JPH04324355A - アミノ酸分析法 - Google Patents

アミノ酸分析法

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JPH04324355A
JPH04324355A JP9396791A JP9396791A JPH04324355A JP H04324355 A JPH04324355 A JP H04324355A JP 9396791 A JP9396791 A JP 9396791A JP 9396791 A JP9396791 A JP 9396791A JP H04324355 A JPH04324355 A JP H04324355A
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JP
Japan
Prior art keywords
proline
amino acid
naclo
concentration
acid
Prior art date
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Pending
Application number
JP9396791A
Other languages
English (en)
Inventor
Hitoshi Iwabuchi
等 岩渕
Yoshimasa Hamano
浜野 吉政
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hitachi Instruments Engineering Co Ltd
Hitachi Ltd
Original Assignee
Hitachi Instruments Engineering Co Ltd
Hitachi Ltd
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Publication date
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  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】アミノ酸分析においてプレラベル
法が最近用いられるようになってきた。これにはプレラ
ベル化を行うにあたり前処理機能付きオートサンプラの
製品化にある。これを利用してアミノ酸をオルトフタル
アルデヒド(以下OPAと略す)にてプレラベル,分離
、そして螢光検出器にて検出しているが、反応試薬濃度
によっては、プロリンが検出されない。反応試薬の一つ
である次亜塩素酸ナトリウムの濃度を変更することによ
りプロリンの検出を可能とし併せて、シスチン,アンモ
ニヤの検出を可能とした。
【0002】
【従来の技術】アミノ酸分析プレラベル法は、G.Al
iqureshi, S.Van den berg 
らが J.Chromatogr.279  83〜8
9(1984)に、用手法によるアミノ酸分析を紹介し
ている。但し、この時はアミノ酸の中でも特定成分のヒ
スチジン(His),3−メチルヒスチジン(3−M−
His),チロシン(Tyr),フェニールアラニン(
Phe)の4成分であった。
【0003】その後の文献ではプロリンの検出はされて
いなかった。また、試みたが検出できなかった(従来ポ
ストラベルOPA法では問題無く検出されている)。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】アミノ酸分析は、ポス
トラベルとプレラベル法の二通りがあるのは前述したが
、前処理付きオートサンプラを用いてアミノ酸をラベル
化することができ、且つ迅速分析ができれば装置構成の
簡略化が図れ蛋白質やペプチド構成のアミノ酸配列を決
定する上で強力な装置となる。
【0005】特にアミノ酸構成成分の一つであるプロリ
ンの検出は重要な要素である。プロリンは二級アミンの
ため次亜塩素酸ナトリウムを用いて一級アミンに酸化し
OPAと反応して検出するが、従来法のポストラベル法
の試薬(1.水酸化ナトリウム、2.次亜塩素酸ナトリ
ウム、3.OPA)をそのまま引用したのでは、プロリ
ンの検出は全くできない。
【0006】ここでは、次亜塩素酸ナトリウム濃度を反
応ビンの中で最適な量にしプロリンの検出を可能にする
分析法の提供を目的とした。
【0007】
【課題を解決するための手段】前処理機能付オートサン
プラを用いて、試料のプレラベル化を行うとき、各反応
試薬、試料(1.水酸化ナトリウム試薬、2.次亜塩素
酸ナトリウム試薬、3.試料、4.OPA試薬、5.1
,2,3,4混合液のpH調整液)の検討を行い、次亜
塩素酸ナトリウム濃度の低いことが判明した。
【0008】ポストラベル法に比較し40〜120倍に
することで解決した。
【0009】
【作用】プロリンを次亜塩素酸ナトリウムで二級アミン
から一級アミンに変換する。
【0010】反応式は
【0011】
【化1】
【0012】となる。
【0013】ポストラベル法の場合は連続的に反応試薬
を送液し続けるため溶出したアミノ酸に対し最適な量と
なっている。
【0014】本法では、反応ビン(バッチ法)の中で行
うため反応試薬の濃度を調整する必要が有り、ポストラ
ベル法に比較し、約40〜120倍加えることで二級ア
ミンから一級アミンに(酸化)変換することができた。
【0015】今回、酸化剤として次亜塩素酸ナトリウム
を用いたが、クロラミンTを用いる方法もある。
【0016】
【実施例】以下、本発明の一実施例を図1〜図4により
説明する。
【0017】図1は、液体クロマトグラフの流路系統図
を示す。1  溶離液,2ポンプ,3  前処理付オー
トサンプラ,4  カラムとカラムオーブン,5  螢
光検出器,6  デ−タ処理装置、となっている。
【0018】図2は、図1の1の前処理付オートサンプ
ラの外観を示す。8は、反応試薬ラックで4個設置する
ことができる。9は試料ラックで、10は反応ラックで
ある。
【0019】プレラベル化の順序として最初に、反応試
薬である0.6N水酸化ナトリウム液を300μl、次
に、3ml/lの次亜塩素酸ナトリウム(10%/水溶
液)溶液300μlと混合する。この時の濃度は図3に
示す濃度変化に対するプロリンの感度を参照としている
【0020】次に試料100μl、ホウ酸とブリッジ−
35の溶液中のOPAを490μlと最終的に分離カラ
ムを保護する目的で0.96N 硫酸/水300μlを
加え最終pHを酸性側にする。各試薬,試料の混合は全
てエアバブリング法を採用している。分離に関しては、
25mMりん酸緩衝液とメチルアルコールの混合比をコ
ントロールして行っている。
【0021】分離カラムは、シリカゲルODSを用い、
検出器に螢光光度計を、測定波長は、励起波長340n
m,螢光波長450nmで行っている。
【0022】図4に得られたクロマトグラムを示す。分
析成分はシスチン(Cys)からリジン(Lys)まで
18成分の分離を示す。
【0023】
【発明の効果】本発明によれば、アミノ酸分析法の一手
段として新しくプレラベルOPA法によってもアミノ酸
18成分の分析が可能となった。且つ、反応試薬の節約
と分析時間の短縮が計れ、従来、蛋白ペプチドの構成ア
ミノ酸分析に長時間要していたものが20分以内で測定
可能となった。装置構成においても大幅に簡略化される
【0024】分析精度向上においても内部標準物質とし
てグルコサミン酸等を入れることにより向上を計ること
ができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明を利用した分析システムの流路系統図で
ある。
【図2】前処理機能付オートサンプラの外観図である。
【図3】プロリンの酸化剤である次亜塩素酸ナトリウム
の濃度がプロリンに対してどのように関与するかを示す
図である。
【図4】アミノ酸分析のクロマトグラムを示す図である
【符号の説明】
1…容離液、2…ポンプ、3…前処理機能付オートサン
プラ、4…分離部、5…螢光検出器、6…データ処理装
置。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】送液系,試料前処理および試料注入系,分
    離系,検出系からなる液体クロマトグラフにおいて、試
    料前処理および注入系にて、アミノ酸に発螢光剤オルト
    フタルアルデヒドを用いて誘導体化後、螢光検出器で検
    出する方法で、二級アミンであるプロリンの検出に際し
    て、一級アミンに酸化する次亜塩素酸ナトリウム(10
    %水溶液)濃度を0.25ml〜15ml/lの範囲に
    することにより検出できることを特徴とするアミノ酸分
    析法。
JP9396791A 1991-04-24 1991-04-24 アミノ酸分析法 Pending JPH04324355A (ja)

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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015049218A (ja) * 2013-09-04 2015-03-16 株式会社島津製作所 液体クロマトグラフによるプレラベルアミノ酸分析法
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CN110095535A (zh) * 2019-04-22 2019-08-06 山东理工职业学院 一种复方氨基酸注射液(5%)中胱氨酸的含量测定方法

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