JP2770926B2 - Human placental angiogenesis inducer capable of promoting capillary endothelial cell protease synthesis, DNA synthesis and migration - Google Patents
Human placental angiogenesis inducer capable of promoting capillary endothelial cell protease synthesis, DNA synthesis and migrationInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
本出願はMoscatelliらの毛管内皮細胞プロテアーゼ、
DNA合成よおび遊走を促進することの出来るヒト胎盤血
管形成誘導因子という表題の、1985年12月17日出願の米
国特許出願番号No.809,873の継続出願である。
発明の背景
血管形成誘導因子は種々の性質、即ち、(1)内皮細
胞増殖;(2)内皮細胞プロテアーゼ合成増加;(3)
蛋白質の位置方向への内皮細胞遊走の促進;および
(4)生体内毛管増殖の誘起の能力を有する蛋白質とし
て定義されている。特に血管形成誘導因子として分類さ
れる物質は内皮細胞のDNA合成に影響することで有糸分
裂促進能を有し、従つて内皮細胞増殖の速度および血管
形成の速度を高めることが観察されている。
この性質と関連して血管形成誘導因子は内皮細胞によ
るプロテアーゼ合成を増加する能力がある。これらプロ
テアーゼとしてはプラズミノーゲン活性化因子(PA)お
よびコラゲナーゼがある。具体的には血管形成誘導因子
はPAおよび潜伏性コラゲナーゼの合成を促進し、PAはプ
ラスミン前酵素を特異性の広いプロテアーゼである活性
型プラスミンに変換し、これが潜伏性コラゲナーゼを活
性型コラゲナーゼに変換する。活性型プラスミンおよび
活性型コラゲナーゼの2つの酵素は周囲の組織中のほと
んどの蛋白質を分解することができ、従って毛管内皮細
胞等の種々組織の侵蝕を高める。さらに血管形成誘導因
子は特に毛管内皮細胞のようなある種の細胞では化学走
性を示し、即ち、血管形成誘導因子はそのような細胞が
それら因子の方向へ遊走するよう誘導する。
これらの特性を念頭に、血管形成誘導因子を単離する
ことによつて器官への血管供給を増加させることの出来
る治療剤を創製することができると考えられた。例えば
ある種の心筋梗塞後梗塞の結果中断した心臓への血液供
給の再成を促進すること、或いは慢性閉鎖症で血管の再
生長を促進することが望ましい。さらに、血管形成誘導
因子の使用により褥瘡、外科切開および特に老人および
糖尿病患者の遅延治癒性創傷の回復を促進できる。さら
に本物質をやけどに応用すれば治癒の速度や程度を高め
ることができる。従つてヒトに対する治療応用に適した
精製血管形成誘導因子を検索した。さらに血管形成を促
進する物質を研究することによりガン細胞への血液供給
を阻害し、ガンを飢死させる方法が見つかると考えてい
る科学者もいる。
既に「血管形成誘導因子」と称する蛋白質のクラスが
同定されているが、これらの蛋白質はヒト以外の動物か
ら単離されている。ヒト以外の動物から単離される血管
形成誘導因子は異種蛋白質に対する免疫反応副作用の可
能性のためにヒトへの治療剤としての使用に適当でない
と考えられる。その上、これらの個々の非ヒト蛋白質が
上述の血管形成誘導因子としての4つの特質を有するか
どうか、また観察される性状が蛋白質の組合せの間での
相互反応に起因するかどうか確認されていない。
事実、内皮細胞有糸分裂促進作用を有するとされる各
種蛋白質は2つのクラスに分類される:ヘパリン−セフ
アロースより1MのNaClで溶出され、酸性pIを有する外皮
細胞生育因子様分子;およびヘパリン−セフアロースに
より強度に結合し、塩基性pIを有する線維芽細胞生育因
子様分子である。さらに本発明者らは最近ハーバード医
学部のValleeらによりBiochemistry、24巻、5480−5499
頁(1985年)に出版された論文で「アンジオジエニン
(angiogenin)」と記載されている第三の血管形成誘導
因子が存在すると信じている。アンジオジエニンは真の
血管形成誘導因子の性状を有しているが有糸分裂促進作
用のみ持たぬ点で区別される。
これらのいろいろな研究を基に本発明者らは検討を重
ね、FGF塩基性と分類され得るヒト胎盤組織から単離さ
れるものと実質的に同質であつて単一分子の、上述の性
状、即ち、有糸分裂促進性、化学走性で生体内で毛管の
増殖を起こさせると共にプロテアーゼ合成を促進する性
質を有するヒト血管形成誘導因子を発見した。さらに本
発明者らは本血管形成誘導因子をヒト胎盤組織より実質
的に精製した状態で単離することを試みた。この単離し
た血管形成誘導因子のアミノ酸配列が決定された。この
アミノ酸配列の決定により本血管形成誘導因子の合成の
ための組換えDNA法に有用な染色体またはcDNA配列を得
るのに利用するDNAプローブの入手が可能となる。
発明の要約
本発明は血管形成誘導因子一般、さらに詳しくはFGF
塩基性と分類される血管形成誘導因子に関するものであ
る。特に本発明はヒト胎盤組織から単離され得るものと
実質的に同等であり、有糸分裂促進および化学走性能を
有し、プロテアーゼ合成を誘導して生体内で毛管増殖を
起させることが出来るFGF塩基性血管形成誘導因子に関
する。
特定的には、本発明は、
(1) ヒト胎盤組織(分娩後の)から単離できる天然
の血管形成誘導因子と実質的ホモロジーを示す精製した
ヒトまたは合成の一本鎖ポリペプチド蛋白質よりなる血
管形成誘導因子(bFGF)であって、該血管形成誘導因子
は、有糸分裂促進活性、化学走性活性、プロテアーゼ合
成促進能およびそれらの組合せより成るグループから選
ばれた活性を示す少なくとも一つの活性部位を有し、SD
S−PAGEで測定して約18,700ダルトンの分子量を有し、
そして以下のアミノ酸配列
を含有する血管形成誘導因子、(2) またはさらに上
記(1)の血管形成誘導因子のN末端に付加アミノ酸を
有する血管形成誘導因子およびその製造方法に関する。
ここで上記(2)の血管形成誘導因子はSDS−PAGEで測
定して約18,700ダルトンより大きい分子量を有するポリ
ペプチドを含む。
本発明の目的はこれらの性質を有する血管形成誘導因
子を精製した状態で提供することである。さらに本発明
の目的はこのような血管形成誘導因子のアミノ酸配列を
決定することである。さらに本発明の目的としてはプロ
テアーゼ合成を促進する能力と共に有糸分裂促進および
化学走性能の性質を示す医薬品調製物として価値のある
FGF塩基性を精製した形で提供することがある。
本発明のその他の目的および利点は以下の記載に示さ
れ、また記載より明らかであるか、或いは本発明の実施
から習得される。これらの目的および利点は特に添付の
請求の範囲に指摘するような方法および手段で実現し、
達成できる。
目的の達成のため、また本発明の目的に沿つて、有糸
分裂促進活性、化学走性活性、プロテアーゼ合成促進能
およびそれらの組合せより成るグループから選ばれる活
性を有する少なくとも1つの活性部位を有する血管形成
誘導因子が明かにされる。ヒト由来または合成のその血
管形成誘導因子はFGF塩基性と分類され、ヒト胎盤組織
から単離され得る天然の血管形成誘導因子と実質的均質
性を呈する。
血管形成誘導因子自体がプロテアーゼ合成を促進でき
るのが好ましいのであるが、ここで使用する「プロテア
ーゼ」という語は活性型と前駆体とを含む。そのような
前駆体としては潜伏性またはプローコラゲナーゼがあ
る。さらに本発明の範囲内に含まれるがプロテアーゼ合
成を直接促進はしないような血管形成誘導因子を単離す
ることも可能である。しかしそれらの血管形成誘導因子
は生物応答を起し、その結果プロテアーゼ合成を促進す
る。従つて、本発明の血管形成誘導因子は直接または間
接にプロテアーゼ合成を促進する。
本発明による特に好ましい血管形成誘導因子は以下の
中核アミノ酸配列を有す:
さらに次の配列を有するペプチドが中核配列外のポリ
ペプチド内に存在する。
およびここに示す配列中カツコは完全に同定されてい
ない一つのアミノ酸残基の存在を示す。もう一つの特に
好ましい血管形成誘導因子は以下の配列を有す。 上述の略号で表わされるアミノ酸は以下の「好ましい
実施態様の説明」の中に記載されている。
さらに、目的を達成するためそして本発明によつてヒ
ト胎盤組織から単離できる天然の血管形成誘導因子の実
質的に精製されたものが開示される。またさらに、目的
を達成するため、また本発明の目的によつて少なくとも
1つの活性成分、本発明により記載される血管形成誘導
因子を含有する医薬品組成物が開示される。
上記の一般記述および以下の詳細な記載は例示および
説明のためのみのものであつて、請求の範囲にある本発
明を制限するものではないのは言うまでもない。
好ましい実施態様の説明
本発明の現状で好ましい実施態様を記載するが、この
記載と続く例と合わせて本発明の基本を説明するもので
ある。
上述のように、本発明は精製された形で単離された血
管形成誘導因子に関する。好ましくは本発明の血管形成
誘導因子はヒト胎盤組織から単離され得る天然の血管形
成誘導因子と実質的に同質で、免疫的に同等であつて特
に好ましくは生物学的に同等である単一ポリペプチド鎖
蛋白質である。本明細書および請求の範囲で用いている
「生物学的に同等」というのは、本発明の組成物が天然
の血管形成誘導因子と同じように、しかし必ずしも同じ
程度ではなく有糸分裂促進活性および化学走性能を有
し、プロテアーゼ合成を誘導することが出来るという事
を意味する。
以下の明細書および請求の範囲を通して用いている
「実質的に同質」というのは、今までに報告され、精製
されている実質的に同質な血管形成誘導因子が示すより
もより高い天然血管形成誘導因子とのホモロジーを意味
する。好ましくはホモロジーの程度は50%以上、好まし
くは60%、さらに好ましくは75%以上高く、特に好まし
い蛋白質は天然の蛋白質と85%或いは90%のホモロジー
である。上記ホモロジーの程度は、特に参考文献として
採用するAtlas of Protein Sequences and Structure、
第5巻、124頁(1972年)、National Biochemical Rese
arch Foundation、ワシントン、D.C.、中でM.O.Dayhoff
により記載されるように、配列に加えるために100個の
アミノ酸の長さに4ギヤツプを導入し、比較する配列で
同一アミノ酸を並べて二本の配列の短い方の配列で見ら
れるアミノ酸残基のパーセントとして計算する。
ここに記載する本発明の血管形成誘導因子はヒトより
単離されるか、または合成のポリペプチドである。「合
成」ポリペプチドという用語は今まで天然から実質的に
精製した形で単離されていないアミノ酸配列のことを言
う。この定義を用いると、「合成」という中には他の物
と共に組換えDNA法により創造されるポリペプチドまた
は全体または一部分を試験管内で合成したものを含む。
特に以下に記載される好ましい配列と1個または2個の
アミノ酸が異なる合成ポリペプチドが企画される。
本発明による好ましい血管形成誘導因子はヒト胎盤組
織抽出物より発見され、初めて精製した形で単離され
た。本出願の目的において、ここに開示する血管形成誘
導因子に関して使用する「純粋の形」または「精製した
形」というのは血管形成誘導因子以外の他の蛋白質を実
質的に含有していない事をいう。好ましくは本発明の血
管形成誘導因子は少なくとも50%の純度、好ましくは70
%の純度であり、もつと好ましくは80%または90%の純
度である。
さらに、本発明の血管形成誘導因子は種々の腫瘍およ
び正常細胞から単離された。その例としてSK−Hepl細
胞、HeLa細胞、K562細胞およびヒト胎児肺線維芽細胞な
どがある。
本発明の血管形成誘導因子は次のステツプより成る方
法によりヒト胎盤組織から純粋に単離できる:(a)ヒ
ト胎盤組織の採取;(b)組織中の蛋白性物質の分画に
よるヒト胎盤組織からの血管形成誘導物質の単離;
(c)血管形成誘導因子活性を有する画分の同定;およ
び(d)血管形成誘導因子活性を示す画分の濃縮。
好ましい実施態様では、ヒト胎盤組織に存在する蛋白
性物質はヘパリンアフイニテイクロマトクラフイー、イ
オン交換クロマトグラフイーおよび任意にゲル濾過クロ
マトグラフイーの組合せにより分画する。ここで述べる
血管形成誘導因子は胎盤蛋白質特異性のモノクローナル
抗体を使用しても単離できる。この具体例では抗原を胎
盤蛋白質に対するモノクローナル抗体を含有するマトリ
ツクス(樹脂)に結合し、樹脂を緩衝液で洗滌すること
により非抗原性蛋白質を除去する。次に高いpHまたは低
いpHの緩衝液、高イオン強度の緩衝液或いはカオトロピ
ツク剤を単独または組合せで温度を変化させることによ
り抗原を抗体から除去する。
このようにして得られた画分につき血管形成誘導因子
活性の存在を検索する。好ましくは適当な内皮細胞培
養、好ましくは哺乳動物毛管内皮細胞を血管形成誘導因
子の存在下でインキユベートし、培地中の潜伏性コラゲ
ナーゼおよび細胞内のPAを測定することによりPAおよび
コラゲナーゼ合成への影響を評価することにより行なつ
た。血管形成誘導因子により誘発された細胞が生成する
プロテアーゼの量はELISAまたはRIAアツセイ或いは免疫
沈降法のような免疫学的方法により測定する。
血管形成誘導因子の有糸分裂促進活性は好ましくは適
当な内皮細胞、好ましくは哺乳動物の毛管内皮細胞を血
管形成誘導因子および放射標識ヌクレオチド、好ましく
は125I−沃化デオキシウリジン(125I−dU)の存在下で
インキユベートすることにより測定する。トリクロール
酸不溶性画分に取り込まれる125I−dUの量をDNA合成の
程度の指標として測定する。血管形成誘導因子の化学走
性能は、適当な内皮細胞培養、好ましくは哺乳動物毛管
内皮細胞を血管形成誘導因子の存在下でインキユベート
し、適当な槽中、好ましくは改良型Boydenチヤンバー中
で細胞の移動性を測定することにより判定する。
上述のように本発明者らは血管形成誘導因子をヒト胎
盤組織から今まで得られていない精製した形で単離する
ことに成功した。本蛋白質を精製した形で単離すること
は、本蛋白質の正しい配列決定並びに血管形成誘導因子
を含む医薬組成物の開発に必須である。
本発明の好ましい血管形成誘導因子は以下の中核アミ
ノ酸配列を有する:
なる配列を有するペプチドが中核配列外に存在する。も
う一つの特に好ましい血管形成誘導因子は次の配列を有
する:
上記略号は例えばA.L.LehningerによるBiochemistr
y、第2版、Worth Publishers,Inc.、ニユーヨーク(19
75年)、72頁に記載される標準のアミノ酸配列略号に対
応する。請求されている血管形成誘導因子の活性は本来
のポリペプチドから15、16、17または18個のN末端アミ
ノ酸残基を除去しても影響されることはないと考えられ
ている。従つて、これらの省略配列の全てが本発明に含
まれる。その上、本来のポリペプチドのN−末端アミノ
酸に110個のアミノ酸までを延長することも企画され
る。
また本発明の血管形成誘導因子のC−またはN−末端
にポリペプチド鎖を付加することも考えられる。特に、
ポリペプチド鎖はいずれかの末端に蛋白質融合技術によ
り結合される。これらの塩化ポリペプチドは本発明の血
管形成誘導因子の薬効を高める役割を任う。例えば他の
ポリペプチドとの融合により本ポリペプチドが低pHまた
は高温下で活性を保持できるようになるか、或いは得ら
れるポリペプチドが長い循環寿命、分解に対するより高
い抵抗性を有するようになるかまたは小腸上皮を通して
の透過性が増加する。
しかし、これらの変化でアミノ酸配列の変異は本血管
形成誘導因子を投与する生物での免疫応答副作用を起す
ようであつてはいけなく、そのような副作用は血管形成
誘導因子に由来する利点が保証されないほどの損害とな
り得る。生物活性分子がそのような免疫応答副作用を起
すかどうかの判定方法は通常の技術の熟練者に周知であ
る。
本発明の血管形成誘導因子および本明細書で開示され
るアナログは有糸分裂促進或いは化学走性能を有し、ま
たプロテアーゼ合成を促進する能力を持つ医薬製品の形
でヒトおよび動物に応用される。少なくとも一つの活性
成分として本発明の血管形成誘導因子の一つを含有する
医薬品組成物は目的の剤形によりまた適当な医薬的に許
容される担体、希釈剤、充填剤、結合剤、および他の賦
形剤を含有する。経口投与用には活性蛋白質の消化管中
の分解を防ぐ手段をとらねばならない。従つて腸溶皮剤
形が経口投与に適当な一つの形として考えられる。非経
口投与を採用する場合には、調製物は水または塩溶液或
いは他の医薬的に許容される溶液剤を含有する。一般に
非経口投与のための調製物は最終的に全体で体液と同じ
浸透圧となる十分濃度の塩化ナトリウムを含むのが好ま
しい。本発明の血管形成誘導因子を含む医薬品調製物で
傷、外科切開または皮膚潰瘍の治療のため注射または局
部投与のように局所投与用も考えられる。さらに心筋梗
塞後の心臓への血液供給を再開するための投与用に徐放
性挿入剤も考えられる。
上述の各疾病の治療に適当な投与量および前述のデリ
バリー法に使用する適量を決定するのに必要な計算は普
通の技術の熟練者により常法で行なわれ、特に標準アツ
セイや本明細書に開示するアツセイを考慮に、不必要な
実験をしないで通常できる範囲のものである。計算した
投与量は適当な投与量応答データー合せて有効投与量を
決定する確立したアツセイを用いることにより確認され
る。
本発明の教えの具体的な個々の問題や状況に応じた応
用は本明細書に含まれる教えを考慮して通常の技術熟練
者の能力範囲内のものである。本発明の生成物の例およ
びその単離および製造の代表的な方法は以下の例に示
す。
例1
胎盤組織からのヒト血管形成誘導因子の精製
A.蛋白質の精製
出産後の満期ヒト胎盤を−20℃で凍結する。凍結胎盤
を小片に切り、電気食品チヨツパー(General Slicing,
ニユーヨーク州、バルデン)でひき、食品用加工機でホ
モジナイズする。ホモジナイズ後の操作は全て−4℃で
行なう。ホモジナイズした胎盤を冷20mMトリス、pH7.
5、3mM EDTAで希釈し、50W(モデル185ソニケーター、
Branson Sonic Power Co.、ニユーヨーク州、プレーン
ビユー)で10分間ソニツクにかける。通常1kgの凍結胎
盤から2リツトルの処理物を得る。
音波処理物を塩酸でpH4とし、2分間このpHにインキ
ユベートした後NaOHで中和する。NaClを終濃度0.5Mとな
るように添加してから10,000×gで60分間遠心分離す
る。上澄液を0.5M NaCl/3mM EDTA 120mMトリス、pH
7.5で平衡化したヘパリン−セフアロース(フアルマシ
ア、ニユージヤージー州、ピスカタウエイ)のカラム、
85×153mm、にのせる。カラムを同じ緩衝液で洗い、2M
NaCl/3mM EDTA/20mMトリス、pH7.5で溶出する。溶出
液を3mM EDTA/20mMトリス、pH7.5で希釈して電導度を2
4mmhoとし、二回目のヘパリン−セフアロースカラム(1
6×190mm)にのせる。カラムを3mM EDTA/20mMトリス、
pH7.5、中0.7M NaCl溶液で洗い、同じ緩衝液中NaClの
0.7から2Mの勾配で溶出する。
各画分につきプロテアーゼ誘導活性を測定し、活性画
分を三回目のヘパリン−セフアロースカラム(12×75m
m)で濃縮する。カラムを先ず3mM EDTA/20mMトリス、p
H7.5、中0.8M NaCl溶液で、次に0.1Mりん酸ナトリウ
ム、pH6.0、中0.2M NaCl溶液で洗滌し、0.1Mりん酸ナ
トリウム、pH6.0中0.2M NaCl溶液で溶出する。三回目
のヘパリン−セフアロースカラムからの活性画分を20倍
量の0.1Mりん酸ナトリウム、pH6.0で希釈する。
希釈液を10,000×gで30分間遠心分離してから同じ緩
衝液で平衡化した9×72mmのCM−セフアデツクスC−50
カラム(フアルマシア)にのせる。カラムを0.1Mりん酸
ナトリウム中0.15M、0.5Mおよび2MのNaCl溶液で順次溶
出し、各画分のプロテアーゼ誘導活性を測定する。
プロテアーゼ誘導活性を含むCM−セフアデツクスカラ
ムからの0.5M NaCl溶出液を0.5mlのヘパリン−セフア
ロースカラムで濃縮する。このカラムは60mMりん酸ナト
リウム、pH6.0、中2M NaCl溶液の0.5mlずつで順次洗
う。活性は全て最初の1mlに溶出された。この溶出液に
つき、2M NaCl、60mMりん酸ナトリウム、pH6.0を用
い、流速0.5ml/minでFPLCスペロース−12のカラム(フ
アルマシア)にかける。
本発明の請求の範囲にある血管形成誘導因子はこの溶
出液から単離される。この血管形成誘導因子は本例中で
「蛋白質」とも呼ぶ。
B.蛋白質の性状および血管形成誘導因子活性の確認
1.NaDad SO4−PAGE
NaDod SO4ポリアクリルアミドゲルを用い、3%の上
層ゲルおよび10−18%勾配の分解ゲルを調製し、特にこ
こに参考文献として採用するNature277巻、680−685頁
(1970年)に記載されるLaemmliの方法に従つて泳動す
る。カラムからの活性画分はNaDod SO4−PAGEで分子量
18,700の単一バンドであった。
2.蛋白測定
蛋白濃度はウシ血清アルブミンを標準として用いたBi
o−Rad蛋白アツセイ(Bio−Rad Laboratories,カリフオ
ルニア州、リツチモンド)により測定する。本蛋白質の
配列に関する情報は例4に記載する。
3.有糸分裂促進活性−125I−沃化デオキシウリジンの取
り込み
屠殺したばかりの一才牛の副腎皮質よりウシ毛管内皮
(BCE)細胞を、ここに参考文献として採用するProc.Na
tl.Acad.Sci.USA76巻、5217−5221頁(1979年)に報告
されているFolkmanらの方法により単離する。特にここ
に参考文献として採用するJ.Cell Biol.95巻、974−981
頁(1982年)中でGrossらにより記載されるようにマウ
ス肉腫180細胞で条件づけした培地で補足した10%(v/
v)仔ウシ血清加アルフア最少必須培地(MEM)中で細胞
をコンフルエントになるまで生育させる。コンフルエン
トに到達したら培地を5%仔ウシ血清加の条件因子を含
まぬMEM培地と交換する。
BCE細胞のコンフルエント培養物を5%仔ウシ血清加M
EM培地中で7日間維持する。その後培地の各種濃度の精
製胎盤血管形成誘導因子を含む5%仔ウシ血清加MEM培
地に変える。20時間後に培地を5%仔ウシ血清および0.
3μCi/mlの125I−沃化デオキシウリジン(2000Ci/mmo
l、New England Nulear、マセチユセツツ州ボストン)
を含有するダルベツコ改良イーグル培地に置換する。標
識培地中で16時間インキユベート後、細胞を冷りん酸緩
衝塩液で洗滌して標識を停止する。細胞を冷5%トリク
ロロ酢酸(TCA)と30分間インキユベートし、5%TCAお
よび蒸溜水で二回洗滌して酸不溶物に取り込まれる。
125I−沃化デオキシウリジンを測定する。
4.遊走性測定
遊走性測定は、ここに参考文献として採用されるPro
c.Natl.Acad.Sci.USA 79巻:5597−5601頁に記載される
Castellotの方法に従い、ゼラチンおよびフイブロネク
チンで被覆したPVP非含有のポアサイズ5μmのポリカ
ーボネート製フイルターを用いて200μのブラインド
ウエル(Nuoleopore、カリフオルニア州、プレサント
ン)中で行なう。0.5%のウシ胎児血清含有のMEM培地で
10段階希釈した精製プロテアーゼ誘導因子をウエルの下
層に入れる。次にフイルターを挿入し、200μの0.5%
ウシ胎児血清加MEM培地に入つた5×104個のBCE細胞を
ウエル上層に添加する。37℃で4時間インキユベート後
ウエル上層の培地を除去し、フイルターの上部表面の細
胞を静かに綿棒で取り除く。次にフイルターを取り外し
て室温で乾燥し、ライト−ギムザ色素(Baker Chemical
Co.、ニユージヤージ州、フイラデルフイア)で染色す
る。フイルターの下部表面の全細胞数を光学顕微鏡(40
0倍の倍率)で数える。
5.PAおよびコラゲナーゼの誘導測定
少なくとも2日間5%仔ウシ血清含有のMEMで維持し
たBCE細胞のコンフルエント培養物を5%仔ウシ血清お
よび試験する物質を含む新しいMEM倍値と交換する。37
℃で24時間インキユベート後培地を集め、参考文献に採
用するCell.20巻;343−351頁(1980年)中にMoscatelli
らにより記載されるようにしてコラゲナーゼを測定す
る。コラゲナーゼは全て潜伏性であるので活性を検出す
るためトリプシンで活性化する。この同じ培養物からの
細胞単層を冷りん酸緩衝塩液で2回洗滌し、0.1Mりん酸
ナトリウム、pH8.1、中の0.5%(v/v)トウイトンX−1
00溶液で抽出してからGrossら(前述)により記載され
るようにPA活性を測定する。実験の結果、細胞抽出物の
PA量は条件づけした培地中で見られた量に比例している
ことがわかつた。プロテアーゼ誘導活性の1単位はPAお
よびコラゲナーゼ合成の最大誘導の半分まで誘導するの
に必要な量と定義する。
例2
ヒト胎盤組織からの血管形成促進因子の精製
例1の方法に従つて二回目のヘパリン−セフアロース
カラムにかける溶出液を得る。カラムを3mM EDTA/20mM
トリス、pH7.5、中0.95M NaCl溶液で洗い、同じ緩衝液
中の2M NaCl溶液で溶出する。
2M溶出液を0.2M NaCl/20mM MES、pH6.0、に対して
透析する。透析物を100,000×gで60分間遠心分離して
不溶物を除き、Fast Protein Liquid Chromatography
(FPLC)システムを用いてMono−Sカラムにかける。カ
ラムを0.2M NaCl/20mM MES、pH6.0、で洗滌後20mM M
ES、pH6.0中の0.2−2M NaCl勾配で溶出する。各画分に
つきプロテアーゼ誘導活性を測定する。プロテアーゼ誘
導活性は0.45−0.6M NaClで溶出した。
例3
肝癌細胞からの血管形成誘導因子の精製
FPLC以外の全ての精製ステツプは4℃で行なう。SK−
Hep−1細胞(American Type Culture Collection[ATC
C]寄託番号No.HTB52)のコンフルエント単層より細胞
を冷PBSにかけ取り、400×gで10分間遠心分離して集め
る。細胞ペレツトを10倍容量のPBS/0.5M NaClにけん濁
し、Branson Sonicator(ニユーヨーク州、プレインビ
ユー)を用いて5ワツトで3分間音波処理を行なう。抽
出物を遠心分離にかけ(10,000×g、1時間)、上澄液
を集める。ペレツトは等容量のPBS/0.5M NaClに再けん
濁して音波処理を行ない、遠心分離する。上澄液を合わ
せて28×75mmのPBS/0.5M NaClで平衡化したヘパリン−
セフアロースカラム(フアルマシア、ニユージヤージー
州、ピスカタウエイ)を通す。カラムを0.5M NaCl/3mM
EDTA/100mMトリス、pH7.5で洗滌後、同じ緩衝液中の
0.5−2M NaCl勾配で溶出する。各画分についてPA誘導
活性を測定し、活性画文を集めて電導率が20mmhoとなる
まで3mM EDTA/20mMトリス、pH7.5で希釈する。
次に活性物質を3mM EDTA/20mMトリス、pH7.5中0.5M
NaCl溶液で平衡化した二回目のヘパリンセフアロース
カラム(10×75mm)にかける。カラムを先ず0.5M NaCl
で、次に3mM EDTA/20mMトリス、pH7.5で洗い、同じ緩
衝液中の0.9−2M NaCl勾配で溶出する。活性画分を三
回目のヘパリン−セフアロースカラム(7×85mm)にの
せて20mM MES、pH6.0中の0.5M NaClで洗滌後、NaClを
2Mとして溶出する。三回目のヘパリン−セフアロースカ
ラムからの活性画分を20mM MES、pH6.0、で1:10に希釈
して100,000×g、/時間の遠心分離で不溶性物質を除
く。
これを0.2M NaCl/20mM MES、pH6.0で平衡化したMon
o−S FPLCカラム(フアルマシア)にのせる。カラム
を0.2M NaClで洗つてから溶出をNaClの勾配(20mM ME
S、pH6.0、中0.2から2M)で溶出する。各画分につきPA
誘導活性を測定し、活性画分を集めて純度をNaDod SO4
−PAGEで検定する。
例4
ヒト胎盤より単離した胎盤血管形成誘導因子(PAF)の
アミノ酸配列の決定
A.Lys−Cペプチド
上述の例2の方法により20mM MES、pH6.0、0.5M Na
Clに溶解した精製PAFを得る。天然蛋白質を以下のよう
にエンド型プロテナーゼLys−Cを用いて消化する:2nmo
leの天然蛋白質を350μの20mM MES、pH6.0、0.5M N
aClに溶解して含有する反応液を2M NH4HCO315μを添
加してpH8.7に調整する。1.17単位のエンド型プロテナ
ーゼLys−C(ベーリンガー)を添加し、37℃で7時間3
0分消化を行なう。次に2−メルカプトエタノールを最
終濃度が1%(v/v)となるように添加し、37℃でさら
に15分間インキユベートする。トリフルオロ酢酸(TF
A)を最終濃度0.1%(v/v)となるように添加し、消化
物をSynchrom RP8カラムを用いた逆相高速液体クロマ
トグラフイー(HPLC)で分画する。ペプチドは0.1%TFA
水溶液および次に0.1%TFA中のアセトニトリル勾配(60
分間で0‥60%のアセトニトリル)でカラムから溶出す
る。カラムからのペプチド溶出はA215およびA280で追跡
し、適当な画分を手動で集める。
19%のアセトニトリルで溶出したペプチドを自動エド
マン分解により配列決定した結果、次の配列を示した:
この配列および以下の配列中カツコ内に示すアミノ酸
残基ははつきりと同定されていない残基である。
19.8%のアセトニトリルで溶出したペプチドを配列決
定した結果次の配列であつた:
同じ消化物から17.5%アセトニトリルで溶出した他の
ペプチドは次のアミノ酸配列を示した:
26%のアセトニトリルで溶出したペプチドを自動エド
マン分解にかけて次のアミノ酸配列を示した:
16%のアセトニトリルで溶出したもう二個のペプチド
は混合物として得られ、配列決定前に再精製した。得ら
れたペプチド混合物を真空下で乾燥し、100μの50mM
トリス−塩酸、pH8.5、8M尿素に再けん濁する。20nmole
のジチトトライトール(DTT)を添加して37℃15分で存
在するS−S結合を還元する。次に60nmoleの3H−沃度
酢酸を添加してペプチドをカルボキシメチル化し、室温
で暗所下20分インキユベートする。さらに60nmoleのDDT
を添加して室温で30分間インキユベートした後、反応液
をTFA0.1%に調整し、Altex C−3逆相カラムを用いたH
PLCで再分画する。ペプチドはカラムより0.1%TFA水溶
液および続くアセトニトリル勾配(120分間で0−60%
アセトニトリル)で溶出する(流速1ml/min)。
13%アセトニトリルで溶出したペプチドを自動エドマ
ン分解にかけたところ次の配列を示した:
B.SMP−ペプチド
天然PAF蛋白質をマウス下顎腺プロテアーゼで消化し
てさらにペプチドを得る。
350μの20mM MES、pH6.0、0.5M NaCl中に2nmole
の蛋白質を含む溶液に25μの1M TANCO3、pH9.0、を
添加してpH8.0に調整する。下顎腺プロテアーゼ(3.6μ
g)を添加して消化を37℃で24時間行なう。90nmoleのD
TTを添加して37℃のインキユベーシヨンを30分間続け
る。360nmoleの3H−ヨード酢酸を添加してペプチドのカ
ルボキシメチル化を行ない、室温暗所で20分間インキユ
ベーシヨンをする。さらに360nmoleのDTTを添加してか
ら反応液をTFA中0.1%(v/v)に調整し、上述のように
ペプチド混合物をRP−8HPLCで分画する。
12%アセトニトリルで溶出するペプチド混合物を一つ
の画分に集め、乾燥して100μの50mMトリス−HCl、pH
0.8M尿素に再けん濁してAltex C−3カラムを用いたHPL
Cで再分画してLys−Cペプチドの精製で記載した溶出ス
ケジユールと同じように溶出した。
14.8%アセトニトリル(a)および15.3%アセトニト
リル(b)で溶出した二つのペプチドを自動エドマン分
解にかけて次のようなアミノ酸配列を得た:
天然PAFをS.aureusプロテアーゼ(V8)で消化してい
くつかのペプチドを得た。500μの20mMトリス−HCl、
pH7.5、2M NaClに溶解した1moleの蛋白質をRP−8逆相
カラムを用いてHPLCで脱塩する。蛋白含有の脱塩画分を
乾燥し、50mM酢酸、pH4.0の50μに再けん濁し、1μ
gのV8のプロテアーゼを加える。37℃18時間消化を行な
う。ペプチドを上述のようにRP−8逆相カラムを用いた
HPLCで分画する。
17%アセトニトリルで溶出したペプチドを自動エドマ
ン分解にかけ次のアミノ酸配列を得た: V8消化物からの20%アセトニトリル溶出のペプチドも
配列決定し、次の結果を得た:
21%アセトニトリルで溶出したV8ペプチドを配列決定
して次の結果を得た:
上記アミノ酸配列を整理すると以下に示すヒト塩基性
線維芽細胞増殖因子の中核配列が得られる:
さらに他のペプチドを単離して自動エドマン分解にか
けた。それらのアミノ酸配列は上記中核配列外にあつ
た。
下顎腺消化物(上記参照)の分画で13%のアセトニト
リルで溶出したペプチドは次のアミノ酸配列を示した:
20%アセトニトリルで溶出したLys−Cペプチドは次
のアミノ酸配列であつた:
例5
治療剤として臨床応用に適した血管形成誘導因子性状の
同定
例1および例2の方法により単離した胎盤由来の因子
および肝癌細胞から単離した因子が血管形成誘導因子に
予想される試験管内の三つの全ての性質を示すことを明
かにした。先ず、0.1から10ng/mlの範囲の濃度でこれら
の分子はBCE細胞のPAおよび潜伏性コラゲナーゼの合成
を促進する。PAは前酵素プラズミノーゲンを特異性の広
いプロテアーゼであるプラズミンに変換することができ
る。プラズミンは潜伏性コラゲナーゼを活性コラゲナー
ゼに変換できる。従つて低濃度の本因子の影響で毛管内
皮細胞は周囲組織のほとんどの蛋白質を分解できる少な
くとも2つのプロテアーゼを生成し、その結果細胞が組
織に侵入する。
精製分子はBCE細胞のPAおよびコラゲナーゼを濃度依
存的に促進する。コラゲナーゼは全て活性型である。ト
リプシン処理の後コラーゼ分解活性が検出された。PAお
よび潜伏性コラゲナーゼの両者が相関して促進される。
1/2最大促進は1ng/mlのプロテアーゼ誘導因子の濃度で
観察される。未処理細胞で生成するPAおよびコラゲナー
ゼの量は実験により差があり、従つて促進の割合も変化
する。プロテアーゼ誘導因子の濃度を非常に高くする
と、化学走性および有糸分裂促進と同様にPA合成の促進
も低下する。BCE細胞をPAおよびコラゲナーゼを誘導す
る濃度のプロテアーゼ誘導因子と24時間インキユベート
すると、細胞の形態が典型的な玉石型から伸長した紡錐
型に変化する。
第二番目として本因子はBCE細胞に対して化学走性能
を示す。そこで試験管内で毛管内皮細胞は本因子の方向
に移動する。本因子を0.001および0.1ng/mlの範囲の濃
度で添加するとBCE細胞の化学走性がブラインドウエル
槽内で促進される。これより高い濃度では化学走性は見
られない。上槽から下槽への細胞移動の増加は下槽に上
槽より高濃度の因子が存在する場合のみ観察され、この
ことは真の化学走性が起きていることを示す。化学走性
は観察される運動性増加の25%以上を占めることはなか
つた。
第三番目に、本因子はBCE細胞に対して有糸分裂促進
を示す。BCE細胞培養にプロテアーゼ誘導因子を添加し
た時、その添加量に依存した125I−ヨードデオキシウリ
ジンのDNAへの取り込み促進を示す。プロテアーゼ誘導
因子の濃度を高めるとこの誘導活性は低下する。125I−
ヨードデオキシウリジン取り込みの促進はPAおよびコラ
ゲナーゼ誘導ができると同じ濃度で観察される。胎盤由
来の粗超音波処理物による125I−ヨードデオキシウリジ
ンのDNAへの取り込み促進は他の有糸分裂促進活性と相
関していることを本発明者は既に確認している。従つて
本因子は真に有糸分裂促進的に作用している。精製した
単一分子がBCE細胞でPAおよびコラゲナーゼを誘導し、
細胞複製を促進し、その運動性を促進する能力があると
考えられる。
例6
血管形成活性
血管形成の測定のためにAuat.Rec.199巻、33−42頁
(1981年)に報告されているようにDunnらの方法を用い
た実験で、例2の血管形成誘導因子はトリ繊毛尿膜上で
65ngの投与量で91%の卵で血管形成を促進した。
例7
a) PAFのN−末端アミノ酸配列
上述のようにして(例1および例2参照)ヒト胎盤血
管形成因子を精製する。20mM MES緩衝液、pH6.0、およ
び500mM NaClに溶解した精製蛋白質をRP−8逆相カラ
ムを用いた高速液体クロマトグラフイーで脱塩する。25
0から500pmoleの脱塩蛋白質を自動エドマン分解するた
めABI470A気相蛋白質シークエンサーにかける。得られ
るPTHアミノ酸をシアン逆相カラムを用いた高速液クロ
で同定する。
これらの実験結果よりPAFのN末端アミノ酸配列は以
下のように決定された:
さらに、上述のPAFのN末端アミノ酸配列は例4、A
に記載するクロマトグラフイー系で23%アセトニトリル
で溶出したLys−Cペプチドの自動エドマン分解によつ
ても確認された。
b) PAFのC末端アミノ酸配列
PAFのLys−C消化物より例4に記載のようにC−末端
PAFペプチドを単離した。本ペプチドは22%アセトニト
リルで溶出する。このペプチドを自動エドマン分解にか
けて次のアミノ酸配列を示した:
A−I−L−F−L−P−M−S−A−K−S
(i) 例;(ii)PAFのN末端アミノ酸配列;(iii)
PAFのC末端アミノ酸配列;および(iv)cDNAのデータ
を総合してPAFの全アミノ酸配列は以下のとおりであ
る:
1.PAF 1型
2.PAF 2型:N末端ブロツクPAF
精製PAFおよび天然PAFを自動エドマン分解にかけた多
くの実験で、チヤージした蛋白質のある部分(50−80
%)がエドマン処理で分解しないことがわかつた。
PAF蛋白質分子の一部分はN末端がブロツクされて存
在するものと考えられた。
ブロツクしている基の性状は精製アミノ末端ペプチド
の研究により明白になつた。PAFの酵素分解(例4参
照)から得られるアミノ末端ペプチドはアミノ酸分析で
同定する。また濾紙電気泳動または薄層クロマトグラフ
イーと参照文献として採用するChem.Ber.87巻、1103−1
107頁(1954年)中にF.ReindelおよびW.Hoppeにより記
載される塩素/O−トリジン試薬による染色で同定され
る。(ブロツクされているペプチドは側鎖のリジン残基
による弱い呈色以外には、先ず加水分解しない限りニン
ヒドリンで検出されない。)
さらに、小さいN−末端ブロツクPAFペプチドは酸性
サーモリシンまたはペプシンによるPAF消化物をNarita
ら(1975年)によりProtein Sequence Determination、
30−103頁、Springer−Verlag、ベルリン、ハイデリベ
ルグ、ニユーヨーク、中に記載されるようにDowex50、x
20(H+型)のクロマトグラフイーで単離するか、I.Klun
によりColl.Czech.Chem.Comm.(英語版)44巻、145−14
7頁(1979年)に記載されるようにスルホエチル−セフ
アデツクスのクロマトグラフイーにより単離できる。こ
れらの文献は参考文献としてとり上げている。
ブロツクされた短かいペプチドの構造は多くの標準手
法および方法により決定される。例えば、G.AllenのSeq
uencing of Proteins and Peptides;North Holland Pub
lishing Company、アムステルダム、ニユーヨーク、オ
ツクスフオード(1981年)またはそこに記載されている
文献で、これらの本出願の参考文献として採用してい
る。これらの手順および方法はN末端のブロツクしたペ
プチドのカルボキシペプチダーゼ、プログルタミン酸ア
ミノペプチダーゼによる消化、ヒドラジン分解、質量分
析、核磁器共鳴、ガスクロマトグラフイーおよびBoisse
lら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82巻、8448−8452(198
5年)により記載されるFAB質量分析などがある。
3.PAF 3型:短縮および伸長PAF
ウシ腎線維芽細胞生育因子(FGF)はN末端からのア
ミノ酸の多くを欠損していることがわかつている(A.Ba
irdら、Regul.Pept、印刷中:1985年)(D.Gospodarowic
z、Meth.Enzymol印刷中:1986年)。G.NeufeldおよびD.G
ospodarowicz、J.Biol.Chem.260巻、13860−13868頁(1
985年)により示されているように短縮した繊維芽細胞
生育因子はFGFレセプターの結合能力を保持しており、
このことは本蛋白質のN末端はFGFの細胞表層レセプタ
ーとの相互作用に重要な役割を持たないことを示してい
る。従つて、PAFの短縮型および伸長型の両者ともレセ
プター結合能を保持すると予想される。PAFの生物活性
を保持したままのN末端最大欠損および伸長はまだ決定
されていない。
例8:PAFのcDNAクローン
SC−HEP−1細胞を10%ウシ胎児血清、非必須アミノ
酸およびPen−Strep添加の最少必須イーグル培地で培養
する。RNAはここに参考文献として採用するMolecular C
loning:A Laboratory Manual.(Cold Spring Harbor La
boratory,New York、1982年、191−193頁)中にManiati
sらにより記載されるNP−40溶解法を用いて単離した。P
oly(A)+mRNAを文献として採用したProc.Natl.Acod.S
ci.USA 69巻、1408頁(1972年)に記載されるH.Avivお
よびP.Lederの手法を用いたオリゴdTクロマトグラフイ
ー(BRL)により選択した。こゝに文献として採用したG
ene、25巻、263−269頁(1983年)にGublerおよびHoffm
anが記載するように、オリゴdTによる第一鎖合成および
RNase H−DNAポリメラーゼ関与の第二鎖合成を用い、
5μgのmRNAから8μgの二重鎖cDNAを得た。この操作
にはAmershamの試薬を使用した。以下の反応は特に記載
しない限り製造元の指示通り行なつた。このcDNAを10単
位のT4DNAポリメラーゼ(Amersham)を用いて平滑末端
化した。EcoR I部位は400単位のEcoR Iメチラーゼ(New
England Biolabs)および100mMのS−アデノシルメチ
オニンで保護した。同量のEcoR Iリンカー(New Englan
d Biolabs、8塩基対)を1単位のT4DNAリガーゼ(Prom
ega Biotec)で結合した。過剰のリンカーは200単位のE
coR I(New England Biolabs)で消化して除去し、100n
gのこのcDNAをEcoR I消化のアルカリフオスフアターゼ
処理ラムダgt−10 DNA(Vector Cloning Systems)1
μgと連結する。DNAをインビトロでパケツジングし(V
ector Cloning System)、E.coli C600HFLaにプレーテ
イングして8.2×105個の形質転換株を得た。
オリゴヌクレチオドプローブのデザイン
SK−HEP−1 cDNAクローンの単離のため2種の混合
配列オリゴヌクレオチドプローブを使用した。プローブ
は決めたアミノ酸配列に対応する全ゆるDNA配列をプー
ルしたものより成る。プローブは本明細書に記載される
PAFの中核アミノ酸配列中の配列を選択した。プローブ
#5はアミノ酸配列
Ile−Lys−Gly−Val−Cys−AlaをコードするDNAとハイ
ブリダイズするように作成し、192配列から成る17マー
である:
X=A、T、GまたはC
N=AまたはG
Y=TまたはC
Z=T、CまたはA
プローブ#8はアミノ酸配列
Tyr−Cys−Lys−Asn−Gly−Gly−Phe,をコードするDN
Aとハイブリダイズするように作成し、256種の配列より
成る20マーである。
両プローブともApplied Biosystems DNA合成機で合
成した。いずれもゲルにより精製してT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ(フアルマシア)を用い[γ−32P]ATP(Am
ersham)で4−6×106cpm/pmolの比活性に放射標識し
た。
ハイブリダイゼーシヨン温度は文献に特に採用してい
るS.V.Suggsら、(Developmental Biology Using Purfi
ed Genes:D.D.BrownおよびC.F.Fox編集、683−693頁:19
82年、Academic Press、ニユーヨーク)により記載され
ているように、ATの多いもののほとんどで計算したTm値
よりも2℃低い温度とした。最後の洗滌については計算
値どおりのTmで行なつた。(即ちハイブリダイゼーシヨ
ン温度より2℃高い温度)。
cDNAのライブラリーを150mmルリアーベルトニ寒天平
板につき50,000個のプラーク濃度となるように、E.coli
C600HFLa株とNZCYM上層寒天(0.7%)を用いてブレー
トした。フアージDNAは二枚のニトロセルロースフイル
ター(Schleicher and Schuell、BA85)にトライスフア
ーし、文献に採用しているScience、196巻、180−182頁
(1979年)のBentonおよびDavisにより記載されている
ようにハイブリダイゼーシヨン用に調製した。フイルタ
ーは6×SSC(20×SSCは3M NaCl、0.3Mクエン酸ナトリ
ウム、pH7.5)、2×デンハルツ溶液(100×デンハルツ
溶液は2%フアイコール、2%ポリビニルピロリドンお
よび2%BSA)、0.1%SDS、0.05%ピロリン酸ナトリウ
ムおよび100mg/ml酵母tRNAを含む溶液中48℃で2時間プ
レハイブリダイゼーシヨンを行なう。プローブ#8を0.
2pmol/mlで添加し、16時間ハイブリダイゼーシヨンを行
なう。ハイブリダイゼーシヨン後、フイルターを以下の
ように洗滌した:6×SSCおよび0.1%SDS中室温で15分間
ずつ3回と最後の1回は50℃で8分間。次にフイルター
を乾燥し、コダツクXAR5フイルムおよび「ライトニング
・プラス」増幅スクリーンを用いて−70℃で24時間オー
トラジオグラフイーを行なう。二枚のフイルターで陽性
であるプラークを精製のため吊る。それらのプラーグを
プローブ#5および#8を用いて二次選択を行ない、両
プローブとハイブリダイズしたプラークを血管形成誘導
因子をコードする候補として選んだ。
文献として特に採用したAdvanced Bacterial Genetic
s:A manual for Genetic Engineering(Cold Pring Hob
ar Laboratory,ニユーヨーク:1980年)中でR.W.Davis、
D.BosteinおよびJ.R.Rothにより記載されている方法に
従い、このフアージよりプレート溶解法およびホルムア
ミド抽出によりDNAを調製した。このDNAのEcoR I消化に
より1%アガロースゲルで1.1kbの挿入断片を放出し
た。この挿入断片をManiatisら、上述、173−178頁によ
り記載されるようにサブクローニングのため5%アクリ
ルアミドゲルから精製した。挿入断片をバクテリアオフ
アージM13mp19RF DNAのEcoR I消化物に連結し、参考文
献のJ.Mol.Biol.94巻、441頁(1975年)に記載されるSa
ngerのジデオキシヌクレオチド法を用いて配列決定し
た。得られた配列の解析の結果、PAFの一時構造をコー
ドする読みワクが得られた。
蛋白質の配列データ(例7参照)および報告されてい
るFGFの情報(Eschら;Proc.Natl.Acad.Sci.USA82巻、65
07−6511:1985年)から、PAFのいくつかの活性型が精製
されているものと思われる。PAF 1型(例7参照)は
このDNAよりAGTMAAの5′側のどこかから翻訳が開始
し、まだ解明されていないプロセスによるAG結合の翻訳
後の切断により生成される。さらにPAF3型はコンセンサ
ス開始部位(M.Kozak、Microbiol.Rev.47巻、1−45頁:
1983年)であるMAA配列から翻訳が開始し、任意にメチ
オニンの分解除去により精製する。PAF3型はまた他の機
能的開始部位からの翻訳開始によつても精製される。そ
のような部位は技術に熟練した物に容易に理解されるも
ので、特に本明細書に記載より明かである。さらに、翻
訳一次生成物の翻訳後のプロセシングも起るが、これは
必須ではない。PAF2型は1型または3型からまだわかつ
ていないプロセスによりN末端のアミノ酸の遊離アミノ
基のブロツクが起ることにより生じる。
例9:PAFの発現
PAF発現の原理は以下のとおりである。ラムダgt10グ
ローンから単離した1.1kbのEcoR I断片をプラスミドpUC
9にサブクローンする。この断片はPAFの全コード配列を
含む。サブクローンの小さい2つの断片が発現システム
の構築に有用である。1つは367bpのAva IからBamH Iま
での断片で、これは胎盤由来の1型蛋白質のGTMAA残基
を1から5と数えて17から137までのアミノ酸残基のPAF
をコードする配列を含む。もう一つは405bpのNco Iから
BamH Iまでの断片で、これはPAFの4から137までのアミ
ノ酸残基をコードする配列を含む。これらの制限断片の
両端に合成アダプターをつけてコード配列を完全し、翻
訳開始、終了またはカプリング配列などを調製して適当
な発現ベクターとの連結に必要な配列も加える。
ヒト胎盤から単離したPAFはGTAMMで開始する配列を有
する。SK−Hep−1細胞から単離したcDNAクローンからG
TMAA配列より少なくとも100アミノ酸上流から、またはM
AAで開始するPAFの他の型が存在することが示唆され
る。胎盤型を用いて酵母(S.cerivisiae)および細菌
(E.coli)で発現した。他のSK−Hep−1型およびアミ
ノ末端の短縮型は下に記述する方法の改良で発現させる
ことが出来、その方法は技術に熟練する者には明白であ
る。その方法はcDNA断片のアミノ末端(Nco I部位また
はAva I部位)を発現ベクターに連結するのに用いる合
成アダプターを変化させることより成る。また別の方法
としては、以下に示すGTMAA型からヌクレオチド−支持
欠損変位処理(文献として採用する“Nucleic Research
Future Development"、K.Mizobuchi、I.Watanabeおよ
びJ.D.Watson編集、Academic Press、ニユーヨーク、41
9−436頁:1983年にM.Inouye、K.Nakamura、S.Inouyeお
よびY.Masuiにより記載)によつて短縮型の発現プラス
ミドを構築できる。
以下のアダプターをApplied Biosystem DNA合成機で
合成し、ゲルを精製する。5′末端をT4ポリヌクレオチ
ドキナーゼ(フアルマシア)でりん酸化する。対の相補
オリゴヌクレオチドを以下のようにしてアニールし、二
重鎖アダプターを精製する。等量の核オリゴヌクレオチ
ドを50mM NaCl、10mMトリス、pH7.5および1mM EDTAに
添加する。この溶液を沸とう湯浴中で加熱する。続いて
湯浴を火から外し、2時間で室温まで冷やす。以下が使
用したアダプターのリストおよびその説明である。 例9:酵母発現プラスミドの構築
pUC8をHind IIIで消化してpUC8由来でポリリンカーの
Hind III部位からSma I部位までの制限酵素部位を欠い
ているプラスミドpGS185を構築し、それをHind III部位
を再生しないHind III/Sma Iアダプター(Amersham、カ
タログ番号DA106)とSma I消化および希薄溶液(1ng/m
l)中でライゲーシヨンして連結し、E.coli JM83を形
質転換する。形質転換株から単離したプラスミドDNAをE
coR I、Sma IまたはHind IIIで消化して正しいプラスミ
ドを同定する。このようにしてEcoR I部位およびSma I
部位を有するがHind III部位を欠いているプラスミドを
保有する形質転換株を同定した。
酵母MF1遺伝子を含むEcoR I断片をJ.KurganおよびI.H
erskowitzによりCell、30巻:933頁(1982年)中に記載
されるようにプラスミドpCY17からゲル電気泳動により
精製し、EcoR Iで切断したpGS185に連結する。このライ
ゲーシヨン反応液を用いて、E.coli HB101を形質転換
し、アンピシリン耐性の形質転換株を選択する。形質転
換株よりプラスミドDNAを単離し、DNAをEcoR Iで消化し
て正しい挿入の存在を確認する。これがプラスミドpGS2
85である。
プラスミドpGS285をHind IIIで完全消化し、希薄状態
(1nm/ml)で連結して上述のKurjanおよびHersknwitzに
より記載されるMF1遺伝子中の4個のHind III部位の3
個を除去する。上に記載のようにして正しい構成を選択
する。これがプラスミドpGS385である。
部位特異変異のため、EcoR I消化によりpGS385からMF
1遺伝子を除き、ゲルで精製後(1.5kb)EcoR Iで消化し
たM13np18RFと連結する。ライゲーシヨン反応液を用い
てE.coli 71−18を形質転換し、MF1遺伝子が正しい方
向性で挿入されているクローンを[32P]標識MF1遺伝子
とハイブリダイズにより同定する。MF1の配列をZoller
およびSmith(Methods in Enzymology、100巻、1983
年、Academic Press Inc.,468頁)が記載する部位特異
インビトロ変異の標準法を用いてGTA TCT TTG GAT
AAA AGAからGAT AGC TTG GAT AAA AGAに変える。
−フアクター遺伝子変異、MF−Hをジデオキシ法配列決
定により確認する。
M13pm18クローンのRF型をEcoR Iで消化してMF−H遺
伝子を除去し、1.5kbのEcoR I断片をアクリルアミドゲ
ル電気泳動により精製し、EcoR I切断のpGS185と連結す
る。得られるライゲーシヨン反応液を用いてE.coli HB
101を形質転換し、MF−遺伝子を有するプラスミドを保
有するコロニーをMF−H遺伝氏を含む32P標識の1.5kb
EorR I断片とハイブリダイズして同定する。そのような
プラスミドをpGS286と命名する。
PAF遺伝子を以下のとおりpGS286に挿入する。アダプ
ター#1および#2をPAF Nco I/BamH I断片と連結す
る。反応液をポリアクリアミドゲルで電気泳動し、アダ
プターを付加したPAF DNAをMWの増加により同定する。
この正しく連結したDNA断片をゲルより溶出し、Hind II
I/Sal I消化のpGS286と連結する。E.coli HB101をこの
ライゲーシヨン反応液で形質転換し、アンピシリン耐性
のコロニーを選択する。正しい挿入を有するプラスミド
を保有する形質転換株を[γ−32P]ATPおよびT4ポリヌ
クレオチドキナーゼとインキユベートして放射標識した
アダプター1Aおよび2Aとハイブリダイズして同定する。
このようにして構築し、単離したプラスミドをpGS286−
PAFと命名している。このプラスミドはMF H遺伝子がM
F H遺伝子の“プレープロ”領域のHind III部位でPAF
遺伝子と融合している。このような構築物は酵母に導入
されると、A.J.Brakeら、1981年(PNAS:USA81巻、4642
頁)により示されるように異種蛋白質の合成、プロセシ
ングおよび分泌を指示することが知られている。
MF H遺伝子およびPAFの融合物を含むEcoR I断片はp
GS286−PAFである。この断片はEcoR Iによる消化および
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離する。T4
DNAポリメラーゼにより平滑末端とした後T4 DNAリガー
ゼを用いてPst Iアダプター(フアルマシア)を連結す
る。この断片を次にベクターpC1/1(A.J.Brakeら、1981
年、PNAS USA81巻:4042頁)のPst I消化物に連結し、
E.coli HB101をこの反応液で形質転換してTETrのコロ
ニーを選択する。PAF遺伝子とのハイブリダイゼーシヨ
ンにより正しい構築を同定する。このプラスミドをS.ce
rivisiae DBY 746(Yeast Gentic Stock Center、カリ
ホルニア州、バークレイ)にToh−EおよびWickner(J.
Bacteriology、145巻、1981年、1421−1424頁)により
記載されるように欠損させた2ミクロンDNAプラスミド
を用い、標準の形質転換プロトコールにより導入する。
PAFを発現する形質転換株は精製抗PAF IgGとのアフイ
ニテイーの反応性により選択する。
例10:E.coliペリプラズマ分泌
PAF発現をE.coliペリプラズマへの輸送に適した型に
制御するため、以下のような制御因子を使用した:転写
開始を高レベルで行なうためのプラスミドpCJ−1上のt
acプロモーター;転写調節のためのプラスミドpCJ−1
上のlacオペレーター;E.coli JM107株の染色体上に存
在するlacレプレツサー(lac I)。PAFのペリプラズマ
への輸送を行なうためOmp AリーダーペプチドをPAFを
コードするDNAに、前者ペプチドのC−末端AlaとPAF1型
のN−末端Glyとが融合し、一次産物中のAla−Gly結合
がE.coliのリーダーペプチダーゼにより切断されて成熟
PAFが生成するように連結する。
E.coliの分泌ベクターは以下の通り構築する。アダプ
ター#5および#4をPAFのAva I/BamH I断片に連結す
る。正しい大きさのDNAをポリアクリルアミドより溶出
し、Omp AリーダーDNAとおよび、EcoR I/Pst I消化M1
3mp19RFと連結する。E.coli JM−107をライゲーシヨン
反応液で形質転換する。PAF遺伝子を含む形質転換株を
制限酵素マツピングにより検出し、ジデオキシ法配列決
定により構築物の配列を確認する。PAF遺伝子を含有す
るEcoR I/Pst I断片をEcoR IおよびPst Iによる消化お
よびポリアクリルアミドゲルからの溶出によりRF DNA
から単離する。これをEcoR I/Pst I消化のpCJ−1に連
結し、反応液でE.coli JM107を形質転換する。PAFを生
成するコロニーをTet平板に生育させアフイニテイーで
精製した抗PAF IgGで免疫スクリーニングして選択す
る。
例11:E.coliの細胞質内発現
PAFの発現をE.coliの細胞質内に留めるよう制御する
ために次のような操作因子を用いた:プラスミドpCJ−
1上のtacプロモーター;プラスミドpCJ−1上のlacオ
ペレーターおよびE.coli JM107株の染色体上のlacレプ
レツサー(lac Iq);コンセンサスシヤイン−ダルガー
ノ配列;高レベルの翻訳を開始するための翻訳カプラー
として使用するOpm Aリーダーペプチド断片。翻訳カ
プリング配列はOpm A遺伝子の翻訳開始領域をコード
するDNA、Omp Aリーダーペプチドの最初の8アミノ
酸、上述のコンセンサスシヤイン−ダルガーノ配列およ
び翻訳ターミネーターにより成る。翻訳カプリング配列
はlacオペレーターとPAF遺伝子の翻訳開始部位との間に
後者に重なつて挿入する。(翻訳カプラーの特性はE.co
liの分泌発現でアダプターと共に示したDNA配列に組込
まれている。)
PAF遺伝子はpCJ−1プラスミドに以下のように翻訳カ
プラーと共に取り込まれる。アダプター#3およびOmp
A翻訳カプラーを例10に記載するM13mp19構築物から
のPAF Ava I/Pst I断片に結合する。この断片をポリア
クリルアミドゲルから精製する。次にこの断片をM13 m
p19 RFのEcoR I/Pst I消化物に連結し、連結反応液を
用いてE.coli JM107細胞を形質転換する。PAF遺伝子融
合物を含むプラークを制限酵素マツピングにより選択す
る。PAF遺伝子融合物を含むEcoR I/Pst I断片をポリア
クリルアミドゲルから溶出し、pCJ−1のEcoR I/Pst I
消化物と連結し、E.coli JM107細胞を反応液で形質転
換する。テトラサイクリン耐性を示すコロニーを選択
し、PAF生産をアフイニテイー精製した抗PAF IgGで免
疫スクリーニングする。
本発明の方法および生産物について多くの修飾および
変異があることは技術の熟練者には明白である。従つ
て、本発明はそれれが添付の請求の範囲およびそれに同
等なものの範囲内である限りそのような本発明の修飾お
よび変異を含む。
例12:E.coliでの細胞質内発現
例11に記載したM13 mp19分泌用構築物をNru Iおよび
Nco Iで消化し、大きい断片をゲルから溶出する。次に
アダプター#6をNru I/Nco I切断DNAに連結する。E.co
li JM107株を反応液で形質転換する。PAF遺伝子融合物
を含有するプラークをジデオキシ法配列決定により確認
する。PAF遺伝子融合物を含むEcrR I/Pst I断片をポリ
アクリルアミドゲルより溶出してEcoR I/Pst Iで消化し
たpCJ−1と連結し、反応液でE.coli JM107細胞を形質
転換する。テトラサイクリン耐性を示すコロニーを選択
し、PAF生産をアフイニテイー精製した抗−PAF IgGで
免疫スクリーニングする。アダプター#6
例13:mRNAの同定
以下の細胞株より全RNAを単離する:SK−HEP−1ヒト
肝癌細胞、ヒト胎児肺(HEL)細菌、RPMI 7272ヒト黒
腫細胞および肉腫180細胞。次にPoly Aプラスマイナ
スメツセンジヤーRNA(mRNA)をオリゴ(DT)セルロー
スクロマトグラフイーを用いて単離する。上記各細胞か
らのPoly AプラスマイナスRNA15μgを1.25パーセン
トアガロース/ホルムアルデヒドゲルの電気泳動により
分離する。これらのRNAをゼタプローブメンブレンに移
す。ヒト肝癌細胞SK −HEP−1からのヒト塩基性FGFに
対するcDNAプロープ(FGF15、EcoR I挿入)をニツクト
ランスレーシヨン法により比活性が8.64×108cpm/μg
となるよう32P−DCTPで標識する。32P−BFGF cDNAプロ
ーブのRNAへのハイブリダイゼーシヨンは50パーセント
ホルムアミド、6×SSC、2×デンハルト溶液、1パー
セントSDS、0.05パーセント ピロリン酸ナトリウムお
よび175μg/ml tRNA中で42℃16時間行なう。ゼタープ
ローブメンブレンを0.5×SSC/1パーセントSDS、0.2×SS
C/1パーセントSDS、0.1×SSC/1パーセントSDSの各1リ
ツトルで65℃15分洗滌し、さらに0.1×SSC/1パーセント
SDSで70℃15分間洗う。次にメンブレンを乾燥し、オー
トラジオグラフイーを−80℃で1日および3日間行な
う。SK HEP−1細胞、HEL細胞およびRPMI 7272細胞は
それぞれ大きさが8.0KB、4.3KB、2.3KBおよび1.0KBの上
記cDNAプローブとハイブリダイズする4種のRNAを含有
した。cDNAプローブはマウス肉腫180細胞のどのRNAとも
ハイブリダイズしなかつた。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
This application is based on the capillary endothelial cell protease of Moscatelli et al.
Human placental blood can promote DNA synthesis and migration
U.S. filed December 17, 1985, entitled Tube Formation Inducer
This is a continuation application of National Patent Application No. 809,873.
Background of the Invention
Angiogenic factors have various properties, namely, (1) endothelial cells.
Vesicle proliferation; (2) increased endothelial cell protease synthesis; (3)
Promoting endothelial cell migration toward the location of the protein; and
(4) a protein capable of inducing capillary proliferation in vivo
Is defined. Particularly classified as an angiogenic factor
Substances affect the DNA synthesis of endothelial cells
Has the ability to promote tearing, and therefore the rate of endothelial cell proliferation and blood vessels
It has been observed to increase the rate of formation.
In connection with this property, angiogenic factors are
Has the ability to increase protease synthesis. These professionals
Plasminogen activator (PA) and the like
And collagenase. Specifically, angiogenic factors
Promotes the synthesis of PA and latent collagenase;
Rasmin preenzyme is a broadly specific protease activity
Plasmin, which activates latent collagenase
Converted to sex collagenase. Active plasmin and
The two enzymes of activated collagenase are found in most of the surrounding tissues.
Can degrade most proteins, and therefore capillary endothelium
Increases erosion of various tissues such as vesicles. Further angiogenic factors
The offspring are chemotactic, especially in certain cells such as capillary endothelial cells.
That is, the angiogenic factor
Induce them to migrate in the direction of those factors.
Isolating angiogenic factors with these properties in mind
Can increase the vascular supply to organs
It was thought that a therapeutic agent could be created. For example
Blood supply to the heart interrupted as a result of certain myocardial infarction
Promote renewal of feeding or revascularization in chronic atresia
It is desirable to promote growth. In addition, induction of angiogenesis
Factor ulcers, surgical incisions and especially elderly and
It can promote the recovery of delayed healing wounds in diabetic patients. Further
Applying this substance to burns will increase the speed and extent of healing
Can be Therefore, suitable for human therapeutic applications
The purified angiogenic factor was searched. Further promotes angiogenesis
Blood supply to cancer cells by studying evolving substances
Believe that there is a way to block cancer and starve cancer
Some scientists do.
A class of proteins already called "angiogenesis-inducing factors"
Are these proteins identified as nonhuman animals?
Have been isolated. Blood vessels isolated from non-human animals
Formation-inducing factors can have side effects on immune response to heterologous proteins
Not suitable for use as a therapeutic in humans due to its potency
it is conceivable that. Moreover, these individual non-human proteins
Whether it has the above four characteristics as an angiogenesis inducer
Whether the observed properties are between protein combinations
It has not been confirmed whether it is due to interaction.
In fact, each of the alleged endothelial cell mitogens
Seed proteins fall into two classes: heparin-cef
Hull eluted with 1 M NaCl from allose and has an acidic pI
Cell growth factor-like molecules; and heparin-sepharose
Fibroblast growth factors that bind more strongly and have a basic pI
It is a child-like molecule. Furthermore, the present inventors have recently
Biochemistry, Vol. 24, 5480-5499 by Vallee et al.
In a paper published on pp. 1985.
(Angiogenin) "
Believe that the factor exists. Angiodienin is true
It has the properties of an angiogenesis-inducing factor but has mitogenic effects
It is distinguished in that it does not have a business.
The present inventors have studied based on these various studies.
Hey, FGFbasicIsolated from human placental tissue that can be classified as
A single molecule of substantially the same nature as
Shape, that is, mitogenic, chemotactic and capillary in vivo
Ability to promote proliferation and promote protease synthesis
A human angiogenesis-inducing factor with high quality was discovered. More books
The present inventors have found that this angiogenic factor is substantially more effective than human placental tissue.
An attempt was made to isolate it in a partially purified state. This isolated
The amino acid sequence of the angiogenic factor was determined. this
Determination of the amino acid sequence allows the synthesis of the angiogenic factor
Chromosome or cDNA sequences useful for recombinant DNA methods
DNA probes can be obtained for use.
Summary of the Invention
The present invention relates to angiogenesis-inducing factors in general, and more specifically to FGF
basicAngiogenic factors classified as
You. In particular, the present invention contemplates that it can be isolated from human placental tissue.
Substantially equivalent, providing mitogenic and chemotactic performance
Induces protease synthesis to promote capillary growth in vivo
FGF that can be awakenedbasicAngiogenic factors
I do.
Specifically, the present invention provides
(1) Natural isolated from human placental tissue (postpartum)
Purified with substantial homology to angiogenesis-inducing factor
Blood consisting of human or synthetic single-chain polypeptide proteins
An angiogenesis-inducing factor (bFGF)
Indicates mitogenic activity, chemotactic activity,
Selected from the group consisting of
SD having at least one active site exhibiting reduced activity
Has a molecular weight of about 18,700 daltons as determined by S-PAGE,
And the following amino acid sequence
(2) or further above
An additional amino acid is added to the N-terminus of the angiogenesis-inducing factor of (1).
The present invention relates to an angiogenesis inducing factor and a method for producing the same.
Here, the angiogenesis-inducing factor of the above (2) was measured by SDS-PAGE.
Having a molecular weight greater than about 18,700 daltons
Including peptides.
It is an object of the present invention to provide an angiogenic factor having these properties.
To provide the offspring in a purified state. Further, the present invention
The purpose of this is to use the amino acid sequence of
Is to decide. Furthermore, the purpose of the present invention is to
Mitogenesis with the ability to promote the synthesis of thease and
Valuable as a pharmaceutical preparation exhibiting chemotactic properties
FGFbasicMay be provided in purified form.
Other objects and advantages of the present invention are set forth in the following description.
And are apparent from the description, or
Learned from. These objects and advantages are particularly
Realized by the methods and means as set out in the claims,
Can be achieved.
In order to achieve the object and in accordance with the object of the present invention,
Mitogenic activity, chemotactic activity, ability to promote protease synthesis
Activities selected from the group consisting of
Angiogenesis with at least one active site
Inducers are revealed. Its blood of human or synthetic origin
Tube formation inducer is FGFbasicClassified as human placental tissue
Natural angiogenic factor and substantially homogeneous, which can be isolated from
It has sex.
Angiogenic factor itself can promote protease synthesis
It is preferable to use the “Protea
The term "ase" includes active forms and precursors. like that
Precursors include latent or procollagenase
You. Further within the scope of the present invention,
An angiogenic factor that does not directly promote growth
It is also possible. But their angiogenic factors
Provokes a biological response and thus promotes protease synthesis
You. Therefore, the angiogenesis-inducing factor of the present invention can be directly or
Immediately promotes protease synthesis.
Particularly preferred angiogenic factors according to the present invention include the following:
Has a core amino acid sequence:
Furthermore, a peptide having the following sequence
Present in the peptide.
And in the sequences shown here, Kazuko has been completely identified.
Indicates the presence of no single amino acid residue. Another especially
Preferred angiogenic factors have the following sequences: Amino acids represented by the above-mentioned abbreviations are the following "preferred"
Description of Embodiments ".
Further, to achieve the objectives and in accordance with the present invention,
Of a natural angiogenic factor that can be isolated from placental tissue
Qualitatively purified are disclosed. Still further, the purpose
At least for the purposes of the present invention.
One active ingredient, angiogenesis induction described by the present invention
Disclosed are pharmaceutical compositions containing the factor.
The above general description and the following detailed description are exemplary and
The present invention is for explanation only and is in the scope of the claims.
Needless to say, it does not limit the light.
Description of the preferred embodiment
The presently preferred embodiment of the present invention will be described.
It explains the basics of the invention in conjunction with the description and examples that follow.
is there.
As mentioned above, the present invention relates to isolated blood in purified form.
It relates to a tube formation inducer. Preferably the angiogenesis of the invention
Inducers are natural vascular forms that can be isolated from human placental tissue
Substantially the same as the induction factor, immunologically equivalent and
Single polypeptide chains which are preferably bioequivalent
It is a protein. Used in the specification and claims.
"Biologically equivalent" means that the composition of the invention
As, but not necessarily the same as,
Mitogenic activity and chemotactic performance
And can induce protease synthesis
Means
Used throughout the following specification and claims
“Substantially the same” has been reported to date and has been purified.
Compared to substantially identical angiogenic factors
Also means higher homology with natural angiogenesis inducer
I do. Preferably the degree of homology is at least 50%, preferably
60%, more preferably 75% or more, especially preferred
Protein is 85% or 90% homologous to the native protein
It is. The degree of homology described above, especially as a reference
Atlas of Protein Sequences and Structure,
Vol. 5, p. 124 (1972), National Biochemical Rese
arch Foundation, Washington, D.C., M.O.Dayhoff in
100 to add to the array as described by
Introduce 4 gaps in amino acid length and compare
Identical amino acids are aligned and found in the shorter of the two sequences.
Calculated as percent of amino acid residues.
The angiogenesis inducing factor of the present invention described here is
An isolated or synthetic polypeptide. "Go
The term “growth” polypeptide has never been
An amino acid sequence that is not isolated in purified form.
U. Using this definition, "synthesis" means that
Together with polypeptides created by recombinant DNA methods
Include those synthesized in whole or in part in a test tube.
In particular, the preferred sequences described below and one or two
Synthetic polypeptides with different amino acids are designed.
A preferred angiogenic factor according to the present invention is a human placenta group
Found in woven extracts and isolated for the first time in purified form
Was. For the purposes of the present application, the angiogenesis inducers disclosed herein
"Pure form" or "purified"
`` Shape '' refers to the expression of proteins other than angiogenic factors.
It does not contain qualitatively. Preferably the blood of the present invention
The tube formation inducer is at least 50% pure, preferably 70%
% Purity, preferably 80% or 90% pure
Degrees.
Furthermore, the angiogenesis-inducing factor of the present invention is useful for various tumors and tumors.
And normal cells. As an example, SK-Hepl
Vesicles, HeLa cells, K562 cells and human fetal lung fibroblasts
There is.
The angiogenesis-inducing factor of the present invention comprises the following steps:
Can be isolated purely from human placental tissue by the method:
Collection of placental tissue; (b) for fractionation of proteinaceous substances in the tissue
Isolation of an angiogenesis-inducing substance from human placental tissue by
(C) identification of a fraction having angiogenesis-inducing factor activity; and
And (d) enrichment of the fraction showing angiogenesis-inducing factor activity.
In a preferred embodiment, the protein present in human placental tissue
Heparin Affinity Chromatography, I
On-exchange chromatography and optionally gel filtration chromatography
Fractionation is performed by a combination of matographies. State here
Angiogenic factors are placental protein-specific monoclonals.
It can also be isolated using antibodies. In this example, the antigen is
Matri containing monoclonal antibodies against disc protein
Bind to fox (resin) and wash the resin with buffer
Removes non-antigenic proteins. Next higher pH or lower
PH buffer, high ionic strength buffer or chaotropic
By changing the temperature of the stick agent alone or in combination
The antigen is removed from the antibody.
Angiogenesis-inducing factor is used for the fraction thus obtained.
Search for the presence of activity. Preferably a suitable endothelial cell culture
Cultivation, preferably a mammalian capillary endothelial cell
Incubate in the presence of offspring
Measuring PA and intracellular PA
Do this by assessing the effects on collagenase synthesis
Was. Cells generated by angiogenic factors are generated
ELISA or RIA assay or immunization
It is measured by an immunological method such as a sedimentation method.
The mitogenic activity of the angiogenic factor is preferably
Appropriate endothelial cells, preferably mammalian capillary endothelial cells.
Tube formation inducer and radiolabeled nucleotide, preferably
Is125I-deoxyuridine iodide (125In the presence of I-dU)
It is measured by incubating. Trichlor
Incorporated in acid-insoluble fraction125The amount of I-dU is
Measure as an indicator of degree. Chemotaxis of angiogenic factors
Performance depends on suitable endothelial cell culture, preferably mammalian capillary
Incubate endothelial cells in the presence of angiogenic factors
And in a suitable tank, preferably a modified Boyden chamber.
The determination is made by measuring the mobility of the cells.
As described above, the present inventors used angiogenesis-inducing factor in human embryos.
Isolate in a previously unpurified form from disc tissue
Succeeded. Isolation of the protein in purified form
Is the correct sequencing of this protein and an angiogenic factor
It is essential for the development of a pharmaceutical composition containing
Preferred angiogenic factors of the present invention are the following core amino acids:
Having a no acid sequence:
A peptide having the following sequence exists outside the core sequence. Also
Another particularly preferred angiogenic factor has the following sequence:
Do:
The abbreviations are, for example, Biochemistr by A.L.Lehninger.
y, 2nd edition, Worth Publishers, Inc., New York (19
1975), compared to the standard amino acid sequence abbreviation described on page 72.
Respond. The claimed activity of the angiogenic factor is
15, 16, 17 or 18 N-terminal amino acids
It is believed that removing the acid residue will not be affected.
ing. Therefore, all of these omitted sequences are included in the present invention.
I will. In addition, the N-terminal amino acid of the native polypeptide
It is also planned to extend up to 110 amino acids to the acid
You.
Also, the C- or N-terminal of the angiogenesis-inducing factor of the present invention.
It is also conceivable to add a polypeptide chain to the peptide. Especially,
The polypeptide chain can be attached to either end by protein fusion technology.
Are combined. These chlorinated polypeptides are
Responsible for enhancing the efficacy of tube formation inducers. For example other
By fusion with the polypeptide, the polypeptide is brought to low pH or
Will be able to maintain activity at elevated temperatures or
Polypeptides have longer circulating lifetimes, higher against degradation
Resistance or through the small intestinal epithelium
Increases the permeability.
However, due to these changes, the amino acid sequence
Causes immune response side effects in organisms receiving formation inducers
Should not appear to be such side effects
The damage from the inducer is such that the benefits cannot be guaranteed.
Can get. Bioactive molecules can cause such immune response side effects.
The method of determining whether or not to
You.
The angiogenesis-inducing factor of the invention and the invention disclosed herein
Analogs have mitogenic or chemotactic properties.
Pharmaceutical product forms capable of promoting improved protease synthesis
Applied to humans and animals. At least one activity
Contains one of the angiogenesis-inducing factors of the present invention as a component
Pharmaceutical compositions may be suitably pharmaceutically acceptable depending on the intended dosage form.
Carriers, diluents, fillers, binders, and other additives
Contains excipients. Active protein in the digestive tract for oral administration
Measures must be taken to prevent the decomposition. Therefore, enteric coating
The form is considered as one form suitable for oral administration. Non-tradition
If oral administration is employed, the preparation may be water or saline or
Or other pharmaceutically acceptable solutions. In general
Preparations for parenteral administration are ultimately identical to body fluids
It is preferable to include a sufficient concentration of sodium chloride to achieve osmotic pressure.
New A pharmaceutical preparation containing the angiogenesis-inducing factor of the present invention
Injection or local treatment for the treatment of wounds, surgical incisions or skin ulcers
Topical administration, such as local administration, is also contemplated. More myocardial infarction
Sustained release for administration to resume blood supply to the post-occlusion heart
Sexual intercalating agents are also conceivable.
Dosages appropriate for the treatment of each of the above-mentioned diseases and the above-mentioned deli
The calculations required to determine the appropriate amount to use for the Barry method are routine.
It is performed by a person skilled in the art in the usual manner,
Unnecessary due to the size of the assay and the assays disclosed herein.
This is the range that can usually be done without experimentation. Calculated
Dosage should be combined with the appropriate dose response data to determine the effective dose.
Determined by using established assays
You.
Specific teachings of the teachings of the present invention
Use of ordinary skill in light of the teachings contained herein
Within the ability of the person. Examples of products of the invention and
Typical methods for their isolation and production are shown in the following examples.
You.
Example 1
Purification of human angiogenesis-inducing factor from placental tissue
A. Protein purification
The postnatal term placenta is frozen at -20 ° C. Frozen placenta
Into small pieces, and use the electric food chili par (General Slicing,
Mill in Balden, New York)
Modify. All operations after homogenization are performed at -4 ° C.
Do. Place the homogenized placenta in cold 20 mM Tris, pH 7.
Dilute with 5,3mM EDTA, 50W (Model 185 sonicator,
Branson Sonic Power Co., Plain, New York
Sonicate for 10 minutes with view. Usually 1 kg frozen embryo
Obtain 2 liters of processed material from the board.
The sonicated product was adjusted to pH 4 with hydrochloric acid, and the pH was adjusted to 2 minutes at this pH
After uvating, neutralize with NaOH. NaCl to a final concentration of 0.5M
And centrifuge at 10,000 xg for 60 minutes.
You. The supernatant was washed with 0.5 M NaCl / 3 mM EDTA 120 mM Tris, pH
Heparin-Sepharose equilibrated in 7.5 (Pharmacia
A, Piscataway, New Jersey)
Place on 85 × 153mm. Wash column with same buffer, 2M
Elute with NaCl / 3 mM EDTA / 20 mM Tris, pH 7.5. Elution
Dilute the solution with 3mM EDTA / 20mM Tris, pH 7.5 to reduce conductivity to 2
4 mmho and a second heparin-sepharose column (1
6 × 190mm). Column is 3mM EDTA / 20mM Tris,
pH 7.5, wash with 0.7M NaCl solution in the same buffer NaCl
Elute with a gradient from 0.7 to 2M.
The protease inducing activity was measured for each fraction,
The third heparin-sepharose column (12 x 75m
m). The column is first loaded with 3 mM EDTA / 20 mM Tris, p
H7.5, 0.8M NaCl solution in medium, then 0.1M sodium phosphate
Washed with 0.2M NaCl solution, pH 6.0, 0.1M Na phosphate
Elute with a 0.2 M NaCl solution in thorium, pH 6.0. third time
20 times the active fraction from the Heparin-Sepharose column
Dilute with volume of 0.1 M sodium phosphate, pH 6.0.
Centrifuge the diluent at 10,000 xg for 30 minutes and then
9 × 72 mm CM-Sephadex C-50 equilibrated with the buffer
Place on column (Pharmacia). Column is 0.1M phosphoric acid
Dissolve sequentially in 0.15M, 0.5M and 2M NaCl solution in sodium
And measure the protease-inducing activity of each fraction.
CM-Sephadexcala containing protease-inducing activity
0.5M NaCl eluate from the system
Concentrate on a loin column. This column is 60 mM sodium phosphate
Wash sequentially with 0.5 ml of 2M NaCl solution in pH 6.0, pH 6.0
U. All activity eluted in the first 1 ml. This eluate
With 2M NaCl, 60mM sodium phosphate, pH 6.0
At a flow rate of 0.5 ml / min.
Almasia).
Angiogenesis-inducing factors as claimed in the present invention are
Isolated from the effluent. This angiogenic factor is
Also called "protein".
B. Confirmation of protein properties and angiogenesis inducing factor activity
1.NaDad SOFour−PAGE
NaDod SOFourUsing polyacrylamide gel, 3% above
Prepare a layered gel and a 10-18% gradient degraded gel, especially
Nature 277, 680-685 adopted here as reference
Electrophoresis according to the method of Laemmli described in (1970)
You. The active fraction from the column is NaDod SOFour-Molecular weight by PAGE
There were 18,700 single bands.
2.Protein measurement
Protein concentration was determined using Bi using bovine serum albumin as a standard.
o-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Calif.
(Ritzchimond, Lunia). Of this protein
Information on the sequence is provided in Example 4.
3.mitotic activity125Removal of I-deoxyuridine
Inset
Bovine capillary endothelium from the adrenal cortex of a freshly slaughtered one-year-old cow
(BCE) cells, Proc. Na, incorporated herein by reference.
Reported in tl.Acad.Sci.USA 76, 5217-5221 (1979)
And isolation by the method of Folkman et al. Especially here
J. Cell Biol. 95, 974-981
Mouse as described by Gross et al.
10% (v / v) supplemented with medium conditioned with 180 cells
v) Cells in Alpha Minimum Essential Medium (MEM) with calf serum
Grow until confluent. Confluence
Medium, the medium should contain 5% calf serum supplemented conditions.
Replace with fresh MEM medium.
A confluent culture of BCE cells was added to 5% M calf serum.
Maintain in EM medium for 7 days. Then, adjust the concentration of the medium to various concentrations.
5% calf serum-containing MEM medium containing placental angiogenesis-inducing factor
Change to earth. After 20 hours, the medium was supplemented with 5% calf serum and 0.
3 μCi / ml125I-deoxyuridine iodide (2000 Ci / mmo
l, New England Nulear, Boston, Massachusetts)
Replace with Dulbecco's Modified Eagle Medium containing Mark
After incubation for 16 hours in a culture medium, the cells were cooled in cold phosphate buffer.
The label is stopped by washing with a salt solution. Cells are cold 5% tric
Incubate with chloroacetic acid (TCA) for 30 minutes and add 5% TCA
After washing twice with distilled water, it is incorporated into the acid-insoluble matter.
125I-Deoxyuridine iodide is measured.
4.Migration measurement
The migratory measurement is performed by the Pro, which is hereby incorporated by reference.
c. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5597-5601
Gelatin and fibronect according to Castellot's method
PVP-free polycarbonate coated with tin and having a pore size of 5 μm
-200μ blind using a carbonate filter
Wells (Nuoleopore, Pleasant, Calif.)
In). In MEM medium containing 0.5% fetal bovine serum
Add 10-fold diluted purified protease inducer under the wells
Put in layers. Next, insert a filter and add 0.5% of 200μ
5 × 10 in MEM medium supplemented with fetal calf serumFourBCE cells
Add to upper well. After incubating at 37 ° C for 4 hours
Remove the medium in the upper layer of the well and remove the fine surface from the upper surface of the filter.
Gently remove the cells with a cotton swab. Next, remove the filter
And dried at room temperature, and the light-Giemsa dye (Baker Chemical
Co., Philadelphia, New Jersey)
You. The total number of cells on the lower surface of the filter was determined by light microscopy (40
(0x magnification).
5. Induction measurement of PA and collagenase
Maintained in MEM containing 5% calf serum for at least 2 days
Confluent cultures of cultured BCE cells with 5% calf serum and
And replace with a new MEM multiple containing the substance to be tested. 37
Collect the medium after incubation for 24 hours at
Moscatelli in Cell. 20; 343-351 (1980).
Assay collagenase as described by
You. All collagenases are latent and detect activity
Activated with trypsin. From this same culture
The cell monolayer was washed twice with cold phosphate buffered saline and
0.5% (v / v) Twiton X-1 in sodium, pH 8.1
00 solution and described by Gross et al. (Supra).
PA activity is measured as described above. As a result of the experiment,
PA amount is proportional to the amount found in the conditioned medium
I can tell you. One unit of protease-inducing activity is PA or
And half of the maximal induction of collagenase synthesis
Is defined as the amount required for
Example 2
Purification of angiogenic factors from human placental tissue
A second heparin-sepharose according to the method of Example 1
Obtain the eluate to be applied to the column. Column is 3mM EDTA / 20mM
Tris, pH 7.5, wash with 0.95M NaCl solution in the same buffer
Elute with 2M NaCl solution.
2M eluate against 0.2M NaCl / 20mM MES, pH 6.0
Dialyze. Centrifuge dialysate at 100,000 xg for 60 minutes
Excluding insolubles, Fast Protein Liquid Chromatography
Apply to Mono-S column using (FPLC) system. Mosquito
The ram was washed with 0.2 M NaCl / 20 mM MES, pH 6.0, then 20 mM M
Elute with a 0.2-2M NaCl gradient in ES, pH 6.0. For each fraction
The protease-inducing activity is measured. Protease induction
Conductivity eluted between 0.45 and 0.6M NaCl.
Example 3
Purification of angiogenic factor from hepatoma cells
All purification steps except FPLC are performed at 4 ° C. SK-
Hep-1 cells (American Type Culture Collection [ATC
C] Cells from confluent monolayer with accession number No. HTB52)
Was collected by centrifugation at 400 xg for 10 minutes.
You. Suspend cell pellet in 10 volumes of PBS / 0.5M NaCl
The Branson Sonicator (Plainville, New York)
Sonicate at 5 watts for 3 minutes using (U). Lottery
The product is centrifuged (10,000 xg, 1 hour) and the supernatant is
Collect Pellet re-stain in equal volume of PBS / 0.5M NaCl
Perform sonication after turbidity and centrifuge. Combine the supernatant
Heparin-equilibrated with 28 x 75 mm PBS / 0.5 M NaCl
Sepharose column (Pharmacia, New Jersey)
State, Piscataway). Column is 0.5M NaCl / 3mM
After washing with EDTA / 100 mM Tris, pH 7.5,
Elute with a 0.5-2M NaCl gradient. PA induction for each fraction
The activity is measured, and the activity images are collected and the conductivity becomes 20mmho.
Dilute up to 3 mM EDTA / 20 mM Tris, pH 7.5.
The active substance is then added to 0.5 mM in 3 mM EDTA / 20 mM Tris, pH 7.5.
Second heparin sepharose equilibrated with NaCl solution
Apply to a column (10 x 75 mm). First column is 0.5M NaCl
And then wash with 3 mM EDTA / 20 mM Tris, pH 7.5
Elute with a 0.9-2M NaCl gradient in the buffer. Three active fractions
Load the second heparin-Sepharose column (7 x 85 mm)
After washing with 0.5 M NaCl in 20 mM MES, pH 6.0, the NaCl was
Elute as 2M. Third Heparin-Sephaloska
Active fraction from lamb diluted 1:10 with 20 mM MES, pH 6.0
To remove insoluble material by centrifugation at 100,000 xg / hour.
Good.
The Mon was equilibrated with 0.2 M NaCl / 20 mM MES, pH 6.0.
Load on o-S FPLC column (Pharmacia). column
Was washed with 0.2 M NaCl and eluted with NaCl gradient (20 mM ME
S, pH 6.0, 0.2 to 2M in). PA for each fraction
The inducing activity was measured, and the active fractions were collected to determine the purity of NaDod SO.Four
Test by -PAGE.
Example 4
Of placental angiogenesis-inducing factor (PAF) isolated from human placenta
Determination of amino acid sequence
A. Lys-C peptide
According to the method of Example 2 described above, 20 mM MES, pH 6.0, 0.5 M Na
Obtain purified PAF dissolved in Cl. Natural protein as below
Digest with endo-proteinase Lys-C: 2 nmo
le natural protein at 350 μM 20 mM MES, pH 6.0, 0.5 M N
Dissolve the reaction solution containing aCl in 2M NHFourHCOThreeAdd 15μ
And adjust to pH 8.7. 1.17 units end type proteiner
Lys-C (Boehringer) was added and the mixture was added at 37 ° C for 7 hours 3
Perform digestion for 0 minutes. Next, add 2-mercaptoethanol
Add to a final concentration of 1% (v / v),
Incubate for 15 minutes. Trifluoroacetic acid (TF
A) to a final concentration of 0.1% (v / v)
Reversed-phase high-performance liquid chromatography using Synchrom RP8 column
Fractionate by chromatography (HPLC). 0.1% TFA for peptide
Acetonitrile gradient in aqueous solution and then 0.1% TFA (60
Elute from the column with 0-60% acetonitrile per minute)
You. Elution of peptide from column is A215And A280Track with
And collect the appropriate fractions manually.
Automated edging of peptides eluted with 19% acetonitrile
Sequencing by Mann decomposition showed the following sequence:
Amino acids shown in this sequence and in the following sequence
Residues are residues that have not been identified.
Sequencing of peptides eluted with 19.8% acetonitrile
The result was the following array:
Others eluted with 17.5% acetonitrile from the same digest
The peptide had the following amino acid sequence:
Automated edging of peptides eluted with 26% acetonitrile
The following amino acid sequence was given following Mann degradation:
Two more peptides eluted at 16% acetonitrile
Was obtained as a mixture and was re-purified before sequencing. Get
The peptide mixture was dried under vacuum and 100 μl of 50 mM
Re-suspend in Tris-HCl, pH 8.5, 8M urea. 20nmole
Dicitritol (DTT) is added at 37 ° C for 15 minutes.
Reduce existing SS bonds. Then 60nmoleThreeH-Iodine
Carboxymethylate the peptide by adding acetic acid, room temperature
Incubate in the dark for 20 minutes. 60nmole DDT
And incubate for 30 minutes at room temperature.
Was adjusted to 0.1% TFA and H using an Altex C-3 reverse phase column.
Refractionate by PLC. Peptide is 0.1% TFA soluble from column
Solution and subsequent acetonitrile gradient (0-60% over 120 minutes)
(Acetonitrile) (flow rate 1 ml / min).
Automated Edma analysis of peptides eluted with 13% acetonitrile
The following sequence was shown after digestion:
B.SMP-peptide
Digest native PAF protein with mouse mandibular gland protease
To obtain more peptides.
2 nmole in 350 μM 20 mM MES, pH 6.0, 0.5 M NaCl
25μM 1M TANCO in solution containing proteinThree, PH 9.0,
Adjust to pH 8.0 by addition. Mandibular gland protease (3.6μ
g) is added and digestion is carried out at 37 ° C. for 24 hours. 90nmole D
Add TT and incubate at 37 ° C for 30 minutes
You. 360nmoleThreeAdd H-iodoacetic acid to add peptide
Perform ruboxyl methylation and incubate at room temperature in the dark for 20 minutes.
Make a basis. Add more 360 nmole of DTT
Adjust the reaction to 0.1% (v / v) in TFA and add
The peptide mixture is fractionated by RP-8 HPLC.
One peptide mixture eluting with 12% acetonitrile
And dried to 100 μl of 50 mM Tris-HCl, pH
HPL using Altex C-3 column after resuspension in 0.8M urea
Refractionate with C and elute as described for Lys-C peptide purification.
It eluted in the same manner as the kejur.
14.8% acetonitrile (a) and 15.3% acetonitrile
Automated Edman analysis of the two peptides eluted with Lil (b)
The solution yielded the following amino acid sequence:
Natural PAF digested with S. aureus protease (V8)
Several peptides were obtained. 500 μM 20 mM Tris-HCl,
1 mole of protein dissolved in 2M NaCl (pH 7.5) is reverse phase RP-8
Demineralize by HPLC using a column. Protein-containing desalted fraction
Dry, resuspend in 50μM 50mM acetic acid, pH 4.0, 1μ
Add g of V8 protease. Digest at 37 ° C for 18 hours
U. Peptides were applied to RP-8 reverse phase columns as described above.
Fractionate by HPLC.
Automated Edma analysis of peptides eluted with 17% acetonitrile
The following amino acid sequence was obtained upon degradation: 20% acetonitrile eluting peptides from V8 digests
Sequencing gave the following results:
Sequence V8 peptide eluted with 21% acetonitrile
And got the following results:
The above amino acid sequences are summarized as follows:
The core sequence of fibroblast growth factor is obtained:
Further isolation of other peptides for automated Edman degradation
I did. Their amino acid sequences are outside the above core sequence.
Was.
13% acetonitrile in fraction of mandibular gland digest (see above)
The peptide eluted with ril showed the following amino acid sequence:
Lys-C peptide eluted with 20% acetonitrile
The amino acid sequence of was:
Example 5
Properties of angiogenesis-inducing factors suitable for clinical application as therapeutic agents
Identification
Placenta-derived factors isolated by the methods of Examples 1 and 2.
And factors isolated from liver cancer cells become angiogenic factors
Demonstrate all three expected properties in a test tube
I did it. First, at a concentration ranging from 0.1 to 10 ng / ml,
Is a synthesis of PA and latent collagenase in BCE cells
To promote. PA has broad specificity for the proenzyme plasminogen
Can be converted to plasmin, a new protease
You. Plasmin activates latent collagenase
Can be converted to ze. Therefore, the effect of low concentrations of this factor
Skin cells are small enough to degrade most proteins in surrounding tissue
Produces at least two proteases, resulting in cells
Break into the weave.
Purified molecules depend on PA and collagenase in BCE cells
To promote it. All collagenases are in active form. G
After the treatment with lipsin, cholase-degrading activity was detected. PA
And latent collagenase are both promoted in a correlated manner.
1/2 maximal enhancement at 1 ng / ml concentration of protease inducer
To be observed. PA and collagen in untreated cells
The amount of zeolites varies from experiment to experiment, and therefore the rate of promotion varies
I do. Very high concentration of protease inducer
Promotes PA synthesis as well as chemotaxis and mitogenesis
Also decrease. Induces BCE cells to PA and collagenase
Concentrations of Protease Inducer and 24 Hour Incubate
Then, the morphology of the cell is extended from a typical boulder type spindle
Change to type.
Second, this factor has chemotactic performance against BCE cells
Is shown. Therefore, in the test tube, the direction of this factor is
Go to Concentrate this factor in the 0.001 and 0.1 ng / ml range.
BCE cell chemotaxis when added in a blind well
Promoted in the tank. At higher concentrations, chemotaxis is not seen.
I can't. Increase in cell migration from upper tank to lower tank
Observed only when there is a higher concentration of
This indicates that true chemotaxis is taking place. Chemotaxis
May not account for more than 25% of the observed increase in motility
I got it.
Third, this factor is mitogenic for BCE cells
Is shown. Add protease-inducing factor to BCE cell culture
Depends on the amount added125I-iododeoxyuri
Fig. 4 shows promotion of incorporation of gin into DNA. Protease induction
This inducing activity decreases with increasing factor concentration.125I−
Enhancement of iododeoxyuridine uptake by PA and cola
Observed at the same concentration as where the genease induction is possible. Placenta
By the original coarse sonicated material125I-iododeoxyuridine
Enhanced incorporation of DNA into DNA conflicts with other mitogenic activities
The present inventor has already confirmed that this is the case. Accordingly
This factor is truly mitogenic. Purified
A single molecule induces PA and collagenase in BCE cells,
Has the ability to promote cell replication and its motility
Conceivable.
Example 6
Angiogenic activity
For measurement of angiogenesis, Auat. Rec. 199, 33-42.
(1981) using the method of Dunn et al.
In an experiment, the angiogenic factor of Example 2 was found on the avian ciliary allantois.
At a dose of 65 ng, 91% of the eggs promoted angiogenesis.
Example 7
a) N-terminal amino acid sequence of PAF
Human placental blood as described above (see Examples 1 and 2)
Purify tube forming factors. 20 mM MES buffer, pH 6.0, and
Purified protein dissolved in NaCl and 500 mM NaCl
Desalting by high-performance liquid chromatography using a medium. twenty five
Automated Edman degradation of desalted proteins from 0 to 500pmole
Run on an ABI470A gas phase protein sequencer. Obtained
High-performance liquid chromatography using PTH amino acids
Identify with.
From these experimental results, the N-terminal amino acid sequence of PAF is as follows.
Determined as follows:
Further, the N-terminal amino acid sequence of PAF described above is Example 4, A
23% acetonitrile in the chromatographic system described in
By automated Edman degradation of Lys-C peptide eluted in
Even confirmed.
b) C-terminal amino acid sequence of PAF
C-terminal from Lys-C digest of PAF as described in Example 4.
PAF peptide was isolated. This peptide is 22% acetonitrile
Elute with rill. Can this peptide be used for automated Edman degradation?
The following amino acid sequence is shown:
AILFLPMSPSAKS
(I) Example; (ii) N-terminal amino acid sequence of PAF; (iii)
C-terminal amino acid sequence of PAF; and (iv) cDNA data
The total amino acid sequence of PAF is
RU:
1.PAF type 1
2.PAF type 2: N-terminal block PAF
Automated Edman degradation of purified and natural PAFs
In many experiments, some portion of the charged protein (50-80)
%) Did not decompose in the Edman treatment.
A portion of the PAF protein molecule exists with the N-terminus blocked.
Was considered to be present.
The nature of the blocking group is a purified amino-terminal peptide
Made it clearer. Enzymatic degradation of PAF (see Example 4)
Amino-terminal peptide obtained from
Identify. Also filter paper electrophoresis or thin layer chromatography
Chem. Ber. 87, 1103-1, which is adopted as a reference.
Written by F. Reindel and W. Hoppe on page 107 (1954)
Identified by staining with the chlorine / O-tolidine reagent
You. (The blocked peptide is a lysine residue on the side chain.
Other than weak coloration by nin
Not detected with hydrin. )
In addition, small N-terminal block PAF peptides are acidic
Narita with PAF digest from thermolysin or pepsin
(1975) by Protein Sequence Determination,
30-103, Springer-Verlag, Berlin, Heidelibe
Lug, New York, Dowex50, x as described in
20 (H+Type) or I. Klun
By Coll. Czech. Chem. Comm. 44, 145-14
Sulfoethyl-Seph as described on page 7 (1979).
It can be isolated by Adexus chromatography. This
These references are included as references.
The structure of the blocked short peptide is
Determined by method and method. For example, G. Allen's Seq
uencing of Proteins and Peptides; North Holland Pub
lishing Company, Amsterdam, New York, Ohio
Tuxford (1981) or listed there
The literature has adopted these references as references in this application.
You. These procedures and methods involve blocking the N-terminal block.
Peptide carboxypeptidase, proglutamic acid
Digestion with minopeptidase, hydrazinolysis, mass fraction
Analysis, nuclear porcelain resonance, gas chromatography and Boisse
Natl. Acad. Sci. USA 82, 8448-8452 (198
5 years).
3. PAF type 3: shortened and elongated PAF
Bovine kidney fibroblast growth factor (FGF) is
It is known that many amino acids are deficient (A. Ba
Ird et al., Regul. Pept., printing: 1985) (D. Gospodarowic)
z, Meth. Enzymol Printing: 1986). G. Neufeld and D.G
ospodarowicz, J. Biol. Chem. 260, 13860-13868 (1
985), shortened fibroblasts as indicated by
The growth factor retains the binding ability of the FGF receptor,
This indicates that the N-terminus of this protein is a cell surface receptor for FGF.
Does not play a significant role in interacting with
You. Therefore, both the shortened and elongated PAF
It is expected to retain Putter binding capacity. Biological activity of PAF
N-terminal maximal deletion and elongation with retention still determined
It has not been.
Example 8: cDNA clone of PAF
SC-HEP-1 cells in 10% fetal bovine serum, non-essential amino
Cultivation in Eagle's medium, the minimum essential with acid and Pen-Strep
I do. RNA is Molecular C
loning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor La
boratory, New York, 1982, pp. 191-193).
isolated using the NP-40 lysis method described by S et al. P
oly (A)+Proc.Natl.Acod.S using mRNA as literature
ci.USA 69, 1408 (1972)
Oligo dT chromatography using the method of P. Leder
-(BRL). G adopted here as a reference
ene, 25, pp. 263-269 (1983).
As described by an, first strand synthesis with oligo dT and
Using second strand synthesis involving RNase H-DNA polymerase,
8 μg of double-stranded cDNA was obtained from 5 μg of mRNA. This operation
Amersham's reagent was used. The following reactions are specifically described
Unless otherwise specified, follow the manufacturer's instructions. 10 cDNA
Blunt ends using T4 DNA polymerase (Amersham)
It has become. The EcoR I site contains 400 units of EcoR I methylase (New
England Biolabs) and 100 mM S-adenosylmethy
Protected with onin. Equal amount of EcoR I linker (New Englan
d Biolabs, 8 base pairs) with 1 unit of T4 DNA ligase (Prom
ega Biotec). Excess linker is 200 units of E
Digest with coR I (New England Biolabs) and remove
g of this cDNA EcoRI digested alkaline phosphatase
Processed lambda gt-10 DNA (Vector Cloning Systems) 1
Ligation with μg. The DNA is packaged in vitro (V
ector Cloning System), plate on E.coli C600HFLa
8.2 × 10FiveTransformants were obtained.
Oligonucleotide probe design
Mixing of two types for isolation of SK-HEP-1 cDNA clone
Sequence oligonucleotide probes were used. probe
Pools all DNA sequences corresponding to the determined amino acid sequence.
Made up of The probe is described herein
Sequences in the core amino acid sequence of PAF were selected. probe
# 5 is the amino acid sequence
DNA encoding Ile-Lys-Gly-Val-Cys-Ala
17-mer consisting of 192 sequences created to bridge
Is:
X = A, T, G or C
N = A or G
Y = T or C
Z = T, C or A
Probe # 8 is an amino acid sequence
DN encoding Tyr-Cys-Lys-Asn-Gly-Gly-Phe,
Created to hybridize with A, and from 256 types of sequences
Is a 20 mer.
Both probes are combined on an Applied Biosystems DNA synthesizer.
Done. All are purified by gel and T4 polynucleotides
[Gamma-32P] ATP (Am
ersham) 4-6 × 106Radiolabel to specific activity of cpm / pmol
Was.
Hybridization temperatures have been specifically adopted in the literature.
S.V.Suggs et al., (Developmental Biology Using Purfi
ed Genes: Edited by D.D.Brown and C.F.Fox, pp. 683-693: 19.
1982, Academic Press, New York)
Tm value calculated for most of the AT
2 ° C. lower than the temperature. Calculated for last wash
We performed at the Tm according to the value. (That is, hybridization
Temperature 2 ° C higher than the
cDNA library 150mm Luria Bertoni agar
E. coli to a concentration of 50,000 plaques per plate
Break with C600HFLa strain and NZCYM upper agar (0.7%)
I did it. Phage DNA is two nitrocellulose files
Trishua to Tar (Schleicher and Schuell, BA85)
Science adopted in the literature, Volume 196, pp. 180-182
(1979) by Benton and Davis
And prepared for hybridization. Filter
ー is 6 × SSC (20 × SSC is 3M NaCl, 0.3M sodium citrate)
Um, pH 7.5), 2x Denhardt's solution (100x Denhardt's)
The solution was 2% Ficoll, 2% polyvinylpyrrolidone and
And 2% BSA), 0.1% SDS, 0.05% sodium pyrophosphate
In a solution containing yeast and 100 mg / ml yeast tRNA at 48 ° C for 2 hours.
Perform rehybridization. Probe # 8 to 0.
Add 2 pmol / ml and perform hybridization for 16 hours.
Now. After hybridization, filter the following
Washes as follows: 15 minutes at room temperature in 6 × SSC and 0.1% SDS
3 times each and the last one at 50 ° C for 8 minutes. Then filter
Dry the Kodak XAR5 film and "Lightning
24 hours at -70 ° C using a “plus” amplification screen
Perform tradographies. Positive with two filters
Plaques are suspended for purification. Those plaques
A secondary selection was performed using probes # 5 and # 8,
Induction of angiogenesis in plaque hybridized with probe
Factors were selected as candidates for coding.
Advanced Bacterial Genetic especially adopted as literature
s: A manual for Genetic Engineering (Cold Pring Hob
ar Laboratory, New York: 1980) in R.W.Davis,
In accordance with the method described by D. Bostein and J.R. Roth
Therefore, the plate lysis method and formua
DNA was prepared by mid extraction. EcoRI digestion of this DNA
Release 1.1 kb insert on 1% agarose gel
Was. This insert is described in Maniatis et al., Supra, pages 173-178.
5% acrylic for subcloning as described
Purified from luamide gel. Bacteria off insert
Ligation to EcoR I digest of ARG M13mp19RF DNA
Sa, described in J. Mol. Biol. 94, 441 (1975).
sequenced using the nger dideoxynucleotide method
Was. As a result of analyzing the obtained sequence, the temporary structure of PAF was
I got a good reading.
Protein sequence data (see Example 7) and reported
FGF information (Esch et al .; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 65
07-6511: 1985), some active forms of PAF have been purified.
It seems to have been. PAF Type 1 (see Example 7)
Translation starts from this DNA somewhere 5 'of AGTMAA
And translation of AG binding by a process that has not yet been elucidated
Generated by later cutting. PAF3 is a consensus
Start site (M. Kozak, Microbiol. Rev. 47, 1-45:
(1983) translation started with the MAA sequence
Purify by onion decomposition removal. PAF3 is another machine
It is also purified by translation initiation from a functional start site. So
Such parts are easily understood by those skilled in the art.
Thus, it is particularly clear from the description herein. In addition,
Post-translational processing of the translated primary product also occurs,
Not required. PAF2 is still a type 1 or 3
Free amino-terminal amino acids
It is caused by the occurrence of a group block.
Example 9: PAF expression
The principle of PAF expression is as follows. Lambda gt10
The 1.1 kb EcoR I fragment isolated from the
Subclone to 9. This fragment contains the entire PAF coding sequence.
Including. Two small fragments of the subclone are used in the expression system
Useful for constructing One is from 367 bp Ava I to BamHI.
This is the GTMAA residue of type 1 protein from placenta
PAF of amino acid residues from 17 to 137, counting from 1 to 5
Contains an array that encodes The other is from 405bp Nco I
The fragment up to BamHI, which is the PAF from 4 to 137 amino acids.
It contains a sequence that encodes a noic acid residue. Of these restriction fragments
Complete the coding sequence with synthetic adapters at both ends,
Prepare translation start, end or coupling sequence
Sequences necessary for ligation with a suitable expression vector are also added.
PAF isolated from human placenta has a sequence that begins with GTAMM.
I do. G from cDNA clone isolated from SK-Hep-1 cells
At least 100 amino acids upstream of the TMAA sequence or M
Suggests that other forms of PAF that start with AA exist
You. Yeast (S. cerivisiae) and bacteria using placenta
(E. coli). Other SK-Hep-1 types and amino acids
The truncated form of the non-terminal is expressed by modification of the method described below.
And the method is obvious to those skilled in the art.
You. The method is based on the amino terminus of the cDNA fragment (Nco I site or
Is the Ava I site) for ligation to the expression vector.
Changing the adaptor. Another way
As the nucleotides-supported from the GTMAA type shown below
Defect displacement processing ("Nucleic Research
Future Development ", K. Mizobuchi, I. Watanabe and
And J.D.Watson, Academic Press, New York, 41
9-436: M. Inouye, K. Nakamura, S. Inouye
And described by Y. Masui) plus truncated expression
You can build a mid.
Use the following adapters with an Applied Biosystem DNA synthesizer
Synthesize and purify the gel. 5 'end is T4 polynucleotide
Phosphorylates with dokinase (Pharmacia). Pair complement
Anneal the oligonucleotide as follows.
Purify the heavy chain adapter. Equivalent amount of nuclear oligonucleotide
To 50 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5 and 1 mM EDTA
Added. The solution is heated in a boiling water bath. continue
Remove the water bath from the heat and cool to room temperature in 2 hours. Use
A list of adapters used and their descriptions. Example 9: Construction of yeast expression plasmid
pUC8 is digested with HindIII to obtain a polylinker derived from pUC8.
Lack of restriction sites from Hind III to Sma I
Plasmid pGS185 and construct it with a Hind III site.
III / Sma I adapter (Amersham,
Tag No. DA106) and Sma I digested and diluted solution (1 ng / m
l) Ligation inside and concatenation to form E.coli JM83
Change quality. Plasmid DNA isolated from the transformant
digest with coR I, Sma I or Hind III to get the correct plasmid
Identify the code. Thus, the EcoR I site and Sma I
Plasmid that has a site but lacks a Hind III site.
The transformants possessed were identified.
The EcoR I fragment containing the yeast MF1 gene was cloned into J. Kurgan and I.H.
Described by erskowitz in Cell, 30: 933 (1982)
By gel electrophoresis from plasmid pCY17
Purify and ligate to pGS185 cut with EcoRI. This line
Transform E.coli HB101 using the reaction mixture
Then, a transformant resistant to ampicillin is selected. Transformation
Isolate plasmid DNA from the replacement and digest the DNA with EcoRI.
To verify the presence of the correct insert. This is the plasmid pGS2
85.
Plasmid pGS285 is completely digested with Hind III and diluted
(1 nm / ml) and linked to Kurjan and Hersknwitz described above.
Of the four Hind III sites in the MF1 gene
Remove the pieces. Select the correct configuration as described above
I do. This is plasmid pGS385.
Due to site-specific mutations, pGS385 to MF
Exclude one gene, purify by gel (1.5 kb), digest with EcoRI
Ligated with M13np18RF. Using ligation reaction solution
To transform E. coli 71-18,
The clone inserted directionally32P] Labeled MF1 gene
And hybridized. Zoller for MF1 array
And Smith (Methods in Enzymology, 100, 1983)
Year, Academic Press Inc., page 468)
GTA TCT TTG GAT using standard methods for in vitro mutation
Change from AAA AGA to GAT AGC TTG GAT AAA AGA.
-Factor gene mutation, MF-H sequenced by dideoxy method
Confirm by setting.
The RF type of the M13pm18 clone was digested with EcoRI and MF-H
The gene was removed and the 1.5 kb EcoRI fragment was
Purified by electrophoresis and ligated with EcoRI cut pGS185.
You. E. coli HB using the obtained ligation reaction solution
101, and the plasmid containing the MF gene is stored.
Include colonies with MF-H genetics321.5kb of P label
Hybridize with the EorRI fragment and identify. like that
The plasmid is named pGS286.
The PAF gene is inserted into pGS286 as follows. Adap
Litters # 1 and # 2 with the PAF Nco I / BamHI fragment
You. The reaction mixture is electrophoresed on a polyacrylamide gel,
The PAF DNA with the added peptide is identified by increasing MW.
The correctly ligated DNA fragment was eluted from the gel, Hind II
Ligation with pGS286 digested with I / Sal I. E.coli HB101
Transformed with ligation reaction solution, ampicillin resistant
Select colonies. Plasmid with correct insertion
Is transformed into [γ-32P] ATP and T4 polynu
Radiolabeled by incubating with nucleotide kinase
Hybridize with adapters 1A and 2A and identify.
The plasmid thus constructed and isolated was transformed into pGS286-
Named PAF. This plasmid has the MFH gene
PAF at the Hind III site in the "prepro" region of the FH gene
It is fused with a gene. Such constructs are introduced into yeast
A.J.Brake et al., 1981 (PNAS: USA 81, 4642)
Page), synthesis of heterologous proteins, processing
It is known to direct signaling and secretion.
The EcoR I fragment containing the fusion of the MF H gene and PAF
GS286-PAF. This fragment was digested with EcoR I and digested.
Isolate by polyacrylamide gel electrophoresis. T4
T4 DNA ligator after blunt ends with DNA polymerase
Connect Pst I adapter (Pharmacia)
You. This fragment was then transformed into the vector pC1 / 1 (A.J.Brake et al., 1981).
Year, PNAS USA 81: 4042).
E.coli HB101 is transformed with this reaction solution and TETrRoller
Choose a knee. Hybridization with PAF gene
To identify the correct construct. S.ce
rivisiae DBY 746 (Yeast Gentic Stock Center, Cali
Toh-E and Wickner (J.
Bacteriology, 145, 1981, pp. 1421-1424)
2 micron DNA plasmid deleted as described
And introduced according to standard transformation protocols.
Transformants expressing PAF were purified with purified anti-PAF IgG.
Select according to the reactivity of the nature.
Example 10: E. coli periplasmic secretion
PAF expression in a form suitable for transport to E. coli periplasm
To control, the following control factors were used: transcription
T on plasmid pCJ-1 for high level initiation
ac promoter; plasmid pCJ-1 for transcriptional regulation
Lac operator on the chromosome of E. coli JM107
Lac repressor (lac I) present. PAF periplasm
Omp A leader peptide to PAF for transport to
The encoding DNA contains the C-terminal Ala of the former peptide and PAF1 type
Ala-Gly bond in the primary product
Is cleaved by E. coli leader peptidase and matures
Link to produce PAF.
The E. coli secretion vector is constructed as follows. Adap
Litters # 5 and # 4 to the Ava I / BamHI fragment of PAF
You. Elute the correct size DNA from polyacrylamide
And Omp A leader DNA and EcoR I / Pst I digested M1
Connect with 3mp19RF. Ligation of E.coli JM-107
Transform with the reaction solution. Transformants containing PAF gene
Detection by restriction enzyme mapping and sequencing by the dideoxy method.
Confirm the sequence of the construct by determination. Contains PAF gene
Digestion of the EcoR I / Pst I fragment with EcoR I and Pst I
And RF DNA by elution from polyacrylamide gel
From This was linked to EcoR I / PstI digested pCJ-1.
Then, E. coli JM107 is transformed with the reaction solution. Raw PAF
Growing colonies on Tet plates and affinity
Select by immunoscreening with purified anti-PAF IgG
You.
Example 11: Intracytoplasmic expression of E. coli
Controls PAF expression to remain in the E. coli cytoplasm
The following operating factors were used for this: Plasmid pCJ-
1. lac promoter on plasmid pCJ-1
Lac rep on the chromosome of Pererator and E. coli JM107 strains
Letsser (lac Iq); Consensus Shine-Dalgar
Sequencer; translation coupler for initiating high-level translation
Opm A leader peptide fragment used as a primer. Translation
The pulling sequence encodes the translation initiation region of the Opm A gene
DNA, the first 8 amino acids of the Omp A leader peptide
Acid, the consensus Shine-Dalgarno sequence described above and
And a translation terminator. Translation coupling sequence
Is between the lac operator and the translation initiation site of the PAF gene.
Insert it over the latter. (The characteristics of the translation coupler are E.co
Incorporation into the DNA sequence shown with the adapter for secretory expression of li
It is rare. )
The PAF gene is translated into the pCJ-1 plasmid as follows:
Captured with puller. Adapter # 3 and Omp
A translation coupler from the M13mp19 construct described in Example 10
Bind to the PAF Ava I / Pst I fragment. This fragment is
Purify from acrylamide gel. Then this fragment is M13 m
Ligation to EcoR I / Pst I digest of p19 RF and ligation reaction
Are used to transform E. coli JM107 cells. PAF gene fusion
Plaques containing the compound are selected by restriction enzyme mapping.
You. The EcoR I / Pst I fragment containing the PAF gene fusion was
Eluted from acrylamide gel, EcoR I / Pst I of pCJ-1
Ligation with digests and transformation of E. coli JM107 cells with reaction
Replace. Select colonies showing tetracycline resistance
And PAF production was immunized with affinity-purified anti-PAF IgG.
Perform epidemiological screening.
Many modifications and variations of the methods and products of the present invention are made.
Variations will be apparent to those skilled in the art. Follow
Accordingly, the present invention is directed to the appended claims and their equivalents.
Such modifications and variations of the present invention are provided so far as
And mutations.
Example 12: Intracytoplasmic expression in E. coli
The construct for secretion of M13 mp19 described in Example 11 was
Digest with Nco I and elute large fragments from gel. next
Adapter # 6 is ligated to the Nru I / Nco I cut DNA. E.co
The li JM107 strain is transformed with the reaction solution. PAF gene fusion
Plaques Containing Drosophila Confirmed by Dideoxy Method Sequencing
I do. The EcrR I / Pst I fragment containing the PAF gene fusion was
Elution from acrylamide gel, digestion with EcoR I / Pst I
And ligated with pCJ-1 and transformed E. coli JM107 cells with the reaction solution.
Convert. Select colonies showing tetracycline resistance
And PAF production with affinity-purified anti-PAF IgG.
Perform immunoscreening. Adapter # 6
Example 13: mRNA identification
Isolate total RNA from the following cell lines: SK-HEP-1 human
Hepatoma cells, human embryonic lung (HEL) bacteria, RPMI 7272 human black
Tumor cells and sarcomas 180 cells. Next, Poly A Plus Minor
Smut messenger RNA (mRNA) to oligo (DT) cellulose
Isolate using chromatography. Each of the above cells
15 μg of Poly A plus or minus RNA
By electrophoresis of toagarose / formaldehyde gel
To separate. Transfer these RNAs to zeta probe membrane
You. To human basic FGF from human hepatoma cell SK-HEP-1
Nitto cDNA probe (FGF15, EcoRI insert)
Specific activity 8.64 × 10 by the translation method8cpm / μg
So that32Label with P-DCTP.32P-BFGF cDNA Pro
50% hybridization to RNA
Formamide, 6 × SSC, 2 × Denhardt's solution, 1 par
St. SDS, 0.05% sodium pyrophosphate
And in 175 μg / ml tRNA at 42 ° C. for 16 hours. Zetap
Lobe membrane 0.5 × SSC / 1% SDS, 0.2 × SS
One each for C / 1% SDS and 0.1 × SSC / 1% SDS
Wash with a tube at 65 ° C. for 15 minutes, and further add 0.1 × SSC / 1%
Wash with SDS at 70 ° C for 15 minutes. Next, dry the membrane and
Tradiography at -80 ° C for 1 and 3 days
U. SK HEP-1 cells, HEL cells and RPMI 7272 cells
Above 8.0KB, 4.3KB, 2.3KB and 1.0KB respectively
Contains 4 types of RNA that hybridizes with the above cDNA probe
did. cDNA probes are compatible with any RNA from mouse sarcoma 180 cells
I did not hybridize.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI A61K 38/00 ADA A61K 37/02 ADA (31)優先権主張番号 895,829 (32)優先日 1986年8月12日 (33)優先権主張国 米国(US) (72)発明者 リフキン,ダニエル ビー アメリカ合衆国 10021 ニューヨーク 州,ニューヨーク,イー.シィクスティ シィススス ストリート 444 (72)発明者 ソマー アンドリース アメリカ合衆国 80301 コロラド州ボ ールダ−,ピードラ コート 4145 (56)参考文献 Bioscience Report s,vol.5,p.738−790(1985) Biochemistry,vol. 24,No.20,p.5480−5499(1985)──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI A61K 38/00 ADA A61K 37/02 ADA (31) Priority claim number 895,829 (32) Priority date August 12, 1986 ( 33) Priority country United States (US) (72) Inventor Rifkin, Daniel Bee United States of America 10021 New York, New York, E. Sixty Sixth Street 444 (72) Inventor Sommer Andries United States 80301 Boulder, Colorado 4145 (56) References Bioscience Reports, vol. 5, p. 738-790 (1985) Biochemistry, vol. 20, p. 5480-5499 (1985)
Claims (1)
天然の血管形成誘導因子と実質的ホモロジーを示す精製
したヒトまたは合成の一本鎖ポリペプチド蛋白質よりな
る血管形成誘導因子(bFGF)であって、該血管形成誘導
因子は、有糸分裂促進活性、化学走性活性、プロテアー
ゼ合成促進能およびそれらの組合せより成るグループか
ら選ばれた活性を示す少なくとも一つの活性部位を有
し、SDS−PAGEで測定して約18,700ダルトンの分子量を
有し、そして以下のアミノ酸配列 を含有する血管形成誘導因子、(2) またはさらに上
記(1)の血管形成誘導因子のN末端に付加アミノ酸を
有する血管形成誘導因子。 2.アミノ酸配列を含有する請求の範囲第1項の血管形成誘導因子。 3.請求の範囲第2項のアミノ酸配列のN末端に付加ア
ミノ酸を有する請求の範囲第2項の血管形成誘導因子。 4.蛋白質のアミノ酸配列が請求の範囲第2項の配列と
1個のアミノ酸残基だけ異なる請求の範囲第1項の血管
形成誘導因子。 5.蛋白質のアミノ酸配列が請求の範囲第2項の配列と
2個のアミノ酸残基だけ異なる請求の範囲第1項の血管
形成誘導因子。 6.蛋白質のN−末端がブロックされている請求の範囲
第2項の血管形成誘導因子。 7.ヒト胎盤(分娩後の)から実質的に精製された状態
で単離した請求の範囲第1項の血管形成誘導因子。 8.(1) ヒト胎盤組織(分娩後の)から単離できる
天然の血管形成誘導因子と実質的ホモロジーを示す精製
したヒトまたは合成の一本鎖ポリペプチド蛋白質よりな
る血管形成誘導因子(bFGF)であって、該血管形成誘導
因子は、有糸分裂促進活性、化学走性活性、プロテアー
ゼ合成促進能およびそれらの組合せより成るグループか
ら選ばれた活性を示す少なくとも一つの活性部位を有
し、SDS−PAGEで測定して約18,700ダルトンの分子量を
有し、そして以下のアミノ酸配列 を含有する血管形成誘導因子、(2) またはさらに上
記(1)の血管形成誘導因子のN末端に付加アミノ酸を
有する血管形成誘導因子を得るための方法であって、 (a) 血管形成誘導因子を生産することの出来る組織
を集め、 (b) 組織中の蛋白性物質を分画することにより組織
から血管形成誘導因子を単離し、 (c) 血管形成誘導因子活性を有する画分を同定し;
そして (d) 血管形成誘導因子活性を呈する画分を濃縮す
る、ことからなる方法。 9.血管形成誘導因子を生産することの出来る組織がヒ
ト胎盤組織である請求の範囲第8項の方法。 10.(1) ヒト胎盤組織(分娩後の)から単離でき
る天然の血管形成誘導因子と実質的ホモロジーを示す精
製したヒトまたは合成の一本鎖ポリペプチド蛋白質より
なる血管形成誘導因子(bFGF)であって、該血管形成誘
導因子は、有糸分裂促進活性、化学走性活性、プロテア
ーゼ合成促進能およびそれらの組合せより成るグループ
から選ばれた活性を示す少なくとも一つの活性部位を有
し、SDS−PAGEで測定して約18,700ダルトンの分子量を
有し、そして以下のアミノ酸配列 を含有する血管形成誘導因子、(2) またはさらに上
記(1)の血管形成誘導因子のN末端に付加アミノ酸を
有する血管形成誘導因子の製造方法であって、 (a) 形質転換した微生物から血管形成誘導因子を発
現させ、そして (b) いずれの順序でもよく、発現した血管形成誘導
因子を単離し、かつ精製する、ことからなる方法。 11.さらに工程(a)および(b)を行う前に、 (1) 血管形成誘導因子をコードするDNA配列を単離
し; (2) そのDNA配列を宿主微生物中で発現可能なベク
ターに挿入し; (3) 該DNA配列を含むベクターで血管形成誘導因子
を発現できる宿主微生物を形質転換することからなる請
求の範囲第10項の方法。 12.宿主微生物をpGS286−PAFで形質転換する請求の
範囲第10項又は第11項のいずれか一つの方法。 13.宿主微生物がE.coliである請求の範囲第10項又は
第11項のいずれか一つの方法。 14.宿主微生物が酵母である請求の範囲第10項又は第
11項のいずれか一つの方法。(57) [Claims] (1) An angiogenesis-inducing factor (bFGF) consisting of a purified human or synthetic single-chain polypeptide protein exhibiting substantial homology to a natural angiogenesis-inducing factor that can be isolated from human placental tissue (postpartum). The angiogenesis-inducing factor has at least one active site exhibiting an activity selected from the group consisting of mitogenic activity, chemotactic activity, protease synthesis promoting ability and a combination thereof; Has a molecular weight of about 18,700 daltons as determined by and has the following amino acid sequence: (2) or an angiogenesis-inducing factor having an additional amino acid at the N-terminus of the angiogenesis-inducing factor of (1). 2. Amino acid sequence The angiogenesis-inducing factor according to claim 1, comprising: 3. The angiogenesis-inducing factor according to claim 2, which has an additional amino acid at the N-terminal of the amino acid sequence according to claim 2. 4. The angiogenesis-inducing factor according to claim 1, wherein the amino acid sequence of the protein differs from the sequence according to claim 2 by one amino acid residue. 5. The angiogenesis-inducing factor according to claim 1, wherein the amino acid sequence of the protein differs from the sequence according to claim 2 by two amino acid residues. 6. The angiogenesis-inducing factor according to claim 2, wherein the N-terminus of the protein is blocked. 7. The angiogenesis-inducing factor according to claim 1, which is isolated in a substantially purified state from human placenta (after delivery). 8. (1) An angiogenesis-inducing factor (bFGF) consisting of a purified human or synthetic single-chain polypeptide protein exhibiting substantial homology to a natural angiogenesis-inducing factor that can be isolated from human placental tissue (postpartum). The angiogenesis-inducing factor has at least one active site exhibiting an activity selected from the group consisting of mitogenic activity, chemotactic activity, protease synthesis promoting ability and a combination thereof; Has a molecular weight of about 18,700 daltons as determined by and has the following amino acid sequence: (2) or a method for obtaining an angiogenesis-inducing factor having an additional amino acid at the N-terminus of the angiogenesis-inducing factor according to the above (1), wherein (a) an angiogenesis-inducing factor (B) isolating an angiogenic factor from the tissue by fractionating the proteinaceous substance in the tissue, and (c) identifying a fraction having angiogenic activity ;
And (d) concentrating the fraction exhibiting angiogenesis-inducing factor activity. 9. 9. The method according to claim 8, wherein the tissue capable of producing an angiogenesis-inducing factor is human placental tissue. 10. (1) An angiogenesis-inducing factor (bFGF) consisting of a purified human or synthetic single-chain polypeptide protein exhibiting substantial homology to a natural angiogenesis-inducing factor that can be isolated from human placental tissue (postpartum). The angiogenesis-inducing factor has at least one active site exhibiting an activity selected from the group consisting of mitogenic activity, chemotactic activity, protease synthesis promoting ability and a combination thereof; Has a molecular weight of about 18,700 daltons as determined by and has the following amino acid sequence: (2) or a method for producing an angiogenesis-inducing factor having an additional amino acid at the N-terminus of the angiogenesis-inducing factor according to the above (1), comprising: Expressing the angiogenic factor, and (b) isolating and purifying the expressed angiogenic factor, in any order. 11. Prior to performing steps (a) and (b), (1) isolating a DNA sequence encoding an angiogenesis-inducing factor; (2) inserting the DNA sequence into a vector that can be expressed in a host microorganism; 3) The method according to claim 10, comprising transforming a host microorganism capable of expressing an angiogenesis-inducing factor with the vector containing the DNA sequence. 12. The method according to any one of claims 10 or 11, wherein the host microorganism is transformed with pGS286-PAF. 13. 12. The method according to any one of claims 10 or 11, wherein the host microorganism is E. coli. 14. The claim 10 or the claim wherein the host microorganism is yeast.
11. Any one of the methods of clause 11.
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