JPH0442057A

JPH0442057A - 体液中のカルシウムの測定方法及びその測定器具

Info

Publication number: JPH0442057A
Application number: JP14726290A
Authority: JP
Inventors: Emiko Taira; 平　恵美子
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-06-07
Filing date: 1990-06-07
Publication date: 1992-02-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、体液中のカルシウムの泥足方法及びその測定
器具に関するものであり、より詳細には、骨粗鬆症及び
骨軟化症などの骨代謝異常を診断するために、血清中の
血清自身のもつ石灰化沈着能を測定する方法及びその泄
定器具に関する。

（従来技術及び発明が解決しようとする問題点）従来、
骨代謝異常の血清検量による診断には、血液中のカルシ
ウム、リン、アルカリフオスファターゼ、Ｂ［ｉＮ、　
　ＰＴＨｌｌ、２５（ＯＨ）２Ｄ３の直接測定が行われ
てきた。

しかしながら、これらの測定方法に基づく値は、かなら
ずしも骨代謝異常と相関しない、これは、これらの測定
値が骨形成能に関係する因子を正確に測定していないと
解せられるからである。また、血清中のカルシウム等は
骨形成に必要な成分であることは明かであり、骨形成能
に関与することは明かである。しかし、カルシウム成分
のみを直接血清中から測定しても、その値が骨形成能と
充分な相関、特に骨粗鬆症との相関をとらない場合があ
る。

したがって、本発明の目的は、体液中の骨形成能を正確
に測定することのできる体液中のカルシウムの測定方法
及びその測定器具を提供することにある。

本発明の目的はまた、骨粗鬆症等と相関が充分にとれた
体液中のカルシウムの訊定方法及び測定器具を提供する
ことにある。

（間ｇ　Ａを解決するための手段）本発明によれば、体液中に含まれる石灰化抑制物質を除
去或は拡散を阻止した後、体液中に含まれるカルシウム
成分を石灰化沈着して測定することを特徴とする体液中
のカルシウムの測定方法が提供される。

本発明はまた。前記カルシウム成分の石灰化沈着におい
て、カルシウム成分が沈着し得る基質を用い、その基質
に生じる石灰化沈着物を光学的に測定することを特徴と
することができる。

本発明によればまた、カルシウム成分が浸透可能で、且
つ石灰化沈着の抑制をするタンパク質系高分子の拡散が
前記カルシウム成分より小さい構造体基質であって、か
つＩＩＰＪｆｉｌ！抑制物が滅夕した状態のときにカル
シウムを石灰化沈着する構造体基質を有することを特徴
とした体液中のカルシウム測定器具が提供される。

本発明は測定器具においてまた、前記構造体基質の光透
過率（厚さ１０１１ｆ１１）を２０％以上の透明体とす
ることを特徴とすることができる。

本発明の前記構造体基質は？Ｘ数の充填穴を備えたプレ
ートに充填してなることを特徴とすることができる。

本発明は前記構造体基質がポリアクリルアミドゲルであ
ることを特徴とすることができる。

（作用）本発明は、体液中、特に血清中のカルシウム成分を石灰
化沈着させてカルシウム成分の測定をしたことが重要で
あり、しかもこの測定に際して体液中に存在する石灰化
抑制物質を実質的に除いた状態としたことが重要である
。このような測定をすることによって、骨形成能に関す
る病状、特に骨粗髭症との相関が一層高まり、これらの
測定方法及び器具が極めて血液検査に有意義になるとい
ものである。従来、血清中のカルシウム等を測定しても
、骨形成との相関はあまりみられず、充分な骨形成能測
定にはなり得なかった９本発明は骨形成に必要な体液中
の燐酸とカルシウムを石灰沈着能により、骨形成能を直
接測定する方法と実質同じと考えられる。以下、本発明
の作用について詳述する。

体液中には骨を構成しているカルシウムと＊＊とが存在
していること、そして、本発明は体液が骨形成化を抑制
する物質も含んでいるという新たな事実に着目したこと
に特徴がある。また、ここで骨形成化とは曖昧な表現で
はあるが、骨にカルシウム成分が沈着する能力を意味し
１本発明はこの骨形成化を実質的に石灰化沈着能と同質
であるとしたことにも特徴がある。

体液中において、この石灰化（骨形成化）抑制因子があ
るが由に通常は石灰化がまぬがれているが、この石灰化
抑制因子が物理的、化学的に除かれ、しかもそこに石灰
化の基質になり得る物質が存在すれば、そこに石灰沈着
が起こる。成体内における骨形成における石灰沈着もこ
の原理に基づいていると考えられる。

体液中に存在する石灰化抑制物質は分子１１万以上と考
えられ、本発明に友・いては、　この物質を体液中から
実質的に除去あるいはその物質の拡散を阻止するもので
ある。除去方法としては、Ｋ通等があり、拡散阻止とし
ては、ゲル構造体での浸透を抑制するものがある。また
、を通等の場合は体液中のカルシウム成分がふるい分け
られずに通過するものでなければならない、また、構造
体においては、少なくとも石灰化抑ｔ！Ｉ物質の拡散に
比して構造体での拡散が大きくなければならない。

また、カルシウム成分の石灰化をもたらす基質は、カル
シウムが沈着し得るものであれば良いが。

特に好ましくは透明体である。基質が透明体であれば、
その後のカルシウムの沈着の程度を光学的に測定しやす
くなるからである。

また、本発明においては１石灰化抑制物質の拡散を阻止
する構造体と、カルシウム成分が沈着し得る基質とが同
−或は併用可能であることが望ましい。前記構造体と基
質とが併用された同一物であると１体液中の石灰化抑制
物質が構造体に拡散が阻止され、被側定液中でのその濃
度が低下すると同時に、カルシウム成分が構造体（基質
）中に沈着をはじめ、その沈着量にはあまり左右されな
いことから、活定上問題が生じないばかりか、測定器具
として簡単な構造を提供し得る。またこの場合にも、構
造体が一定の透明性を有していれば光学的な測定も容易
となることが理解される。

（実施態様ｙ以下、本発明に係る体液中のカルシウム成分の測定方法
及びその器具の好ましい実施態様を説明する。

本発明に適用される体液としては、血液、リンパ液、組
織液、及び尿等を含むものであるが、本発明においては
特に血清等に使用される０体液は測定においてそれ自体
希釈あるいはｌｉｔ！して使用することができるが、通
常そのまま使用することが操作上望ましい。

の　　　からの　去または逢１石灰化抑制物質とは、実質的に骨形成化抑制タンパク質
系高分子であり、ここでタンパク質系高分子とは、分子
量が約１万以上のものである９　また、タンパク質系高
分子とは、その分子内に１１！１ｍ及び脂質を一部に結
合させているものであってもよい。　このような高分子
タンパクはカルシウムと何等かの結合様式を取り得ると
考えられる。

本発明において、石灰化抑制物質を除去するには、約１
万の分子量の大きさの通過を阻止し得る渡過膜、透析膜
あるいは、経時的に高分子の流れを遅延し得るゲル渡過
等によって分離することができる。また１本発明に使用
される拡散阻止構造体としてはゲル等があり、例えば、
ポリアクリルアミドゲル、寒天ゲル等の合成ゲル或は天
然ゲルが挙げられる。特に、本発明においては、ポリア
クリルアミドゲルが望ましい。

ポリアクリルアミドゲルは、通常のアクリルアミドモノ
マーに所定量の架橋性アクリルアミドモノマーを添加す
ることによって、即ち公知の方法によってゲル中のボア
の大きさを調整でき、本発明に必要とされる分子！約１
万程度の拡散阻止を簡単に達成することができる１本発
明に使用されるアクリルアミドモノマーとしては、アク
リルアミド、ジメチルアクリルアミド、エチルアクリル
アミド等があり、架橋性モノマーとしてはＮ、Ｎ″メチ
レンビスアクリルアミドＮ、Ｎ’　−エチレンビスアク
リルアミド等が挙げられ１本発明においては特にアクリ
ルアミド及びＮ、Ｎ’　−メチレンビスアクリルアミド
が使用上望ましい。

ポリアクリルアミドゲルの製造においては、それ自体公
知の方法によって作成されるが、本発明においては、ア
クリルアミドの元溶液に対する濃度は２０乃至６０％の
範囲が望ましく、また、架橋性アクリルアミドモノマー
は０．５乃至１．７％の範囲で含有させるのが望ましい
。

るカルシウム　　の基本発明に用いられる石灰化沈着用基質としては。

その基質内にカルシウム成分が存在すると、そのカルシ
ウム成分を白濁、即ち沈着させ得るものである。このよ
うな機能を有するものとしては、前述のポリアクリルア
ミドゲル構造体が代表として挙げられるが、通常このよ
うな基質と成り得る構造体には、ψなくとも高分子ゲル
内にカルボキシル基を有していることが望ましく、特に
アミド基の存在が望ましい。

また、本発明においては、基質（構造体）上でカルシウ
ム成分の白濁が確認できる程度の透明感を有している基
質であれば問題なく肉眼で測定使用できる。しかし、本
発明において光学的にその一評価をすることが望ましい
、この場合、構造体の光透過率（厚み１０Ｗｎ）は少な
くとも２０％以上、より好ましく５０％以上であること
が望ましい。

このような透過率を有するものとしては前述したポリア
クリルアミドゲル等があげられる。

本発明においてはまた、前記石灰化抑制物質の拡散防止
用構造体と石灰化沈着させる基質とを同一のもの、即ち
両方の機能を備えた構造体とすることが望ましく重要で
ある。このような構造体として代表されるものとしてポ
リアクリルアミドゲルなどが挙げられる。

前記のように構成した本発明においては、前述した構造
体は、ガラスプレート上、試験管、或は９６穴培養用プ
レート等に充填され、その上に被副定液である体液、例
えば血清等が所定量加えられる。この体液を加えた状態
で一定時間置くと、石灰化抑制物質はその構造体での拡
散が防止される一方１体液中のカルシウム成分は構造体
内に移行すると同時に１石灰化抑制物質の影響を受けな
くなる。このため構造体内にはカルシウム成分の石灰化
沈着による白濁が生じる。したがって、この白濁状態を
肉眼的に或は光学的に測定することによって、体液中の
カルシウム成分量を求めることができ、しかも骨形成能
を知ることができる。

このため、骨粗鬆症の診断も容易となる。以下、具体的
な実施例を示す。

（実施例）１．１％Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを含む
４０％アクリルアミド水溶液を仄整し、次にこの溶液１
０ｍ１取り、２％Ｎ、Ｎ、Ｎ−テトラメチレンジアミン
を０゜１１１１、及び１０％過硫酸アンモニウムを０．
１ｍｌ加えて攪はんし、すぐにこの溶液を９６ｖｅｌｌ
培養用ｐｌａｔｅのｉｗｅｌｌ当り３０ｕ１ずつ加えた
。前記アクリルアミド溶液を加えたプレートをＮ２ガス
中で２ｈｒ放置し、該溶液をゲル化させた。このゲル上
に、異なった年齢（１１オ一８０才）の骨粗鬆症及び他
の疾病患者及び正常人、計３５人より得た血清及び牛胎
児血清な３００ｕｌずつ加え、７日間３７’Ｃに加温し
、アクリルアミドゲル内に起こる石灰沈着量の違いを調
べた。

石灰沈着量は肉眼的にもゲル内の白濁の程度を見ること
で判断できるが、さらに正確な値を調べるために、ゲル
面を蒸留水洗浄を行ったのち、０゜０１Ｎ　ｍ　！ｉ＋
１００ｕｌを加えカルシウムを抽出したのち、このカル
シウム量を、Ｂ、仁Ｒａｙｓａｒｋａｒ　（ライサカー
）とＵ、Ｐ、Ｓ、Ｃｈａｕｈａｎ（＾ｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋２０．１５５−１６６
．１９６７）のへん法によりカルシウムを測定した。以
下にその方法を記す。

上記間ｐｌａｔｅのｗｅｌｌ当り１００ｕｌのアンモニ
アａｍ液ＰＨ１０，５を加え、　さらに、　　２５ｕ１
の　０−ｃｒｅｅｓｏｌ−ｐｈｔｈａｌｅｉｎを加え、
プレートリーダーを用い吸光度を測定した。コントロー
ルとして同　ｐｌａｔｅに０．０．１２５．０．２５．
０．５．１．２５．２．５．５．１０．　２０ｕｌのカ
ルシウムを含む蒸留水３０ｕ１を加え同様の操作を行っ
た。そのコントロールの吸光度から各サンプルのカルシ
ウム量を算出した。測定はすべて各サンプル当り　Ｚｗ
ｅｌｌずつ用いて行った。その結果をａｌに示した。

芽弛１表１に示すように、全般的にみて血清の石灰沈着能は血
液提供者の年齢に強く依存し、年齢の低い人はど血液の
石灰沈着能が高く、加齢に伴ってその能力が減ってくる
ことがわかった。また、骨粗鬆症の患者の血清の石灰沈
着能は同年齢の正常人血清を比べて有意に低値を示して
おり（提供者番号２３．３２．３３）骨粗鬆症を含む骨
代謝異常の血液検査による診断に１本発明が有用である
ことが示された。

（発明の効果）以上、説明したように本発明によれば、体液中のカルシ
ウム成分を、体液中の石灰化抑制物質の影響がない状態
で、その石灰化沈着により測定したので、体液中の骨形
成能を正確に測定することのできる。また、本発明の体
液中のカルシウムの測定方法及びその測定器具は、骨粗
鬆症等と充分に相関をとることができ、骨の発育障害の
診断に適用することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）体液中に含まれる石灰化抑制物質を除去或は拡散
を阻止した後、体液中に含まれるカルシウム成分を石灰
化沈着して測定することを特徴とする体液中のカルシウ
ムの測定方法。
（２）前記カルシウム成分の石灰化沈着において、カル
シウム成分が沈着し得る基質を用い、その基質に生じる
石灰化沈着物を光学的に測定することを特徴とする請求
項第１項記載のカルシウム測定方法。
（３）カルシウムイオン成分が浸透可能で、且つ石灰化
沈着の抑制をするタンパク質系高分子の拡散が前記カル
シウム成分より小さい構造体基質であって、かつ前記抑
制物が減少した状態のときにカルシウム成分を石灰化沈
着する構造体基質を有することを特徴とした体液中のカ
ルシウム測定器具。
（４）前記構造体基質は光透過率（厚さ１０ｍｍ）が２
０％以上の透明体であることを特徴とする請求項第３項
記載の測定器具。
（５）前記構造体基質は複数の充填穴を備えたプレート
に充填してなることを特徴とする請求項第４項記載の測
定器具。
（６）前記構造体基質がポリアクリルアミドゲルである
ことを特徴とする請求項第３項乃至５項記載の測定器具
。