JPH04500559A - 化学種測定方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 化学種測定方法および装置 発明の背景 本発明は流体サンプル中の少なくとも１つ以上の分析物の存在を測定するための 診断キットに関する。さらに詳しくは、本発明は、皮膚を通して浸出される分析 物の濃度を有利に測定できるレベルまで増大するための皮膚濃縮パッチ（ｄｅｒ ａｉｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｐａｔｃｈ）に関する。

患者の生理状態の測定は体液中の所定の化学種の存在および／または濃度の化学 分析により、しばしば補助される。典型的には病院の医務室で行われるこれらの テストは、血液の分析のような侵入的（１ｎｖａｓｉｖｅ）な、あるいは尿また は汗の分析のような非侵入的（ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ）な捕集技術により特 徴づけられる。

血液はしばしば多種多様の成分が分析され、一般に、臨床研究室には血液組成の 高定量プロフィールを提供できる器具が備えれらている。しかし、血液捕集は本 質的に侵入的なものであるため、多くの欠点を伴う。一般に血液サンプルの捕集 に基づく分析は医務室または臨床研究室に限られ、それは歩行できる患者を不便 にし、コストを非常に増大させる。また、侵入的方法に伴う何らかのリスクは、 患者の状態並びに実施が望まれるテストの性質および必要性に応じて、良くても 望ましくないか、全く容認できないものである。

さらに、興味のある多くの分析物または代謝産物が尿中で発見でき、それは、予 知できる供給および非侵入的捕集により特徴ずけられる。しかし、いずれ明らか になるように、尿分析は本発明の濃縮パッチの主に意図する用途に用いるのにあ まり適さない。

汗は、ある種の雰囲気下では、生理状態の測定での分析用の理想的な体液である 。その非侵入的捕集は医務室外での使用を好適にし、その生体分子の濃度の点か らの血液に対する類似性は広範囲の生理テストを好適にする。

かくして汗中の分析物をモニターするための種々の診断キットが開発された。例 えば、フィールズ；　（Ｆｉｅｌｄｓ　ｅｔ　ａｌ、）に対する米国特許第３． ５５２．９２９号は嚢胞性線維症の診断方法として、特に汗中の塩素イオン濃度 測定に適したバンドエイド・タイプのテストパッチを開示している。フィールズ の特許に開示された装置は蒸発を防ぐための不浸透性の上被層を有する吸収性パ ッドバッドからなる。該吸収性パッドが浸されると、皮膚からパッチを取り除き 、多量のクロム酸銀または硝酸銀で満たされた一連のストリップに暴露され、塩 化物塩に変化した時にその色が公知の色に変化する。

ベックら（Ｐａｃｋ　ｅｔ　ａｌ、）に対する米国特許第４，７０６，６７６号 は、分析物の逆移動をふせぐためのバインダーと、分析物を皮膚表面から該バイ ンダーに移送する液体移送媒体と、該液体移送媒体およびバインダーの頂部を覆 う閉鎖カバーとからなる皮膚捕集装置を開示している。

ぺ・７りは種々の環境化学物質に対するヒト暴露の検出への皮膚捕集パッチの適 用を開示している。皮膚捕集装置を患者の皮膚に、ある一定期間装着した後、パ ンチを分析のために取り除いた。分析においては、興味ある結合物質を結合貯蔵 器から化学的に分離し、っいで、通常の実験技術により定性及び／または定量測 定を行う。

一般的に先行技術は、診断テストパッチが所望される有利な現場使用の場合、少 なくとも１つ以上の重要な制限に苦しむ。特に、先行技術の診断テストパッチは 、一般に、汗中に比較的に高濃度で存在するハロゲンイオン等の分析物の存在を 測定することのみに有用である。他の先行技術の皮膚パッチは、それから分析物 を後に分離しかつ濃縮する、または公知の実験技術にしたがって分析のために調 製しなければならない捕集装置にすぎない。また、先行技術の閉鎖外層タイプの 装置は、その中に含有される汗および／または分析物の逆拡散の問題に影響され やすい。

かくして、多種多様の用途において、通常の器具を必要とせずに汗中の低濃度の 分析物の存在を検出するのに利用できる、汗のような体液中の予め選択された分 析物の非侵入的な測定用の方法および装置が相変わらず必要である。テストキッ トは低コストであり、医師以外の有利な使用に適するべきである。

Ｒ里二互！ 先行技術の前記制限に打ち勝つため、本発明のある実施態様によｎば、体液源と 連絡する濃縮ゾーンと、大気に対して露出されて体液中の実質的な水分および他 の望ましくない成分の少なくとも一部分の排出を可能にする排出ゾーンとからな る、体熱の影響下で体液の成分を濃縮するための皮膚濃縮バッチが提供される。

ある好ましい具体例では、皮膚濃縮バッチには、選択された揮発分の存在をモニ ターするのに用いる選択的な揮発分保持層が設けられる。揮発分がエタノールで ある場合、例えば、揮発分保持層は硫酸カルシウム結晶または所望の揮発分を捕 らえる能力を有する当業者に公知の他の物質からなってもよい。

ある具体例では、疎水性膜を設けて排出ゾーンから濃縮ゾーンを分離し、流体相 の通過は防ぐが揮発分の気相の排出を可能とする。

濃縮ゾーン中に蓄積された体液の気相への転移は体熱の影響下で促進され、それ により、濃縮ゾーン中の非揮発分および僅かな揮発分を濃縮する。また、濃縮ゾ ーンおよび排出ゾーンは親水性層により分離されてもよく、該層は流体相が排出 ゾーンに入るのを可能にする。

本発明の好ましい具体例で１１、濃縮バッチは、体液中で測定される分析物用の 固定化特異結合パートナ−（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂｉｎｄｉｎｇｐａｒｔｎｅｒ ）をさらに有してもよい。該特異結合パートナ−は綿ガーゼ等の多孔性支持体ま たは７１１縮ゾーンで露出された複数のミクロビーズに対して固定化されてもよ い。また、特異結合パートナ−は濃縮および排出ゾーンを分離するフィルターに 固定化できる。

本発明の他の具体例によれば、被検哺乳動物からのある量の体液を蓄積した後、 体熱の影響下で該体液から水分を除去して体液に含有される非揮発性分析物を濃 縮し、体液中の少なくとも１つ以上の濃縮分析物を該分析物の固定化特異結合パ ートナ−に結合させる工程かみなる、体液中の分析物の存在の測定方法が提供さ れる。その後、結合分析物の濃度は、酵素結合イムノアソセー等の当業者に公知 の種々のイムノアノセー技術のいずれかにより浸出され、結合分析物の存在に反 応して互変する。

つぎに、好ましい具体例、請求項および添付図面により本発明の特徴および利点 をさらに詳しく説明する。

図面の簡単な説明 図１は本発明の１具体例の皮膚濃縮バッチの斜視図である。

図１８は図１の皮膚濃縮バッチの１ａ−１ａ線に沿った断面図である。

図２は本発明の第２の具体例の皮膚濃縮パッチの斜視図である。

図２ａは図２の皮膚濃縮パッチの２ａ−２ａ線に沿った断面図である。

図３は本発明の皮膚濃縮パッチの第３の具体例の斜視図である。

図３ａは図３のバッチの３ａ−３ａ線に沿った断面図である。

図４は本発明の濃縮バッチ中の分析物の存在に応じて互変を行うのに用いる試薬 パケットの１具体例の斜視図である。

図５は本発明の第４の具体例の分解正面図である。

好ましい具体例の詳説 図１を参照すると、皮膚１２０表面に固定されたように示された本発明の１具体 例である皮膚濃縮バッチ１０を開示している。当業者に認められるように、本発 明の濃縮バッチは獣医学的目的に加えてヒトにも用いることができる。また、該 濃縮バッチは農業等のさらに異なった用途、あるいは化学種が流体中で検出され 、かつ、体熱、日光等の熱源がバッチの蒸留または濃縮作用を果たすのに適して いる他のいずれの環境にも用いることができる。しかし、好ましい用途は汗中の 予め選択された化学種の測定用であり、以下の議論は主に最後の用途に関するも のである。

テストバッチ１０の周囲内の皮膚１２から浸出された水分は、まず疎水性フィル ター１６の第１の面の下の濃縮ゾーン１４中に蓄積する。該濃縮ゾーン１４は、 好ましくは流体浸透性媒体２ｏを含有し、該媒体は綿ガーゼまたは他の通常入手 可能な浸透性材料である。

例えば、編織物あるいは不織レイヨンまたはセルロースファイバー等の種々の公 知の繊維ウェブのいずれかの層を用いてもよい。

水分は媒体２ｏの繊維間の空間に蓄積し、流体相を通して皮膚の表面から容易に 導かれる体熱の影響下、汗の水分は揮発する傾向にある。

前記のように、濃縮パッチ１０には疎水性フィルター１６が設けられる。疎水性 に関しては、皮膚から浸出された流体の通過を可能にするが、流体相を濃縮ゾー ン１４に実質的に保持するいずれの材料をも示すことを意図する。米国メリラン ド州エルクトン（Ｅｌｋｔｏｎ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ）　、タフりニー・エル・ボア・アンド・アソシェーツ（Ｗ。

Ｌ、　Ｇｏｒｅ　＆　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）社製のボア・テックス（Ｇｏｒｅ −Ｔｅｘ）、０．４５ミクロンテフロンフィルター等、種々の好適な市販のミク ロ濾過膜フィルターのいずれもこの目的に用いてもよい。本明細書において用い る「親水性」なる用語は、汗の液体相への通過を可能にする材料を意味する。

疎水性フィルター１６の第２の面に隣接するのは排出ゾーン１８である。前記の ように、疎水性フィルター１６は流体相を保持するが汗中の流体成分の気相の排 出を可能にする。したがって、主に気化した水分からなる気体成分は、連続的に 疎水性フィルター１６を通してその第２の面を出て排出ゾーンに入り、該排出ゾ ーンは大気と連絡している。他の具体例においては、単独に示していないが、疎 水性フィルター１６は、流体相の通過を可能にする親水性フィルターと交換され る。この具体例では、流体、または気体と流体の組合せは濃縮パッチから排出で きる。

排出ゾーン１８中のフィルター１６の第２の面に隣接するのは柔軟な浸透性外層 ２２である。この層は摩耗等の物理的損傷からフィルター１６を保護する役目を 果たし、また、フィルター材料の外部からの化学汚染を防ぐバリヤーとしても機 能する。層２２は、当業者に公知の種々の市販気体浸透性テープまたはフィルム からなってもよい。該層２２は後記のテープ２６と別個あるいは一体であっても よい。また、バッチの所期の用途に応じ、摩耗または外部汚染が濃縮パンチ１０ に悪影響を与えないと考えられる場合、層２２を全く削除してもよい。

図１に示す濃縮パッチ１０はテープ２６の周囲バンドにより皮膚の表面に固定さ れている。好ましくは、テープ２６はバッチ１０の全面の周囲に拡がる。例えば 、テープの環状リングは環状パッチとして使用するために打ち抜くことができる 、または四角形のテープの中央を取り除いて四角形のバッチの層２２またはフィ ルター１６を露出することができる。ｔた、層２２およびテープ２６を全く取り 除いて層１６．２０を包帯により皮膚の表面に固定することもできる。かかる方 法は、腕または脚を包囲する包帯または包装材料下で層１６．２０を捕らえる。

この場合、気体および／または液体は１６．２０を通して包帯に排出することが でき、そこで捕集されるかまたは環境に散逸される。

多種多様の低アレルギー性または他の好適なテープは当業者に公知であり、本発 明の濃縮パッチ１０と併用してもよい。異なったテープまたは接着剤は、テスト キ・／トの所期用途に応じ、日中の下着を着ている間、就寝中、長期間のおびた だしい汗をかいている間またはシャワー中等の異なった条件中に皮膚に接着する 能力に基づいて好ましいものである。最も好ましいテープは、汗がテープの低部 に形成して完全な接着を損なうのを防ぐ多数の穿孔を有することが判明した。好 荻しくは、ジョンソン・アンド・ジＳンンン（Ｊｏｈｎｓｏｎ　＆　Ｊｏｈｎｓ ｏｎ）社により販売されているダーミクリアー（Ｄｅｒｍｉｃｌｅａｒ）等のテ ープが用いるれる。

濃縮バッチ１０を皮膚１２に固定するための種々の手段のいずれを利用してもよ い。例えば、テープ２６を省略して低粘着層が設けられたガーゼ層２０に同じ機 能を行わせることができる。かかる粘着膜は米国ミネソタ州ミネトンカ（Ｍｉｎ ｎｅｔｏｎｋａ、　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）　、メムテソク（Ｍｅｍｔｅａ）社製 のＭＮ−１００粘着膜である。この膜は親水性であるため、ガーゼ層２０のよう に流体を通すが、接着面を有するために皮膚に接着する。また、外側の保護層２ ２はフィルター１６およびガーゼ２０の外端、を越えて外側に半径方向に伸びる 環状フランジ２３を有することができる（図２８参照）。該フランジ２３の下面 には適当な接着剤が設けられる。

ヒト皮膚の表面温度は局部的に異なるが、一般に、約８６〜９００Ｆの範囲内で あり、激しい労作条件下で高温になり得る。これらの温度で、クレアチンキナー ゼ、高密度または低密度リポ蛋白等の本発明の目的とする興味ある多くの化学種 は十分に低い蒸気圧を有するため、揮発は濃縮作用の効率においては重要なファ クターではない。同時に、実質的な水性成分は十分に高い蒸気圧を有するため、 揮発することにより僅かな揮発フラクシヨンを濃縮する傾向にある。

しかし、ある用・途では、本発明の化学種は静止忍度でも十分に高い蒸気圧を有 するため、興味ある分析物の気相が疎水性フィルター１６を通して排出されるこ とはテストパッチの効率を不利に損ねる。

これらの分析物では、修飾された濃縮パッチを用いねばならない。

図２および図２８を参照すると、通常の使用条件下、疎水性フィルター１６を通 して蒸気として排出される性質を有する分析物に使用される本発明の修飾された 濃縮パッチ１１を開示している。該テストパッチは、それに濃縮パッチ１１が固 定された皮膚１２により、その内部境界上で規定される濃縮ゾーン１４を有する 。該濃縮ゾーン１４の外部境界は疎水性フィルター１６により規定され、該フィ ルターは排出ゾーン１８から濃縮ゾーン１４を分離する。濃縮ゾーン１４内に配 置されかつ疎水性フィルター１６に隣接するのは、揮発性分析物の分子を結合し かつその排出を防くための結合＠３０である。該結合層３０は多孔性層２８によ ってガーゼ層２０から分離され、流体を通過を可能とする結合層３０を保持する 種々のフ、・ルムのいずれかを損ねる。

図２３に示す具体例では、汗はガーゼ２０の繊維間の空間にプールし、多孔性層 ２８を通して結合層３０に浸出する。該層中では、化学的活性または生化学的活 性の結合材料が作用して揮発性分析物を選択的に結合し、それにより、それが疎 水性フィルター１６を通して蒸気とＬ５て排出されるのを防ぐ、、図１に示す具 体例に関して述べたように、テストパッチチの外側上での流体の存在が望ましく ない場合、疎水性フィルター１６を親水性層に変えることできる。

該結合層３０は、測定する揮発性分析物の性質に応じて種々の結合剤のいずれを 有してもよい。例えば、該結合剤は分析物と化学的に結合し、でもよく、測定す る分析物を吸収し７てもよい。また、結合層は、層中で測定するのが望まれる特 異抗体に整合するポリクロナールまたはモノクロナール抗体等、測定する分析物 の特異結合／（−トナーを宵してもよい。

濃縮バッチ１１には、図１に示す具体例に関して詳説したように、さろに被験物 の皮膚にバッチを固定するためのテープ２６また：ま他の手段が設けられる。し かし、濃縮パッチ１１は下被層の周囲の下側に伸びる単一の外層２２を有して環 状フランジを形成するように示され、該環状フランジには、その下面上に接着剤 が設けられる。

図１の具体例に関して詳説したように、外側の保護層２２は水蒸気の排出を可能 とし、また、フィルター材料を外部からの化学汚染から保護する。

図３および図３８を参照すると、内部の多孔性層２８と外部の多孔性層３０がミ クロビード層３２を含有するための空間を規定する本発明のテストパッチのさら に他の具体例を開示している。内部層２８と外部層３０は、好ましくは同一の材 料からなり、その間にミクロビーズをトラツブしつつ、バッチを通して流体の非 制限流を提供するのに適したいずれの材料であってもよい。多孔性層２８．３０ に好適な材料は、米国一ニーヨーク州グレン・フープ（Ｇｌｅｎ　Ｃｏｖｅ、　 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）にあるボール・コーポレーシヨン（Ｐ！ＬＬＩＩＣｏｒｐｏ ｒａｔ　１ｏｎ）製のウルチポール（Ｕｌｔｉｐｏｒ、６６ナイロン）とじて公 知の疎水性の微孔性フィルムである。さろに適当なす１′；ン演過膜の製造業者 としては、米国マ号チュー七、ツ州つ５９スｉ・ホロー（簀ｅｓｔｂｏｒｏｕｇ ｈ、　Ｍａｓｓａｃ！１ｕｓｐｔｔｓ）のミクロン１セノ月・”−シーン“イン ク（Ｍｉｃｒｏｎ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ、ｒｎｃ、＞および同コネチカ５・ト 州シリダン（Ｍｅｒｉｄａｎ、　Ｃｏｒ＋ｎｅｃｔｉｃｕｔ＞のクツ（Ｃｕｎｏ ）社が挙げられる１、また、多孔性層２８．３０はナイロン以外の、例えば、ポ リカーボネ−１・、改質ポリ塩化ビニルおよびポリスルホンからなってもよい。

すべての具体例におけるガーゼ層、内部多孔性層および外部多孔性層並びに接着 テープは通常のグイにより一定寸法に切断できる。

ガーゼ層２０および内部多孔性層２８は、その接着面自体に使用されるような通 常の接着剤で接着リング２６に固定できる。また、それらは互いに熱または超音 波接合できる６適当な量のミクロビーズを内部多孔性層の頂部に置き、ついで、 同様の手段により外部多孔性層を付着した。典型的に、直径１インチのバッチに は約０．２５〜４９、好ましくは、約０．５９のミクロビーズを用いた。ミクロ ビーズを一部分から収集するのを防ぐ点で当業者に公知であるように、内部およ び外部多孔性面は互いに幾つかのパターンでステーキングまたはスポット溶接し なければならない。

遊離接着面は最適には個人の指でつかむのに十分な空間を有する剥離紙（ｐｕｌ ｌ−ａｗａｙ　ｐａｐｅｒ）で覆われている。パッチは通常のバンドエイド包装 に用いられるのと同様の紙またはプラスチック・パウチ内にバックされている。

組み立てられたユニットは最終的に市販する前に殺菌または低温殺菌できる。ま た、パッケージは金属箔またはマイラー等の蒸気バリヤーを有することができ、 また、シリカゲル、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、五酸化リンまたは他の当 業者に公知の種々の乾燥剤のいずれかからなる小さいパケットのような酸素また は水分吸収手段を有する。

ミクロビード層３２の全厚はかなり変化し得る。しかし、より厚い層上の固定化 位置で生じる色度は本発明の好ましいイムノア、セーで観察できるとは考えられ ないにめ、層８２は厚さ約３二二以下が好ましい。さらに好ましくは、ミクロビ ード層は厚さ約１〜２：コである。

最適には、ミクロビード層３２中のビーズの直径は、内部多孔性層２８および外 部多孔性層３０の孔の直径より少なくともｌオーダー以上大きい。例えば、ミク ロビード層３２内に含有されるビーズは約５〜５０ミクロン、好ましくは、約５ 〜５０ミクロンの範囲内の直径を有する。直径１０ミクロンのビーズをミクロビ ード層３２に用いると、例えば、内部多孔性層２８および外部多孔性層３ｏは最 適には直径約１ミクロンの中間孔からなる。

ミクロビード層３２はポリスチレン、ラテックスおよびガラスを含む種々の公知 材料のいずれがからなる。本願に好適な約０．０５〜１００ミクロンの直径を有 するビーズは米国ペンシルバニア州ワーリントン（％’ａｒｒｉｎｇｔｏｎ、　 Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）のポリサイエンーズ（Ｐｏｌ　１ｓｃｉｅｎｃｅｓ ）社から入手可能である。

ミクロビード層３２は測定する分析物の固定化特異結合パートナ−用支持体とし て機能する。したがって、分析する流体中の特異成分用の高い化学親和力を有す る分子がミクロビード層３２中のミクロビーズに固定化される。

図５を参照すると、テストパッチに不浸透性の外層４２が設けられた、特に受身 不感性発汗のようなおびただしい汗が存在しない条件下で用いるのに適した本発 明の他の具体例を開示している。流体の皮膚への逆拡散を最小限にするため、吸 収層４４が設けられて、皮膚の表面から水分を吸い込むための貯蔵器を形成し、 該貯蔵器には、支持体４６を介し、測定する少な（とも１つ以上の分析物用の特 異結合パートナ−が結合される。層４４は前記の乾燥剤のような水分を結合また は捕集する化学的手段を育してもよく、それは皮膚に接近して用いるのに適して いる。パッチには、さらに下被多孔性層４８を設けて皮膚の表面から支持体４６ を分離してもよく、パッチには、前記のように皮膚に固定するためのいずれかの 手段が設けられる。

本発明の１つの好ましい具体例において、汗中で測定される分析物は酵素である タレアチンキナーゼＭＢ　（ＣＫ−ＭＢ）であり、それは心筋梗塞や他の心臓窮 迫中に心筋から浸出される。ＧＫ−ＭＢに対して育成されたモノクローナル抗体 はファーマシア・プロダクト・リタレイチヂー二米国二ニーシャーシー州ビス力 タウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｖａｙ、　Ｎｅｂ　Ｊｅｒｓｅｙ）のファーマンア１ インク（ｐＨａｒｍａｃｉａ。

Ｉｎｃ、）　３に記載の臭化シアン法等の種々の通常方法のいずれかに従ってミ クロビーズに固定化できる。

本発明に有用なモノクローナル抗体はミルスタインおよびコーレル（Ｍｉｌｓｔ ｅｉｎ　ａｎｄ　Ｋｏｈｌｅｒ）　、不−チ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）　、　Ｖｏｌ 、２５６．４９５〜４９７　（１９７５）により議論されたような当業者によく 知られた方法により製造・単離してもよい。特に、ジャクンン（Ｊａｅｋｓｏｎ ）は、クリニカル・ケミストリー（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅｗ、）　、３０／７．１ １５７〜１１６１　（１９８４）において、抗ＣＫ−ＭＭ抗体（骨格筋の状態の インジケータ）および抗ＧＫ−ＭＢ抗体の製造方法について記載している。

ある公知の方法にしたがい、Ｂａ１ｂ／ｃ雌マウスまたは他のマウス株等のマウ ス、あるいはラットまたはウサギ等の他の適当な動物を、あるＩのＣＫ−ＭＢ酵 素を免疫化して免疫反応を開始する。有効量の適当な肺細胞を産生ずるための酵 素用量および免疫計画は、用いる動物株により容易に決定できる。

ＣＫ　−Ｍ　Ｂまた：ま他の抗原の用量の大きさおよび間隔は抗体反応において 最も重要である。幸運にも、一般に広範囲の抗原用１１１は害のある薬剤に対Ｉ ２て免疫性がある。したがって、小さい用量の抗原は、通常、抗体反応を開始す るのに充分であり、すなわち、１９量ＯＩ白はしばしば十分である。Ｌかし、免 疫反応を開始するのに必要な最小用量が典型的に存在するが、抗体反応を開始す るのに必要な最小用量以下の抗原の用量は、通常、すでに進行中である抗体産生 を維持する。例えば、約５０μ９の酵素を用いる初期免疫のつき“１こ高度免疫 系の５つの注射を行う。

・五ね自体、必ずしも抗原性を持１こないめる種の化合物と抗原を混合すると、 血し、よう中ての多量の抗体の出現、５４期間の抗体産生および信用ヱの抗原に 対する反応に　より示されろよう１、−１抗原：：′対する増大した抗体産生が 生じる。かかる物質は「アジ、パン！・４．と呼び、フロイント不完全アジュバ ントおよびフロイント完全アズバント並びにみょうばんゲル等が挙げ：）ｔ′！ る。したがって、一定甲量の抗原は、通常、静脈内投与する場合より、アジュバ ントを皮下注射するかまたは分割量を繰り返して注射する場合の方がさらに宵効 である。

典型的に、フロイントアジ二バンドが好ましい、、Ｒ初の「不完全」フロイント アジコバント混合物は鉱油、ワックスおよび死菌結核菌からなる。抗原を水性相 中のアジ二バント混合物に添加して、各水滴が結核菌を含有する連続油相により 包囲される油中水工マルジＨンを形成する。通常、該混合物は実験動物に皮下注 射される。注射は、主に組織法、類上皮細胞およびリンパ球からなるり１傷を有 する著しい丙芽騰性反応を刺激する。局所的なリンパ節は形質細胞の僅かな増加 をテす。

可溶性蛋白抗体の初回投与で９４疫を行−・た後。通常、数Ｐ後に血ｊ５λう中 に最初に現れる特巽件抗体１；５．１月；第２週まで増加Ｉ、た後、数個〜数ケ 月かけてゆっ＜Ｃ゛）瀘少する。

抗体化の後に現れる第１Ｃ＋血清抗体はＩｇＭ抗体である。フ４蓮１、ユれらの 債にＩｇｃ：抗体が出現するう後て抗体血清レー・ルが増加する１一つれ、多分 ｉＢＧ抗体の特異的なフィードパ５・り抑制の結果とし、でＩｇＭ抗体が消滅す る。

ｙ白に対する［−次反応」が過ぎた後、数ケ月また数年後に与えねた同一の按摩 の第２の投与（ま、通常、強くかっカロ速されｔ、通常２または３日の露出で血 清抗体が生じ始める７特異的な２次反応、。

を誘発する。２次反応中の抗体の血清；ノベルはｌ（つ即／′１に達する。

イーの後、動物を犠牲にし、その肺臓から採取した細胞を適当な媒（カ・中ｊ、 懸？剥させ、マウス細胞系統Ｓｒ２１０−Ａｇ１４から寄られるようなｔ髄朦細 胞で融合する１、その結果、得られるのはイン・ビトロで再現できかつＣＫ　− Ｍ　Ｂ酵素上の種々の認識可能な部位の各々に対して特異的な抗体の混合物を生 産する１′−バイブリド”７Ｊと呼ば第１るバイブ１１ノド細１甲である。

選択された骨髄騰細胞系統は、好ましくは、いわゆる「薬剤耐性」タイプである べきであるため、いずれの非融合骨髄慢細胛も選択的媒体中で生存しないがハイ ブリッド細胞は生存する。種々の薬剤耐性を髄腫が知られている。

非融合−細胞２非融合骨！、！竪細腎および融合連吟の混合物を希釈し、すべて の非融合細訃［の死滅を可能にするのに十−分な時間、非融合骨ム挿旧悔の増殖 ≧友持１１．ない選択的溶媒中で培養するゎ薬剤耐性の非融合骨髄捧杷胞系統は ）（ＡＴ　（ヒポキサ／チン、アミ、ノブテリンおよびチミジン）のような選択 的溶媒中で数口以、に生存しない。

したがって、非融合費髄＠細胞系統：ま死滅イ゛る。非融合胛を田飽は非悪性で あり、自生に失敗するまで有限数の世代ｔ７か峙たない。一方、融合細胞は、牌 ＠隋原様により与えら２′した選択され一溶媒中で生存寸゛るのに必要な猾髄彊 原種およ１ｆ酵素により！′ｊえられた悪性を何するため、再生し続ける。

Ｓ７−ル２含有する複数のバイブ・、ノド−マはＣＫ−へ・１Ｂ酵素慣造ζ、： 対する独自の特異的部位に対゛する抗体・Ｄ存在が評価さストらついで、ハイブ リドーマは、特異的品位に所望の抗体が産生ずるように選択される。この選択は 、例えば、希釈倍数ンー限定労ることにより行われ、希釈剤の容量が統計的に計 算さねである数の細胞（例えば、１〜４）をマクロタイタ平板の各ウェルに隔離 される。このように個々のハイブリドーマは、さらにクローニングするために単 離される。

一旦、所望のハイブリドーマが選択されると、ハイブリドーマを製造するのに用 いた同一種の宿主動物、好ましくは同系または半開系動物に注射できる。ハイブ リドーマの注射する結果、適当なインキニベーシｌンの後に宿主中で抗体産生腫 瘍を形成し、その結果、宿主の血流および腹腔浸出液内で非常に高濃度の所望の 抗体が得られる。宿主は血液および浸出液内に正常抗体を有するが、これらの正 常抗体の濃度は所望のモロクローナル抗体の濃度の約５％にすぎない。ついで、 該モノクローナル抗体を当業者に公知の技術に従って単離する。

また、前記のように抗ＣＫ−ＭＭモノクロナールを育成するため、市販の診断キ ットからなる化合物を用いることができ、それを、ビード支持体に化学的に結合 されたＣＫ−ＭＭ酵素に取り込む。米国一ニーシャーシー州、ナノトレイ（Ｎｕ ｔｒｅｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ）のロノンエ（Ｒｏｃｈｅ）社からイソミュ ーシーＣＫ・ダイアグノスティック・キット（ＩｓｏＩＩｌｕｎｅ−ＣＫ　Ｄｉ ａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｋｉｔ）として市販されている適当な牛。

トが市販の候補である。このキットはヒトＣＫ−ＭＭに対するヤギ抗血清および スチレンビーズに共有結合したロバ抗−ヤギ抗体を有する。混合物はヒ）　ＣＫ −ＭＭに対して特異の親和力を有する固定化複合体を産生ずる。しかし、より直 接的でかつより安価な方法では、当業者に公知の方法に従ってミクロビード支持 体に抗ＣＫ−ＭＭモノクロナール抗体を直接固定化する。

ＣＫ−ＭＢと複合する目的に用いる抗体は当業者に公知の種々の支持体のいずれ かに固定化される。例えば、抗ＣＫ−ＭＢ抗体は、米国特許第３，６４５，８５ ２号に記載の方法を眉いてポリサツカリドポリマーに結合される。また、該抗体 は、フィルター紙、あるいはポリエチレン、ポリスチレン、ポリスチレンまたは 他の適当な所望の材料から作製されたプラスチックビーズからなる支持体に結合 してもよい。最適には、該支持体は図３ａに示すミクロビード層３２に有利に成 形できる多数のミクロビーズの形態をとってもよい。

ミクロビード支持層に代わるものとして、特異結合パートナ−を図３８の内部多 孔性層２０または２８、あるいは図１８のフィルター１６の下側に直接固定化す ることができる。この方法では、ミクロビード層３２は全く必要ない、ｒ！に抗 体蛋白を結合するために設計された親水性膜は米国カリフォルニア州コスタメサ （Ｃｏｓｔａ　Ｍａｓａ。

Ｃａｌ　１ｆｏｒｎｉａ）のクツ（Ｃｕｎｏ）社かろゼタボー（Ｚｅｔａｐｏｒ ）として市販され、アイ・シー・エヌ（ＩＣＮ）社からプロットランズ（Ｐｒｏ ｔｒａｎｓ）　として入手できる。

図４を参照すると、本発明の濃縮キットと共に用いるための試薬パケットが開示 されている。該試薬パケット３４は着脱可能に固定された頂部３８を有する容器 ３６からなる。頂部３８上のフラップ４０は頂部３８をつかんで容器３６から剥 離してその中に収容される試薬を見せるのを容易にする。

所定の分析物の存在を具体化するための種々の公知のイムノアッセー反応式は当 業者によく知られており、ここでは詳しく説明する必要はない。しかし、最適な 反応式は単純で少ない工程しが必要としないものである。例えば、ＣＫ−ＭＭお よびＣＫ−ＭＢ酵素の両方の存在を測定するために設計された本発明の濃縮バッ チでは、各酵素用の固定化された特異結合パートナ−は分離してテストバッチの 領域を分離する。この方法では、酵素結合イム／ア、セーを用いる場合、通常の 酵素および通常の基質を用いることができる。しかし、最適には、異なった色を 用いて異なった分析物の存在を表す。

また、蛋白質電気泳動に用いるような染料、例えば、コーマッシー・ブリソアン トーブルーまたはアミドプラ７り１０ｂを、試薬パケット３４中に含有される精 製された分析物に結合できる。テストバッチをパケット３４中に浸漬すると、汗 中の分析物により結合されていないミクロビーズ上のいずれの抗体もパケット３ ４中で染色された精製分析物により占有されるようになる。したがって、バッチ に吸収された染料の量と、バッチを通過した酵素の量の間に逆比例の関係が生ま れる。この具体例では、ユーザーはバソヶト３４の流体中にバッチを置き、３０ 秒以上の間待ち、水道水でバッチを洗浄し、該バッチが得た色を酵素の存在に関 係させる。この判断を助けるために色比較チャートを設けてもよい。

また、ユーザーは小さいジャーまたはバイアル等の開放容器、あるいは該バッチ の接着性をベッセルの試薬バケットに固定する試薬ボケ、ト３４に似たテザイン の空容器上にテストバッチを固定し、ポケットの内容物をテストバッチの頂部上 に注ぐことができる。重力は・ポケット３４の内容物がテストバッチを通して移 送されるのを助けて、染色／結合反応の効率を最大限にし、互変の視覚化を容易 にする。

系は容易に設計できるため、ユ・−ザーは、一旦その内容物がバッチを通過した バケ・７ト内容物を観察することにより、パンチ中では全く知られていない濃度 の説明を行うことができる。

この方法は、そのポケット内容物が特異酵素基質と反応する酵素を含有する通常 のＥＬＩＳＡアソセー法に似ている。酵素基質は１、：れらの内容物が子ストバ 、・チを通過した後でパケ、・ト内害物に添加された。

汗が興味ある分子を含有するとすれば、それらはバッチ上の固有の固定化結合パ ートナ−に結合される。もし、これが生じれば、パケット中で複合された酵素は テストバッチを自由に通過し、バＡｒ、、。

ト内の溶液中の制御された互変を生む酵素基質を酵素的に修飾する。

汗が興味ある所望の分子に到達すれば、酵素複合体はバ・ノチを通過する途中に 結合され、基質溶液中での互変を起こさなくなる。他のイムノアッセー反応式は 当巣者により本発明に容易に用いることができる。

本発明の濃縮バッチは種々の体液のいずれにも用いることができるが、低分析物 濃度にもかかわらず、その信頼できる供給、血液に対する類似性により、汗が所 望の流体である。また、唾液は多くの血液の化学成分を含有しているように考え るれるが、しばしば汗中に見られるより低い濃度である。

本発明の方法を実施する場合、濃縮バッチは種々のファクターに応じて身体の異 なった部分に有利に配置してもよい。出る汗の量は身体の各部分並びに捕集中お よび捕集直前の身体的活性の機能であることがよく知ちれる。これは身体の異な った部分での汗腺の異なった密度並びにこれらの汀線のある種の不甥則な機能に よる。

汗腺は２つのタイプのいずれかに分類される。まず、エクリンタイブは蒸発熱損 失との関係によ１）体１を調節する。運動と関係する汗を提供するのはニクリン タイブの汗腺であるため、本発明の濃縮バッチの斉くの用途のための興味ある発 汗の源である。つ′ボクリンクイブの汗腺は、腋窩、恥部、乳房部等の身体の比 較的孤立し、た部分にのみ局在する大きい分泌エレメ：署・である。

汀の病因１ま比較的複雑である、・シ（、精神運動、情緒ストレス等の精神状態 、温度制御に対する着性の身体の反応のような熱性ストレス、温度制御に対する 身体的に活性な身体の反応のような１動ス）　Ｌ、＝スにより起こることが知ち れている。

前記の特徴に加えて、発汗は不感性または感性であり得る。不惑性発汗は皮膚ま たは上皮層を通ｌ、での水拡散により生じる。その目的は熱調節に全く間係１． ないと、顕われるが５、−〇、らの皮膚と表面の間にの機械的相互作用の改良を 助けてグリップを容易にする。また、汗腺の正量分布および種々のタイプの発汗 の流速に関して複雑さ生じる、手車および足裏等の特殊な部分は連続的に発汗す るが、極めて低速度である。不感性発汗の速度は心臓に関係する当該の特別な部 分の位置に依存する。例えば、心覚を越えて足を上げると、不感性発汗速度か減 少する。

安静時の大人の体温が約３１℃以下で壜不感性発汗は、約６〜１０９／ｚ”／時 間（り速度で、腕、足および胴から、約１００９／＝丁／′時間の速度で手掌、 足裏および顔面皮膚にかけて進行する。Ｐｉ、者の３−Ｔ、ｌ　ｉ：ｉ）部分の 合計ｉｔ非発汗状態、すなわち、約２４〜２６°Ｃの気温で多体から失われる全 水分損失の約４２％であると考えられる。かかる不感性発汗１区、才゛ｆはの背 面から開始し、気温が上昇する：：つ卆ｌ、で身体の高い位置に向かって拡がる 。ある報告された研究によると、体面積１．７５ｉ’当たりの不感性発汗による 乎均水分損失は、気温が２２６（１：、２７”’Ｃ，３０’ｃで、各・ン３８１ ｆｆＩ？、５２６紅、６９５＝Ｑ／１日と変化−夕ることが判明し７た。皮膚の 特別ヅ、Ｓ表面エレメント、！：量関係ないと思われる不感性発）］に対１で、 感性発汗はエフリン帥と関係し、ている。活発に分泌するコク１；ン［７の数は 個人によって変化し、観察される身体の部分および形成される汗反応の種類によ る。最大汗腺密度は、前腕における約２（’１０個／Ｇ！″から、母指球におけ る４００個／ｃｘ”以上と変化する。

感性発汗は皮膚温度が約９４°Ｆを越えるかまたは直腸温度が正常心温度を約０ ．２°Ｆ越える時に開始する。汗！損失の最大速度は平均的被験者で１時間当た り２リツトルであり、短期間で１時間当たり４リツトルにもなり得る。感性発汗 は下脚の遠位部分から開始し、気温の上昇につれて上に向かって進行する。した がって、足の背面は胸部のだいぶ前に発汗が開始する。また、感性発汗反応は熱 ストレスが増大するにつれである部分から他の部分に移行する。軽い熱ストレス 下では、発汗は主に下脚で生じる。熱ストレスがさらに増大するにつれて、発汗 が胴にまで拡がる。その大きい表面積ゆえに、胴は顕著な水分損失面となる。結 局、胴で極めて高速度が認められ、一方、下脚での速度は実際に減少する。額は 極めて高い発汗速度を生じ得るが、熱ストレスに反応して発汗する最後の部分に 含まれる。

前記のように、血液中で検出できる多種多様の化学種も汗中に存在するが、典型 的には、ずっと少ない濃度である。組成の初期の研究はナトリウム、塩素、カル シウムおよびカリウム等を含む電解質に集中していた。極端な個々の変化は個々 において見ちれ、また、電解質組成は汗が熱、精神または他の病因により刺激さ れたかどうかにより異なる。

さらに研究することにより、電解質およびさらに複雑な生物分子を含む汗中の多 くの付加成分が識別された。汗中で識別された幾つかの実例となる化学種を以下 の表Ｉに示す。

表１ 汗の化学成分 ジフテリア抗毒素　硫酸塩 アスコルビン酸　ヨード塩 チアミン　鉄 リボフラビン　フッ素 ニコチン酸　臭素 アミノ酸　ビスマス エタノール　乳酸 アンチピリン　ビルベートグルコース クリアチニン　窒素 Ｃ−１４メチル尿素　アンモニア Ｃ−１４アセトアミド　尿酸 Ｃ−１４尿素　ニコチン チオ尿素　モルヒネ パラアミノ馬尿酸　スルファニルアミドマンニトールスルロース　アタプリン ラクテート　メタド。

塩化ナトリウム　フェンンシクリジン カリウム　アミノビリン カルシウム　スルファグアニジン マグネシウム　スルファジアジン 表１に記載の成分のほとんどが非揮発性であるため、それらは図１に示す濃縮パ ッチ１ｏの濃縮ゾーン１４内にトラップされる。しかし、幾つかの成分、もっと も著しくは、エタノールは体熱の影響下で揮発し、それにより、疎水性フィルタ ー１６を通して蒸気層中に排出させ得る。測定される分析物がエタノールまたは 他の揮発性成分である場合、本発明の濃縮パッチは図２に示す具体例に関して記 載のように修飾してもよい。

本発明のある特定の用途は、運動の結果として生じる骨格筋および心筋状態の二 相測定である。つぎに、実施例によりこの用途を詳しく説明するが、それは本発 明の唯一の用途を記載するものではない。

実施例１ 図３に示す具体例にしたがって皮膚濃縮パッチを作成する。ジッンンン＆ジ璽ン ソン社の非接着ガーゼパッドから直径約１インチの円形パッチを切り出すことに より、ガーゼ層を作成する。ついで、米国一ニーヨーク州グレン・コープ（Ｇｌ ｅｎ　Ｃｏｖｅ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）のポール・コーポレーシラン（Ｐａｌｌ 　Ｃｏｐｏｒａｔｉｏｎ）製のウルチボア（６６ナイロン）の円形パッチを切り 出すことにより、内部および外部の多孔性層を作成する。ウルチボア（Ｕｌｔｉ ｐｏｒ）膜は親水性でかつ微孔性であり、膜は、例えば等級１ミクロンを有する ものが選択される。ミクロビード層は、ＧＫ−ＭＢに対して育成されたモノクロ ナール抗体を、少なくとも約１０ミクロン以上の平均粒径を有する多数のポリス チレンビーズに共有結合することにより製造される。

濃縮パンチは、約１ｇのミクロビーズを多孔性層のうちの１つの表面全体に分散 することにより組み立てられる。その後、第２の多孔性層をミクロビーズに隣接 して配置し、ついで、ガーゼ層を第２の多孔性層の頂部に配置する。この時点で 、バッチ逆さまにする。

第１および第２の多孔性層並びにガーゼ層の周囲端を、通常のヒート・シール技 術により互いに固定する。その後、サブアセブリをひつくり返し、それに１イン チの内径より僅かに小さい約２インチの外径を宵する円環体の粘着テープを固定 して最終濃縮バフ・チが得られる。

実施例１の濃縮バッチをつぎに健常？ｊ４０令の雄老マウスＣ；固定し、３６− マイル（１３０−マイル）自転車こぎの間中、付看させた。その後に濃縮パッチ を取り除き、テストノテ・ノチを約３０分の間、過剰の酵素標識抗−〇に−ＭＢ を含有する第１の溶液中に液浸して、固定化分析物で標識抗体を接合する。つい で、該ノ寸・ソチを水道水下で洗浄して非結合の標識抗体を除去し、結合酵素襟 識用の基質を含有する第２の溶液中で液浸し、該溶液は酵素の作用時に色度する 。

頂部の多孔性層を通しての色の様子により、ＣＫ−ＭＢの存在および心臓損傷の 可能性が示される。カラーチャートと比較することζこより大まかな定量化が可 能である。

以上、本発明の好ましい具体例について説明したが、本発明の精神を逸脱するこ となく、種々の変形および修飾を加尤ること力（できることは当業者に明らかで あり、それらも本発明の範囲のものである。

国際調査報告

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．第１および第２の面を有する水分浸透性支持体層と；該支持体に固定化され る少なくとも１つ以上の試薬と；被験者の皮膚と流体連絡する支持体の第１の面 を着脱可能に固定する手段とからなり、 濃縮パッチの支持体と外部を通して水分が排出するのを可能にし、かつ、試薬が 測定する分析物用の特異結合パートナーを有することを特徴とする被験哺乳動物 の汗中の分析物の存在を測定するための皮層濃縮パッチ。
2. ２．水分が濃縮パッチから気体相に排出される請求項１記載の皮膚濃縮パッチ。
3. ３．支持体の第２の面に隣接して配置された浸透性の外部保護層をさらに有する 請求項１記載の皮膚濃縮パッチ。
4. ４．支持体層が複数のミクロビーズからなる請求項１記載の皮膚濃縮パッチ。
5. ５．ミクロビーズを収容するための支持体の第１の面に配置された第１の流体浸 透性層と、支持体の第２の面に配置された第２の流体浸透性層をさらに有する請 求項４記載の皮膚濃縮パッチ。
6. ６．支持体の第１の面から離れた表面に接着剤を有する支持体の第１の面上に親 水性の浸透性膜をさらに有する請求項１記載の皮膚濃縮バッチ。
7. ７．固定手段が接着テープである請求項１記載の皮膚濃縮パッチ。
8. ８．試薬が測定する分析物に対して親和力を有する抗体からなる請求項１記載の 皮膚濃縮パッチ。
9. ９．試薬がクリアチンキナーゼＭＢおよびクリアチンキナーゼＭＭの少なくとも 片方に対する抗体からなる請求項１記載の皮膚濃縮パッチ。
10. １０．それを通して蒸気の排出を可能としつつ、流体を保持するための支持体の 第２の面上にさらに疎水性層を有する請求項１記載の皮膚濃縮パッチ。
11. １１．体液源と流体連絡するのに適合させた濃縮ゾーンと；大気に露出された排 出ゾーンと： 該排出ゾーンから濃縮ゾーンを分離する微孔性膜とは；体液源と連絡する濃縮ゾ ーンを着脱可能に固定する手段とからなり、 濃縮ゾーン中に蓄積された体液の望ましくない成分を該膜を通して押出し、それ により、濃縮ゾーン中の所望の成分を濃縮することを特徴とする体熱の影響下で 体液の成分を濃縮するための濃縮パッチ。
12. １２．濃縮ゾーンが、体液中で測定される少なくとも１つ以上の分析物用の固定 化特異結合パートナーをさらに有する請求項１１記載の濃縮パッチ。
13. １３．分析物がクレアチンキナーゼである請求項１２記載の濃縮パッチ。
14. １４．体液源が皮膚の表面であり、親水性膜を皮膚から間隔をあけるための濃縮 ゾーン中の内部多孔性層と：濃縮パッチを皮膚に着脱可能に固定する接着面とを 有する請求項１１記載の濃縮パッチ。
15. １５．排出ゾーン中にさらに外部の保護多孔性層を有する請求項１４記載の濃縮 パッチ。
16. １６．被験哺乳動物からのある量の体液を蓄積し；体熱の影響下で流体から水分 の少なくとも一部分を除去して濃縮物とし；ついで 該濃縮物中の少なくとも１つ以上の分析物を、該分析物の固定化特異結合パート ナーに結合する工程からなることを特徴とする体液中の分析物の存在の測定方法 。
17. １７．分析物の濃度の出現を表す工程をさらに有する請求項１６記載の方法。
18. １８．蓄積工程を多孔性層内で行う請求項１６記載の方法。
19. １９．固定化相を分析物用の過剰の標識結合パートナーに露出する工程と結合工 程をさらに有して、固定化相に結合された分析物が標識結合パートナーに結合さ れるようになる請求項１６記載の方法。
20. ２０．標識結合パートナーが標識精製分析物または分析物類似体である請求項１ ９記載の方法。
21. ２１．皮膚と流体連絡して配置された、皮膚表面から蓄積された汗流体に容易に 伝わる体熱の影響下で蒸発する体液を蓄積する物質から形成される第１の層と； 反膚から浸出きれた流体の蒸気相の通過を可能とするが該第１の層内でその流体 層を維持する物質から形成された第２の層と；少なくとも１つ以上の選択された 分析と選択的に結合するための、蓄積された汗と接触する固定化試薬とからなる ことを特徴とする通常の器具を必要とせずに発汗時に皮膚を通して浸出された体 液中の少なくとも１つ以上の予め選択された低濃度の分析物の非侵入的測定用皮 膚濃縮パッチ。
22. ２２．皮膚と流体連絡して配置された、体熱の影響下で失われる体液を蓄積する 物質から形成された第１の層と；該第１の層に隣接した、皮膚から浸出された液 体の通過を可能とする物質から形成された第２の層と； 少なくとも１つ以上の予め選択された分析物を選択的に結合する第２の層中の固 定化試薬とからなることを特徴とする通常の器具を必要とせずに発汗時に皮膚を 通して浸出された体液中の少なくとも１つ以上の予め選択された低濃度の分析物 ○非侵入的測定用皮膚濃縮パッチ。