JPH04334399A - 大腸菌における成熟ヒトｐｄｇｆ−ｂの発現 - Google Patents

大腸菌における成熟ヒトｐｄｇｆ−ｂの発現

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JPH04334399A
JPH04334399A JP4005565A JP556592A JPH04334399A JP H04334399 A JPH04334399 A JP H04334399A JP 4005565 A JP4005565 A JP 4005565A JP 556592 A JP556592 A JP 556592A JP H04334399 A JPH04334399 A JP H04334399A
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human pdgf
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Denise M Alexander
デニス・エム・アレキサンダー
Michael B Cable
マイケル・ビー・ケーブル
Barbara L Dalie
バーバラ・エル・ダリー
Satwant K Narula
サットウォント・ケイ・ナルーラ
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は大腸菌における成熟ヒト
ＰＤＧＦ−Ｂの発現に関する。
【０００２】
【従来の技術】血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は血清
中の主要な分裂促進因子であり、インビトロで線維芽細
胞および平滑筋細胞の増殖を促進する［Ｈｅｌｄｉｎ　
　ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ　　３７：９（１９８４）；Ｄ
ｅｕｅｌｅｔ　　ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｃｅｌｌ
．Ｒｅｇｕｌ．２６：５１（１９８５）；Ｒｏｓｓ　　
ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ　４６：１５５（１９８６）］。 ＰＤＧＦは刺激によりチロシン残基を自己リン酸化する
特定の細胞受容体と高い親和性で結合することによりそ
の分裂促進効果を発揮する。
【０００３】精製されたＰＤＧＦは約３０，０００ダル
トンの分子量を持つ陽イオン性糖蛋白質であるが、分子
はかなりのサイズ不均一性を示す。個々の化学種のサイ
ズは約２７，０００から３１，０００ダルトンの範囲で
ある。この不均一性はポリペプチド鎖の２つの形（Ａお
よびＢ）のグリコシル化の程度の差により生じると信じ
られている。すべてのＰＤＧＦ種は同一の生物活性を示
し、それはジスルフィド架橋の化学的切断により破壊さ
れる。
【０００４】天然のＰＤＧＦは通常そのような架橋によ
り連結されている１つのＡ鎖および１つのＢ鎖から成る
ヘテロダイマーであるが、２つのＡ鎖または２つのＢ鎖
から成るホモダイマーもまた知られている［Ｈａｒｔ　
　ｅｔ　　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　２９
：１６６（１９９０）］。Ｋｅｌｌｙ　　ｅｔ　　ａｌ
．，［ＥＭＢＯ　　Ｊ．４：３３９９（１９８５）］は
Ｓ．セレビジエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においてｖ−
ｓｉｓ遺伝子の誘導体を発現させ、Ｂ鎖配列のみを含む
ポリペプチドを産生した。発現生成物は生物学的に活性
であり、ＰＤＧＦのＢ鎖単独で分裂促進に十分であるこ
とを示している。最近Ｈｏｐｐｅ　　ｅｔ　　ａｌ．，
［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　２８：２９５６（１９
８９）］はホモダイマーを形成し、生物活性を示す改良
組換え体ＰＤＧＦ−Ｂポリペプチドの調製について記載
している。
【０００５】アミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列データは
、ＰＤＧＦのＡおよびＢ鎖は部分的に相同であり、Ｂ鎖
はサル肉腫ウィルスの形質転換生成物、ｐ２８ｓｉｓの
予想アミノ酸配列の一部として非常に相同であることを
示している［Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅｅｔ　　ａｌ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ　　２２１：２７５（１９８３）；Ｗａｔｅ
ｒｆｉｅｌｄ　　ｅｔ　　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　　３
０４：３５（１９８３）］。Ｗａｎｇｅｔ　　ａｌ．，
［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１０６４５（１９
８４）］はまた線維芽細胞膜においてｐ２８ｓｉｓがＰ
ＤＧＦ受容体部位への結合において１２５Ｉ−ＰＤＧＦ
と競合することを示した。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】その分裂促進効果のた
め、ＰＤＧＦは傷の治療の促進に使用できる。それ故、
医薬使用のため十分な量のＰＤＧＦを産生することが望
ましいであろう。好適には、そのようなＰＤＧＦははっ
きりした分子構造を持ち、単一の化学種（天然の原料に
観察されるごとき化学種の混合物の代わりに）であるべ
きである。
【０００７】多量のＰＤＧＦ−Ｂ相同体を産生しようと
する努力については、Ｇｉｅｓｅｅｔ　　ａｌ．，［Ｊ
．Ｖｉｒｏｌ．６３：３０８０（１９８９）］がバキュ
ロウィルスベクター系を用いてサルｖ−ｓｉｓ遺伝子を
発現している。しかしながらその結果は、明らかにアミ
ノおよびカルボキシの両方の末端での種々のグリコシル
化および蛋白分解プロセシングに起因する不均一の混合
物であった。
【０００８】ＰＤＧＦのグリコシル化は生物活性には必
要でなく、グリコシル化の変動により生じる微不均一性
を避けることができるのでグリコシル化されていない（
非グリコシル化）蛋白質の産生が望ましいであろう。 しかしながら、大腸菌のごとき細菌におけるグリコシル
化されていず、生物活性をもつ成熟ヒトＰＤＧＦを産生
する試みはまだ成功していない。初期のものは生物不活
性の物質を産生し、多分微生物環境における不正確なポ
リペプチド鎖折りたたみおよびジスルフィド架橋形成に
よるものであろう［Ｄｏｖａｒｅ　　ｅｔ　　ａｌ．，
Ｃｅｌｌ　　３６：４３（１９８４）；Ｗａｎｇ　　ｅ
ｔ　　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１０
６４５（１９８４）］。より最近のものでは、大腸菌発
現系において生物学的に活性な物質が産生されているが
、しかしＰＤＧＦ配列のすべてを含み、余分な配列は含
んでいない無傷な成熟蛋白質ではない。
【０００９】例えば、Ｈｏｐｐｅ　　ｅｔ　　ａｌ．，
（上記文献）は大腸菌中ｃｒｏ−β−ｇａｌ−ＰＤＧＦ
−Ｂ融合蛋白質をコードしている遺伝子を発現させるこ
とにより、改良された生物学的活性ＰＤＧＦ−Ｂダイマ
ーを調製した。融合蛋白質は臭化シアンによる分解によ
りアミノ末端から１２のアミノ酸残基が失われた端が切
り取られた形のＰＤＧＦ−Ｂが生じた。Ｈｏｐｐｅ　　
ｅｔ　　ａｌ．，のＰＤＧＦ−Ｂはまたカルボキシ末端
に拡張された５つのアミノ酸も含んでおり、その最後の
３つはどんなＰＤＧＦ配列にも関連しておらず、ＰＤＧ
Ｆ　　ｃＤＮＡへ融合された終止リンカーに起源してい
た。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明はグリコシル化さ
れていない、生物学的に活性な成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂを
提供する。好適な実施態様においてはこのＰＤＧＦ−Ｂ
は細菌蛋白質を実質的に含んでいない。
【００１１】本発明はさらに、そのようなＰＤＧＦ−Ｂ
をコードしているＤＮＡおよび組換えベクターを提供す
る。これらのベクターは成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂをコード
しているＤＮＡを含んでおり、大腸菌細菌においてその
ようなＤＮＡの発現を指令できる。好適には、ベクター
は５’から３’の方向に、Ｔａｃプロモーター、Ｉｑ抑
制遺伝子および成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂをコードしている
ＤＮＡを含んでいる。本発明はまたさらに、成熟ヒトＰ
ＤＧＦ−ＢをコードしているＤＮＡを含む組換えベクタ
ーで形質転換された大腸菌細菌も提供し、その細菌はそ
のようなＤＮＡを発現できる。これらの細菌はＩｏｎプ
ロテアーゼおよび熱ショック制御因子ｈｔｐＲが欠損し
ている（Ｉｏｎ−およびｈｔｐＲ−）。
【００１２】本発明はさらに： （ａ）成熟ヒトＰＤＧＦ−ＢをコードしているＤＮＡを
含む組換えベクターで形質転換させたＩｏｎ−，ｈｔｐ
Ｒ−大腸菌をＤＮＡが発現される条件下で培養し；およ
び （ｂ）培養物から生物学的に活性で、グリコシル化され
ていない成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂを調製することから成る
生物学的に活性な、グリコシル化されていない成熟ヒト
ＰＤＧＦ−Ｂをつくる方法を提供する。
【００１３】本明細書に引用されているすべての文献は
引例としてそのまま包含されている。記載されているす
べての核酸配列は左から右に読んで通常の５’から３’
の規定に従っている。標準単一文字略号が配列中の核酸
塩基に対し使用されている（３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８
２２）。
【００１４】本明細書で使用するかぎり“成熟ヒトＰＤ
ＧＦ−Ｂ”とは（ａ）配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎ
Ｏ）：１で定義される配列と実質的に同一のアミノ酸配
列を持ち、および（ｂ）天然ＰＤＧＦ−Ｂに共通の生物
活性を持つＰＤＧＦ−Ｂとして定義される。アミノ酸配
列の実質的同一性とは別の成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂ蛋白質
の配列が配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）：１で定
義された配列と比較して同一であるかまたは生物活性を
実質的に損わない１つまたはそれ以上のアミノ酸変化（
欠損，付加，置換）があることを意味する。
【００１５】例えば、配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎ
Ｏ）：１により定義される配列の対立遺伝子変異体であ
ってもよい。さらに、それは当業分野でよく知られてお
り、例えば化学合成または改良ポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）プライマーまたは部位特異的突然変異誘発の使
用により、配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）：１で
定義されている配列を持つＰＤＧＦ−Ｂをコードしてい
るＤＮＡを改変して、それらにより産生されるＰＤＧＦ
−Ｂの生物活性を実質的に損わない一つまたは多数の塩
基置換を生みだす。そのような保存的改変変異体も本発
明の範囲内である。
【００１６】配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）：１
により定義されたアミノ酸配列はＲａｔｎｅｒ　　ｅｔ
　　ａｌ．，［Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅ
ｓ．１３：５００７（１９８５）］により記載されたｃ
−ｓｉｓ蛋白質のサブ配列と同一である。便宜上、本発
明の生物学的に活性なＰＤＧＦは本明細書で“ＰＤＧＦ
−Ｂ”で示されるが、前に指摘したごとく、この蛋白質
は実際には２つのＢ鎖を含むホモダイマーである（すな
わち、ＰＤＧＦ−ＢＢ）。
【００１７】本発明のＰＤＧＦ−ＢをコードしているＤ
ＮＡは既知の核酸配列［Ｒａｔｎｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ
．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ．１３：
５００７（１９８５）］およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ　　
ｅｔ　　ａｌ．，［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０
３：３１８５（１９８１）］のホスホラミダイト固相法
のごとき常法またはＹｏｏ　　ｅｔ　　ａｌ．，［Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７６４：１７０７８（１９８９）
］の方法を使用する化学合成により調製できる。
【００１８】もしくは、ｃＤＮＡはＰＤＧＦを産生する
ことが既知の任意の細胞から作製できる。そのような細
胞には例えばヒト肉腫、グリア芽腫、胎盤および静脈内
皮細胞が含まれる。ＨＴＬＶ−Ｉまたは−ＩＩによる形
質転換により生じるヒトＴ−リンパ系細胞株（例えばＨ
ＵＴ１０２細胞）は別の細胞源である。メッセンジャー
ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）はこれらの細胞から通常の技術を用
いて単離でき、このｍＲＮＡはＭａｎｉａｔｉｓ　　ｅ
ｔ　　ａｌ．，［モレキュラークローニング；実験マニ
ュアル、１９８２，Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ］により記載されているご
とく、二本鎖ｃＤＮＡを産生するための鋳型として使用
できる。このｃＤＮＡは大腸菌を形質転換するために使
用できるクローニングベクター内へ挿入でき、ｃＤＮＡ
ライブラリーを作製する。
【００１９】このｃＤＮＡライブラリーは次に既知の核
酸配列に基づいた分子プローブを用いてスクリーニング
できる。そのようなプローブは、例えば４つのデオキシ
ヌクレオチド（その１つはα位に３２Ｐを含んでいる）
の存在下ＰｏｌＩ　　ＤＮＡポリメラーゼを用いるニッ
ク−トランスレーションにより放射標識できる（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ．，上記文献，ｐ１０９）
。
【００２０】さらに別の方法が下記の実施例のごときＤ
ＮＡを得るために使用された。ＰＤＧＦ−Ｂ　　ＤＮＡ
のコピーをつくるために既知のＰＤＧＦ−Ｂ配列に基づ
いたオリゴヌクレオチド　　プライマーおよび鋳型とし
てＰＤＧＦ−Ｂ挿入物を含んでいるプラスミドを用いる
ＰＣＲ法［Ｓａｉｋｉ　　ｅｔ　　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２３９：４８７（１９８８）］が使用された。ＰＣ
Ｒ法はまたｃＤＮＡライブラリーおよびそのようなＤＮ
Ａを含む当業分野で既知の他のプラスミドにも応用でき
る。
【００２１】もちろん、遺伝コードの縮重性のため、本
明細書で定義したように成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂをコード
できる多数の機能的に等価な核酸配列がある。化学合成
、改良プライマーを用いるＰＣＲおよび部位特異的突然
変異誘発のごとき既知の方法を用いて容易に製造できる
そのような機能的に等価な配列は、本発明の範囲内であ
る。
【００２２】ＤＮＡおよびベクターの両方の末端が同一
の制限部位を含む場合は、ベクター内へのヒトＰＤＧＦ
−ＢをコードしているＤＮＡの挿入は容易に達成できる
。もしそうでない場合は、平滑端をつくるため制限エン
ドヌクレアーゼ切断により発生した一本鎖ＤＮＡオーバ
ーハングを消化しなおし、または同じ結果となるように
適当なＤＮＡポリメラーゼにより一本鎖末端を満たして
ＤＮＡおよび／またはベクターの末端を改変することが
必要である。もしくは、末端へヌクレオチド配列（リン
カー）を連結することにより所望される部位をつくって
もよい。そのようなリンカーは所望の制限部位を定義す
る特定のオリゴヌクレオチド配列を含んでいるであろう
。切断されたベクターおよびＤＮＡ断片は必要に応じホ
モポリマーの尾を付けてもよい。
【００２３】多数の大腸菌と合致する発現ベクターが本
発明で使用でき、Ｔａｃ，Ｌａｃ，Ｔｒｐ，ＬａｃＵＶ
Ｓ，λＰｒおよびλＰＬプロモーターのごとき細菌また
はバクテリオファージ　　プロモーターを含むベクター
が含まれるが、それらに限定されるわけではない。好適
には、選択されるベクターはＰＤＧＦ−Ｂ　　ＤＮＡ発
現の速度が制御可能な発現制御配列を持つものであろう
。そうすると宿主細胞に対して毒性であると判明した過
剰生産を避けてＰＤＧＦ−Ｂ生産が制御できる。最も好
適なものは、５’から３’へ（上流から下流へ）Ｔａｃ
プロモーター，Ｉｑ抑制遺伝子および成熟ヒトＰＤＧＦ
−ＢをコードしているＤＮＡを含むベクターである。本
発明における使用のために選択されたベクターはまたｏ
ｍｐＡまたは蛋白質Ａリーダーのごとき分泌リーダーを
含んでいてもよい（そのようなリーダーが翻訳後プロセ
シングの間に切断されて成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂを産生さ
えすれば）。
【００２４】下記の実施例において、最終例示プラスミ
ドｐＴａｃＢＩｑをつくるためプラスミドｐＴａｃＲＢ
Ｓ，ｐｉｑＩ−１およびｐＳＭ−１を用いて各々Ｔａｃ
プロモーター，Ｉｑ抑制遺伝子およびＰＤＧＦ−Ｂ　　
ＤＮＡが得られた。しかしながら当業者はｐＴａｃＢＩ
ｑを作製するに必要な要素の他の容易な供給源があるこ
とを知るであろう。
【００２５】例えば、プラスミドｐＴａｃＢＩｑへのほ
かの経路においては、プラスミドｐＢＴａｃ２（Ｔａｃ
プロモーター源，例えばＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍから入手可能）がＢａｍＨＩ消化、やえな
り（Ｍｕｎｇ　　ｂｅａｎ）ヌクレアーゼによる平滑端
化、ＰｓｔＩによる切断およびウシ腸アルカリホスファ
ターゼによる脱リン酸化により製造される。大きな断片
を単離しアガロースゲルから精製する。
【００２６】ヒトＰＤＧＦ−Ｂの成熟形をコードしてい
るＤＮＡ断片を発生させるため、配列番号（ＳＥＱ　　
ＩＤ　　ＮＯ）：２および配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　
　ＮＯ）：３で定義された核酸配列を持つ２つのオリゴ
ヌクレオチドが合成され、鋳型としてλファージＤＮＡ
（ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離された）での
ＰＣＲのためのプライマーとして使用された。得られた
ヒトＰＤＧＦ−Ｂ　　ＤＮＡ断片をＰｓｔＩで消化し、
連結させてプラスミドｐＢＴａｃ２を調製する。ＰＤＧ
Ｆ−Ｂ配列を正しい向きに含んでいるプラスミドｐＴａ
ｃＢと称される。
【００２７】プライマーとして配列番号（ＳＥＱ　　Ｉ
Ｄ　　ＮＯ）：４および配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　
ＮＯ）：５で定義される核酸配列を持つ合成オリゴデオ
キシヌクレオチドを用いるＰＣＲにより大腸菌Ｋ−１２
株ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ　　３３８７６）から大腸菌Ｌ
ａｃＩｑ遺伝子を含む１１０７−ヌクレオチドＥｃｏＲ
Ｉ断片を発生させる。ＣｌａＩ消化後、ＬａｃＩｑ断片
をＣｌａＩ−消化脱リン酸化ｐＴａｃＢ　　ＤＮＡへ結
合させる。大腸菌を形質転換させ、陽性クローンを同定
し、ＬａｃＩｑ遺伝子の向きをエンドヌクレアーゼ消化
により決定する。
【００２８】もしくは、任意の株から野生型Ｌａｃプロ
モーターを単離でき、続いて例えばＩｑ遺伝子中に存在
することが知られている単一塩基置換を含んでいるプラ
イマーでのＰＣＲを用いる突然変異を行う［Ｍｕｌｌｅ
ｒ−Ｈｉｌｌ　　ｅｔ　　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　　５９：１２５９（１９
６８）］。
【００２９】本発明で使用するための二重に突然変異を
起こしたＩｏｎ−，ｈｔｐＲ−大腸菌細菌は以下に詳細
に説明するごとく容易に入手可能な一つの突然変異を起
こした細菌から生成できる。本発明の組換えベクターの
そのような細菌内への形質転換は常法を用いて実施でき
る。
【００３０】形質転換された細胞はＰＤＧＦ−Ｂ　　ｃ
ＤＮＡが発現される条件下で培養され： （ａ）細胞を破壊し； （ｂ）破壊された細胞から封入体分画を調製し；（ｃ）
濃縮尿素溶液を用いて工程（ｂ）の封入体分画中のＰＤ
ＧＦ−Ｂを可溶化し；および （ｄ）還元型および酸化型グルタチオンの混合物および
尿素濃度を減少させる濃度勾配を用いて工程（ｃ）から
の可溶化ＰＤＧＦ−Ｂを再び折りたたむから成る工程に
より培養物から生物学的に活性なヒトＰＤＧＦ−Ｂを調
製する。大腸菌で産生されると、ＰＤＧＦ−Ｂは細胞質
中の封入（屈折）体中にとどまっている。ＰＤＧＦを遊
離させるには細胞の膜を破壊する必要がある。このこと
は好適には超音波処理またはフレンチ　　プレッシャー
　　セルまたはガウリン　　ホモゲナイザーのごとき機
械的破壊手段により達成される。
【００３１】細胞破壊はまた化学的または酵素的手段に
よっても達成できる。二価陽イオンはしばしば細胞膜の
完全性に必要とされるので、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡの
ごとき適当なキレート剤による処理により膜は十分に破
壊される。同様に、リゾチームのごとき酵素が同じ結果
を達成するのに用いられてきた。その酵素は細胞壁のペ
プチドグリカン骨格を加水分解する。
【００３２】浸透圧ショックの適用もまた用いることが
できる。このことは最初に細胞を水を失わせ収縮させる
高張溶液中に置くことにより達成される。続いて高張“
ショック”溶液に置くと、細胞内への水の急激な流入を
起こし、細胞が破裂する。
【００３３】細胞が破壊されたら、細胞破片が除去され
、常法により封入体分画が得られる。この分画中のＰＤ
ＧＦ−Ｂは約７または８Ｍ（好適には８Ｍ）濃度の尿素
溶液を用いて可溶化される。代わりに濃（約６Ｍ）グア
ニジン−ＨＣｌ溶液も使用できるが、尿素では可溶化蛋
白質の続いての精製に陽イオン交換クロマトグラフィー
の使用が可能であるので尿素が好適である。
【００３４】可溶化蛋白質は吸着クロマトグラフィー、
陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲルまた
は他の支持マトリックス中での分取電気泳動、等電点電
気泳動などのごとき常法により精製される。塩濃度勾配
溶出を用いる陽イオン交換クロマトグラフィーが好適で
あり、選択された樹脂はカルボキシメチル−セファロー
スＲ（ＣＭ−セファロースＲ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ　　
Ｆｉｎｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓのビーズ化アガロース
生成物）である。もちろん、ＣＭ−セルロースのごとき
他の樹脂も同様に使用できる。
【００３５】精製後ＰＤＧＦ−Ｂは好適には約０．１Ｍ
亜硫酸ナトリウムおよび１ｍＭ四チオン酸ナトリウムを
用いて常法によりスルホン化される。生物学的に活性な
形へのスルホン化ＰＤＧＦ−Ｂの再折りたたみは、還元
型および酸化型グルタチオン（ＧＳＨ）の混合物を含む
濃（好適には８Ｍ）尿素溶液中で開始される。還元型：
酸化型ＧＳＨのモル比は約２ｍＭから１０ｍＭの範囲の
還元型の濃度で約１０：１から６：１まで変化できる。 好適には、５ｍＭ還元型ＧＳＨおよび０．５ｍＭ酸化型
ＧＳＨの混合物が使用される。
【００３６】生物学的に活性なＰＤＧＦ−Ｂダイマーへ
のポリペプチド鎖の再折りたたみは、ＧＳＨ濃度を維持
しながら尿素濃度を１Ｍ以下（好適には約０．５Ｍ）に
徐々に減少させることにより達成される。このことは多
数の方法により達成されるが、尿素溶液を徐々に引き出
し、等量の尿素を含まない溶液で対応させて置換するの
が都合の良い方法である。下記の実施例においては、尿
素濃度の減少は７０時間以上かけて指数関数的に達成さ
れた。好適には、再折りたたたみ過程はアルゴンガスの
ような不活性雰囲気下に実施される。
【００３７】限外濾過または所望の緩衝液に対する透析
のような常法により、またはゲル濾過または他のクロマ
トグラフィー法を用いて再び折りたたまれたＰＤＧＦ−
Ｂから尿素およびＧＳＨを除去できる。
【００３８】本発明のグリコシル化されていない、成熟
ヒトＰＤＧＦ−Ｂは従来の技術のＰＤＧＦにより処置を
受けやすい任意の健康状態に使用できるであろう。その
ような使用のための医薬組成物は，有効量のグリコシル
化されていない成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂおよび生理学的に
受容可能な担体を含んでいる。
【００３９】例えば、ＰＤＧＦを含む傷治療製剤のため
の処方および用量範囲は当業分野ではよく知られている
（例えばＭｕｒｒａｙ　　ｅｔ　　ａｌ．，による米国
特許第４，８４５，０７５号を参照されたい）。また、
切断、擦過、太陽、風などにより障害を受けた皮膚の処
置に使用するためのＰＤＧＦ含有組成物もよく知られて
いる（Ｇｏｖｉｅｒによる米国特許第４，９００，５４
１号を参照されたい）。
【００４０】
【実施例】本発明は以下の実施例により例示できるが、
それに制限されるわけではない。特に断らない限り、固
体中の固体、液体中の液体および液体中の固体に与えら
れたパーセントは各々ｗｔ／ｗｔ，ｖｏｌ／ｖｏｌおよ
びｗｔ／ｖｏｌに基づいている。
【００４１】材料 制限酵素およびＴ４　　ＤＮＡリガーゼはＮｏｗ　　Ｅ
ｎｇｌａｎｄ　　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍ
Ａ，から購入された；テルムス　　アクアチクス（Ｔｈ
ｅｒｍｕｓ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ，Ｔａｑ）ＤＮＡポリ
メラーゼはＢｅｃｋｍａｎ　　Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒ
ｔｏｎ，ＣＡから得られた；およびウシ腸アルカリ性ホ
スファターゼ（ＣＩＡＰ）およびアルカリ性ホスファタ
ーゼ−共役ウサギ抗−ヤギＩｇＧはＢｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ　　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｃａｌｓ，
Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ　　から供給された。 ヤギ抗−ヒトＰＤＧＦポリクローナル抗血清およびＰＤ
ＧＦ標品はＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　　Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡから得られた
。すべての酵素は製造元の教示に従って使用された。ザ
　　シークナーゼバージョン２．０配列決定システムは
Ｕｎｉｔｅｄ　　Ｓｔａｔｅｓ　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨから得られた。
【００４２】プラスミドｐＴａｃＲＢＳ［Ｚｕｒａｗｓ
ｋｉ　　ｅｔ　　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７
：３３５４（１９８６）］，ｐＳＭ−１［Ｒａｔｎｅｒ
．ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅ
ｓ．１３：５００７（１９８５）］およびｐｉｑＩ−１
が各々運搬可能なＴａｑプロモーター、ｃ−ｓｉｓ　　
ｃＤＮＡおよびＬａｃＩｑ遺伝子源として使用された。
【００４３】大腸菌Ｋ−１２株ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ　
　３３８７６）およびＭＭ２９４（ＡＴＣＣ　　３３６
２５）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン，ロックビル，マサチューセッツ州から得られた。バ
クテリオファージＰ１（ＡＴＣＣ２５４０４−Ｂ１）も
また同所から入手可能である。大腸菌Ｋ−１２株ＳＧ２
０２５２（Ｉｏｎ−）およびＫ１６５（ｈｐｔＲ−）は
エール大学生物学部の大腸菌遺伝子保存センター、Ｎｅ
ｗ　　Ｈａｖｅｎ，ＣＴ　　から得られた。ＣＡＧ６２
９と称されるＩｏｎ−，ｈｐｔＲ−大腸菌Ｋ−１２突然
変異体はウィスコンシン大学，マジソン，ウィスコンシ
ン州のＣ．Ｇｒｏｓｓ博士から寄贈された。
【００４４】オリゴヌクレオチド合成 ＰＣＲのために使用されたオリゴヌクレオチドはＡｐｐ
ｌｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　　３８０Ｂ　　Ｄ
ＮＡシンセサイザーを使用する常法により合成され、常
法により精製された。
【００４５】プラスミドｐＴａｃＢＩｑの構築本質的に
Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ．，［モレキュラー
　　クローニング：実験マニュアル，１９８２，Ｃｏｌ
ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ］により記載されているようにして標準的組換
えＤＮＡ法が実施された。
【００４６】ＰＣＲ反応は本質的にＦｒｉｅｄｍａｎ　
　ｅｔ　　ａｌ．，［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　　Ｒ
ｅｓ．１６：８７１８（１９８８）］により記載されて
いるごとくＴｅｃｈｎｅプログラム可能Ｄｒｉ−Ｂｌｏ
ｃｋ（ＧＲＩ，Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ）で実施された。簡単
に記すと、５０ｍＭ　　ＫＣｌ，１０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．３），１．５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２，１ｍｄ
　　ｄＮＴＰｓ，０．０１％ゼラチン、１００ピコモル
の各々のオリゴヌクレオチドプライマー，５０−１００
ｎｇの適当な鋳型ＤＮＡおよび４−８単位のＴａｑポリ
メラーゼから成る反応混合物を９５，５０および７２℃
の３０回の２分サイクルにかけ、７２℃の最終伸長期間
を９分とした。インキュベーション終了後、ＰＣＲ混合
物を１．２％アガロース／トリス−酢酸ゲル中の電気泳
動にかけた。関心あるＰＣＲ断片をエチジウムブロミド
で染色することにより可視化し、ゲル電気溶出により精
製した。 ゲル精製後、ＰＣＲ断片は下に示すごとく制限エンドヌ
クレアーゼで消化させた。
【００４７】プラスミドｐＴａｃＢＩｑを構築するには
、プラスミドＳａｃＩで消化することによりプラスミド
ｐＴａｃＲＢＳが調製された。切断されたプラスミドは
次にＴ４　　ＤＮＡリガーゼにより平滑端化され、Ｂａ
ｍＨＩで切断されおよびＣＩＡＰで脱リン酸化され、大
断片が単離され、アガロースゲル電気泳動により精製さ
れた。
【００４８】ヒトＰＤＧＦ−Ｂの成熟形をコードしてい
るＤＮＡ断片を産生するには、プラスミドｐＳＭ−１が
鋳型として用いられ、プライマーとして配列番号（ＳＥ
ＱＩＤ　　ＮＯ）：６および配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ
　　ＮＯ）：７により定義される核酸配列を持つ合成オ
リゴデオキシヌクレオチドを用いるＰＣＲにかけた。得
られるヒトＰＤＧＦ−Ｂ　　ＤＮＡ断片を単離し、Ｂａ
ｍＨＩで消化し調製されているｐＴａｃＲＢＳベクター
に結合させることによりｐＴａｃＢと称されるプラスミ
ドを生成させる。
【００４９】大腸菌ＬａｃＩｑ遺伝子を含む１１０７−
塩基対ＥｃｏＲＩ断片はｐｉｑＩ−１から単離され、Ｅ
ｃｏＲＩで消化されＣＩＡＰで処理されているプラスミ
ドｐＴａｃＢに結合させる。以下に説明するごとく、大
腸菌株２９４内への結合混合物の形質転換に続いて、陽
性のクローンを同定し、ＬａｃＩｑ遺伝子の配向は制限
エンドヌクレアーゼ消化により決定した。所望の形質転
換体の大規模調製試料はＣｓＣｌ／エチジウムブロミド
遠心分離により得られ（Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ｅｔ　　
ａｌ．，上記文献、ページ９３）、ＰＤＧＦ　　ｃＤＮ
Ａ挿入物の確実性はシークナーゼバージョン２．０シス
テムを用いる配列決定により確立された。そのようにし
て得られたプラスミドはｐＴａｃＢＩｑと称された（図
１）。
【００５０】プラスミドｐＴａｃＢＩｑに対する核酸配
列分析は配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤＮＯ）：８により定
義されている成熟ＰＤＧＦ−Ｂ　　ｃＤＮＡ挿入物の配
列を示した。この配列はＲａｔｎｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ
．，の文献［Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ
．１３：５００７（１９８５）］の図２に示されている
ヌクレオチド残基３６１−６８７の配列と同一である。
【００５１】Ｉｏｎ−，ｈｔｐＲ−大腸菌細菌の調製Ｃ
ＡＧ６２９と称されるＩｏｎ−　　ｈｔｐＲ−大腸菌突
然変異体が下記の本実施例で使用されているが、同様の
結果を生み出す本発明の方法に使用できる等価な突然変
異体もまた調製された。この突然変異体をつくるには常
法［Ｍｉｌｌｅｒ、分子遺伝学の実験、１９７２，Ｃｏ
ｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ，ＮＹ，ｐｐ２０１−２０５］を用いて大腸菌Ｋ−１
２株ＳＧ２０２５２（Ｉｏｎ−）にＰ１を導入ファージ
貯蔵物で処理する。Ｐ１貯蔵物を１０ｍＭ　　ＣａＣｌ
２含有ＬＢ（ルリア−ベルターニ）培地中で増殖させた
大腸菌株１６５（ｈｐｔＲ−）細胞に３０℃で３０分間
吸着させた。０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ８．０
）の添加により吸着を停止させ細胞を遠心分離により採
取した。
【００５２】細胞は２０ｍＭクエン酸ナトリウムに再懸
濁し、テトラサイクリン含有（３５μｇ／ｍｌ）ＬＢ培
地上へ播種した。粘液性である（Ｉｏｎ−突然変異体の
特徴的表現型）テトラサイクリン耐性コロニーを単離し
、再播種した。
【００５３】単離された形質導入体コロニーは、培養皿
から３０ｃｍの所に置かれたランプを用いて０−３０秒
の間コロニーを紫外（ＵＶ）照射に暴露することにより
ＵＶ照射に対する高まった感受性（Ｉｏｎ−突然変異の
別の特徴）を試験した。種々のＵＶ照射量後細胞の生存
率を試験した。ＤＡ１６と称される１つのクローンが親
株Ｋ１６５と比較して増加したＵＶ感受性、しかし株Ｓ
Ｇ２０２５２とは類似の感受性を示した。
【００５４】細胞形質転換 大腸菌Ｋ−１２ＣＡＧ２６９細胞は本質的にＭａｎｉａ
ｔｉｓ　　ｅｔ　　ａｌ．，［前記文献、ページ２５０
］により記載されているごとく形質転換された。ただし
細胞は３０℃で２分間熱ショックを与え、塗布した後２
５℃でインキュベートした。
【００５５】組換えヒトＰＤＧＦの産生大腸菌ＣＡＧ２
６９細胞は２７℃で５００ｍｌの培養液で１００μｇ／
ｍｌアンピシリンおよび２０μｇ／ｍｌテトラサイクリ
ンを含むＬＢ培地中、６００ｎｍで０．６　　Ｏ．Ｄ．
の密度になるまで増殖させた。培養液は３７℃へ移行さ
せ０．８−１．０のＯ．Ｄ．まで増殖させ、その時点で
２ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピアノシド
（ＩＰＴＧ）を添加し、３７℃で２時間インキュベーシ
ョンを続けた。
【００５６】ＰＤＧＦの精製 前記のごとく培養した細菌を遠心分離して集め、５００
ｍｌの培養物当り２５ｍｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，
ｐＨ７．８，０．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ），１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２に再懸濁した。細胞は
９−１０，０００ｐｓｉでマイクロフルイディクス流動
化機を通して破壊した。ＤＮＡａｓｅおよびＲＮＡａｓ
ｅ（Ｓｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｃｏ．，Ｓｔ
．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を各々２０μｇ／ｍｌおよび１０
μｇ／ｍｌの最終濃度で添加し、消化は２５℃で３０分
間実施された。
【００５７】細胞破片を４℃にて１０００ｘｇで５分間
遠心分離して除去した。封入体は４℃にて２７，０００
×ｇで１５分間遠心分離すると得られた。封入体ペレッ
トを４０ｍｌの２％トリトンＸ−１００を含む２Ｍ尿素
に再懸濁し、前記のごとくペレット化した。洗浄したペ
レットを２０ｍｌの３０％ショ糖に再懸濁し、４℃にて
１５分間１０，０００×ｇで遠心分離した。最終ペレッ
トは続いてのＰＤＧＦ−Ｂの精製に先立ってＮ２ガス下
−７０℃にて凍結させた。
【００５８】以下に説明する精製工程において、カラム
分画はドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド　　
ゲル電気泳動［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２２７：６８０（１９７０）］およびヤギ
抗−ヒトＰＤＧＦポリクローナル抗血清を用いてのイム
ノブロッティング［Ｔｏｗｂｉｎ　　ｅｔ　　ａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　　７
６：４３５０（１９７９）］により分析した。概算の蛋
白質測定はＢｉｏ−Ｒａｂ　　Ｌａｂｓ［Ｂｒａｄｆｏ
ｌｄ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８（１９
７６）］の比色試薬および標品としてウシ血清アルブミ
ンを用いて実施された。より正確なタンパク質決定は常
法を用いアミノ酸組成分析によりなされた。
【００５９】室温にて２５ｍＭ　　ＭＯＰＳ（３−［Ｎ
−モルホリノ］プロパンスルホン酸），ｐＨ７．２　　
８Ｍ尿素および５ｍＭ　　ＤＴＴ（ジチオスレイトール
）で封入体ペレットを抽出した。混合物を清澄化後２１
℃にて４５分間２５，０００×ｇで遠心分離し、全量で
１１０６ｍｇの蛋白質を含む上澄み液を前もって抽出緩
衝液で平衡化させた２．６×１９．５ｃｍのＣＭ−セフ
ァロースＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　　ＬＫＢ　　
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，
ＮＪ）上に置いた。カラムを平衡化緩衝液で洗浄して非
結合物質を除去した後、結合蛋白質は０から０．４Ｍ　
　ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した（１４ベッド容量
）。ＰＤＧＦを含む分画をプールし６Ｍ−グアニジン−
ＨＣｌに対して透析した。
【００６０】プールされた分画中の蛋白質（約２８ｍｇ
）を０．１Ｍ亜硫酸ナトリウムおよび１０ｍＭ四チオン
酸ナトリウムで室温で５時間スルホン化し、アルゴン下
、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ，２ｍＭ　　ＥＤＴＡ，ｐＨ
７．８中に０．５ｍＭ酸化型グルタチオンおよび５ｍＭ
還元型グルタチオンを含む８Ｍ尿素に対して透析した。 次にアルゴン下尿素を含んでいる緩衝液をポンプで除去
し、同じ速度で尿素を含まない緩衝液をポンプで送り込
むことにより７０時間以上かけて尿素濃度を減少させた
。透析した試料は次に５０ｍＭ酢酸ナトリウム，ｐＨ５
．０および０．２５Ｍ　　ＮａＣｌに調整し、存在する
沈殿物は遠心分離によりペレット化し廃棄した。
【００６１】上澄み液（主として再折りたたまれたダイ
マーおよびモノマーを含んでいる）をＡｍｉｃｏｎ　　
ＹＭ−５膜を通す限外濾過により３倍に濃縮し、Ｃ４　
　ＤｙｎａｍａｘＲカラム（３００Å；ｎ−ブチルトリ
クロロシラン樹脂，ＲａｉｎｉｎＩｎｓｔｒ．Ｃｏ．，
Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ，ＮＪ）での逆相高速液体クロマ
トグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。試料は０．１％ト
リフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でカラムに負荷し、０．１％
ＴＦＡ中０−６０％のアセトニトリル濃度勾配で溶出し
た（３ベッド容量）。ＨＰＬＣ精製ＰＤＧＦ−Ｂの最終
収量は約２ｍｇであった（蛋白質の全出発量の０．２％
）。
【００６２】ＰＤＧＦ確認 アミノ酸配列決定 アミノ酸組成分析が精製、再折りたたみＰＤＧＦ−Ｂの
試料およびＧｅｎｚｙｍｅ　　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡから購入された酵母発現組換えヒ
トＰＤＧＦ−Ｂの試料に対して常法を用いて実施された
。 試料は６Ｎ　　ＨＣｌ中１５０℃で１時間Ｗａｔｅｒｓ
　　Ｐｉｃ−Ｔａｇワークステーションで加水分解され
た。 アミノ酸はＯＰＡ−Ｆｍｏｃ化学を用いる前カラム誘導
化およびＯＰＡ誘導体を逆相ＨＰＬＣにより分離させる
ことによるＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ　　Ａｍｉ
ｎｏ　　Ｑｕａｎｔ　　ワークステーションで分析され
た。
【００６３】これらの分析は２つの蛋白質のアミノ酸組
成が実質的に同一であることを示した。精製再折りたた
みＰＤＧＦ−Ｂの分析はまた試料の実際の蛋白質濃度が
Ｂｉｏ−Ｒａｄ比色アッセイで決定された値の正確に２
倍であることを示した。従ってすべての比色による値が
訂正された。
【００６４】標準自動化エドマン分解により、精製、再
折りたたみＰＤＧＦ−Ｂ蛋白質に対しＮ−末端アミノ酸
配列分析が３０サイクル実施された。Ａｐｐｌｉｅｄ　
　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　　モデル４７７Ａ蛋白質シー
クエンサーが使用され、ＰＨＴ−アミノ酸はＡｐｐｌｉ
ｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　　モデル１２０ＡＰＨ
Ｔ分析器により分離された。この分析により得られた配
列データは既知のヒトＰＤＧＦのＮ−末端配列［配列番
号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）：１］と一致していた。 アミノ酸配列分析はまた少量の精製蛋白質が（１０％未
満）付加的Ｎ−末端メチオニン残基を含んでいることも
示した。
【００６５】電気泳動分析 ２００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ２．５中、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ　　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル２７０Ａユニッ
トでＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびキャピラリーゾーン電気泳
動が実施され、精製再折りたたみされたＰＤＧＦ−Ｂは
９０％以上の純度であった。
【００６６】有糸分裂誘発アッセイ グリコシル化されていないＰＤＧＦ−Ｂのヒト線維芽細
胞の有糸分裂誘発が可能かどうかを決定するため、精製
し再折りたたみされた物質の試料およびＧｅｎｚｙｍｅ
　　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ），
Ｂａｃｈｅｍ　　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　　Ｉｎｃ．（
Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）およびＣｏｌｌａｂ
ｏｒａｔｉｖｅ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｉｎｃ．（Ｂ
ｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入された市販の試料の有糸
分裂誘発活性が本質的にＷｉｔｔｅ　　ｅｔａｌ．，［
Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　　Ｒｅｓ．４２：４０２（１
９７８）］により記載されているようにして平行して検
定された。
【００６７】Ｈｓ２７新生児ヒト包皮細胞（ＡＴＣＣ　
　ＣＲＬ　　１６３４）を０．５ｍｌ容量のダルベッコ
改良イーグル培地（ＤＭＥＭ），１０％ウシ胎児血清（
ＦＣＳ），２ｍＭグルタミンおよび１％ストレプトマイ
シン／ペニシリン溶液（１００単位ペニシリンおよび１
００μｇストレプトマイシン／ｍｌ）を含む完全培地中
、ウェル当り３×１０４細胞の密度で２４−ウェル組織
培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した。３７℃にて加湿
した５％ＣＯ２インキュベーター中で一夜インキュベー
ション後、ウェル中の培地を１％ＦＣＳを含む培地に置
きかえ、細胞がコンフルエントになるまでインキュベー
トした。
【００６８】精製物質および市販のＰＤＧＦを連続的に
希釈してウェルに添加し、前記のごとく一夜インキュベ
ーションを実施した。各々のウェルに３Ｈ−チミジン（
３μＣｉ，比活性６．７μＣｉ／ｍＭ：　　Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ）を加え、プレートを３７℃で４時間インキュベ
ートした。このインキュベーションに続いて、吸引によ
り培地を除去し、プレートを２度リン酸緩衝化塩溶液、
２度５％トリクロロ酢酸および１度脱イオン水の順で洗
浄した。各々のウェルに０．２Ｎ　　ＮａＯＨを１ｍｌ
加え、各々のウェルの内容物の１ｍｌを１０ｍｌのＳｃ
ｉｎｔｉｖｅｒｓｅＩＩＲ（Ｆｉｓｈｅｒ　　Ｓｃｉｅ
ｎｔｉｆｉｃ）カクテルを含んでいるシンチレーション
　　バイアルに移し、液体シンチレーション分光計中で
計数した。
【００６９】結果が図２に示されており、同じ濃度の各
種のＰＤＧＦは培養細胞におけるチミジン取り込みにお
いて本質的に類似の増加を与えることが読み取れる。本
発明のグリコシル化されていないＰＤＧＦ−Ｂは少くと
も市販のＰＤＧＦと同じように活性であった。
【００７０】培養線維芽細胞からの１２５Ｉ−ＰＤＧＦ
−Ｂの置換 本発明のＰＤＧＦ−ＢがＰＤＧＦのその細胞受容体への
特異的結合と競合しそれによりその結合を阻害できるか
を決定するために、本質的にＢｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅ　　
ｅｔ　　ａｌ．，［Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ　　１０９：６９（１９８５）］により
記載されているごとき放射リガンド受容体結合アッセイ
を、前記のごとく調製されたＰＤＧＦ−ＢおよびＧｅｎ
ｚｙｍｅ　　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｕｐｓｔａｔｅ
　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｌａｋｅ
　　Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ），Ｂａｃｈｅｍ　　Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅ　　Ｉｎｃ．およびＣｏｌｌａｂｏｒａｔ
ｉｖｅ　　Ｒｅｓｃａｒｃｈ，Ｉｎｃ．から購入された
グリコシル化ＰＤＧＦに対して実施した。
【００７１】ＤＭＥＭ，１０％ＦＣＳ，２ｍＭグルタミ
ンおよび１％ストレプトマイシン／ペニシリン溶液を含
む完全培地中のＨｓ２７線維芽細胞を３×１０４細胞／
ウェルの密度で２４−ウェルの組織培養皿に入れた。加
湿した５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で一夜イン
キュベーション後、ウェル内の培地を０．５％ＦＣＳを
含む培地に置きかえた。細胞はアッセイでの使用に先立
って少くとも４８時間インキュベートされた。
【００７２】細胞が変質の徴候を示す（４日）前に、４
℃にて１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＤＭＥ
Ｍで３回洗浄した。各種のＰＤＧＦを連続的に希釈した
ものを６２ｎＣｉの１２５Ｉ−ＰＤＧＦ−Ｂ（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ；比放射活性約８００Ｃｉ／ｍＭ）と一緒に（
０．２ｍｌの洗浄培地中）ウェルに添加した。かき混ぜ
ながら４℃で２時間インキュベーション後、１％ＢＳＡ
を含むＤＭＥＭで５回洗浄し、１ｍｌの１％トリトンＸ
−１００で可溶化し、ＬＫＢモデル１２７５ガンマカウ
ンターで計数した。
【００７３】結果は図３に示されており、Ｈｓ２７細胞
上の受容体に対する標識ＰＤＧＦの特異的結合の阻害に
おいて本発明のグリコシル化されていないＰＤＧＦ−Ｂ
（白ぬき四角）は他のＰＤＧＦと同じように有効であっ
たことが読みとれる。
【００７４】細胞寄託 大腸菌クローンＤ１６はアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション，ロックビル，マサチューセッツ州に
１９９０年１２月１９日、寄託番号ＡＴＣＣ５５１３２
として寄託された。この寄託は、特許手続上の微生物の
寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定に基づ
いてなされた。
【００７５】当業者には明らかになるであろうごとく、
本発明の精神および範囲から離れることなく、本発明の
多くの改変および変形が可能であろう。本明細書に記載
された特定の実施態様は例示のためだけに与えられたも
のであり、本発明は付随する特許請求の範囲の請求項に
よってのみ制限されるべきである。
【００７６】
【配列表】配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）：１配
列の長さ：１０９アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：線状 分子型：ペプチド 配列 配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）：２配列の長さ：
１５塩基対 配列の型：核酸 鎖状：一本鎖 トポロジー：線状 配列 配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）：３配列の長さ：
３３塩基対 配列の型：核酸 鎖状：一本鎖 トポロジー：線状 配列 配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）：４配列の長さ：
２７塩基対 配列の型：核酸 鎖状：単一鎖 トポロジー：線状 配列 配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）：５配列の長さ：
３３塩基対 配列の型：核酸 鎖状：一本鎖 トポロジー：線状 配列 配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）：６配列の長さ：
２１塩基対 配列の型：核酸 鎖状：一本鎖 トポロジー：線状 配列 配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）：７配列の長さ：
４２塩基対 配列の型：核酸 鎖状：一本鎖 トポロジー：線状 配列 配列番号（ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ）：８配列の長さ：
３２７塩基対 配列の型：核酸 鎖状：二本鎖 トポロジー：線状 配列
【図面の簡単な説明】
【図１】　　プラスミドｐＴａｃＢＩｑを模式的に表示
する図面である。
【図２】　　有糸分裂誘発アッセイの結果を表示するグ
ラフである。そのアッセイにおいては本発明のグリコシ
ル化されていないＰＤＧＦ−Ｂおよび各種の市販ＰＤＧ
Ｆのヒト包皮線維芽細胞におけるＤＮＡ合成を刺激する
能力が試験されている。ＤＮＡへの３Ｈ−チミジンの取
り込みが本発明のＰＤＧＦ−Ｂ（白ぬき四角）およびＢ
ａｃｈｅｍ　　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　　Ｉｎｃ．（白
ぬき丸），Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　　Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ　　Ｉｎｃ．（黒ぬり丸）およびＧｅｎｚｙｍｅ
　　Ｃｏｒｐ．（白ぬき四角）からのＰＤＧＦ−Ｂの濃
度の関数として示されている。
【図３】　　放射リガンド−受容体アッセイの結果を表
示するグラフである。そのアッセイにおいては本発明の
グリコシル化されていないＰＤＧＦ−Ｂおよび各種の市
販ＰＤＧＦのヒト包皮線維芽細胞上の受容体に対する１
２５Ｉ−ＰＤＧＦ−Ｂの特異的結合を阻害する能力が試
験されている。標識ＰＤＧＦ結合の阻害のパーセントが
、本発明のＰＤＧＦ−Ｂ（白ぬき四角）およびＵｐｓｔ
ａｔｅ　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（＋
），Ｂａｃｈｅｍ　　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　　Ｉｎｃ
．（白ぬき丸），Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　　Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（黒ぬり丸）およびＧｅｎｚｙ
ｍｅ　　Ｃｏｒｐ．（白ぬき四角）からのＰＤＧＦ−Ｂ
の濃度の関数として示されている。

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　グリコシル化されていない、生物学的
    に活性な成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂ。
  2. 【請求項２】　　５’から３’へ、Ｔａｃプロモーター
    、Ｉｑ抑制遺伝子および成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂをコード
    しているＤＮＡを含み、大腸菌細菌中で該ＤＮＡの発現
    を指令できる組換えベクター。
  3. 【請求項３】　　５’から３’へ、Ｔａｃプロモーター
    、Ｉｑ抑制遺伝子および成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂをコード
    しているＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換され、
    該ＤＮＡを発現することができる大腸菌細菌。
  4. 【請求項４】　　Ｉｏｎプロテアーゼおよび熱ショック
    制御因子ｈｔｐＲを欠く請求項３に記載の細菌。
  5. 【請求項５】（ａ）　　成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂをコード
    しているＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換された
    Ｉｏｎ−，ｈｔｐＲ−大腸菌細菌をそのようなＤＮＡが
    発現される条件下で培養し；および （ｂ）　　培養物からグリコシル化されていない、生物
    学的に活性な成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂを調製することを含
    む、グリコシル化されていない、生物学的に活性な成熟
    ヒトＰＤＧＦ−Ｂの製造方法。
  6. 【請求項６】（ｉ）　　形質転換された細胞を破壊し；
    （ｉｉ）　　工程（ｉ）の破壊された細胞から封入体分
    画を調製し；（ｉｉｉ）　　約８Ｍ尿素で工程（ｉｉ）
    の封入体分画中のＰＤＧＦ−Ｂを可溶化し；　　（ｉｖ
    ）　　可溶化ＰＤＧＦ−Ｂをスルホン化し；および（ｖ
    ）　　初期濃度約８Ｍの尿素および還元型：酸化型ＧＳ
    Ｈのモル比が約１０：１から６：１の還元型および酸化
    型ＧＳＨを含む混合物中、初期尿素濃度を徐々に１Ｍ未
    満に減少させることにより可溶化、スルホン化ＰＤＧＦ
    −Ｂを再び折りたたむことから成る工程により該ＰＤＧ
    Ｆ−Ｂが調製される、請求項５に記載の方法。
  7. 【請求項７】　　アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
    レクションに寄託番号ＡＴＣＣ５５１３２で寄託された
    大腸菌ＤＡ１６。
  8. 【請求項８】　　グリコシル化されていない生物学的に
    活性な成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂおよび生理学的に受容可能
    な担体を含む医薬組成物。
  9. 【請求項９】　　グリコシル化されていない生物学的に
    活性な成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂと生理学的に受容可能な担
    体を混合することから成る請求項８に記載の医薬組成物
    の製造方法。
  10. 【請求項１０】　　ＰＤＧＦによる処置が可能な健康状
    態の処置のための医薬組成物の製剤のための、グリコシ
    ル化されていない生物学的に活性な成熟ヒトＰＤＧＦ−
    Ｂの使用。
  11. 【請求項１１】　　ＰＤＧＦによる処置が可能な健康状
    態の処置のためのグリコシル化されていない生物学的に
    活性な成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂの使用。
JP4005565A 1991-01-16 1992-01-16 大腸菌における成熟ヒトｐｄｇｆ−ｂの発現 Pending JPH04334399A (ja)

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