JPH04502709A

JPH04502709A - ニューモシスチス　カリニイジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子及びその使用方法

Info

Publication number: JPH04502709A
Application number: JP3501062A
Authority: JP
Inventors: サンティ，ダニエル　ブイ．; エドマン，ジェフリー; エドマン，ウルスラ
Original assignee: ザリージェンツオブザユニバーシティオブカリフォルニア
Priority date: 1989-11-15
Filing date: 1990-11-14
Publication date: 1992-05-21
Also published as: CA2045184A1; WO1991007419A1; EP0453556A1; EP0453556A4; US5306493A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ニューモシスチス　カリニイ　ジヒドロし゛り　−ゼ゛　云　びその発二吸」し１！量１３坏す辷１本発明は、遺伝子工学及び薬物の２つの分野及びより詳しくは、特定の精製された酵素の阻害において効果的な薬物の同定及び調製に関し、前記酵素は、そのペプチドをコードする遺伝子の遺伝子工学の結果として利用できる。

宣景坐■所ニューモシスチス　カリニイ（Ｐｎｅｕ信ｏｃｙｓｔｉｃ　ｃａｒｉｎｉｉ）肺炎は、後天性免疫欠損症候群（ＡＩＤＳ）における病変性及び死亡性の主な原因である。ＡＩＤＳ流行病の発病以来、Ｌカリニイ肝炎の発生率は、アメリカにおいて１年当たり約２００〜２５，０００件以上である。連続したインビトロ培養システムの欠乏及び−Ｐ、、’Ｉｔ三（−肝炎のラットモデルのやっかいな性質により、抗−Ｐ、カリニイ療法は、抗−原生動物用物質が多分、効果的である仮定に基づいて主に開発されて来た。事実、旦−Ｕ三不は、最近、菌類のメンバーであることが示されている。

２種の主な療法様式、すなわちトリメトプリム／スルファメトキサゾール及びペンタミジンが抗−原生動物理論を用いて開発された。ＡＩＤＳ流行病の前、これらの物質はＰ、カリニイ肝炎のまれな患者の処理のために十分であった。しかしながら、ＨＩｖ−陽性患者において、標準の抗−ヱー左ユ三土物質による治療及び予防は、時々の毒性及びアレルギー性副作用により複雑化される。Ｕ王土に対して活性的な新規化合物が明らかに必要とされる。

１三工をインビトロで確実に増殖することの不能性及び感染されたラット肺から精製され得る上、左ユ三土酵素の限定された量が、抗−ヱ、左ｌ王土物質のための研究を妨げて来た。そのような物質のための細胞内標的の精製及び特徴化が、Ｐ、カリニイ肺炎の新規療法の開発を可能にするであろう。

知られている抗−ヱーノ［ｂ＝土動物質うちで、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）インヒビターが最っとも十分に特徴づけられる。ＤＨＦＲは核酸前駆体のｄｅ　ｎｏｖｏ合成において重要な役割を演じる。ＤＨＦＲＨＦ上ビター（たとえばメトトレキセート、トリメトプリム及びピリメタミン）は、効果的な抗− 悪性、抗−細菌及び抗−原生動物剤で散る。

ヱエｆｉ肺炎は、ＤＨＦＲＨＦ上ビター（トリメトプリム又はピリメタミン）及びスルホンアミドの組合せに明らかに応答する。しかしながら、スルホンアミドと共に使用される場合、それらの明らかな効率にもかかわらず、トリメトプリム及びピリメタミンはそれ自体Ｐ、カリニイＤＨＦＲの良好でないインヒビターである〔それぞれ３９，６００及び２゜４００ｎＭの５０％阻害濃度値（ＩＣ５゜）は類似する基質濃度で旦、ユニＤＨＦＲのために８及び２．５００ｎＨに匹敵した〕。

他の抗フオレートは、上、左ユ三±ＤＨＦＲのより効果的なインヒビターであるが、しかし宿主の毒性を妨げるためにロイコボリンの付随する投与を要することが示された。純粋なヱエ左１三−ｆＤＨＦＲが研究のために利用できる場合、既知の抗フオレートの効率をしのぐインヒビターが、Ｈを比較することによって見出され得る。

主」Ｌ少」Ｌ組本発明は、−り一ノロＬ二Δ−からの酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子物質を提供する。その遺伝子物質は、ＤＨＦＲ酵素を特異的に阻害する薬物の企画に使用するための酵素を生成するために使用され得る。

さらに、遺伝子物質は、ヱー左ユ正否感染の直接的な検出のために核酸ハイブリダイゼーションアッセイ使用され得るプローブの源として使用され得る。Ｐ　カリニイＤＩ（ＦＲを選択的に阻害する薬物の同定のための特定の遺伝子材料及び技法、が次の詳細な記載及び例に開示されている。

豊里■皿様勿に豊本発明者は、これまで限定された量でのみ利用できた、菌類ヱーＵ−±のジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする最初の遺伝子材料について同定し、そして得た。ＤＨＦＲは核酸前駆体の合成に重要であるので、純粋な形で有意な量での酵素の利用可能性は、宿主のＤＨＦＲ酵素に対するＰ、カリ正否酵素を特異的に阻害する薬物の企画を可能にするであろう、従って、この特定された遺伝子材料の同定及び単離は、ＰエメＬＬ壬／−Ｄ　ＨＦ　Ｒインヒビターの生成を可能にする。それはまた、Ｐ、カリニイ感染の直接的な検出を可能にするハイブリダイゼーション技法に使用するための核酸プローブの源を提供する。

本発明は、第１表及び第２表（下記）に列挙された可能なコドン選択に基づいての組合せを選択することによって製造され得るポリヌクレオチドの個々の及びあらゆる可能な変動を特別に言及し、そしてすべてのそのような変動は特別に開示されているように思われる。第３塩基がＡ又はＴであるコドンが１三盃において好ましい、しかしながら、コドンは好ましくは、酵素が生成される宿主細胞を適合せしめるように選択される。異種宿主におけるタンパク質の発現を最大にするためのコドンの選択は既知の技法である。

そのようなペプチドをコードする他のＤＮＡ分子は、第２表におけるコドンの列挙から容易に決定され得、そして同様に第１表のＤＮＡ配列に等しいように言及されている。実際、ＤＮＡコドンとペプチドにおけるアミノ酸との間の一定の関係が存在するので、ペプチドにおける置換又は他の変化の本明細書における論議が、その対応するＤＮＡ配列又はＤＮＡ分子、組換えベクター又は配列が配置される形質転換された微生物に同等に適用できる（及び逆もまた同様）。

メー」し−表アラ＝：／（Ａｌａ、　Ａ）　ＧＣＡ、　ＧＣＣ，ＧＣＧ、　ＧＣＴアルギニン（Ａｒｇ、　Ｒ）　ＡＧＡ、　ＡＧＧ、　ＣＧＡ、　ＣＧＣ，ＣＧＧ、　ＣＧＴアスパラギン（Ａｓｎ、　Ｎ）　ＡＡＣ，ＡＡＴアスパラギン酸（Ａｓｐ、　Ｄ）　ＧＡＣ，ＧＡＴシスティン（Ｃｙｓ、　Ｃ）　ＴＧＣ，ＴＧＴグルタミン（Ｇｉｎ、　Ｑ）　ＣＡＡ、　ＣＡＧグルタミン酸（Ｇｌｕ、　Ｅ）　ＧＡＡ、　ＧＡＧグリシン（Ｇｌｙ、　Ｇ）　ＧＧＡ、　ＧＧＣ，ＧＧＧ、　ＧＧＴヒスチジン（Ｈｉｓ、　Ｈ）　ＣＡＣ，ＣＡＴイソロイシン（ｆｌｅ、　Ｉ）　ＡＴＡ、　ＡＴＣ，ＡＴＴロイシン（Ｌｅｕ、　Ｌ）　ＣＴＡ、　ＣＴＣ，ＣＴＧ、　ＣＴＴ、　ＴＴＡ、　ＴＴＧリシン（Ｌｙｓ、　Ｋ）　ＡＡＡ、　ＡＡＧメチオニン（Ｍｅｔ、　Ｍ）　ＡＴＧフェニルアラニン（Ｐｈｅ、　Ｆ）　ＴＴＣ，ＴＴＴプロリン（Ｐｒｏ、　Ｐ）　ＣＣＡ、　ＣＣＣ，ＣＣＧ、　ＣＣＴセリン（Ｓｅｔ、　Ｓ）　ＡＧＣ，ＡＧＴ、　ＴＣＡ、　ＴＣＣ，ＴＣＧ、　ＴＣＴトレオニン（Ｔｈｒ、　Ｔ）　ＡＣＡ、　ＡＣＣ，ＡＣＧ、　ＡＣＴトリプトファン（Ｔｒｐ、　Ｗ）　ＴＧＧチロシン（Ｔｙｒ、　Ｙ）　ＴＡＣ，ＴＡＴバリ：／（Ｖａｌ、　Ｖ）　ＧＴＡ、　ＧＴＣ，ＧＴＧ、　ＧＴＴ及び右側上に３′末端を有するＤＮＡのトリヌクレオチドを示す、それらの文字はヌクレオチド配列を形成するプリン又はピリミジン塩基を表わす：Ａ＝アデニン、Ｇ＝ニブアニンＣ−シトシン及びＴ＝チミン。ＲＮＡコードは同じであるが、但し、Ｕ（ウラシル）がＴと代わる。

第１表に列挙される特定のヌクレオチドの他に、本発明のＤＮＡ　（又は対応するＲＮＡ）分子は、特異的に列挙される前の又は次の追加のヌクレオチドを有することができる。たとえば、ポリＡは３′−末端に付加され：短い（たとえば２０個以上のヌクレオチド）配列が、制限エンドヌクレアーゼ部位に対応する終結配列を供給するためにいづれかの末端に付加され、停止コドンは翻訳を終結するためにペプチドに配列を従がえ、そして同様のことが生じる。さらに、遺伝子から上流にプロモーター領域又は他の制？Ｂ　９Ｍ域を含むＤＮＡ分子が生成され得る。本発明の配列を含むすべてのＤＮＡ分子は少なくとも１つの目的のために有用であろう。なぜならば、すべてはオリゴヌクレオチドプローブを生成するために最少にフラグメント化され得、そして生物学的源からのＤＮＡの単離又は検出に使用され得るからである。

本明細書に使用される多くの用語は、それらのより共通する意味の他に特定の意味を有する。“同等”とは、２つのヌクレオチド配列を言及する場合、問題の２つのヌクレオチド配列がアミノ酸の同じ配列をコードすることを意味する。

“同等”が２種のペプチドに関して使用される場合、それは、２種のペプチドが共通する性質（たとえば酵素活性）を有するであろうことを意味する。その性質は両ペプチドにおいて同じ程度に存在する必要はないが（たとえば２種のペプチドは酵素活性の異なった速度を示す）、シかしその性質は好ましくは実質的に同じである。″相補的”とは、２種のヌクレオチド配列について言及される場合、それらの２種の配列が、好ましくは２５％以下、より好ましくは１５％以下、さらにより好ましくは５％以下、最っとも好ましくは対立するヌクレオチド間にミスマツチが存在しないようにハイブリダイズすることができることを意味する。

好ましいハイブリダイジング条件（ミスマツチの特定の数に限定されない）は例に示される。用語“′実質的”とは、当業者により理解されるような程度で変化し、そして一般的に、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少な（とも９０％及び最っとも好ましくは少なくとも９５％を意味する。本明細書に使用される用語“単離される”とは、それぞれ他のペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡから分離されたペプチド、ＤＮＡ又はＲＮＡを言及し、そして同じ生化学的溶液に通常存在する溶媒、緩衝液、鉄又は他の成分のみの存在下で見出される。

“単離される”とは、それらの天然の状態における天然の材料又は成分中に分離されたが（アクリルアミドゲルにおいて）、しかし純粋な物質として又は溶液として得られていない天然の材料のいづれも包含しない。句“〜により置換される ”又は“置換”とは、生じるいづれかの作用を必ずしも言及する必要はないが、しかし指摘された“置換”のアミノ酸が、異なった式に存在することが指摘されたアミノ酸と同じ位置に存在する場合（たとえばバリンの代わりにロイシンがアミノ酸１１で存在する場合）に存在するペプチドを言及する。

遺伝子のＤＮＡ配列が同定されて以来、合成化学によりＤＮＡ遺伝子を完全に生成することが可能であり、この後、その遺伝子は組換えＤＮＡ技法の既知の技法を用いて多くの利用できるＤＮＡベクターのいづれか中に挿入され得る。従って、本発明は、試薬、プラスミド及び遺伝子材料の寄託を要しないで特許出願の時点で自由に利用できる微生物を用いて実施され得る。

たとえば、１００塩基よりも長いヌクレオチド配列が、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ　３８０＾ＤＮＡ　５ｙｎｔｈｓｉｚｅｒ上で、その広告（たとえば、Ｇｅｒｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓ＋　１９８４年１１月り１２月、３ページ）により明らかなように容易に合成され得る。

そのようなオリゴヌクレオチドは、中でも、オーバーラツプする相補的配列（たとえば１〜１００のコード鎖、０〜５０及び５１〜１５０の相補的鎖、１０１〜２００のコード鎖、等）を調製する技法を用いて容易にスプライスされ得、続いてハイブリダイズされ、そして鎖を連結され得る。そのような技法は良く知られており、そしてたとえばＤａｖｉｓ　ｆｌ煮、。

Ｂａ５ｆｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｌ　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌ、Ｃｏ、、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８６）に詳細に記載されている。

次にペプチドは、本明細書に記載されるように宿主生物中で発現され得る。

さらに、本明細書に開示される多くのペプチド、特にヱーカリニイＤＨＦＲ酵素のペプチドフラグメントの直接的な合成を行なう自動化された装置もまた利用できる。上記のＧｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓの同じ発行において、９９％以上の結合効力を有する市販の自動化ペプチド合成機が広告されている（３４ページ）。そのような装置は、直接的な合成又は他の既知の技法を用いて結合され得る一連のフラグメントの合成のいづれかにより、本発明のペプチドに容易に接近できるようにする。

第１表に示される特定のポリペプチド配列の他に、この配列及びフラグメント及びその最少変動を示す十分な長さの配列に基づくペプチドフラグメントは、少なくともある程度のＤＨＰＲの生物学的活性を有し、そして従って、薬物開発又は他の研究において有用であろう、たとえばＤＨＦＲ酵素配列のフラグメントば容易に調製され得、そして結合部位モデルとしての使用のためにスクリーンされ得る。ペプチド合成機は、小さなポリペプチドフラグメント（たとえば１００個以下のアミノ酸）を調製するために使用され得、又は遺伝子工学の技法は大きなフラグメントを調製するために使用され得る。適切なポリペプチドフラグメントを同定するであろう単純なスクリーニング方法は、ＤＨＦＲ基質の親和性カラムへの結合及び結合された支持体により保持されるペプチドフラグメントの捕獲から成る。そのようなペプチドはまた、抗体の調製のための免疫原として又はＰ、カリニイ感染の存在を同定する方法としてＰ、カリニイＤＨＦＲに対する抗体を使用するアッセイにおける対照としても使用され得る（そして、実際より使用される傾向がある）。

大きなタンパク質から適切な結合親和性を有するペプチドフラグメントを調製し、そして選択する能力は当業界において良く知られており、そして多くの出版物（特許も包含する）に記載されている。たとえば、完全なウィルスタンパク質と同じ抗体と結合するウィルスタンパク質の免疫学的に活性的なフラグメントの調製を記載するアメリカ特許第４．６２９，７８３号を参照のこと。

さらに、前記ペプチド及びＤＮＡ分子の少々の変動はまた、当業者により明らかであるように、より詳細に示されるそれらのペプチド及びＤＮＡ分子に等しいものとして言及される。

たとえば、ロイシンとイソロイシン又はバリンとの置換、アスパラギン酸塩とグルタミン酸塩との置換、トレオニンとセリンとの置換又はアミノ酸と構造的に関連するアミノ酸との類僚する置換（すなわち保存的な置換）は、特にその置換が生物学的活性の結合部位又はその他の部位でのアミノ酸を含まない場合、その得られる分子の生物学的活性に対して主な効果を有さないであろう。これは、種間に存在する既知の有意な変動の観点からＤＨＦＲ酵素のために特に真実である。

さらに、当業界において知られているように、追加のアミノ酸が２つの末端のいづれかで存在することができ、又はアミノ酸がその末端の１つ又は両方で不存であることができる。

変化が機能的なペプチドをもたらすかどうかは、天然のＤＨＦＲ酵素（又はフラグメント）の正常な機能を行なう変性された酵素（又はフラグメント）の能力に錬るアッセイにおける機能のための直接的な分析により容易に決定され得る。

１つ以上の置換が生じているペプチドは、同じ方法で容易に試験され得る。好ましいペプチドは、２０個の隣接するいづれかのグループにおいて１２個よりも多くない、より好ましくは５個よりも多くないアミノ酸で異なる。アミノ酸の置換は、それらが存在する場合、好ましくは標準の保存グループ内から存在する。アミノ酸の標準の保存グループは、１文字のアミノ酸コードを用いて括弧で示されている：非極性（Ａ。

Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍ）；芳香族（Ｆ、Ｔ、Ｗ）ｉ未変化の極性（Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｃ，Ｎ、Ｑ）；酸性（Ｄ、Ｅ）；塩基性（Ｋ、Ｒ，Ｈ）。芳香族アミノ酸は時々、広く定義された非極性（Ｆ、Ｗ）又は未変化の極性（Ｔ）グループに属すると思われる。しかしながら、そのような変性された酵素は、Ｌ左１三４ＤＨＦＲの種 −特異的インヒビターの同定に関連する下記の特定の技法においてほとんど有用でない。

本明細書に記載されるいづれかのペプチドの塩は、そのようなペプチドが種々のｐＨの水溶液に存在する（又はそれらの水溶液から単離される）場合、天然に存在するであろう、指摘された生物学的活性を有するペプチドのすべての塩は、本発明の範囲内にあると思われる。そのような例は、カルボン酸残基のアルカリ、アルカリ土類及び他の金属塩、アミノ残基の酸付加塩（たとえばＨＣｌ）、及びカルボン酸と同じ分子内のアミノ残基との間の反応により形成された双性イオンを包含する。

本発明のペプチドは、本明細書に記載されるように直接的な合成により又はクローン化された遺伝子又はそのフラグメントを用いることによって、他の旦、左ユ三工物質を有さない均質調製物としてまず初めに調製され得る。４三盃ＤＨＦＲペプチドは、０．１％以下の純度での粗均質物の形でこれまで利用された。この粗調製物は、すべての他のＬＵ王土物質を有さないわけではなかった。

遺伝子及び対応するタンパク質は上記の完全な合成技法により調製され得るが、本発明の好ましい態様においては、遺伝子情報は天然源から得られ、そして本明細書に記載されるようにして同定される。遺伝子物質は、まず、いづれか多くの技法を用いて遺伝子ライブラリーの形で得られる。これらのうち初めは、ゲノムＤＮＡをランダムにせん断し、そして発現ベクター中にこのせん断された物質を挿入することである。十分な組換え体が生成される場合、対象の酵素に対応する融合タンパク質を発現する少なくとも１つの組換え体を集団で有する良好な可能性が存在する。

遺伝子ライブラリーを調製するためのもう１つの手段は、生物の全体のｍＲＮＡ集団の相補的なりＮＡ　（ｃＤＮＡ）を製造し、そしてこれらを発現ベクターにおける組換え分子としてクローン化することである。生物の予測される性質（すなわち、菌類の特徴を有することが予測される）は、イントロンが所望する遺伝子のコード領域内に存在することを指摘した。イントロンは、せん断されたゲノムＤＮＡの使用を排除するが、それらはスクリーンされるべき組換え体の数を高め、そしてさらに分析を実質的に複雑化する。この結果に基づけば、Ｐ、カリニイ遺伝子を得るためには、ｃＤＮＡライブラリーの使用が好ましい。

そのようなライブラリーは、本発明者の実験室において生成され、そして宿主に対してトリメトプリム耐性を付与する遺伝子生成物の発現についてスクリーンされた。この例の詳細は、遺伝子の完全な配列の獲得を導びく実験の詳細を含んで、下記に示される。しかしながら、本発明者より調製された配列及び特定の生物が、本明細書に示されるガイドを用いて調製され得る他のクローンよりも良好であることを信じる理由は存在しない。実際、Ｐ、カリニイＤＨＦＲの発現は、他の発現システムの選択により本明細書に記載されるものよりも増強され得る傾向がある。

Ｐ、カリニイＤＨＦＲの配列が決定されれば、本発明の遺伝子材料を得るためにこれらの段階を通過することはもはや必要ではない。ポリマラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技法は、より単純且つより直接的な方法で天然源から遺伝子を単離するために使用され得る。診断への使用を包含するＰＣＲ技法は、アメリカ特許第４．６８３．２０２号に開示されており、これは引用により本明細書に組込まれる。Ｐ、ｌ　Ｑ（一検体は、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭａｒｙｌａｎｄのＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎから容易に入手され得、そしてＰＣＲプローブは本明細書に示される配列を用いて調製され得るので、ＰＣＲ技法及び旦、互丈三盃ゲノム材料の市販源を用いて本明細書に示される配列のいづれか所望するセグメントを得ることが可能である。ＬＵ三（ＤＨＦＲ染色体遺伝子を単離するためのそのような技法の特定の例は、次の例に記載されている。

遺伝子工学の分野においての当業者の知識と前で記載された概要とを組合して使用する場合、上記技法は、所望の遺伝子の単離及び組換えＤＮＡベクターへのその使用を容易に可能にするが（十分な情報が遺伝子を配置するために提供されれば）、同じ結果を導びく他の方法もまた知られており、そして本発明の組換えＤＮＡベクターの調製に使用され得る。

ヱー左ユ王土タンパク質の発現は、形質転換された宿主において遺伝子の複数のコピーを含むことによって；宿主において再生することが知られているベクターを選択することによって、それによって挿入された外来性ＤＮＡ　（たとえばｐＵＣ８；　ｐｔａｃ１２　；　ｐｒＮ−ｍ−ｏｔｓｐＡ　１　、２　、又は３　；ｐＯＴｓ；ｐＡＳ　１　；又はｐＫＫ２３３−３）から多量のタンパク質を生成し：又はペプチド発現の増強のいづれか他の既知の手段により増強され得る。

１つの通常の変法は、融合されたポリペプチドの形での本発明のポリペプチドの調製である。そのようなペプチドは、典型的には、宿主において発現されることが知られている遺伝子のプロモーター領域を用い、そして宿主タンパク質のための遺伝子配列中に本発明のアミノ酸配列のすべて又は主要部分をコードするヌクレオチドを挿入することによって調製される。そのような融合されたタンパク質の例は、β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を包含する。所望により、その融合されたペプチドは、タンパク質分解酵素により認識される部位が２つの融合されたタンパク質の間の接合部で存在するように構成され得る０次にタンパク質分解酵素は、発現されたタンパク質を切断するために使用され、その結果、所望するＤＨＦＲ酵素が純粋な形で利用できる。

すべての場合、Ｐ、カリニイタンパク質は、そのＤＮＡ配列がベクター中に機能的に挿入される場合に発現されるであろう。“機能的に挿入される”とは、当業者に十分理解されるように、適切な読み枠及び配向での存在を意味する。典型的には、遺伝子は、プロモーターの下流に挿入され、そして続いて停止コドンが存在し、但しハイブリッドタンパク質としての生成（たぶん続いて切断が伴う）が、所望により使用され得る。

組換えＤＮＡ分子を調製するために使用され得、そして本発明の実施に従って単細胞生物を形質転換する上記の一般的な方法の他に、他の既知の技法及びその変法は本発明の実施に使用され得る。特に、遺伝子工学に関係する技法は最近暴発的な成長及び開発を受けて来た。多くの最近のアメリカ特許は、プラスミド、遺伝子工学的に構成された微生物及び本発明の実施において使用され得る遺伝子工学を行なうための方法を開示する。たとえば、アメリカ特許第４．２７３．８７５号は、プラスミド及びそれを単離する方法を開示する。アメリカ特許第４．３０４．８６３号は、ハイブリッドプラスミドが構成され、そして細菌宿主を形質転換するために使用される遺伝子工学により細菌を調製するための方法を開示する。アメリカ特許第４．４１９．４５０号は、組換えＤＮＡ作業においてクローニングビークルとして有用なプラスミドを開示する。アメリカ特許第４．３６２．８６７号は、組換えｃＤＮＡ構成方法及びクローニング方法において有用である、それにより生成されたハイブリッドヌクレオチドを開示する。アメリカ特許第４．４０３，０３６号は、ＤＮＡセグメントの複数のコピーを含むプラスミドを生成するための遺伝子試薬を開示する。アメリカ特許第４，３６３，８７７号は、組換えＤＮＡ）ランスファーベクターを開示する。アメリカ特許第４，３５６．２７０号は、組換えＤＮＡクローニングビークルを開示し、そしてそれは、遺伝子工学及びそこに使用される基本的な方法に使用される多くの用語を定義するので、遺伝子工学の分野において特に有用な開示である。アメリカ特許第４．３３６．３３６号は、融合遺伝子及びその製造方法を開示する。アメリカ特許第４．３４９．６２９号は、プラスミドベクター及びその製造方法及び使用法を開示する。アメリカ特許第４．３３２．９０１号は、組換えＤＮＡにおいて有用なりローニングベクターを開示する。これらの特許のいくつかは、本発明の範囲内でない特定の遺伝子生成物の産生に向けられているが、そこに記載される方法は、当業者により、本明細書に記載される本発明の実施に容易に変性され得る。

本発明の包含は、本発明のＰ、カリニイＤＨＦＲ及び遺伝子材料の有用な量がハイブリダイゼーションアッセイの開発において又は診断、免疫化、治療及び研究に使用するための試薬としてこれらの物質を利用するいづれか他のタイプのアッセイにおいて使用のために利用可能になるであろうことにおいて有意である。単離されたＰ、カリニイｃＤＮＡの他の発現ベクターへのトランスファーは、Ｅ、コリにおける旦工Ｕ三（ＤＨＦＲの発現を改良し、又は他の宿主においてポリペプチドを発現する構造体を生成するであろう。

本明細書に開示される主要且つ異なったヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを用いて、Ｊ工孔工の他の株からの遺伝子の単離に特に向けられる。そのようなプローブは、完全な配列よりも相当に短いが、しかし少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１４個の長さのヌクレオチドであるべきである。

２０〜５００個、特に３０〜２００個の長さのヌクレオチドを有する中間のオリゴヌクレオチドが特に、特異的且つ急速に作用するプローブを提供する。

遺伝子の完全な長さまでのより長いオリゴヌクレオチドもまた有用である。ＲＮＡ及びＤＮＡプローブの両者が使用され得る。

使用する場合、プローブは典型的には、検出可能な手段（たとえば”　Ｐ　＋　 ”　Ｈｘビオチン又はアビジン）によりラベルされ、そして遺伝子が調べられる生物からの一本１１ＤＮＡ又はＲＮＡと共にインキュベートされる。ハイブリダイゼーションは、−末鎖及び二本鎖（ハイブリダイズされた）ＤＮＡ（又はＤＮＡ／ＲＮＡ）が分離された後（典型的にはニトロセルロース紙を用いて）、ラベルにより検出される。オリゴヌクレオチドと共に使用するのに適切なパイプリダイゼ、−ション技法は良く知られている。

プローブは通常、容易な同定を可能にする検出できるラベルと共に使用されるが、ラベルされていないオリゴヌクレオチドもまた、ラベルされたプローブの前駆体として及び二本鎖ＤＮＡ　（又はＤＮＡ／ＲＮＡ）の直接的な検出を提供する方法への使用のために有用である。従って、用語°“オリゴヌクレオチドプローブとは、ラベルされた及びラベルされていない形の両者を言及する。

撃約すれば、Ｐ、カリニイＤＨＦＲｃＤＮＡ配列は、旦−二における直接的な発現により単離される。この遺伝子の読み取り枠は、既知のＤＨＦＲに類似する２３．８６８ドルトンのタンパク質の合成に向ける。少なくとも１つの場合、Ｐ　カリニイＤＨＦＲ遺伝子は４３ｂｐのイントロンを含む。

そのＤＮＡ配列はＡ−Ｔに冨み、そして第３位置にこれらの残基を含むコドンに対して需要傾向を示す。Ｐ、カリニイＤＨＦＲはチミジル酸シンターゼ（ＴＳ）を有する二官能価酵素として見出されない。染色体位置は、ＤＨＦＲが、原生動物に見出されるように、ＴＳに遺伝的に結合されないことを示す。Ｐ、カリニイＤＨＦＲは旦−ユニ中に多量発現され、これは追加の研究のための純粋な酵素の源を提供する。さらにＤＮＡ配列分析は、ヒトＰ、カリニイＤＨＦＲがラットからの酵素と同一であることを示す。免疫抑制されたラットは、Ｐ、カリニイー特異的ＤＨＦＲインヒビターによるヒトの処理のための薬物を開発すために唯一の利用できる非−ヒトモデルである。

微生物及びヒ）ＤＨＦＲ間の記録された配列差異は、広く使用される抗菌剤、たとえばトリメトプリム及びピリメタアミンにより例示されるように、抗菌性化学療法のための重要な標的にこの酵素をした。スルファメトキサゾールとの組合してのトリメトプリムは、Ｐ、カリニイ肺炎のための主な治療及び予防型の１つである。驚くべきことには、トリメトプリム成分は旦−Ｕ三（ＤＨＦＲのひじょうに良好でないインヒビターであり、旦−ユ見酵素よりｉｏ、ｏｏｏ倍高いＩＣ３゜値を示す。さらに、その薬物は標的の旦−車重正否酵素よりも宿主ＤＨＦＲをより有効に阻害する。いくつかの推測がこの発見から生じる。第１に、トリメトプリム−サルファメトキサゾールの組合せにおけるスルファ成分がＰ、カリニ− イーに対して効果的な役割を演じることが明らかである。これは、Ｐ、カリニイ感染のラットモデルの処理においてトリメトプリムのみの効力の欠乏及びトリメトプリム及びサルファ薬物の既知の相乗性により支持される。第２に、トリメトプリムは−Ｌ−）し九二ゴーの処理に使用されるべき最適のＤＨＦＲＨＦ上ビターではない傾向がある。最後に、本発明により供給される多量の組換えＰ、カリニイＤＨＦＲの利用可能性により、トリメトプリムの効力を越えることは困難であるはずがない。これは、抗−葉酸塩（及びそれらが開発されるような新規の化合物）の利用できる収集物をスクリーニングし、そしてＰ　カリニイ酵素を阻害する種類を選択しながら、ヒト酵素を阻害する化合物の種類を回避することによって単純に達成され得る。Ｐ、カリニイＤ）（ＦＲはまた、分子構造体に基づく薬物企画のための有望な標的も示す。

前記に記載される技法は、初期スクリーニング方法であり、そして特定の化合物が感染されたヒトを処理するために使用され得るかどうかの問題に対して明確な答えを提供しないことが認識されるであろう。他の要因、たとえば毒性及び安定性もまた考慮されるべきである。しかしながら、分子がＰ。

カリニイＤＨＦＲの可能性あるインヒビターでなく、又は種−特異的選択性を示さない場合、その分子はこの様式により効果的でありそうもない、従って、スクリーニング技法は、ヱー立１三不肺炎の商業的な処理法を開発する上で重要な第１の段階である。

本発明が一般的に記載され、そして次の例は本発明の例示目的のためであって、本発明を制限するものではない。

■ λ及びプラスミド宿主として使用した。発現実験のために使用されるＤＨＦＲ− 欠失性株Ｄ３−１５７は、５ｅｒａ　Ｓｉｎｇｅｒから得られ、そして前記に説明されている：　Ｓｉｎｇｅｒ星煮、　＋Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．　（１９８５）　１６４　：　４７０〜４７２を参照のこと。他の入手できる株が所望により使用され得る。Ｅ、コリ及びＭ１３ベクターを、ＤＮＡ配列決定のために使用した。使用される培地は、Ｌｕｒｉａブイヨン＋適切な抗生物質（アンピシリン１００μｇ／ｄ及び／又はトリメトプリム１００　ｕ　ｇ／Ｉｎｌ１）ステロイド処理されたラットからのＰ　カリニイ及び検死解剖サンプルからのヒトＰ、カリニイを、Ｋｏｖａｃｓ７Ｊ＆、＋　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９８８）　１４０　：　２０２３〜２０３１に記載されるようにして調製した。

Ｐ、カリエイＤＮＡライプーリー　びファ　゛ミドの　：バクテリオファージλ ベクターＺ　Ａ　Ｐ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）におけるラッ）ｌΔ−ｃＤＮＡライブラリーを、次の方法で構成した。ファゲミドを、１ｕｒｉａブイヨン４５ｊｄｌ中、δ×１０７のプラグ形成単位（ｐ　ｆ　ｕ）のλファージ及び２ＸＩＯ”のｐｆｕのＲ４０ＢへルバーファージによるＥ　コーリーＸＬＩＢの同時感染のためにライブラリーから開放した。

３７℃で４時間後、その培養物を７０℃に３０分間加熱し、そして遠心分離し、そして開放されたファゲミドを含む上清液を保存した。その上滑液は、１μ！当たり、４Ｘ１０’のアンピシリン耐性コロニー形成単位の力価を有した。

Ｐ、カリニイカ色　のトーンスパース−アル　−ネーー５−７１’フィールド− ０°　Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ　ａｌｔｅｒｎａｔｉｎ　ｆｉｅｌｄ　ｅｌｅｃｔｐ動ｙ至１幻−：感染されたラットの肺からの一１三Δ−染色体を、トランスバースーアルターネーチングフィールド効果電気泳動のために調製した。電気泳動を３段階で行なった：第１段階、４秒のパルス時間による１７０＋ｗＡで３０分間；第２段階、２５秒のパルス時間による１５０ｍＡで１５時間：第３段階、３５秒のパルス時間による１７０ｍＡで７時間（１０ａＭのトリス、０．５ａ＋ＭのＥＤＴＡ、４．３ｔｘＭの酢酸を含む０．８％アガロース中において１６°Ｃで行なった）。電気泳動の後、そのゲルを写真に取り、３０２ｎｍの紫外線トランス照明器に７分間照射し、０．５ＭのＮａＯＨ，１，５ＭのＮａＣ１溶液中で１時間変性し、ＩＭのトリス−ＨＣＩ（ｐＨ８）、１．５ＭのＮａＣ１溶液中で中和し、そして１０ＸＳＳＣ中で１８時間、ＨＹＢＯＮＤ−Ｎナイロンフィルターにプロットした。その膜を８０°Ｃで２時間、焼き付けし、そして５０％ホルムアミド、５ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液及び５ＸＳＳＣ中で４２°Ｃで予備ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションを、Ｐ−左ユ三−（ＤＨＦＲの完全なコード領域を含む１０’ｃｐｍ／戚の３２Ｐ−ラベル価された７１０ｂｐのＳ　ａ　ｌ　Ｉ　−）ユ」」フラグメントの添加により開始し、そして４２°Ｃで１６時間、インキュベーションを続けた。膜を室温で２ｘｓｓｃ中で１５分間２度洗浄し、５０°Ｃでｏ、１ｘｓｓｃ中で１５分間３度洗浄し、そしてＸ−線フィルムに照射した。

プラスミド　び　の　：Ｐ　カリニイＤＨＦＲのｃ　ＤＮＡクローンからのコード領域を、ポリマラーゼ鎖反応技法を用いて増幅した。５′プライマーは、ヌクレオチド１〜２０を含み、そして開始コドンに最っとも近いＢａｍＨＩ及びＮｄｅＩ部位を創造するｄＧＧＧＡＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＴＣＡＧＣＡＡＡＡＧＴＣＴＴＴであった。３′プライマーは、ｄＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＴＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＴＡＡＡＴＡＧＡＡＴＡＡ　（ヌクレオチド６６９〜６８９に相補的である）であり、そして５ａｌＩ及びＨｉｎｄｌ［１部位を創造する。増幅された生成物をＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄｌｌｌにより消化し、そしてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクローン化し、ｐＤＨＦＲｌを得た。ｐＤＨＦＲｌと配列決定し、ｌΔ−ＤＨＦＲコード領域が増幅工程により変えられないことを確保した。Ｐ、カリニイＤＨＦＲの全コード領域を含むｐＤ）ＩＦＲＩの７１２ｂｐのＳｍａ■及びＮｄｅＩフラグメントを、Ｎｄ　ｅ　Ｉ−Ｓｍａ　Ｉにより消化された発現ベクターｐＤＬＴｓ− Ｎｄ　ｅ中にサブクローン化し〔これは、Ｄａｖｉｓｓｏｎ星＆、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　（１９８９）２６４：９１４５〜９１４８に記載されており）、ｐＤＬＤＨＦＲを生成した。

このプラスミドを、ＤＨＦＲ欠失性旦、二丈株Ｄ３−１５７中に導入した。ｐＤＬＤＨＦＲを含む細胞を、ＬＢ＋１００μｇ／ｄのアンピシリン中で飽和まで増殖し、遠心分離により収集し、１１００ａのトリスＨＣＩ　（ｐＨ８，０）、１ｍＭのＥＤＴＡ中に再懸濁し、そして音波処理により溶解した。次に可溶性タンパク質抽出物を遠心分離により調製した。Ｐ、カレキセートーセファロース上に粗抽出物を通し、そして２ｍＭのジヒドロ葉酸塩により溶離することによって達成した。

Ｐ、カリニイＤＨＦＲｃＤＮＡ　＋の　ニブローブとして種々のクローン化されたＤＨＦＲ配列を用いて低−緊縮ハイブリダイゼーションによりヱエ左ユ正否ＤＨＦＲ遺伝子配列を単離する試みは、たぶんＤＨＦＲ配列の低い保存性により不成功であった。トリメトプリムは一部精製された一Ｆ、＃υ三Δ−ＤＨＦＲの弱いインヒビターであるこ与するそれらの能力によりＰ　カリニイＤＨＦＲ配列を単離した。λファージベクターＺＡＰ中にクローン化されたラットのＰ、カリエイＤＮＡライブラリーのプラスミド同等物を、λフアージライブラリー及び複製不完全一本鎖ファージＲ４０８による旦−ユＪＸＬ−ＩＢ細胞の同時感染により生成した。これは、挿入体の切り出し、及びＺＡＰ組換え体からのプラスミド配列の結合及び“ファゲミド”中へのそれらの一本鎖同等物のパフケージングをもたらす。この感染がらの上清液を加熱し、λファージを不活性化し、そしてそれは１μ！当たり４Ｘ１０’のアンピシリン−耐性コロニー形成単位（ｃ　ｆ　ｕ）を含んだ、１０’ｃｆｕによるＸＬ−ＩＢの感染及び１００μｇ／ｄのトリメトプリムを含む培地へのプレーテングは、３０個のトリメトプリム耐性コロニーの単離を可能にした。プラスミドＤＮＡをそれぞれから単離し、そしてｆｉＬ２ｉＨＢ１０１を形質転換するために使用した。２種のプラスミドは、トリメトプリム耐性をトランスファーすることができることが見出された。初期のトリメトプリム耐性クローンの残りは、染色体ＤＨＦＲ突然変異を示すことが推定された。

Ｐ　力曹ニイＤＨＦＲｃＤＮＡの　１：２種のプラスミドの制限分析は実質的なオーバーラツプを示し、そして１つをＤＮＡ配列分析のために選択した。ｐｐｃＤＨＦＲｃＤの完全な９００個の塩基対（ｂｐ）の配列が決定され（第１表）、そして６１８個のｂｐの読み取り枠を含むことが示された。直接的な選択方法により得られたＤＨＦＲ配列がトリメトプリムの存在により変えられなかったことを確認するために、独立したクローンを核酸ハイブリダイゼーションにより単離した。これらの単離物の１つのコード領域は、トリメトプリム選択により最初に得られたクローンと同一であった。

ｃＤＮＡの予測される出発コドンは、Ｓ、セレビシアエ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）翻訳開始のために決定された好ましい環境に十分に適合しない（ＲｘｘＡＴＧＲｘｘＴ　；　Ｄｏｂｓｏｎ＠　ｌ’　、　＋　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８２）１０　：　２６２５〜２６３７）　、得られた配列はＡ−Ｔに冨んでいる（コード領域において６８％；全体において７１％）。コドン使用は、第３位置においてＡ又はＴに強く片寄らされる。第３位置におけるＡＴ又はＧＣの間の選択が可能である１９４個のコドンのうち、１６８個（８７％）のコドンがＡ又はＴ残基を含むことが見出される。

Ｐ　力１ニイＤＨＦＲ゛　云　イントロンの　：Ｐ　カリニイの種々の源からのＤＨＦＲ配列の天然の変動性を評価するために、特異的プライマーが、５匹のラット及び２人のヒトＰ、カリニイ調製物から単離されたＤＮＡからのＤ）ｆＦＲコード配列を増幅するためにポリマラーゼ鎖反応と共に使用された。予測される増幅生成物は７１２ｂｐのものであった。しかしながら、上工互丈とニゲツムＤＮＡの増幅は、すべての源から７５０ｂｐの生成物を表わした。この生成物がサズクローン化され、そしてヌクレオチド２６７（第１表）で４３ｂｐの挿入体を含むことが示された。この配列は読み取り枠を破壊し、そして小さなイントロンと一致した特徴を示す。５′及び３′スプライス結合、すなわちＧＣＡ及びＴＡＧは、他の菌類のイントロンにおいて決定されるこれらの領域のためのコンセンサス配列に相当する。さらに、イントロンの大きさは、Ｐ、カリニイＴＳ遺伝子において観察される大きさに類似する（４５〜５５個のヌクレオチド）。イントロン以外に、７５０ｂＰの生成物の配列における唯一の変化は、３′未翻訳領域（位置６５４）におけるＡからＧへのトランジションであった。

チミジル　シン　−ゼへのＰ、力１ニイＤＨＦＲ人〇■：Ｄ）（ＦＲが特徴化されているすべての原生動物において、それはチミジル酸シンターゼ（ＴＳ−ＤＨＦＲ）を有する二官能価タンパク質として見出される。対照的に、これらの遺伝子が特徴づけられているすべての他の生物は、別々のＴＳ及びＤＨＦＲ遺伝子及びタンパク質を含む。Ｐ、カリニイＤＨＦＲ遺伝子は二官能価タンパク質をコードしない。さらに、染色体の配置（下記を参照のこと）により、ＴＳ及びＤＨＦＲ遺伝子は結合されない。二官能価ＴＳ−ＤＨＦＲの不在はさらに、４三不が原生動物のメンバーでないという結論を支持する。

の　のＤＨＦＲ配置とＰ、カリニイＤＨＦＲとの　：ヱユＱＤ　ＨＦ　Ｒゲノム配列は、２０６個のアミノ酸及び２３．８６８の分子量のタンパク質を予測する。この大きさは、一部端製されたＰ、カリニイＤＨＦＲのゲル濾過によりこれまで決定された２０．０００〜３０．０００の値と調和しくＫｏｖａｃｓｌｌ？、、　Ｐａｒａｓｉｔｉｃ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　（１９８８）　；　ＬｅｅｃｈｆＸ　ｅ、、　Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ　Ｌｉｖｉｎｇｔｏｎ出版、Ｎｅｈ　Ｙｏｒｋ、　１７７〜１９３ページ）、そしてＳ、セレビシアエにおけるように、哺乳類及び細菌ＤＨＦＲよりもわずかに大きい。第３表において、そのタンパク質配列は、−クトバシラス　カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉ　１１ｕｓ臼μ壮）、ヒトＳ、セレビシアエ及びレイシマニア　メジヤニ（ｋ■ｈａ＋ａｒｉａ　ｍａ’ｏｒ）からのＤＨＦＲ配列に整合される。

ＤＨＦＲ間の低程度の類似性により、三次元構造の不在での整合は、いく分任意的であるべきである。それにもかかわらず、−次構造及び三次元構造の両者は、これらを整合する場合、考慮される。上、左ユ三４ＤＨＦＲはすべてのＤＨＦＲに保存されるそれらの残基（太字）を含む。より大きなサイズのＰ、カリニイＤＨＦＲは、Ｂｌａｋｅｌｙ、　Ｆｏｌａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｐｔｅｒｉｎｓ　：　Ｖｏｌ、　ｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｓｉｓｔｒ　ｏｆ　Ｆｏｌａｔｅｓ　（１９８４）＋Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ出版、Ｔｏｒｏｎ　ｔｏに記載されているように、既知の二次構造要素間でループする領域における挿入によると主に考えられる。しかしながら、Ｓ、セレビシアよりＨＦＲに類似する特に大きな挿入が、カルボキシ末端（アミノ酸１８１〜１９３）近くに存在する。細菌と背椎動物のＤＨＦＲとの間の最っとも劇的な構造的差異がまた、この領域で存在する。細菌酵素におけるβ−シート（第３表における βＧ）は、背椎動物酵素における小さな挿入により、“β−バルジ”に変化される。Ｐ、カリニイＤＨＦＲに見られる挿入が類似する構造変化又は細菌酵素に対してさらに一層のラジアル変化をもたらすかどうかは知られていない。

Ｐ　力１ニイＤＨＦＲ゛　−の　配　：ヱーｐが２９５〜７１０　ｋ　ｂ　ｐ（ｋｂｐ：Ｆｉｓｈｍａｎ７Ｊ？、。

Ｊ、Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ、　（１９８９）３６　：　４　Ｓ　〜５　Ｓを参照のこと）の大きさの範囲の１４個の染色体を含むことが最近水された。さらに、種々の単離物における染色体のパターンの変動が存在する。旦、左ユ三４ＤＨＦＲプローブは、トランスバース　アルターネーチング　フィールド電気泳動により分離されたＰ−Ｕ正否染色体のフィルター複製物をプローブするために使用された。２つの単離物は、３２０ｋｂｐの単一の染色体上にＤＨＦＲ配列を有することが示された。第３の単離物は、わずかに大きな分子量の染色体上にＤＨＦＲ配列を有した。

大きさの変動の有意性は明確ではないが、しかし１三−イーにおける株の差異の影響は存在する。Ｓ　セレビシアエ染色体へのハイプリダイゼーシ５ンは検出されなかった。ＬＵ三ヱチミジル酸シンターゼは３３０ｋｂｐの染色体上に見出されるので、これらのタンパク質の遺伝的結合は存在し初期の単離物におけるトリメトプリム耐性は、機能的なヱーカリニイＤＨＦＲが合成されたことの表示である。これらの単離物における全体のＤＨＦＲ活性は、ベクターのみを含むＥ　コリに等しい、この少量のＰ、カリニイＤＨＦＲは、これらのクローンを単離するために使用されるトリメトプリムのレベルを克服するのに明らかに十分である。

しかしながら、ｌΔ−ＤＨＦＲに対する追加の研究は、詳細な構造及び運動特徴化を行なうために十分な量の酵素を生成する能力に依存する。発現レベルを増強するために、Ｐ　カリニイＤＨＦＲのコード領域が発現ベクターＰＤＬＴＳ−ＮＤｅに置かれ、そしてＤＨＦＲ−欠失性旦一ユユ株Ｄ３−１５７を形質転換するために使用された。発現構造体は、この株におけるＤＨＦＲＨＦ性を補足することができ、そして富化培地においてその増殖速度を有意に高めることができた。

この構造体を含む細胞の溶解物は、ベクターのみを含む細胞に存在しない約２５．ＯＯＯＭｒのタンパク質を含む、メトトレキセート−セファロース　アフィンティークロマトグラフィーによりこれらの細胞から精製されたＰ、カリニイＤ）（ＦＲは、２５、ＯＯＯＯＭｒのタンパく質と共に同時移動する。酵素活性の測定及び染色されたゲルのデシシトメータースキャンは、Ｐ、カリニイＤＨＦＲのレベルがヱエノｕＬと±ＤＨＦＲ発現構造体を含む旦−ユ丈における可溶性タンパク質の約５％であったことを示した。

１メトブｉムによる　えＰ、カリニイＤＨＦＲの　ニトリメトプリムは、ラットの肺からの生物の粗均質物に↓ける一５Δ−ＤＨＦＲ活性の弱いインヒビターであることが報告されている。精製された組換え酵素の使用は、トリメトプリムが酵素のひじょうに良好でないインヒビターであることを示した。２５μＭのジヒドロ葉酸塩濃度で、トリメトプリムについてのＩｃ５ｏｉｌはＰ、カリニイ酵素のために２０．０００ｎＭであった。対照的に、ヒ）ＤＨＦＲに関するトリメトプリムのためのＩＣ，。は２０００ｎＭであり、そしてＬ２Ｊ−Ｄ　ＨＦ　Ｒのためには２ｎＭであった。ＤＨＦＲの非選択的インヒビター、すなわちメトトレキセートは、すべての３種のＤＨＦＲのために約０．１ｎＭのＩＣ，。値を示す。

本明細書におけるすべての出版物及び特許出願は、本発明が関与する当業者の熟練のレベルの表示である。すべての出版物及び特許出願は、引用により本明細書に組込まれる。

本発明は十分に記載されて来たが、当業者に明らかなように、本発明は請求の範囲内で変更及び修飾を行なうことができる。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｐ．カリニイジヒドロ葉酸レダクターゼをコードするヌクレオチド配列を含んで成る単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子。
２．前記分子が下記ジヒドロ葉酸レダクターゼコード配列：【配列があります】又は同等の又は相補的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含んで成る請求の範囲第１項記載の分子。
３．前記分子がＤＮＡである請求の範囲第２項記載の分子。
４．前記分子が前記ジヒドロ葉酸レダクターゼ配列を含む請求の範囲第３項記載の分子。
５．前記分子がＲＮＡであり、そして前記ジヒドロ葉酸レダクターゼ配列に対応し又は相補的な配列を含む請求の範囲第２項記載の分子。
６．前記配列の先の５′側に機能的プロモーター配列が存在する請求の範囲第１項記載の分子。
７．前記配列の少なくとも１つのコピーが機能的な組換えＤＮＡ又はＲＮＡベクターに存在する請求の範囲第６項記載の分子。
８．遺伝子工学により生成された徴生物であって、前記微生物が請求の範囲第７項記載のベクターを含んで成る微生物。
９．前記微生物がＥ．コリ株である請求の範囲第８項記載の微生物。
１０．単離されたオリゴヌクレオチドであって、下記ヌクレオチド配列：【配列があります】相補的ＤＮＡ配列及び同等の又は相補的ＲＮＡ配列から選択された少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含んで成るオリゴヌクレオチド。
１１．前記オリゴヌクレオチドが検出可能な標識によりラベルされる請求の範囲第１０項記載のオリゴヌクレオチド。
１２．前記オリゴヌクレオチドが少なくとも１４個の連続したヌクレオチドを含んで成る請求の範囲第１０項記載のオリゴヌクレオチド。
１３．サンプル中のＰ・カリニイの存在を検出するための方法であって；ハイブリダイズ条件下で請求の範囲第１０項記載のオリゴヌクレオチドと前記サンプルとを接触せしめ、そして前記オリゴヌクレオチド及び前記サンプルに存在するＤＮＡ又はＲＮＡを含んで成る複合体の形成を検出することを含んで成る方法。
１４．前記方法がポリマーゼ鎖反応を含んで成る請求の範囲第１３項記載の方法。
１５．請求の範囲第１項記載のヌクレオチド配列によりコードされる遺伝子工学的に構成されたペプチド。
１６．前記ペプチドがグリコシル化されていない請求の範囲第１５項記載のペプチド。
１７．下記アミノ酸配列：【配列があります】又は少なくとも５個の連続したアミノ酸残基を含んで成る前記配列のフラグメンを含んで成るペプチドであって、前記ペプチドが他のＰ．カリニイ物質から単離されていることを特徴とするペプチド。
１８．Ｐ．カリニイに対して特異的なジヒドロ葉酸レダクターゼ　インヒビターを同定するための方法であって：請求の範囲第１７項記載のペプチドのための可能性あるジヒドロ葉酸レダクターゼ　インヒビターの結合親和性を決定し；哺乳類ジヒドロ葉酸レダクターゼのための前記可能性あるインヒビターの結合親和性を決定し；前記結合親和性を比較し；そして前記ペプチド及び前記哺乳類ジヒドロ葉酸レダクターゼのためのトリメトプリムにより示される比率よりも高い、前記哺乳類ジヒドロ葉酸レダクターゼのための結合親和性に対する前記ペプチドのための結合親和性の比率を示すインヒビターを選択することを含んで成る方法。
１９．前記インヒビター比率が１：１よりも高い請求の範囲第１８項記載の方法。
２０．前記哺乳類ジヒドロ葉酸レダクターゼがヒトジヒドロ葉酸レダクターゼである請求の範囲第１８項記載の方法。