RI-BamHI7 fragment was removed and replaced. Oligonuku A leotide linker was inserted to produce the p258 plasmid. this is, Retains the Eco RI site and also contains Ncol, Bgll and Bam HT inhibitors. It also encodes additional DNA sequences that are recognized by the regulatory endonuclease. child deformation causes the collagen/β-galactosidase fusion to fall out of frame. provided a novel ATG initiation codon. As a result, the p258 plasmid is transformed There is no β-galactosidase activity in these cells. In addition, this transformation The cro protein is diamino-terminal and therefore adjacent to the ATG start codon. inserted t; any resulting recombinant fusions have c at their amino terminus. It no longer has the amino acid encoding ro. On the contrary, the original pJG All recombinant proteins expressed from 200 vectors encode cro. They will have amino acids at their amino termini. 5-2-3-ptAc promoter, 5hine Dalgarno sequence and and addition of ATG codon In the second step of constructing the IL-6 expression vector, To produce plasmid p277, the suppressor 7 fragment, pKK23 3-2 Eco R1-Nco +7 Ragment (Pharmacia Bio chemicals, Milwaukee, Wl) of plasmid p258. It was inserted into the EcoRI-NcoI suppression site. As a result, p277 plasmid is the PyAc (also known as Ptic) promo of pKK233-2. data, a 1acZ liposome binding site, and an ATG initiation codon. In this p277 plasmid, insertion of the target protein sequence is carried out by IP Its transcription in an appropriate strain background from a promoter capable of inducing TG. and make it possible. This appropriate strain background will allow the uninduced PTkC promoter to The protein provides sufficient milk repressor protein to inhibit transcription from the protein. The cells are p277 plus, as it can be induced by the addition of small amounts of the chemical IPTG. Mid, for example, P of pJG200, induces temperature changes like the promoter. It has significant commercial advantages over demanding promoters. temperature inducible promo Induction of cell cultures in commercial quantities containing Requires heating of large amounts of cells and media to generate For example, P, promoter induction of pJG200 inactivates the Cl857 repressor, which inhibits the pJG200 promoter. In order to do so, a change in temperature is required. An additional benefit of converting the promoter is that cells are exposed to high temperatures or changes in temperature. This means that it will not be 1. High temperatures or temperature changes can cause thermal shock reactions and Heat shock reaction capable of reducing recombinant proteins as well as host proteins produce proteolytic enzymes (Grossman et al., 1984. Ce1l 38:383; Baker et al., 1984. 　Pro c, Natl. Acad. Sci. 81:6779). 5. 2. 4. The p277 expression vector with improved liposome binding site has a 29 base pair was further modified by inserting . That is, 5゛CATG ATCG ATTAAAATAAGGAGGAATAAC3' to produce plasmid p340. It was inserted into the Nco site of p277 in order to This arrangement is based on Shockner's "Minicistron" sequence (Main text 2. 5. 1. (described in ). More It is different from that. By including those 29 base pairs, liposomal/ Provides optimal 5hine/Da1garno site for mRNA interaction do. The final p340 vector is suitable for the high productivity required for commercial preparation. , contains a highly inducible promoter, and has an improved synthesis for improved translation. has a synthetic liposome binding site region and for inserting fragments. pJG200 and are sufficiently different. The steps in the construction of vector p340-1 are shown in Figure @4. 5. 3. Variant synthesis of interleukin-6 sequence Cysteine 7 Lee recombination TL The sequence of the code used for the expression of IL-6 is the cDNA sequence of human IL-6. Based on. This coding sequence encodes 11 pairs of complementary synthetic oligonucleotides. It was constructed using On the other hand, it allows for the proper assembly of sub7 fragments of the gene. , on the other hand, in order to ensure effective expression of the assembled t:gene, some Mutations were introduced into the recombinant IL-6 code sequence during oligonucleotide synthesis. It was. Nucleotide sequence modifications to link gene subfragments It is designed to induce novel suppression sites for use, and is designed to induce novel suppression sites for use within the coding sequence. Do not change the amino acid composition of the synthetic gene with respect to the natural IL-6 protein sequence. It was incorporated into the sea urchin. This modification: i) is normally found within the natural IL-6 gene The 5'-terminal 118 nucleotides encoding the 28 amino acid signal sequence were replaced with methionine. (nucleotides 3-5), ii) natural IL-,6 tan Synthesize the [Pro3 residue in the IL-6 protein sequence with the [G1y! (nucleochi 6-8); 1ii) synthetic IL-6 protein collagen; To perform fusion with a linker, the TAG stop codon is usually replaced with a serine codon (nucleonin). 558-560); and iv) disulfide bond. In order to produce a synthetic IL-6 protein that cannot form a The inward cysteine residues are serine (nucleotides 135-137, 153-155. 222-224. 252-254). qualified The sequence of the synthetic cysteine-free protein is shown in FIG. A person skilled in the art can synthesize It is recognized that other variations in the sequence of peptides are also useful in the present invention. will. The contemplated invention is that other amino acids in the peptide sequence, or Other nucleotide variations of the NA sequence are included. 5. 4. Oligonucleotide synthesis and assembly Assembly of synthetic oligomers involves three steps. Therefore, it was done. First, an oligonucleotide with complementary overhangs is annealed and to generate four separate duplex 7 fragments. connected, one of which has 4 oligonucleotides (2 in the l strand), the other 3 with 6 oligonucleotides (3 in the l chain). Before assembly, The oligomers were kinased with 10 units of T4 polynucleotide kinase. To prevent ligation during the ligation reaction, the 5°-terminal oligomer of either chain is phosphoric acid. was not converted into A subset of these double-stranded oligonucleotides consists of four Prepare buff fragments! Assembled in separate annealing and ligation reactions. each containing approximately the coding sequence of recombinant synthetic cysteine IL-6. Achieved 1/4. The modified plasmid allows the amplification of the DNA and the unique sequence of each oligomer. configured to do so. pBS M13+ clone vector (Strage ne) is a 28 base oligonucleotide adapter (5°AGCTTCCATG GTCGCGAC-CGAGCTGCA-3') and its composite cloning region modified by inserting between the Hind I11 site and the Pst1 site of It was done. As a result, the modified plasmid, which is the intended p287 Does not include the first 5ph1 repression site, Nco I, Nru I, and Xho I Code additional parts of. Synthetic oligomers are used for DNA amplification and dideoxynucleoly Sequence verification by sequencing 1sequence verificaf-1On' 4 into the transformed pBS M13+ vector p287. Loaned. Inserting the assembled fragment into the transformed vector Recombinant plasmids p333, pBS4, p331. and pBS2 each is a synthetic system that evolves from an amino to a carboxy terminus. It contained part of the protein food region of In7LeI L-6. Following the ligation reaction and each plasmid DNA was individually isolated from the correct E. coli JMIO It was transformed into I. The second step of assembly is to synthesize amino and carboxyl cysteine 7 Lee IL - Construct two vectors that code for half of 6. These are N- The inserts of pBS3 and pBS4 were ligated to produce the terminal encoding vector p336. pBS2 and forming the C-terminal encoding vector p335. and p331 inserts. In the third and final step of this construction, the insert is then ligated and the recombinant It completely encodes the sequence of the synthetic cysteine TL-6 gene. Plasmi The insert separated from p335 is ligated into pBS6. As a result The resulting plasmid p365 is a modified pBS M13 + vector p287. Complete synthesis of synthetic T L-6 inserted between Nco1 site and Eco R1 site of It contained a code sequence. This configuration is shown in FIG. 5. 59 Synthetic TL-6/Collagen/ β-galactosidase fusion product Construction of p367 vector for expression The assembled cysteine-free recombinant IL-6 gene is stimulated by p365. Neo 1 site raised and surrounding the starting methionine and the collagen shown in Figure 7. inserted into plasmid 340 between the BamH1 site adjacent to the linker. Ru. The resulting vector p367 is schematically illustrated without length measurements in FIG. was used to transform E, Co11 JMIOI. The recombinant colony Based on antibiotic resistance, selection is based on the blue coloring phenomenon in the presence of X-Ga1. selected. The size of the insert DN A was confirmed by minilysate extraction; Polyacrylamide gel electrophoresis was then performed. Synthetic cysteine 7-ly I L-6, 60 amino acid collagen linker, and A three-part fusion protein consisting of β-galactosidase and produced in transformed bacteria (see Figures 3 and 9). Prediction from gene sequence Ampicillin-resistant transformation with modified IL-6 expression plasmids as described The cells were treated with the addition of the inducer I PTG and the chromogenic β-galactosidase substrate X-Ga1. Upon addition, blue colonies were produced. I Synthesis of fusion proteins by PTG-induced transformed cells was performed using Promega Using monoclonal anti-β-galactosidase antibody obtained from Biotec by Western blot analysis of the entire E. coli lysate. It was confirmed exactly. This monoclonal anti-β-ga used in Western blots. For the lactosidase antibody, a band with an apparent molecular weight of 13,000 kDa was observed. . 5. 6. modified interleukin-6 Large-scale induction of fusion proteins Transformed JMIOI containing plasmid p367 was transformed into Magnaferm fer Using mentor (New Brunswick 5 scientific) The IOL was placed in an incubator. Cells were treated with 100 ug/ml ampicillin 5mM isopropylthio-B-D- A355 by the addition of galactopyranoside (I PTG% Si gma) -1. It was induced at 5. 8-12 hours after inoculation, cell number and β-galactosidase When the activity reaches maximum level, the cells are pelleted by centrifugation at 5000 x g and The samples were frozen at 20°C and stored until needed. 5. 7. Purification of fusion proteins The frozen E. coli cell pellets were divided into 100 g (wet weight) fractions. TNSNS Par77- (30mM Tris, CI, pH7,4:30mM By washing with NaCl (1,0,05% sodium lauroylsarcosine) It has been processed. The washed cells were prepared by 1. 5mM EDTA and 0, 5mg/ml was isolated in 450+n+ TNS containing lysozyme. floating matter on ice After incubation for 3 minutes, complete separation of cells was achieved by 3 cycles of freeze-lyse. ensured by short sonication and exposure. β-galactosidase activity The stripped soluble proteins were washed three times in TNS and then washed for 20 It was removed by centrifugation at 10,000 x g for minutes. Approximately 40g weight The final pellets were resuspended in 60 ml of 10% Sarkosyl and buffered with phosphoric acid. 2. on Saleen (PBS) which was offered. Diluted to 4 liters. non-melting substance is removed by centrifugation, and the supernatant is dissolved in a saturated solvent of ammonium phosphate at 4% Diluted to 0%. The extract was incubated on ice for 30 min; after which the precipitated proteins were , recovered by centrifugation again and subjected to two additional ammonium phosphate precipitations. I was forced to;. The final extract was mixed with 20mM Tris, CI, pH 7.4 and 150 Resuspend in 20mM of mM NaCI, divide into 4ml aliquots, Eggplants were stored at 20°C until ready for further processing. 5. 8. Fusion protein cleavage and synthesis cysteine-free interleukin IL -6 purification Recombinant synthetic cysteine-free I L-6 protein using reverse phase HPLC and purified into homologs. The dissolved extract (4 ml) disperses the aggregates. Add to the pretreated collagenase, sonicate briefly, and at room temperature. Incubated for 455 minutes. Most of the cleaved β-galactosidase is 0.0% of saturated ammonium phosphate. It can be removed by adding 5 volumes. Remove and incubate on ice for 30 minutes to pellet unmelted material. Ta. cleaved; recombinant cysteine-free IL-6 saturated the entire volume of supernatant. Concentrate by making 13mls with ammonium phosphate and keep on ice for 30min. incubate and transport the non-melting proteins into a floating film. The heart was separated. The liquid drains by bursting the tube and the remaining thin The membrane was Tris-buffered Atherene 0. Resuspended in 5mls. Resuspended; recombinant cysteine-free IL-6 was dissolved in 60% acetonitrile. And 0. for reverse-phase HPLC by adding an equal volume of 1% trifluoroacetic acid. was prepared. The non-melting material is pelletized and the clear supernatant is 250 mm, 4 ．． 6-way TD reversed phase column (Vydac, 218Tp, clg, 10μm-A 11tech As5ociates), 0. Load with an injection volume of 5 to 1 ml. I was forced to do so. The mobile phase was a mixture of solvent A (0°1 trifluoroacetic acid) and solvent B (60° % acetonitrile and 0. 1% trifluoroacetic acid) Ta. The flow rate was 0-5 ml min, from 25% to 80% B in 5 min, and 54 From 80% to 100% B in minutes, to pre-bar two consecutive linear gradients The system is programmed. Dissolved from the column with 54% acetonitrile Collected into a single beak distillate! = Protein is purified synthetic cysteine 7 - interleukin-6 peptide, which was subjected to 5DS-PAGE followed by 23 It migrated in kDa. The purification process is shown in Figure 9, and the products obtained in each process are shown in Figure 9. is shown in Table 1. ·to To confirm the identity of the 23 kDa protein, the HPLC purified material was The N-terminus was made to automatically indicate the protein sequence. Sequential decomposition of 7 concave [5eq Amino acid residues (MG VPPGED) is derived from the synthetic recombinant protein free-I L-6 gene. The results were consistent with the predicted N-terminal amino acid composition of the recombinant protein. protein Sequence confirmation indicates that the product is a recombinant cysteine 7 with a terminal methionine residue. It was revealed that it contains a small fraction of L-6 protein. Ta. In some embodiments, the isolated active 7-lactone contains an amino-terminal methionine. Synthesis of amino-terminal methionine fluoride cysteine 7-ley IL-6 protein mixture composed of things. Amino acid sequence analysis shows that in one product of the mixture, 90% of the mixture is amino-terminated and methionine-free; 10% is amino-terminated and methionine-free. It was shown to contain methionine. In this example, cysteine-free tan The active preparation of protein differs from natural IL-6 in the following respects. l) Intramolecular disulfide 2) the methionine amino acid at position l in the bioengineered protein amino acid replaces the signal sequence amino acids 1-28 of the natural, unprocessed protein. , 3) bioengineered protein, i.e. amino acid 2 in glycine is the natural IL- 6) Substitute the proline amino acid in the protein, and 4) add the carboxy terminus. Contains amino acids. Collagenases generally cleave after the Y in the sequence PYGP. Here Y is It is a neutral amino acid. Keil et al., FEBS Letters 56:292- See 296 (1975). In this example of a fusion protein with the IL-6 sequence, Y The neutral amino acid represented by is valine. Therefore, it has collagenase. The fusion protein encoded by the p367 vector after digestion of the two fusion proteins. The carboxy terminus of proteins produced by proteinaceous proteins is mainly 19. . It appears to be P-G-P-V-G-P-V and/or, P-G-P-V. . If sufficient collagenase is present under sufficiently logical conditions, carboxylic acid The terminal end is 1. ,,It must be P-G-P-■. If the 3rd amino acid in Figure 5 Begins with an acid (i.e. V) and ends with the 14th amino acid from the end (i.e. M) If the amino acid sequence is called pep, then the following peptides are That's what I can think of. G-pep-5DPGPVGPV C9 protein engineering) G-pep-3DPGPV , (Protein If) MG-pep-5DPGPVGPV (Protein ■ ) MG-pe p-5DPGPV (Protein ■) This specimen is described in 7. of the main text. 8 and 9. Presence or absence of methionine at the amino terminus and G-P-V at the carboxy terminus The presence or absence of IL-6 does not affect the activity of IL-6. 5. 99 Synthetic Synthetic Cystine 7-Lee IL-6 Alternative Manufacturing Method Only one special feature of the useful method by which the synthetic cysteine-free I L-6 peptide is produced. This is an example. However, those skilled in the art will appreciate that other vector constructs as well as other unicellular hosts can be used. It is recognized that the methods of the present invention are also useful. Generally speaking, for example, specialized In order to obtain transcription and translation of the inserted gene, the gene is selected. recognize that the protein must be placed under the control of a promoter that is compatible with the host cell. There will be. A promoter is a region of DNA where RNA polymerase is added to initiate transcription. be. The selected promoter is any one isolated from the host cell organism. Any time is fine. For example, the commonly used host system, E. coli, is associated with associated with that bacteriophage, or associated with that plasmid. It also has a number of promoters, such as the aC or recA promoters. Ma In addition, synthetic or recombinantly produced promoters such as the λ7age PL and P8 promoters Romota directs high-level production of segments of DNA adjacent to it It can be used for. Similar promoters are also found in other bacteria and bacterial cells. was identified. Signals are also required to achieve sufficient transcription and translation of genes. For example, E , coli mRNA, the ribbonome binding site is located at the translation initiation codon (AUG or GUG) and other sequences complementary to the 3° terminal base of 16S liposomal RNA. include. What is the origin of these latter sequences (Shine-Dalgarno or 5-D)? , E. coli and other suitable host cell types. host cell system and both Any possible 5D-ATG sequence can be used to create the 5D-AT of the 1st gene or N gene. G sequence, or E, co+±tryptophan E, D, C, B or A genes. , but not limited to them. There are many methods for inserting DNA fragments into cloning vectors in vitro. Ru. DNA ligase binds between adjacent nucleotides in a double DNA chain. It is an enzyme that seals single-strand nicks. This enzyme is therefore inhibited by certain inhibitory enzymes. Used to firmly splice the generated annealed complementary ends. Alternative proposal As a DNA ligase, the phosphogesta link between the plant-end 7 fragments can be used to catalyze the formation of compounds. Finally, the enzyme terminal deoxynucleotide leotidyl transferase is homopolymeric at the end of the 7-ragment. It can be employed to form a 3'-single stranded tail. One oligo (dA) array at the 3' end of one population and multiple oligo(dT) blocks at the 3' end of a second population. By adding , the two types of molecules are annealed and form a dimeric circle. form a le. Both of these methods target the regulator to a specific site on the vector. Can be used for tying. Therefore, cysteine 7- or cysteine-containing The sequence code for the IL-6 fusion protein of bound to the selection vector in a special relationship to the regulator. Therefore, that The sequences are in the correct reading frame with respect to the vector ATG sequence. Adopted The vectors used are typically ampicillin-resistant or tetracycline-resistant. As a result, transformed cells can be identified. Ru. The method employed uses either known expression vectors or derivatives thereof. and the most frequently used ones are pBR322゜pAC105, pVA　5 ．． pACYC177, pKH47゜pACYC184, pUB ilo, pmB 9. pBR325゜cot El, pSClol, pBR313, pML21. R5F2124. Plasmid vectors such as pCRI or Rp4, or Muda gt11. Lambda gt-WES-Lambda B, chain 28. Chain 4. La Muda gt-I-Lambda BC, Lambda-gt-1 Lambda B, M13mp7. M 13mp8. M13mp9; SV40 and adenovirus vector; and It is a yeast vector. The vector is selected for compatibility with the chosen host cell system. It will be done. Bacteria, especially E. coli, are not capable of producing high yields of synthetic IL-6 peptide. Although always found to be effective and preferred hosts, the present invention It is not limited to. In the present invention, any culturable cell can be used as a host. Cellular organisms are also considered. For example, eukaryotic hosts such as yeast and insects. Mammalian cells are also competent hosts for IL-6 production. Host cell selection Based on this, the selection of an appropriate expression system is done within the knowledge of an expert. Those skilled in the art will appreciate that variations of the fusion proteins described herein are also possible. I understand. For example, the order of the first and third peptides may be reversed. the result, The third peptide segment is located at the amino terminus and is a peptide with IL-6 activity. The sequence code for the code is at the carboxy terminus. second cleavable peptide portion is left as a link between those two segments. The specificity of each of these segments may also be varied. For example, substantial modifications can be made within and around the basic T L-6 peptide sequence. It is possible. A particularly interesting observation is that a substantial portion of the amino terminus loses activity. without binding the activity of both cysteine-containing and cysteine-free IL-6 sequences. As a result, it can be deleted with an increase of 2-37 olds. However, removal of the final 20 residues in the sequence Together with tin-containing forms, it results in a complete loss of activity. Also, IL-6 carbo The presence of additional amino acid residues on the oxy-terminus does not affect the biological activity of the molecule, Amino acids of the known sequence of IL-6 are replaced with chemically equivalent amino acids. can be easily understood by those skilled in the art. In other words, the molecule as a whole "Silent changes" can be made to the amino acid sequence without affecting its activity. For example, as shown, replacing all cysteine residues with serine residues Purified IL-6 molecules can retain biological activity. Substitution for cysteine Alternative choices such as valine, proline, inleucine and glycine, serine or and other neutral amino acids such as tyroline. For example aspartic acid and glutamine Negatively charged residues such as acids are similar to positively charged residues such as lysine and arginine. As such, they are interchangeable. Tryptophan, phenylalanine, leucine Hydrophobic residues including , isoleucine, valine and alanine are also interchangeable. be. Testing of the resulting molecule to determine whether biological activity is retained and amino acid substitutions, deletions, or additions are within the ability of those skilled in the art without undue experimentation. It is possible to implement within the scope of. Identification of the cleavable linker peptide sequence is also a matter of design only, and chemical and enzymatic It can be carried out using technical means. Where the adopted sequence can be chemically cleaved The biologically active peptide of IL-6 is derived from the rest of the fusion protein. can be freed from. In a preferred embodiment, the cleavable sequence is enzymatically degradable [d egradable]. The collagenase-sensitive sequence is an example of cancer. be. Other sites include enterokinase- or Factor Xa-cleavable sites. It is something that For example, enterokinase has the sequence As p-As p-As Cleave after the lysine in p-Lys. Factor Xa has the sequence 11e-Glu - site with GIy-Arg and specific for subsequent cleavage of arginine . Other useful cleavage sites include the sequence Leu-Va]-Pro-Arg-Gly- This is the site of thrombin that recognizes 5er-Pro. Thrombin is Arg and G Cleave the ly residue. Another enzyme-cleavable site is also opened by cyanogen bromide. Can be selected to include a cleavable site. Cyanogen bromide replaces methane within a peptide sequence. Attacks onine residues. A non-essential preference is that when cleaved, the IL-6 sequence is attached to The goal is to choose a linker sequence that leaves the minimum number of residues. Therefore, the released I The terminus of the L-6 active peptide is as close to the native sequence as possible. In one example In this case, the IL-6 active portion is located at the carboxy-terminus of the fusion protein. . The cleavage site also leaves the native pro-val-pro amino-terminal peptide sequence. has a special effect on proteolytic enzymes that can Examples of such cleavage sites are , which is cleaved by enterokinase. There are also various methods for identifying the third peptide sequence. This part of the three-part structure consists of the following two parts. serve one purpose. (1) Correctly selected proteins that can be expressed in the chosen host For protein purposes, production of peptides with IL-6 activity is carried out under the control of strong promoters. (2) it is a fusion protein that facilitates the purification of those peptides; This may provide a convenient means for identifying transformed clones that produce protein. example For example, in the above study, the complete sequence encoding β-galactosidase was used. This protein can be visually detected by adding an appropriate substrate. give you the means to do so. Alternatively, if the remaining portion is readily expressed by the host cell, The third peptide moiety can be a heptadon of such a protein. This section Minutes can also be peptides that do not necessarily need to be visually detectable. However, its presence can be detected, e.g. by calculating the expected molecular weight of the fusion protein. can be detected by other means, such as by inserting into the vector a marker capable of prokaryotic host Other useful alternative sequences for use within the trpE gene product, or portions thereof, are (Kleid atal, 5science 214:1125(129, 1981). Additional selection encodes against the cro gene of a human bacterial virus. sequence or the Iac sequence encoding for β-galactosidase. Contains other parts of the gene. A person skilled in the art will understand that the claimed fusion protein Additional choices can be recognized that provide a basis for the quality of the third peptide moiety. . 5. IO alternative DNA composition The following example shows that the positions of the first and third peptide portions of a three-part fusion protein are reversed. This shows a sample of the DNA composition of In addition, an alternative linker and a third peptide part minutes are shown. The amount of IL-6 protein produced using this configuration is also It is large, ranging from about 1-20% of total soluble cellular protein. 5. 10. l TrpE-enterokinase cleavage site-IL-6 mutant protein protein fusion protein (a) following the enzymatic cleavage site, the C of the native IL-6 peptide Synthesis with terminal and N-terminal parts and all 4 cysteines replaced by serine The TrpE gene, anthranilate, immediately followed the L-6 peptide sequence. The fusion protein encoding the production of synthase was created using the new recombinant plasmid pT. Expressed by rpE/EK/cfIL6. pTr　pE/EK/c　f　 In order to manufacture IL6, (Main text 5. 5 and 6) plasmids p365 has an EcoRII region located 14 bases from the 5'Nco1 site. (to truncate) the enzyme EcoRII, also shown in Figure 13 as (BglII') (to cut Bgll as indicated). The plasmid is Digested with 5 units of each enzyme for 10+ug plasmids for 2 hours at 37°C. It will be done. 0. 492Kb EcoRII/Bgl 117 fragment is not electron eluted Isolated by standard procedures. This 0°492Kb7 fragment is sequence A. Called. This array A and the next array described in the next text of this section Refer to the explanation of FIG. 12. (b) Additional aliquots (approximately 10 μg) of plasmid p365 were added to 25 mM Tri s HCl, 100mM MgClx, 10mg/mI B S A and 2 HindIll as described above in a buffer of mM BME at pH 7.5. and Bglll. Referenced in Figure 13 as BgI 11' The large ( The 3,0 Kb)7 fragment is referred to as sequence B. (C) A synthetic double-stranded oligonucleotide (sequence C) is made, with sequence A and sequence B tied to. The oligonucleotides overlap HindIll and B Starting at the e11 site, the first three amino acids of native In, -6, Pro-Va I- An access point containing an enterokinase cleavage site followed closely by Pro (PVP). It encodes a amino acid sequence and ends with an EcoR11 site. Oligonucleotide arrangement The row is Be1I DC5its 5'AG CTT CAT CA GCG GA, T CCG GAA GG T to G’l’ AGCQCCAC (:ACQCAAAslA Cu cxc ccc GTA G Ccrr cca cca xcc crc crc c rc ctc 1rnPVP3' CCG Grr CCG ccc CAA GOCcc’r cc s”Eco shaku11 Each strand of oligonucleotide is made separately and subjected to appropriate reaction for 30 min at 37°C. Polynucleotide kinase in the presence of 1mMrATP in buffer annealed by heating to 85~C for 5 minutes, followed by annealing to 25~C. is slowly cooled down. To join sequence C to sequences A and B, approximately 1 Ig of synthetic cysteine 7-lead I L-6 EcoRT I/Bg I I 7 fragment (sequence A) is 200 ng synthetic oligonucleotide (sequence C), and p 365 Hindll/BgllI vector component (sequence B) . Binding: 20mM Th1s Hcl, pH 7, 6, 0, 5mM rATP, lomM Mgc12. In a 20μl reaction volume containing 5mM DTT, Run overnight at 16°C. The new plasmid is pABC. pABC is a reaction By adding 5 μm fractions of the mixture to HB I O1 bacteria capable of responding. is cloned. Ampicillin-resistant colonies appeared in the ink overnight at 37°C. selected after validation. (d) Recombinant synthetic cysteine 7-ley IL-6 gene expressed in p365 The 3' end of I is methionine-terminated, to encode the -6 carboxy terminus. It will be reconfigured for this purpose. To accomplish this, the following oligonucleotides are synthesized as described above. 5' GA TCT TTCAAA GAA TTCCTG CAG TCCT C (: CTG CGT GCT CTG C0 31 Input GTTτ C TT λAG CACGTC entered GG entered GGG entered CGTλCG entered CACGCA cAG ATG TAA TGλ, τ-in G GTA C3’GTCτAC-in TT λCT Input TC5' Read from left to right, this nucleotide is Bg111 part starts at position 365 and encodes the natural amino acid of IL-6 according to Bglll'. , and a methion immediately followed by three stop codons and a KpnI site (sequence D). Ends with a nin residue. (e) pABC (step C) is Hindllll and Bgllll (sequence E) is digested. (f) (A, Tzajaloff, from Columbia University, New York City) PTH23 is located adjacent to the polyanchor containing the Htndl11 site. in the readout frame at its 3° end with respect to the Tosynthase component) The gene encoding the top 337 amino acids of TrpE is ampicillin resistance plasmid containing. The TrpE operon has been described by Miller and and Reznikoff, eds, The 0peron, Co1d Spring g Harbor Laboratory. pp. 263-302 (1978). All of trpE and 1acZ or other DNA sources encoding portions are readily available. Such other DNA sources include, for example, Pouves et al., Clonong V ectors, A Laboratory Manual, Elsevie r, 1985. For example, the trpE sequence can be can be isolated from plasmids with the following specific codes in the manual: 20/1g PATH23 was treated with 5 units of Bindl each for 2 hours at 37°C. Digested by l+ and Kpn l. Large 7-ragment gel chromatograph and then separated by electronic elution and ethanol precipitation (Sequence F). (g) Approximately 200 ng of Sequence E is mixed with approximately 1 μg of Sequence E. the The resulting mixture was co-precipitated with ethanol in the presence of sequence F and Combined as described above. The resulting 7 fragments were pTrpE/EK/CfI It is called L-6. (h) Competent E. coli host cells are pTrpE/EK/cfIL-6 It is converted with . For example, in one example, the E. coli H8101 strain Used as a replacement host cell. Ampicillin resistant colonies are collected. this These colonies are recognized by TrpE segment, enterokinase and The amino acid segment that is cleaved and the natural I starting with PVP and ending with M Add termini3 to both the carboxy and amino acid ends of L-6. A fusion protein consisting of a synthetic cysteine-free I L-6 amino acid sequence with manifest. 5. 10. 2 Beta-galactosidase-enterokinase cleavage site-synthetic site Stin7ri-I L-6 mutant protein fusion protein TrpE entero Kinase-cleavage site synthesis cysteine-7-IL-6 fusion protein protein Meno, 5. 10. The protocol described in 1. pEx-1 vector It is as follows, except that f is replaced with PATH23. pEx-1 is B Digested with amHI and KpnI. BamHI and BclI are compatible inhibitors. It has a control part. The resulting configuration consists of a thermally induced polyanchor followed by a cloning polyanchor. Contains the conducting β-galactosidase gene. The cut gene is approximately 48Kd. produces a peptide that is a beta-galactosidase protein (Stanle yJ, N., & Luzio, J.P., 1984. EMBOJ, Vol. 3. p p1429-1434). The resulting configuration is pβga I/EK/c f It is called IL-6. Other sources of beta-galactose DNA include 5. 2. 1. Described in Contains an estimated pH of 2000. The fusion protein is pβgal/EK/cfl L6 and heat induction replicates in E. coli strain N99. N9 9 and N4830 are available from Pharmacia. fusion protein is cleaved by enterokinase using known methods. Enterokinase cleaves proteins that have an enterokinase recognition site That is the conventional method. For example, Hopp et al. ogy 6:12l2O4-1210 (see 198. 5. 10. 3. The fusion protein factor Xa site with the factor Xa cleavage site is 5. 20 ．． 1. and 2. Place the enterokinase site by adjusting step C of will be replaced. 5. 10. Synthetic oligonucleotide (sequence) shown in Step C of 1° Column C) is a DNA sequence encoding Asp, Asp-Asp, Asp, Lys. It consists of This DNA sequence includes Factor Xa cleavage recognition sites IIe, Giu, Gly, A Adjusted to code rg. The resulting configuration is called pβga l/Xa/c f I L-6. Plasmid pTrpE/EK/cf IL-6 and pβga l/Xa/cf I L-6 is 5-10-1- and 5. 10. It was expressed as described in 2゜. It will be done. The resulting fusion protein is cleaved with factor Xa. The factor is Cleave after arg within the recognition site by known methods. For example, Naga L & Thorgerson, ~ture 309:810-812 (1984 ). 5. 1t, Activity analysis of synthetic cysteine-free protein 5, i1. 1. Liver details Cell stimulation analysis FAZA 967 rat hepatocytes were treated with 10% NuSerum (Collabora tive research), penicillin, and streptomycin. It was grown in DMEM/Fi2. Assay matures within 48 wells The test was carried out on confluent monolayers. 5. 2 to 5. 8, as made by the method described in Section 8. Cells were incubated at 107M before treatment with recombinant IL-6 and other conditioning media. Washed with serum-free medium containing xamethacin. The treated cells are then separated. The intestine was maintained in serum-free/dexamethacin medium during analysis. cells cell culture Cystine 7ri, recombinant rL-6 and other Incubated in the presence of conditioning medium. After treatment, the cell supernatant is removed. It was stored at -20°C, i.e. directly against fibrinogen as follows. was directly analyzed. A 2-fold serial dilution of the cell supernatant was divided into 96-unyl microtiters. prepared in an itaplate and using a dot-plot device (Bio-Rad). ,0. It was dripped onto a 45γm nitrocellulose filter. of fibrinogen Levels were determined by solid-phase enzyme-linked immunoassay. Fibrinogen is , (obtained from Stafford University, Dr. Crabtree, Gerald R. 1:1000 of rabbit anti-rant fibrinogen voriclone antiserum Detected using diluted solution. The secondary antibody was an affinity purified alkaline phosphate-conjugated Goat anti-rabbit antiserum (Promega Biotec). Boun This antibody uses two substrates, low blue tetrazolium (NBT) and 5-bromo- 4-chloro-3-indolyl-phosphate, p-)luidine salt (BCTP; Si gma) was added to make it visible. Treated with supernatant obtained from PMA A positive control consisting of cells stimulated MRC-5 fibroblasts. Quantification of analysis densitometry was performed by scanning laser densitometry. CVan 5 Nick statue, Proc. Nat’1. And, Sci, tlSA 83:9679-9683. 1986 ), various deletions of amino acid residues from the IL-6 sequence were tested. Table 3 is the percentage activity compared to an equivalent amount of recombinant cysteine-containing IL-6 (mge n). These results are shown expressed as dynamics. The IL-6 sequences tested were all It contains cysteine. Plasmid p478, in p478, Given that the cysteine in the IL-6 sequence was not replaced, plasmid It has the same plasmid structure as p367. I L-6 active protein 7 lac Desired is the IL-6 peptide excised from the fusion protein with collagenase. (rp478J disruption in Table 2). Therefore, each deletion mutation tested This peptide flixicon against mutation is IL-6 cysteine-containing with a separate amino acid added to the carboxy terminal of the peptide sequence. It is a mixture of L-6 peptides. Furthermore, the proteins tested were fused The protein itself ('p478 uncleaved'). Fields generated by p478 The sex-type cysteine-containing natural I L-6 sequence fusion protein is The hemolytic black forming c) was determined. 5, 11. 3 In vitro bone marrow analysis 5. 2-5. Synthetic cysteine 7ly IL made according to the method described in 8. -6 has also demonstrated therapeutic utility in technically accepted in vitro tests. I found out that I have it. IL regarding fluorouracil treated with bone marrow cells- A delta (Δ) analysis of the effect of synthetic cysteine-free IL-6 showed that It was found to have good stimulatory activity on progenitor cells. For these analyses, The protocol for doing so can be found in section 1m. When synthetic cysteine-free IL-6 is combined with IL-1, furthermore, These two cytokines are bound to either M-CSF or IL-3. Particularly effective stimulation was also observed when The Δ values are shown in Table 2. be. A graphical representation of the time-colony analysis is shown in FIG. 5. 11. 4 Analysis of deletion mutant 77D1 to quantify biological activity -7TD1 analysis using growth of a 6-dependent mouse hybrid cell line 5. 11. 2B cell differentiation analysis Mouse B-cells 0-7CH12, LX (N", d"LY-10) are grown 5% heat-inactive embryonic tricytheum, 30ONg/ml glutamine, 004 mM 2-mercaptoethanol and sheep red blood cell phos-7 atidylcholine formation Antibiotics effective against (SRBC) CH12, LX Cell Bear Surfice I Maintained within RPM 11640 containing gM. Differentiation analysis was carried out in 2m1B-cell media in Co5tar 24-well plates. ,5. 2 to 5. Synthetic systems of various concentrations, as made by the method described in 8. By culturing 2×1O″ B-cells in the presence or absence of stain-free IL-6. It has been executed. 5RBCCASA Biological Product, Einstor-5alem, N C was washed three times with RPM11640 before use. lXl0' red blood cells were included in the experimental culture. 5ONg/ml Glue Popolysaccharide (Dirco A positive control consisting of mitogen-stimulated B-cells using 5% C Incubated at 37°C in an O8 atmosphere. CHi 2. The normal cysteine-containing L-6 peptide produced therefrom in LX culture ( The r478478 split compared preserves the biological activity of IL-6 (3% activity). So The 478-interrupted eptide has 9 deletion mutations. Tested and alone 100% active in the test. Therefore, in Table 3, 478 fragment was cleaved from the fusion protein with collagenase rL-6 Wild-type plasmid expressing cysteine-containing IL-6 fusion protein However, 478 uncleaved in Table 3 refers to the uncleaved fusion protein. mutant IAB is for the analogous I L-6 cysteine-free peptide whose met is in Figure 8b. Within the cysteine-containing IL-6 peptide, which is amino acid number 1 of the peptide sequence, It is a deletion mutation generated by deleting amino acids 4-23. suddenly Mutations 2AB, 3AB and all others are caused by the deleted amino acid residue named The corresponding 2 in the appropriate position within the array as specified in Table 3 in column 2. Reference 0 amino acid deletion. Table 2 Soto effect colony stimulating activity in liquid culture in liquid culture Media IL-I IL-61L-1+LI-6 Read value Read value Read value Read value C5A C5A C3A C5A G I G 5G 7G 149 Medium M sM7M2M27 GM I GM 15 CM 4 GM 37IL-311L-35IL-31 1L-315csc19G17G344 G-C5FMIM7MM3M65 (G) GM I GM 25 GM 7 GM 58IL-311L-311 1L-341L-322GIC140G32G518 C5F-I M I M 29M 2M 97GM)GMIGM43GM9GM 99 IL-31IL-328IL-331L-337G IG 122G 362 G 704GM-C3F M I M 55 M 19 M 236 (GM) GM I GM 54 GM 53 GM 157IL-311L-3341L -3371L-385G 14G 509G 186G 1781G-C 5F M 15M 208M 136M 675GM 19 cM 129 G M 132 GM 415IL-324IL-3102IL-362IL-31 31 table 3 In the quantification of removed 7TD1 Mutation name Amino acid residue Activity IAB 4-23 280% 2AB 24-43 0. 001 3AB 44-63 0. 000 4AB 64-83 0. 0003 5AB 84-103 0. 0003 6AB　1　04-123　0. 0067AB　124-143　(0,000 0)8AB　144-163　(0,0000)9AB　l　64-183　( 0,0000) 478 Cut 100% 478 Non-cutting 3% 6. Examples: Materials and methods 6. 1 Conditions for inhibited enzyme digestion Enzymes were obtained commercially from New England Biolabs and manufactured by the manufacturer. Perform the digestion process according to the method specified by. 6. 2. Genetic tendency of bacteria and plasmid E, coli JMIOI (P-L Pharmacia) is a paper (Hannan, 1983, J. Urnal of Molecular Biology, Vol, 166 , P, 557). Plasmid pKK233-2 is , P-L Pharmacia. Plasmid pBSt is a Strad Obtained from Stratogene. Other plasmid configurations are listed above. As described in the paper. 6. 3 Oligonucleotide assembly Oligonucleotides were CHD phosphoric acid amide and American Bi. It was synthesized from Netics' tetrasil. Oligonucleotides were purchased from the manufacturer ( T4 polyester according to the method specified by New England Biolabs). It was transferred by nucleotide transferase I. Transfer is done by heating to 65°C. I was stopped. The oligonucleotide mixture was annealed at 85°C for 15 minutes. After processing, the temperature was lowered to room temperature. Annealed oligo The nucleotides were ligated by +0U T4 ligase and the conjugate was They were separated in a clear acrylamide gel and recovered by electroelution after separation. 6. 4DNA sequence The DNA sequences of the inserted fragments and oligonucleotides are from Sanger et al. (1977, Proc, Natl, Acad, Sci, Vol. 74 Chain termination method (described on page 5463) inati. n Method), Biggen et al. (1983, Proc, Natl. Acad, Sci, Vat. 80, P, 3963, 11ri and Hattori, 5akakaj (1986 , Anal, Biochem. Vol.]52. p. 232) and Banker et al. (published in 1988, By improving and incorporating the methods of I met. 6. 5 Protein plot analysis 50. A sample equivalent to 17L(7) cell culture was prepared by Laemlli (1970, Nature Vol, 227. Relaxing the conditions according to the method described in p. 680) It was dissolved in an 8% NaDodSO4-polyacrylamide gel under . To replicate the gel plot, the gel was coated with Coomassie blue (Coomas ie Blue) or electrostatically on two layers of nitrocellulose. Processed by plotting method. Molecular weight marker (BRL) colored in one color in advance The transformation was observed using Blonde is 0. After protection with 25% gelatin , manufactured by Promega Biotecb for commercially available β-galactosidase All antibodies were prepared and incubated. Crossli Acting Band (c ross reacting band) binds the phosphatase and reacts with the chemical parent 7. Increased Japanese power. 500 times diluted Promega manufactured by BiotecM. Visualized with Tsujiichi anti-mouse IgG antiserum. 6. 6 Cell lysis and engineered hybrid assay Cell lysis was performed as described by Germino et al. (Pr. oc, Natl, Acad, Sci, 1983° Vol, 80. p- 6848-1) Execution based on method. E. coli was extracted by centrifugation. However, Cervelet has a concentration of 0. 05 mo1/L% hydrogen trichloride at pH 8 and concentration 0 ．． 15% Lysozyme dissolved in a ratio of 0.05 mol/L EDTA and 1 mg/m+ 115 volumes of the solution were immersed in the solution A combined with saccharose. After 15 minutes at room temperature, the lysate was frozen at -70°C and rapidly raised to 37°C. After raising the temperature, ultrasonic waves were applied to cut the DNA chain. Trisexual hybrid fusion protein was quantified by chromatric assay, and 0-nitrophenyl-β-D was used as a base. - β-galactosidase activity was determined using galactopyranoside. 6. 7 Collagenase digestion of fusion protein Prior to digestion of the fusion protein, Lecroi sey et al. (1975゜FEBS Lett, Vol. 59. Listed on p. 167 β-Hydroxy-markribenzoate was added according to the method of ). Achr omobacter Iophagus (EC3,4-24,8; Boeh One unit of collagenase (Mannheim) was added at pH 7.4 and concentrated. Hydrogen trichloride at a concentration of 100mM, sodium chloride at a concentration of 250mM, and sodium chloride at a concentration of 1mM. Calcium chloride and β-hydroxy-markribenzo at a concentration of 40 μg/ml Both the buffer and the buffer were dissolved in 8. Dissolved collagenase was added to a 15 ml cylinder. The cells were transferred to a polypropylene tube coated with Recon and incubated at room temperature for 30 minutes. melt Apply ultrasound to the dissolved cell extract (4 ml) to separate and lyse individual cells. Collagenase was added to the cells and incubated for an additional 45 minutes at room temperature. cleaved β-galacto Most of the sidase was prepared by adding 50% of the volume of saturated ammonium sulfide for 30 minutes at ice temperature. The undissolved material was removed by incubation and flocculation. cleaved recombination Synthetic cysteine 7 Lee r L-6 is a saturated ammonium sulfide solution 13 After adding m1S and incubating on ice for 30 minutes, unsoluble proteins were removed by centrifugation. It was suspended as a thin film on the surface of the liquid. The liquid in the tube is removed by suction and left behind. The thin film was soaked in 0.5 ml of [Tris buffered] salt. 7. Example: Stimulation of hepatocytes Cystine 7-Li-1 Synthesis IL-6 is described in paragraph 5. 2 and 5. listed in 8 When prepared according to the method described above, it stimulates hepatocytes as shown in FIG. to liver cells The stimulation force for the above paragraph 5. 9. Quantitated according to the analytical method described in 2. did. The stimulating power of cysteine-free synthetic IL-6 on hepatocytes is due to its concentration. It occurs when the temperature is 10-8 M and the amount is 104 U/mg. This amount of stimulation is , May et al. (1988, J. Biol. Chem., Vol. 263゜p, 7 This is 100 times as large as the measurement result obtained by 760 (described in 760). observed in our FAZA cells. In addition, the level of fibrinogen synthesis was determined in the culture media obtained from PMA-induced fibroblasts. The results are similar to the experimental results using nutrients. 1. At concentrations below uM, the peptide Has the effect of reducing the number of cells and, as a result, reduces the amount of measurable fibrinogen It has the effect of causing 8. Example: B cell differentiation Paragraph 5. 2 and 5. Cystine synthesized according to the method described in 8. The most sensitive method to assess the functionality of the 7ly IL-6 protein is B. - Cell differentiation analysis method. The hemolytic plaque analysis method evaluates the ability of synthetic IL-6 to induce Ig secretion in the instep of B-cells. This is to evaluate the Hemolytic plaque analysis examines differentiation and proliferation at the cellular level. This is an excellent method. (Gronowicz et al., 1976, EUR, J, Tmmunol, Vol, 6. p. 588). Our Ta Protein (synthetic IL-6) has maximum stimulatory potential at a concentration of 0°log/m+. As shown in FIG. 12, one thing was found out. This value is natural! Use L-6 This value is similar to other experimental results. Other experimental results are described in the literature below. Ru. (Vannick et al., 1986. Proc, Matl, Aca d.Sci. Vol, 83. p, 9679; Brakenhoff et al. + 1987. 　 J, Immunol, Vol. 139, p. 4116; Poupar t et al., 1987. EMBOJ, Vol. 6. p, 1219; Kish imoto, 1985. Ann, Rev, Im+ouno1. Vol. 3. p, 133) At concentrations below 43 pM, the synthesized cysteine free -IL-6 has the effect of reducing the number of differentiating B-cells. 9. Biological activity of Example Nijistin Free I L-6 Natural Cystine 7 Lee I L-6 protein with 3 different activation powers Assays have shown that Cysteine 7 Lee IL-6 is biologically active. I made it clear. According to the invention, all that is required to bring the peptide chain into the active form is It is shown that this is the basic sequence of putide. Vaccines are often administered to various species of horse mackerel. formed and multiplied in a combination of adjuvants. Adjuvants are used to treat immunogens alone. This method uses a smaller amount of antigen to provide a higher and longer-lasting immune effect than would otherwise be the case. It has the effect of encouraging The mechanism of action of adjuvants is complex. Adjuvant Its mechanism of action includes cellular cytokines such as cytokine IL-6 and 7-ago receptors. Mechanisms that promote the production of phagocytoses, and other mechanisms within the wire network This includes cell activity, as well as delayed onset and degradation of antigens. As an example of adjuvant Freud adjuvant, Adjuvant 65 (peanut oil, man Needed monooleate [mannide m. (contains nooleate3 and aluminum monostearate), lysolecithin, and pluronic polyols], polyanions, Peptide, oil emulsion, and metal gels such as aluminum hydroxide and aluminum phosphate, etc. There are surface active substances. Fraud adjuvant contains non-metabolizable mineral oil and is carcinogenic. Therefore, it is no longer used as a commercial vaccine material. Purified and synthesized IL-6, such as the peptide according to the present invention, alters the immune response. added to vaccine raw materials to act as an adjuvant be able to. The living organisms used in this immunization device are mice, Guinea Big, and rabbits. chickens, horses, sheep, goats, cows, chimpanzees and other primates and humans. Ru. In vivo use of vaccines as adjuvants using peptins such as TL-6 Injections can be administered orally, cutaneously, intramuscularly, peritoneally, intravenously, subcutaneously, or nasally. and other immune routes. The purified IL-6 active peptide is , used as the antigen for the main immunization to generate IL-6 monoclonal antibodies. child Antibodies such as This is effective for devices where there is a malfunction in the system. This dysfunction include multiple bone marrow disorders and autoimmune disorders. - As an example, the single coulomb above Antibodies can be injected into joints and used to treat rheumatoid arthritis. Ru. Purified synthetics such as cysteine-free or cysteine-containing peptides Adjust IL-6 to an appropriate concentration, and add other suitable cytokine peptides and vaccines. It is possible to use it as an integrated drug by adding other ingredients. IL-6 activity The peptides can also be used as adjuvants in vaccine materials or as drugs themselves. However, it is also possible to incorporate it into liposomes. It also stimulates IL-6 activity. The peptides can also be added to antibodies used for immunotherapy. Furthermore, as another example, peptides with IL-6 activity can be used as immunostimulatory agents. It can also be used. - For example, a peptide with IL-6 activity is Stimulation of hematopoietic cells, especially in cases of immunodeficiency due to disease, drugs, or radiation exposure. It is effective in activating the antibody production function of cells. In addition, these peptides It is also effective in treating AIDS patients who are in a state of incompetence. Also, in case of liver dysfunction It also has the effect of promoting the production of hepatic proteins. Additionally, these peptides can be used in vitro. It is also used as a reagent to induce antibodies in culture, and to evaluate the characteristics of growth factors in cultures. It can also be used for adjustment. Furthermore, as other examples, these This peptide can be used in combination with other antiviral agents to fight against HIV, HBV, etc. It can be used to prevent or treat any viral disease. Furthermore, other embodiments and Therefore, peptides with IL-6 activity can be used alone or in combination with other purified cytokines. In combination with cancer, it is effective in disrupting B-cell differentiation in diseases such as leukemia. be. In addition, cysteine-free or cysteine-containing peptides such as The produced synthetic IL-6 induces antibodies that effectively act on any part of the peptide. It can also be used when 10. Example Nijistin-free I L-6 and other growth factors in vivo bone marrow stalk Effects on cell proliferation and differentiation (Delta analysis)Delta analysis In order to confirm the occurrence of a highly proliferative population in bone marrow stem cells caused by It is held for the purpose of In mice, it is used to eliminate cells with low proliferative potential. Then, uracil 57 fluoride is administered. The cells of the highly proliferative solid population were grown on a first semi-solid agar plate for 12 days under growth factors. cultured in a culture medium. Growth factors include interleukin-1 (rL-1), Interleukin-6 (IL-6) and a 1:1 mixture of IL-1 and rL-6 It is. BM stem cells absorb these growth factors in the absence of other growth factors. and leukocyte colony stimulating factor (G-C5F), Macrophage colony stimulating factor (M-C3F), bleeding M macrophage colo Growth of knee-stimulating factor (GM-C3F) 8 and interleukin-3 (IL-3) It also grows in the presence of factors. Number of colonies grown by these growth factors was quantitatively measured by double-layer agarose clone quantitative analysis method, and in Figure 16, As shown in the data of “Initial Colony Analysis”. The vertical axis of the graph in Figure 16 is Number of mouse bone marrow cells 24 hours after administration of 57 uracil fluoride to mice. 3X10 It shows the total number of colonies formed, with 5 being the number one. The first four bar graph data represent cysteine in the absence of other growth factors. of free IL-1, IL-6 and l:l mixture of IL-1 and IL-6. , showing an effect on colony growth. The following four bar graph data are G-C 5F alone, G-C5F and cysteine-free IL-1, IL-68 and IL= The effects of the combination of 1:1 mixture of IL-6 and IL-6 on colony growth in four ways were investigated. It shows. Furthermore, the following three sets of four bar graph data are M-C9F%GM- C5F and IL-6 alone, M-C5F, GM-C5F and IL-6 Stinfree IL-1, IL-68 and 1:1 mixture of IL-1 and IL-6 It shows the effect of 12 combinations of 1 and 2 on colony growth. As a result of the analysis, Stinfree IL-i, IL-68 and 1=1 mixture of IL-1 and IL-6 When the body is combined with M-C3F, IL-3, GM-CSF and G-C It can be seen that colony formation is promoted more than the combination with 3F. In isolation assays, highly proliferative solid population cells are further hydrated under the same growth factors as above. It is cultivated in a body culture. Results of counting the number of cells that did not attach after 7 days is shown in FIG. In Figure 15, the data for '7 = number of non-adherent cells after inter-liquid culture' is shown. shown in the data. The vertical line of the graph of 'i6m' is 1 ml of culture solution; Total non-adherent cell numbers are shown. The first five sets of 4X bar graph data are shown in Figure 16. Shows the corresponding bar graph data and trends in point species from the “Colony Analysis” shown in . The maximum number of total nonadherent cells was determined by the 1:1 mixture of IL-1 and rL-6. -3, appears when combined with GM-CS F8 and M-C5F. The cells in the liquid culture shell were removed, washed, and again grown in the Wl form under each growth factor. cultured in agarose culture and determined by double-layer agarose cloning quantitative analysis. Quantity measured. This second quantitative analysis of agarose clones is called ``readout analysis''. It is called. The delta value indicates the number of bone marrow cell colonies counted by “readout analysis”. , divided by the number of bone marrow cell colonies counted by “initial colony analysis” . Table 2 shows the calculation results of the delta values. ” The result of delta analysis is “read analysis” Which growth factors have a synergistic effect during liquid culture? It represents what it brings. Promotes colony formation when using liquid culture The effect of cytokines added to IL-1 or rL-6 alone This was more noticeable when a 1:1 mixture of IL,-1 and IL-6 was given than when It will be done. IL-1 and IL-6 compared to giving IL-1 or IL-6 to The fact that the effect of cytokine is noticeable when a 1:1 mixture of 6 is given is that Furthermore, G-C5FSGM-C5F, M-C5F8 and IL-3 were added to the liquid culture. When combined, synergistic effects can be achieved. This synergistic effect is effective for “readout analysis” with G-C3F. This is most noticeable when using . In addition, GM-CSF and IL-3 were cultured in liquid. When used orally in combination with IL-1 or IL-6, IL-6 yields a higher delta value for all Ir--1i=h. However, C3F- When using 1 in liquid culture A in combination with ■Ll or IL-6, IL-1 yields higher delta values compared to IL-6. Based on these analysis results, a mixture of IL-1 and IL-6 was separated and analyzed in a liquid culture port. Therefore, it is best to use G-C5F in combination with IL-3 and for readout analysis. also appears to be the best analytical method. The above analysis results indicate that cysteine-free The use of IL-6 in combination with other growth factors may be useful in bone marrow transplantation and cancer treatment. This shows that it can be an important tool when High delta values are associated with various growth factors This suggests that certain combinations may lead to proliferation and extinction of stem cells. this These characteristics of growth factors are essential for controlling bone marrow proliferation and differentiation in the living mouth. This is a requirement. Delta analysis steps 1) BDFI mice were given 150 mg of 57 uracil fluoride per iKg of body weight. Administer. 2) 24 hours after administering uracil pentafluoride, kill the mouse and remove the bone marrow. . 3) Bone marrow cells were treated with 20% fetal bovine serum (FBS) and antibiotics (gentan). Wash with IMDM solution containing icin). 4) Culture bone marrow cells by double-layer agarose cloning. Contains 20% FBS The growth factor in the IMDM solution was adjusted to 0. on a 35 mm diameter vetri dish in 5% agarose Attach it to. Bone marrow cells were added to 0-5 mIcp per dish. 5X104? Stack the layers so that the number of cells is 2×105. This method Cells were stored at 37°C in an oxygen concentration of approximately 7% or less for 12 days. . 5) Place bone marrow cells in 1 ml liquid culture (20% IM containing fetal bovine serum (FBS’) and antibiotics (gentamicin) Grow in DM solution). Cells were added at 2.0 cells per ml. Initial value is 5X105 Culture for 7 days. 6) After culturing for 7 days, remove only non-adherent bone marrow cells. After counting the number of cells: 5 ytospin] 1 air, and remove unnecessary cells with chilled FBS solution 51. to remove all growth factors. 7) Dilute non-adherent bone marrow cells and allow them to adhere to clonal agarose cultures. culture body , at 37°C for 7 to 12 days in a sufficiently humid atmosphere with an oxygen concentration of approximately 7% or less. save. This culture method is "readout analysis." 8) The delta value, the number of bone marrow cell colonies counted by the “readout analysis”, the “initial It is calculated as the value divided by the number of bone marrow cell colonies counted by "colony analysis". 11. Comparison of IL-6 with commercial products in example near td, 1 growth assay Cysteine-free products obtained by purifying fusions derived from cells containing p367 The biological behavior of I L-6 peptide was determined using a commercially available product (distributed product) using the 7td, 1 analysis method. Reagent) has been compared with cysteine-containing IL-6. (Van 5tick et al. 1986. Proc, Nat'l. Acad, Sci, USA Vol, 83. p, 9679-9683) These commercially available products are E. Bollinger Mannheim, non-recombinant production that produces col-inducible I L-6 It is a gencyme that produces the yeast-induced IL-6 and the yeast-derived IL-6. be. purified from induced p367 containing cells in phosphorus-buffered salt. Cysteine-free synthetic peptide, Bollinger Mannheim's IL-6,! − Comparatively speaking, Bollinger Mannheim's IL-6 is shown in IIEl 713H. As shown, at low concentrations, it shows high activation power, while at high concentration, it shows low activation power. vinegar. The highest activity is shown by the cysteine heptad combination IRr L-6. Comparison of cysteine 7-lyl synthetic I L-6 peptide and endogen IL-6. As shown in Figure 16, the cysteine-free synthetic rL-6 peptide , higher activity across all analyzed concentrations of O, lng to 50ng. It turns out that he has sexual powers. Similarly, cysteine 7-ri-1 synthetic IL-6 peptide and When compared with Gencyme's IL-6, as shown in Figure 18, the system strength is Lee synthetic I L-6 peptide was analyzed from 0, 1 ng to 50 ng. was found to have higher activity across all concentrations. 7td, l growth analysis method description 3. The 50 assay is performed in culture plates with 96 wells. r of L-6 Peptides with activity are counted in HGF units. 100GFH is approximately IP Comparable to CT-GF unit. Approximately 2000 cells with 7td.1 characteristics were incubated in a humid atmosphere of 5% carbon oxide. , cultured on a 200 μm instep with a culture solution containing a diluted peptide with IL-6 active injection. Ru. After 84 hours, tetrazolium salt (tetrazolium salt) was added for 4 hours. um 5 alt) 3- (4. 5 Dimethylthiazol-2y) 2 . 5-dimethylformazan bromide (b) r. m1de) (MTT) and centrifuged for 5 minutes, then remove the vasa. vinegar. 7 Dissolve ormazan crystals in 1μ of DMSOIO, and place the culture plate at wavelength 5. Project onto 70 nm light. The intensity of reflected light is proportional to the number of living cells. H The amount of IL-6 measured in GF gives 50% of the maximum intensity of reflected light. The relationship is the reciprocal of the amount of diluent required. 7td, 1 growth assay reagents The diluent is RPMI 1640 containing 10% fetal bovine serum. Auxiliary dilution The solution is RPM 11640. containing 10% fetal bovine serum. 0. 1mM 2-me with a solution containing ethanol and antibiotics. be. The label reagent is 5 mg of MTT dissolved in 1 mL of PBS. . FIG. 2 Features: T? C promoter 1-275 Minicistron 27G~: (06 Recombinant I+, -G: (OG~1161 collagen 8G3~1041 In 1IQ::: only part of the p367 sequence is shown. FIG.9 Ml　2345M FIG. 10 ゜Koshira Box (Power [(Run Lun) &cFL4-c/2. x10”+1tji,=rnp1. ><let/b ’) ft evening F2 x io-/4-pack fluoron compensation FIG,)5 7 fd, 7 t=1. +ta　Bh　u-IFIG, +6 international search report txt+m+m+++++ Ass work 1h61, Nigo wall 910ξ21

Claims

[Claims] 1. Recombinant gene with nucleotide sequence encoding a synthetic trisexual hybrid protein wherein the trigenic hybrid protein has a first peptide portion, a second peptide portion, and a third protein portion, wherein the first peptide portion has IL-6 activity and the second peptide portion has IL-6 activity. the moiety has a chemically or enzymatically cleavable peptide link between the first peptide moiety and the third protein moiety; A recombinant gene characterized in that the protein or part thereof can be expressed by a host cell. 2. The recombinant gene according to claim 1, wherein the first peptide portion has IL-6 activity. A recombinant gene characterized in that the component is incapable of forming sulfhydryl bonds. Denji. 3. In the recombinant gene according to claim 1 or 2, the second peptide portion is a protein. A recombinant gene characterized by having a peptide link that reacts with a protein-degrading enzyme. 4. In the recombinant gene according to claim 3, the second peptide portion is collagener. A recombinant gene characterized by having a enzyme-sensitive site. 5. In the recombinant gene according to claim 3, the second peptide portion is enterokina. A recombinant gene characterized by having an enzyme-sensitive site. 6. 4. The recombinant gene according to claim 3, wherein the second peptide portion has a factor Xa sensitive site. 7. The recombinant gene according to claim 1 or 2, wherein the third protein portion has a β-galactosidase sequence or a part thereof. 8. The recombinant gene according to claim 1 or 2, wherein the third protein portion has a TrpE gene product. 9. In the recombinant gene according to claim 1, the first peptide portion is a sulfhydryl. The second peptide portion is a peptide with a collagenase-sensitive site. The third protein part is a protein with β-galactosidase enzyme activity. A recombinant gene characterized by having protein. 10. In the recombinant gene according to claim 1, the first peptide portion is a sulfur Rather than forming a drill bond, the second peptide portion has an enterokinase-sensitive site. 1. A recombinant gene characterized in that the third protein portion has a protein that is a TrpE gene product or a part thereof. 11. In the recombinant gene according to claim 1, the first peptide portion is a sulfhydride. The second peptide portion is a peptide with a factor Xa sensitive site. and the third protein portion is the TrpE gene product or a portion thereof. 12. A recombinant gene characterized by having a protein that In the recombinant gene according to claim 1, the first peptide portion is incapable of forming a sulfhydryl bond, the second peptide portion consists of a peptide having an enterokinase-sensitive site, and the third protein portion comprises a β-galactosidase sequence or a portion thereof. A recombinant gene characterized by having 13. In the recombinant gene according to claim 1, the first peptide portion is a sulfhydride. The second peptide portion is a peptide with a factor Xa sensitive site. A recombinant gene characterized in that the third protein portion consists of a β-galactosidase sequence or a part thereof. 14. The recombinant gene according to any one of claims 9 to 13, wherein the first A recombinant gene characterized in that the peptide moiety does not retain amino acid residues from the second peptide moiety after cleavage from the second peptide moiety. 15. The recombinant gene according to claim 2, which has a DNA sequence encoding the IL-6 amino acid sequence shown in FIG. 16. The recombinant gene according to claim 3, which has a DNA sequence encoding the IL-6 amino acid sequence shown in FIG. 17. 5. The recombinant gene according to claim 4, which has a DNA sequence encoding the IL-6 amino acid sequence shown in FIG. 18. The recombinant gene according to claim 5, which has a DNA sequence encoding the IL-6 amino acid sequence shown in FIG. 19. A recombinant vector containing the gene of claim 1. 20. A recombinant vector containing the gene of claim 2. 21. A recombinant vector containing the gene of claim 3. 22. A recombinant vector containing the gene of claim 4. 23. A recombinant vector containing the gene of claim 5. 24. A recombinant vector comprising the gene of claim 6. 25. A recombinant vector comprising the gene of claim 7. 26. A recombinant vector comprising the gene of claim 8. 27. A recombinant vector comprising the gene of claim 9. 28. A recombinant vector comprising the gene of claim 10. 29. A recombinant vector comprising the gene of claim 11. 30. A recombinant vector comprising the gene of claim 12. 31. A recombinant vector comprising the gene of claim 13. 32. A recombinant vector comprising the gene of claim 14. 33. Any one of the recombinant vectors according to claims 19 to 32 is a plasmid. 34. pTrpE/EK/cfIL-6; pβGal/EK/cfIL-6; pTrpE/Xa/cfIL-6; or pβGa1/Xa/cfIL-6. A plasmid formed from a group of 35. A unicellular host comprising the vector of claim 19. 36. A unicellular host comprising the vector of claim 20. 37. A unicellular host comprising the vector of claim 21. 38. A unicellular host comprising the vector of claim 22. 39. A unicellular host comprising the vector of claim 23. 40. A unicellular host comprising the vector of claim 24. 41. A unicellular host comprising the vector of claim 25. 42. A unicellular host comprising the vector of claim 26. 43. A unicellular host comprising the vector of claim 27. 44. A unicellular host comprising the vector of claim 28. 45. A unicellular host comprising the vector of claim 29. 46. A unicellular host comprising the vector of claim 30. 47. A unicellular host comprising the vector of claim 31. 48. A unicellular host comprising the vector of claim 32. 49. 34. A unicellular host comprising the vector of claim 33. 50. 50. A unicellular host comprising any one of claims 35-49 which is a prokaryote. 51. 51. The unicellular host of claim 50, which is a bacterium. 52. (a) a first peptide moiety having IL-6 activity; and a second peptide moiety having a chemically cleavable peptide link between the first peptide moiety and a third protein moiety capable of being expressed by a proliferating host. culturing a unicellular host microorganism containing a recombinant gene having a nucleotide sequence encoding a synthetic trisexual hybrid protein having , which is capable of being replicated, transcribed, and translated in the host; (b) identifying the tripartite protein produced by the host; (c) chemically or enzymatically cleaving the second peptide portion; and (d) a first peptide having IL-6 activity. A method for producing a peptide having IL-6 activity, which is characterized by the step of removing a portion. 53. The second peptide portion has a peptide link that reacts with proteolytic enzymes. 53. The method of claim 52. 54. 54. The method of claim 53, wherein the second peptide moiety has a collagenase sensitive site. 55. 54. The method of claim 53, wherein the second peptide moiety has an enterokinase sensitive site. 56. 54. The method of claim 53, wherein the second peptide moiety has a Factor Xa sensitive site. 57. 54. The method of claim 53, wherein the third protein portion has a β-galactosidase sequence or a portion thereof. 58. 54. The method of claim 53, wherein the third protein portion comprises a TrpE gene product. 59. The first peptide portion cannot form a sulfhydryl bond, the second peptide portion consists of a peptide having a collagenase sensitive site, and the third protein portion consists of a protein having β-galactosidase enzyme activity. The method according to item 53. 60. 59. The first peptide portion does not form a sulfhydryl bond, the second peptide portion has a peptide having an enterokinase-sensitive site, and the third protein portion has a protein that is the TrpE gene product or a portion thereof. The method described in. 61. 59. The first peptide portion is incapable of forming sulfhydryl bonds, the second peptide portion comprises a peptide having a Factor Xa sensitive site, and the third protein portion comprises a protein that is the Trp E gene product or a portion thereof. Those listed in Law. 62. The first peptide part cannot form a sulfhydryl bond, and the second peptide part cannot form a sulfhydryl bond. 60. The method of claim 59, wherein the third protein portion has a peptide having an enterokinase sensitive site and the third protein portion has a β-galactosidase sequence or portion thereof. 63. The first peptide part cannot form a sulfhydryl bond, and the second peptide part cannot form a sulfhydryl bond. The second protein part has a peptide with a factor Xa sensitive site, and the third protein part has a 60. The method of claim 59, comprising a lactosidase sequence or portion thereof. 64. 60. The method of claim 59, wherein the first peptide moiety retains no amino acid residues from the second peptide moiety after cleavage from the second peptide moiety. 65. 65. The trihybrid protein comprises at least about 20% of the total protein produced by the host organism. How to put it on. 66. 65. A method according to any one of claims 52 to 64, wherein the host organism is a prokaryote. 67. 67. The method of claim 66, wherein said host organism is a bacterium. 68. 66. The method of claim 65, wherein the host is a bacterium. 69. 65. The method according to any one of claims 52 to 64, wherein the first peptide moiety does not have a sulfhydryl bond. 70. The first peptide portion has the IL-6 amino acid sequence shown in FIG. 65. A method according to any one of claims 52 to 64. 71. The trihybrid protein is the total protein produced by the host organism. 71. The method of claim 70, having at least about 20% of the quality. 72. Recombinant plasmid with accession number ATCC40516 (p340). 73. Recombinant plasmid with accession number ATCC40517 (p367). 74. a first peptide portion having IL-6 activity, a second peptide portion having a cleavable peptide, and a third protein capable of being expressed by the selected host organism. a substantially pure recombinant protein having a quality portion; 75. A recombinant protein encoded by the gene of claim 1. 76. A recombinant protein encoded by the gene of claim 2. 77. A recombinant protein encoded by the gene of claim 3. 78. A recombinant protein encoded by the gene of claim 4. 79. A recombinant protein encoded by the gene of claim 5. 80. A recombinant protein encoded by the gene of claim 6. 81. A recombinant protein encoded by the gene of claim 7. 82. A recombinant protein encoded by the gene of claim 8. 83. A recombinant protein encoded by the gene of claim 9. 84. A recombinant protein encoded by the gene of claim 10. 85. A recombinant protein encoded by the gene of claim 11. 86. A recombinant protein encoded by the gene of claim 12. 87. A recombinant protein encoded by the gene of claim 13. 88. A recombinant protein encoded by the gene of claim 14. 89. Recombinant protein with IL-6 and collagen amino acid sequences shown in Figure 8b. protein. 90. Chemical or enzymatic opening of the protein of any one of claims 75 to 88. A recombinant protein with IL-6 activity that is a cleavage product. 91. The protein according to any one of claims 75 to 78, which does not contain cysteine. the product of chemical or enzymatic cleavage of a peptide, which after cleavage leaves a second peptide moiety A recombinant protein having IL-6 activity, characterized in that it does not possess amino acid residues derived from. 92. A synthetic peptide that has IL-6 activity and is substantially water soluble. 93. 60. A peptide according to claim 59, which is incapable of forming sulfhydryl bonds. 94. It has the IL-6 amino acid sequence shown in Figure 5, and the sequence is cysteine or its like. Synthetic peptides that do not contain homologs, analogs, or active moieties of Chido. 95. The IL-6 amino acid sequence of FIG. 5 does not contain cysteine. 1. A synthetic peptide characterized by having amino acids of a collagen linker partially or completely deleted. 96. The IL-6 amino acid sequence of FIG. 5 does not contain cysteine. A synthetic peptide in which all of the amino acids of the collagen linker and the serine residue that bridges the collagen to the IL-6 protein have been deleted. Do. 97. 97. Synthetic peptide according to any one of claims 94 to 96, having proline instead of glycine as the second amino acid in the N-terminal sequence. Petite. 98. 98. A synthetic peptide according to any one of claims 94 to 97, lacking an initial methionine in the N-terminal sequence. 99. 99. A synthetic peptide which is a derivative of the peptide according to any one of claims 94 to 98 by deletion, substitution, insertion, inversion, addition or exchange of amino acids. 100. A synthetic peptide consisting of a portion of the amino acid sequence of natural IL-6 from amino acid 29 to amino acid 212, which sequence contains cysteine but does not contain the amino acid sequence described above. A synthetic peptide characterized in that amino acid 29 is glycine instead of proline. 101. 101. A synthetic peptide according to claim 100 having an initial methionine residue. 102. A recombinant gene having a nucleotide sequence encoding the synthetic peptide of claims 92 to 101. 103. A vector comprising the recombinant gene of claim 102. 104. A unicellular host carrying the recombinant gene of claim 102. 105. 104. A unicellular host comprising the vector of claim 103. 106. 11. A method of stimulating antibody production in a host, the method comprising administering to the host an effective amount of the peptide of any one of claims 90-101 together with an effective antigen. 107. 102. A method of preventing or treating a viral infection in a host, comprising administering to the host an effective amount of a peptide according to any one of claims 90-101. 108. 102. A method of stimulating hepatic protein production in a host comprising administering to the host an effective amount of a peptide according to any one of claims 90-101. 109. 102. A method of stimulating terminal B cell differentiation in a host comprising administering to the host an effective amount of a peptide according to any one of claims 90-101. 110. 102. A method of stimulating hematopoietic stem cells in a host, comprising administering to the host an effective amount of the peptide according to any one of claims 90-101. 111. 102. A method of treating an immunosuppressed host comprising administering to the host an effective amount of a peptide according to any one of claims 90-101. 112. A single compound reacting with a peptide according to any one of claims 90 to 101. in immunoglobulin production comprising administering to a host an effective amount of a human antibody. A method of treating disease conditions involving functional impairments. 113. 102. A pharmaceutical formulation containing an effective amount of a peptide according to any one of claims 90 to 101 in combination with a pharmaceutically acceptable carrier. 114. 114. The formulation of claim 113, wherein the peptide comprises at least one A preparation characterized in that it is combined with other cytokines or hematopoietic growth factors. 115. 115. The formulation of claim 114, wherein the cytokine or hematopoietic growth factor is selected from erythropoietin, interleukin, and colony stimulating factor. formulation. 116. 115. The formulation of claim 114, wherein the interleukin is IL-1, IL-2 or IL-3, and the colony stimulating factor is G-CSF, GM-CSF, or M-CSF. A formulation characterized by: 117. Cytokine or hematopoietic growth factor according to claims 114 to 116 simultaneously or 1012. The synthetic peptide according to any one of claims 90 to 1011, which is used for treatment by continuous co-administration. 118. 114. The formulation according to claim 113, wherein the peptide contains an infectious protective antigen. A formulation characterized in that, in combination with an effective amount, it is present as an adjuvant. 119. The first part is an inducible promoter, the second part is a minicistronic sequence, the third part is a cloning site for inserting a DNA fragment with a protein lacking a stop codon, and the cleavable peptide nucleotides. A recombinant nucleic acid vector having a nucleic acid sequence encoding a fourth portion that is a nucleotide sequence of β-galactosidase in frame with a cleavable peptide of the fourth portion. The third part of the above nucleic acid sequence The loning site is located outside the translational reading phase in the fifth part of β-galactosidase. A recombinant nucleic acid vector characterized by: 120. 120. The vector of claim 119 having the DNA sequence shown in Figure 8b. 121. The recombinant gene according to any one of claims 1 to 14, having a DNA sequence encoding a peptide according to any one of claims 92 to 101. 122. A recombinant vector comprising the gene according to claim 121. 123. 123. A unicellular host comprising the vector of claim 122. 124. Recombinant vector with p340 plasmid. 125. Recombinant vector with mutant 1AB DNA sequence. 126. 126. A peptide produced by the vector of claim 125. 127. A DNA sequence encoding a peptide having IL-6 activity, characterized in that said peptide has a sequence formed by mutant 1AB. 128. A peptide encoded by the DNA sequence of claim 127. 129. A peptide having IL-6 activity, characterized in that the peptide has a natural IL-6 sequence from which amino acid residues 4-23 are removed. 130. A DNA sequence encoding the peptide of claim 129.