JPH0449650B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、蛋白質や糖蛋白質、ホルモンある
いは成長因子のような細胞内物質を分泌する細胞
と細胞内物質を分泌しない同種の細胞とを含む培
養液から細胞内物質を分泌する細胞を判別する方
法およびその装置に関する。

〔従来の技術〕

生物学、薬学および医学の分野の多くの応用例
では、細胞内物質を分泌する細胞を細胞内物質を
分泌しない同種の細胞から区別させたい要求があ
る。

例えば、刺激されているリンパ球と刺激されて
いないリンパ球とを含む懸濁液から、刺激されて
いるリンパ球を判別することは、モノクロナール
抗体を形成するため、極めて重要である。

一定のリンパ球は生体内の異物に対して、例え
ば血管中に注射された異種蛋白質に対して抗体
（糖蛋白質）を形成する。抗体を形成したり、排
出するために刺激される上記リンパ球を骨髄腫瘍
細胞のような腫瘍細胞と融合させると、両種の特
性を備えた、所謂雑種細胞が形成される機会が生
じる。この細胞は、特に問題とする異物に対して
のみの抗体（所謂モノクロナール抗体）を形成す
る。この細胞は実際上不死で、リンパ球のような
分離された正規の細胞とは異なり、培養液内で永
久に増殖できる。

しかし、リンパ液の流れの中にある多数のリン
パ球のうち、極めて僅かな数しか刺激されない
が、できる限り刺激されたリンパ球のみを融合に
使用すべきであるから、刺激されたリンパ球を刺
激されていないリンパ球から何らかの選別方法で
分離する必要がある。しかしながら、刺激された
リンパ球を識別することには困難がある。何故な
ら、この等のリンパ球は顕微鏡下で刺激されてい
ないリンパ球と区別できないからである。

更に、他の例として若干の微生物はある種の細
胞内物質（主に糖蛋白質）を排出して生きている
培養酵母を分泌している。この毒素を「キラー因
子」と称している。「キラー酵母」はビールを製
造する場合、幾つかの困難をもたらす。僅かな汚
染度で、既にこれ等の酵母はビールの醗酵とその
品質を変える。

キラー作用の存在とその効果は、醸造酵母、ワ
イン酵母、パン酵母でも、また例えばハンゼニユ
ラ（Hansenula）、ピヒア（Pichia）、デベリオミ
ユセエス（Deberyomyces）、クルイヴエロミユ
ツエス（Kluyveromyces）カンジダ（Candida）
およびトルロプシス（Torulopsis）のような異
種細胞でも確認されている。

上記の場合および他の多くの場合では、他の処
置を用いるため、分泌細胞を識別することが先ず
第一に重要である。このことは、例えば刺激され
たリンパ球の場合のように、これ等の細胞を次に
選別することである。キラー酵母細胞の場合に
は、醗酵工程を監視するため、先ずこのような細
胞を識別する。このことは、再び汚染を防止する
処置を用いることになる。

〔発明の課題〕

この発明の課題は、蛋白質および糖蛋白質、ホ
ルモンあるいは成長因子のような細胞内物質を分
泌する細胞と細胞内物質を分泌しない同種の細胞
とを含む懸濁液から細胞内物質を分泌する細胞を
分離できる方法を提供することにある。

更に、この発明の課題は上記の方法を実施でき
る装置を提供することにある。

〔課題を解決する手段〕

上記の課題は、この発明により、冒頭に述べた
種類の判別方法の場合、回転速度を可変できる回
転電場を前記培養液に印加し、上記二種の細胞が
異なる回転速度で回転することに基づき、細胞内
物質を分泌する細胞が細胞内物質を分泌しない同
種の細胞に対して区別されることによつて解決さ
れている。

更に、上記の課題は、この発明により、上記方
法を実施する判別装置の場合、細胞を含む室ある
いは容器の中間空間を形成しているか、あるいは
細胞を入れる室の中に突出している、少なくとも
三つの電極が、これ等の電極から生じる回転電場
を室または容器の空間Ｋに導入できるように配置
され、周波数を可変できる回転電場を発生させる
電圧発生器が上記の電極に接続されていることに
よつて解決されている。

〔作用〕

この発明による方法は、蛋白質や糖蛋白質、ホ
ルモンあるいは成長に影響を与える物質（所謂
「成長因子」または“growth−factors”）のよう
な細胞内物質を分泌する細胞が、回転電場で細胞
内物質を分泌しない同種の細胞とは異なる回転速
度を示し、この事実が細胞内物質の通過により膜
の変化に帰着すると言う発見に基礎を置いてい
る。

雑誌「Naturforschung，37C，908−915
（1982）“Rotating Field−Induced Rotation
and Measurement of Membrane Capacitance
of Single Mesophyll Cells of Avena Sativa”
by W.M.Arnold and U.Zimmermann」の論文
によれば、個々の細胞（ここではプロトプラス
ト）を、例えば90°位相をずらしせて配置した４
つの電極から生じる回転電場中で回転させること
が知られている。更に、一定種の個々の細胞は回
転電場がある一定周波数（所謂特性周波数）のと
き、最大の回転速度になることも公知である。

一定種の細胞の特性周波数は、他のパラメー
タ、即ち回転電場の電界速度と細胞に対する外部
条件、細胞の存在する培養液の導電率および培養
液の温度に依存する。しかし、判別測定には、区
別すべき細胞の異なる回転挙動のみが大切で、例
えば細胞内物質を分泌する細胞と細胞内物質を分
泌しない同種の残りの細胞との周波数が異なつて
いることが重要である。それ故、主に５〜
500μS／cm、特に５〜50μS／cmの範囲内にある培
養液の導電率は、細胞の区別にとつて二次的な意
義しかない。培養液の温度も、先ず一方で細胞を
壊さず、他方で排出する細胞内物質の形成と分泌
も可能であることを基準にして設定する必要があ
る。

この発明による方法の有利な実施態様では、回
転電場が予め与えられた培養液でその細胞に対し
て基準となる特性周波数を示す場合、分泌細胞を
最高回転速度に調節することによつて、残りの細
胞から区別している。この場合、懸濁液中の細胞
の回転挙動を顕微鏡下で観察し、回転電場の周波
数範囲を変えると、どの周波数で大多数の細胞、
即ち残りの細胞が最大回転速度で回転するかを最
も簡単に観察できる。しかし、回転電場の周波数
を更に変え、分泌細胞の特性周波数に同調させる
ことにより、熟練した目には一般的にこれ等の分
泌細胞を残りの細胞から容易に区別できる。その
場合、専門家は実際上分泌細胞と残りの細胞の特
性周波数を識別できるので、この事実により細胞
の区別が容易になると言うことを出発点としてい
る。どんな生物集団の場合でもあるように、細胞
特性に自然分散幅があるので、細胞の回転挙動の
場合にもこの分散幅を確認できるが、このことは
粒子を区別するのに一般に妨げにならない。

この発明による方法を実行するため、以下のよ
うな装置が適している。この装置では、少なくと
も三つの電極がそれ等の各々の間に細胞を含む室
または容器に対する中間空間を形成するか、ある
いは細胞を収納する室に突出しているが、これ等
の電極は室または容器の空間にこれ等の電極によ
つて生じる回転電場を印加する。そして上記電極
に接続し、可変回転周波数の回転電場を発生する
電圧発生器も備えている。その場合、回転電場の
強度も可変できると有利で、その値は室の中で約
１〜1000V／cmとなる範囲にすべきである。周波
数範囲は１Hz〜1GHzの範囲にすべきである。こ
の発明による方法を実施する場合、処理する細胞
に対し電気絶縁破壊電圧以下に電場強度を選ぶ必
要がある。

明らかに、回転電場を発生する電圧が正弦波形
であると、更に有利である。しかし、回転電場を
矩形波電圧、あるいはパルス状に出力する電圧、
あるいは他の波形電圧で形成することもできる。

〔実施例〕

以下に、この発明を添付図面に示す実施例に基
づき詳しく説明する。

四つの電極を設ける。これ等の電極は細胞を入
れる室Ｋの側壁を形成するように、図示していな
い非導電性の材料製の基板上に配設してある。前
記電極は室の四隅と基板のところで電気絶縁性の
接着剤によつて接着されている。この電極の長
さ、従つて室の側壁の長さは１mmであり、電極の
高さは0.2mmである。従つて、上に開いた正方形
の室Ｋは横寸法が１mmで、高さが0.2mmである。
白金箔のこれ等の電極は、第１図と第２図の電極
番号の順次で電圧発生器Ｇ中の対応する番号の増
幅器Ｖに接続している。これ等の増幅器Ｖから出
力する電圧も、同様に第１図と第２図から判るよ
うに、それぞれ90°位相がずれている。こうする
ことによつて、室の中に回転電場が発生する。

以下の具体例に共通することは、次のような状
況になつている。

マウスを羊の赤血球で免疫性にすることによつ
て、刺激されたＢリンパ球を作製した。マウスか
ら採取したリンパ球のフラクシヨンは刺激されて
いないリンパ球と共に刺激されているリンパ球を
含んでいた。

リンパ球の破片を羊の赤血球の層の中に入れ、
刺激された、つまり抗体を分泌するリンパ球を後
でマイクロピペツトで再び取り出した。この場
合、刺激されたリンパ球はこのリンパ球を取り囲
んでいる一群の溶解された赤血球が形成されてい
ることによつて識別できた（“Annales of
Institute Pasteur”（Zaguryと共著者）に記載さ
れた方法による）。

こうして、羊の赤血球に対する抗体を分泌する
刺激されたリンパ球が得られた。刺激された上記
リンパ球の一部を、同様に赤血球の層からマイク
ロピペツトで採取した少なくとも同量の刺激され
ていないリンパ球に混合した。

このリンパ球混合物を回転室Ｋの中に入れる前
に、低導電性の培養液（電解液として微量の塩化
ナトリウムの0.3Mのマンニツト）で三回洗浄し
た。

具体例 １ リンパ球混合物を含む約10μの懸濁液を回転
室Ｋに入れた。この懸濁液の導電率は18.4μS／cm
で、温度は35℃であつた。

この懸濁液に約100V／cmの強度の回転電場を
印加した。

刺激されたリンパ球は、顕微鏡下で約38±5k
Hzの回転周波数のとき、高い回転速度を確認で
き、約25±5kHzの回転周波数で最高の回転数に
なる残りのリンパ球から区別できた。

上記回転挙動から刺激されたリンパ球と識別さ
れたリンパ球をマイクロピペツトで回転室から取
り出し、調べるために再び羊の赤血球の層の中に
入れた。検査試験により、刺激されたリンパ球で
あることが確認された。

具体例 ２ 具体例１で説明したように、刺激されたリンパ
球と刺激されないリンパ球との混合物に回転電場
を印加した。しかし、具体例１とは異なりこれ等
のリンパ球を含む懸濁液の導電率は5.2μS／cmで
あつた。

この場合も、刺激されたリンパ球を最大の回転
速度に基づいて識別した。これに相当する回転周
波数は約12±3kHzであつた。刺激されていない
リンパ球が最も早く回転する回転周波数は約７±
2kHzであつた。

〔発明の効果〕

この発明による細胞内物質を分泌する細胞を判
別する方法により、微量の試験液を用いるだけで
分泌細胞と同種の細胞とを判別できる。更に、リ
ンパ球の抗体形成に関して、迅速で、簡単でしか
も確実に判別できる。

【図面の簡単な説明】

第１図、この発明による方法で細胞を入れる室
の模式平面図。第２図、この発明による方法の電
圧発生器のブロツク回路図。 図中参照符号、Ｋ……室、Ｇ……電圧発生器、
Ｖ……増幅器。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 蛋白質や糖蛋白質、ホルモンあるいは成長因
   子のような細胞内物質を分泌する細胞と細胞内物
   質を分泌しない同種の細胞とを含む培養液から細
   胞内物質を分泌する細胞を判別する方法におい
   て、回転速度を可変できる回転電場を前記培養液
   に印加し、上記二種の細胞が異なる回転速度で回
   転することに基づき、細胞内物質を分泌する細胞
   が細胞内物質を分泌しない同種の細胞に対して区
   別されることを特徴とする方法。 ２ 細胞内物質を分泌する細胞は、所定の培養液
   中でこの細胞にとつて基準となる回転電場に対す
   る特性周波数で最大回転速度にすることにより、
   細胞内物質を分泌しない残りの細胞に対して区別
   されることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
   記載の方法。 ３ 回転速度を可変できる回転電場を培養液に印
   加し、細胞内物質を分泌する細胞が細胞内物質を
   分泌しない同種の細胞に対して互いに異なる回転
   速度で回転することに基づき、区別され、蛋白質
   や糖蛋白質、ホルモンあるいは成長因子のような
   細胞内物質を分泌する細胞と細胞内物質を分泌し
   ない同種の細胞とを含む培養液から細胞内物質を
   分泌する細胞を判別する装置において、細胞を含
   む室あるいは容器の中間空間を形成しているか、
   あるいは細胞を入れる室の中に突出している、少
   なくとも三つの電極が、これ等の電極から生じる
   回転電場を室または容器の空間に導入できるよう
   に配置され、周波数を可変できる回転電場を発生
   させる電圧発生器が上記の電極に接続されている
   ことを特徴とする装置。 ４ 回転電場の電界強度は可変できることを特徴
   とする特許請求の範囲第３項に記載の装置。 ５ 回転電場を発生させる電圧は正弦波形である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第３項または第
   ４項に記載の装置。