JPH04308600A - ペプチド合成用反応容器およびペプチド合 成用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ペプチド合成用の反応
容器およびペプチド合成用のキットに係り、特に、固相
法によりペプチドを合成するのに好適なペプチド合成用
反応容器およびペプチド合成用キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】天然ペプチドには、ホルモンに代表され
るように生物活性を有するものが多いため、天然ペプチ
ドの構造確認、類似体合成による構造と機能との関係の
解明、物性研究への材料提供、天然物以上に優れた類似
体の創出等を目的として、ペプチド合成が盛んに行われ
ている。ペプチド合成の方法としては、液相法、固相法
があり、それぞれ逐次延長、フラグメント縮合等の手法
が実施されている。そして固相法によるペプチド合成は
、機械を用いて自動的に行うことが可能であるため、既
に種々の自動合成装置が開発されている。

【０００３】ところで、近年では、天然ペプチド中で生
物活性の発現に関与しているアミノ酸配列の残基数は１
０〜４０程度と以外に短いことが明らかとなっている。 したがって、少なくとも基礎研究段階では、生物活性の
発現に関与する１０〜４０程度のアミノ酸残基数のペプ
チドを合成すればよい。また合成量も、所定の解析がで
きる程度の少量でよく、大量に合成する必要性はない。 固相法に基づく既存のペプチド自動合成装置は、アミノ
酸残基数の少ないペプチドを少量合成することも勿論で
きるが、基礎研究段階で使用する機器としては非常に高
価である。このため多くの研究者の間では、より安価に
目的のペプチドを合成することを目的として、市販の反
応容器やろ過器具を組合わせて、手作業によるペプチド
の固相合成や、工程の一部（例えば振盪工程、排液工程
）を自動化した器具を使用してのペプチドの固相合成が
行われている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、固相法
によるペプチドの合成は操作が煩雑であり、かつ市販の
反応容器は元来ペプチドの固相合成のみを目的として作
られている訳ではないため、既存の反応容器を用いて、
手作業や工程の一部を自動化した固相法によりペプチド
の合成を行った場合には、所望量の目的ペプチドを効率
よく合成することが非常に困難であるという難点があっ
た。

【０００５】したがって本発明の第１の目的は、手作業
や工程の一部を自動化した固相合成法によりアミノ酸残
基数の少ないペプチドを固相合成した場合でも、基礎研
究段階で必要となる所望量の目的ペプチドを効率よく合
成することが可能なペプチド合成用反応容器を提供する
ことにある。また本発明の第２の目的は、手作業や工程
の一部を自動化した固相合成法によっても、基礎研究段
階で必要となるアミノ酸残基数の少ない所望量の目的ペ
プチドを効率よく合成することが可能なペプチド合成用
キットを提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】上記第１の目的を達成す
る本発明のペプチド合成用反応容器は、内径が１５〜２
５ｍｍで長さが１００〜３６ｍｍの円筒状側壁部と、こ
の円筒状側壁部の一端に連接された平板状または漏斗状
の底部と、この底部に一方の端を開口させて設けられた
排液用管部と、前記底部に連接して前記排液用管部を取
囲む位置に設けられた雌ネジ状の配管係止部とを少なく
とも有することを特徴とするものである。

【０００７】また、上記第２の目的を達成する本発明の
ペプチド合成用キットは、本発明のペプチド合成用反応
容器と、カルボキシル基が樹脂粒と化学結合し前記カル
ボキシル基以外の反応基が保護基により保護されてなる
１種または複数種のＣ末端用アミノ酸樹脂と、カルボキ
シル基以外の反応基が保護基により保護されてなる１種
または複数種の縮合用アミノ酸と、前記Ｃ末端用アミノ
酸樹脂のアミノ基および前記縮合用アミノ酸のアミノ基
に結合している保護基をそれぞれ離脱させる脱保護剤と
、この脱保護剤によりアミノ基に結合していた前記保護
基が離脱した後の前記Ｃ末端用アミノ酸樹脂または前記
脱保護剤によりアミノ基に結合していた前記保護基が離
脱した後の前記縮合用アミノ酸とカルボキシル基以外の
反応基が保護基により保護されてなる前記縮合用アミノ
酸とを縮合させる縮合剤と、前記縮合剤による縮合の成
否をカイザーテストにより確認する縮合反応モニタリン
グ試薬と、前記Ｃ末端用アミノ酸樹脂のカルボキシル基
とこのカルボキシル基と化学結合している樹脂粒との結
合を化学的に切断する切断用試薬と、Ｎ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミドおよび／またはＮ−メチルピロリドンとを
少なくとも備えたものである。

【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。まず、本
発明のペプチド合成用反応容器について説明する。この
反応容器においては、円筒状側壁部の内径が１５〜２５
ｍｍで長さが１００〜３６ｍｍである点に最も特徴があ
る。 ここで、円筒状側壁部の内径および長さを前述の範囲に
限定する理由は、以下の通りである。すなわち、基礎研
究段階で必要な量のペプチドを固相法により合成する場
合のＣ末端用アミノ酸樹脂の使用量は０．３〜１．０ｇ
（アミノ基が保護されているアミノ酸の量ａ：０．１〜
１．０ｍｍｏｌ　）、縮合用アミノ酸および縮合用試薬
の使用量は、それぞれａの２．５〜４倍ｍｏｌ　が適当
であり、反応容器に一度に入れるＣ末端用アミノ酸樹脂
、縮合用アミノ酸、試薬および溶媒等の総量は、最も多
量となる縮合工程でも１０〜１６ｍｌ、概ね１４ｍｌ前
後である。そして、縮合工程における反応液の液量を１
４ｍｌとし、回転数が３６０〜４００ｒ．ｐ．ｍ　の旋
回撹拌方式の振盪器を用いてジペプチドを合成した場合
には、図５に示すように、例えば反応容器の直径（内径
）を１５〜２５ｍｍ程度とすることにより、目的のジペ
プチドを８５％程度以上の高収率で得ることができる。 したがって、本発明のペプチド合成用反応容器において
は、円筒状側壁部の内径を１５〜２５ｍｍに限定する。

【０００９】また、縮合工程では反応液を振盪させるた
め、反応容器は、反応液の液面が容器の高さの８分目程
度となるだけの高さを有していることが好ましい。例え
ば、内径が１５ｍｍの中空円柱状容器に１４ｍｌの反応
液を入れたときの液深は約７９ｍｍであり、この液面が
容器の高さの８分目であるとすると、容器の高さは約９
９ｍｍである。また、内径が２５ｍｍの中空円柱状容器
に１４ｍｌの反応液を入れたときの液深は約２９ｍｍで
あり、この液面が容器の高さの８分目であるとすると、
容器の高さは約３６ｍｍである。そして、反応容器内の
溶媒や未反応の試薬を排出することを考えた場合、この
反応容器の下部に排液管部を設けておき、この排液管部
の流入口の上方には、溶媒や未反応の試薬の排出に伴っ
て樹脂粒が排出されないように、予め目皿等を設けてお
くことが好ましい。ここで、目皿が予め設けられた反応
容器に反応液を入れた場合、反応液の液面は、目皿が設
けられていない場合に比べて、目皿の体積分だけ上方に
移行する。そして、この目皿は反応容器に内接する外径
を有し、その厚さは０．５〜３．５ｍｍであることが好
ましい。したがって本発明のペプチド合成用反応容器に
おいては、目皿および１４ｍｌの反応液を入れたときの
液面が容器の高さの概ね８分目となるように、円筒状側
壁部の長さを１００〜３６ｍｍに限定する。なお、円筒
状側壁部における内径と長さの特に好ましい比率は、１
：３〜１：５である。

【００１０】本発明のペプチド合成用反応容器は、当然
のことながら底部を有しているが、この底部は平板状で
あっても漏斗状であってもよい。底部の形状を漏斗状と
することにより、このペプチド合成用反応容器の製造が
簡易化する。また、本発明のペプチド合成用反応容器に
は、溶媒や未反応の試薬の排出の便を計るために、排液
用管部を設けている。この排液用管部の一方の端は、底
部に開口している。さらに、溶媒や未反応の試薬を排出
するにあたって吸引ポンプやルアーコック等が容易に使
用できるように、本発明のペプチド合成用反応容器には
、底部に連接して雌ネジ状の配管係止部を設けている。 この雌ネジ状の配管係止部は、上述した排液用管部を取
囲む位置にある。

【００１１】また、本発明のペプチド合成用反応容器に
は、前述のように、予め目皿が設けられていることが好
ましい。この目皿は特に限定されるものではなく、ガラ
ス、ポリプロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、テトラフ
ルオロエチレン樹脂、またはジフルオロエチレン樹脂等
を材料とする公知の目皿を使用することができる。

【００１２】さらに、本発明のペプチド合成用反応容器
は、横断面の外径がペプチド合成用反応容器における円
筒状側壁部の内径と同等以上である中空円柱状または中
密円柱状の挿入部と、この挿入部に連接された把持部と
を有する上キャップ、および、ペプチド合成用反応容器
における排液用管部の外径と同等以上の内径を有し、か
つ一方の端部に長径が配管係止部の外径と同等以上で内
径が排液用管部の外径と同等以上の楕円状つばを有する
円筒状の挿入部と、この挿入部において前記楕円状つば
が設けられた側とは反対側の端部に連接された把持部と
を有する下キャップを具備していることが好ましい。

【００１３】上キャップにおける把持部の形状は特に限
定されるものではない。また、下キャップにおける把持
部の形状も特に限定されるものではないが、この下キャ
ップにおける楕円状つばは、挿入部が雌ネジ状の配管係
止部に捩じ込まれるように雄ネジのネジ山の役割を果た
すものであるため、把持部の横断面形状は、挿入部を捩
じ込みやすい形状、例えば矩形、正方形または円形であ
ることが好ましい。上キャップおよび下キャップを樹脂
のように可撓性の比較的高い物質で作ることにより、各
キャップの挿入部の外径がそれぞれ反応容器の内径や配
管係止部の内径より若干大きくても、各キャップを挿入
することができ、かつこの場合には気密性も向上する。 このような上キャップおよび下キャップを具備すること
により、例えば全工程を手動で行う際の各操作（例えば
試薬の注入や振盪）や、合成後のペプチドの保管がし易
くなる。

【００１４】本発明のペプチド合成用反応容器を用いて
のペプチドの固相合成は、常法により行うことができる
が、反応液等の振盪は回転数が３６０〜４００ｒ．ｐ．
ｍ　の旋回撹拌方式の振盪器を用いて行うことが特に好
ましい。また反応液等の排出は、ルアーコックを配管係
止部に係止させて、または吸引ポンプと連通した配管を
配管係止部に係止させて、ルアーコックまたは吸引ポン
プを用いて行うことが好ましい。

【００１５】次に、本発明のペプチド合成用キットにつ
いて説明する。本発明のペプチド合成用キットは、前述
したように、少なくとも下記■〜■の構成品からなる。 ■上述した本発明のペプチド合成用反応容器。■カルボ
キシル基が樹脂粒と化学結合し前記カルボキシル基以外
の反応基が保護基により保護されてなる１種または複数
種のＣ末端用アミノ酸樹脂。■カルボキシル基以外の反
応基が保護基により保護されてなる１種または複数種の
縮合用アミノ酸。■アミノ基に結合している保護基をこ
のアミノ基から離脱させる脱保護剤。■脱保護剤により
アミノ基に結合していた保護基が離脱した後のＣ末端用
アミノ酸樹脂または脱保護剤によりアミノ基に結合して
いた保護基が離脱した後の縮合用アミノ酸と、カルボキ
シル基以外の反応基が保護基により保護されてなる縮合
用アミノ酸とを縮合させる縮合剤。■縮合の成否をカイ
ザーテストにより確認する縮合反応モニタリング試薬。 ■Ｃ末端用アミノ酸樹脂のカルボキシル基とこのカルボ
キシル基と化学結合いている樹脂粒との結合を化学的に
切断する切断用試薬。■Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
および／またはＮ−メチルピロリドン。

【００１６】ここで、上記■のＣ末端用アミノ酸樹脂に
おいてカルボキシル基と化学結合している樹脂粒とは、
固相法によりペプチドを合成する際に通常使用される、
不溶性の高分子担体を意味する。具体例としては、ポリ
スチレン−１〜２％ジビニルベンゼンコポリマー、ポリ
アクリルアミド樹脂等からなる樹脂粒（粒径２００〜４
００メッシュ）にｐ−アルコキシベンジルアルコール基
、アミノメチル基、ベンズヒドリルアミン基、ヒドロキ
シメチル基、４−ヒドロキシメチルベンゾイルオキシメ
チル基、クロロメチル基、４−メチルベンゾヒドリルア
ミン基、２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコ
ール基等の反応基を導入してなるものが挙げられる。

【００１７】また、Ｃ末端用アミノ酸樹脂においてカル
ボキシル基以外の反応基を保護する保護基のうちでアミ
ノ基を保護する保護基としては、９−フルオレニルメチ
ルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）、ｔ−ブトキシカ
ルボニル基（Ｂｏｃ基）、カルボベンゾキシ基、ｐ−メ
トキシベンジルオキシカルボニル基、３−ニトロ−２−
ピリジンスルフェニル基等が挙げられる。側鎖を保護す
る保護基としては４−メトキシ−２，３，６−トリメチ
ルベンゼンスルホニル基、ｐ−トルエンスルホニル基、
ｔ−ブチルエステル基、ベンジル基、アセトアミドメチ
ル基、ｔ−ブチル基、ｔ−チオブチル基、Ｂｏｃ基、Ｆ
ｍｏｃ基、カルボベンゾキシ基、２，２，５，７，８−
ペンタメチルクロマン−６−スルホニル基、アダマンチ
ル基、トリチル基、２−ブロム−カルボベンゾキシ基、
メジチレン−２−スルホニル基、ｐ−メチルベンジル基
、ホルミル基、２−クロル−カルボベンゾキシ基、ジメ
トキシベンズヒドリル基、ベンジルオキシメチル基、３
−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル基等が挙げられる
。側鎖を保護する保護基は、アミノ酸の種類に応じて適
宜選択される。

【００１８】本発明のペプチド合成用キットは、このよ
うにしてなるＣ末端用アミノ酸樹脂の１種または複数種
を備えている。Ｃ末端用アミノ酸樹脂の種類は、目的ペ
プチドの種類等に応じて適宜選択される。なお、Ｃ末端
用アミノ酸樹脂におけるアミノ酸の導入量は、０．１〜
１ｍｍｏｌ　／ｇで充分である。

【００１９】縮合用アミノ酸は、カルボキシル基が樹脂
粒と化学結合していない点を除けば、上述したＣ末端用
アミノ酸樹脂と同様である。本発明のペプチド合成用キ
ットは、このような縮合用アミノ酸の１種または複数種
を備えており、その種類は目的ペプチドのアミノ酸配列
等に応じて適宜選択される。

【００２０】脱保護剤としては、アミノ基に結合してい
る保護基に応じて種々のものが知られているが、本発明
のペプチド合成用キットにおいては、アミノ基にＦｍｏ
ｃ基が結合しているＣ末端用アミノ酸樹脂および縮合用
アミノ酸（アミノ基にＦｍｏｃ基が結合しているアミノ
酸を、以下、Ｆｍｏｃ−アミノ酸という）に対しては、
２０　ｍｏｌ％ピペリジン／ＤＭＦ溶液（ＤＭＦ：Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド）またはＮ−メチルピロリド
ンを少なくとも備えている。２０　ｍｏｌ％ピペリジン
／ＤＭＦ溶液とＮ−メチルピロリドンとは、アミノ酸の
種類に応じて使い分けられるものである。また、アミノ
基にＢｏｃ基が結合しているアミノ酸に対しては、トリ
フルオロメタンスルホン酸、４Ｎ塩化水素ジオキサン溶
液、４Ｎ塩化水素酢酸エチル溶液、または２５％臭化水
素酢酸溶液を少なくとも備えている。これらの脱保護剤
も、アミノ酸の種類に応じて使い分けられるものである
。

【００２１】縮合剤としても種々のものが知られている
が、本発明のペプチド合成用キットは、Ｎ−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）およびＮ，Ｎ′−ジイ
ソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＩ）を少なくとも
備えている。縮合反応モニタリング試薬としては、カイ
ザーテスト試薬中のニンヒドリン／エタノール溶液、フ
ェノール／エタノール混液、および青酸カリウム／ピリ
ジン溶液を備えている。

【００２２】切断用試薬としても種々のものが知られて
いるが、本発明のペプチド合成用キットは、目的とする
ペプチドの種類（使用するアミノ酸の種類）に応じて、
下記（１）　〜（４）　のいずれかの組合わせの試薬を
少なくとも１組備えている。 （１）　トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ＴＦＡとフェノ
ールとの９５／５（容量比）混液およびエチルエーテル
（無水物）。 （２）　ｍ−クレゾール、エタンジチオール、チオアニ
ソール、ＴＦＡ、およびトリフルオロシリルブロマイド
。 （３）　ｍ−クレゾール、エタンジチオール、チオアニ
ソール、ＴＦＡ、およびトリメチルシリルフルオライド
。 （４）　ｍ−クレゾール、エタンジチオール、チオアニ
ソール、ＴＦＡ、およびトリメチルシリルメタンスルホ
ネート。

【００２３】さらに、本発明のペプチド合成用キットは
、ＤＭＦおよび／またはＮ−メチルピロリドンを備えて
いる。ＤＭＦおよびＮメチルピロリドンは、Ｃ末端用ア
ミノ酸樹脂等の洗浄、脱保護後のＣ末端用アミノ酸樹脂
等の洗浄、ペプチド縮合の溶媒等として、使用するアミ
ノ酸の種類に応じて使い分けられるものである。

【００２４】このようにしてなる本発明のペプチド合成
用キットを用いてのペプチドの固相合成は、常法に基づ
いて行うことができる。

【００２５】

【実施例】

実施例１（ペプチド合成用反応容器） 図１は、本発明のペプチド合成用反応容器の一例を示す
縦断面図である。このペプチド合成用反応容器１はポリ
プロピレン製であり、内径Ｄ１　が１７．３ｍｍで長さ
Ｌ１　が７５ｍｍの円筒状側壁部２を有している。この
円筒状側壁部２の一方の解放端側内壁にはガラス製目皿
（図中には仮想線で記載）３を保持するための目皿保持
部４が設けられており、この目皿保持部４の内径Ｄ２　
は１７．０ｍｍ、長さＬ２　は３．５ｍｍである。そし
て、円筒状側壁部２の目皿保持部４が設けられた側の一
端には、漏斗状の底部５が連接されている。底部５の中
央部には、内径が１ｍｍで排液端側の外径が４．０ｍｍ
で長さＬ３　が７ｍｍの排液用管部６の一端が開口して
おり、排液用管部６は底部５に連接されている。また、
この排液用管部６は、内径（最大径）Ｄ３　が７．３ｍ
ｍの雌ネジ状の配管係止部７により取囲まれており、こ
の配管係止部７も底部５に連接されている。

【００２６】このようにしてなるペプチド合成用反応容
器１を用いてのペプチドの固相合成は、常法により行う
ことができる。

【００２７】なお、本発明のペプチド合成用反応容器は
、図１に示したものに限定されるものではなく、種々の
変形例や応用例を含む。例えば、図１に示したペプチド
合成用反応容器１の円筒状側壁部２の内径Ｄ１　は１７
．３ｍｍ、長さＬ１　は７５ｍｍであるが、本発明のペ
プチド合成用反応容器における円筒状側壁部の内径は１
５〜２５ｍｍの範囲内で適宜選択可能であり、かつその
長さも、ガラス製目皿および１４ｍｌの反応液を入れた
ときの液面が容器の高さの概ね８分目となるように、内
径に応じて１００〜３６ｍｍの範囲内で適宜選択可能で
ある。この円筒状側壁部の一端に連接される底部の形状
も漏斗状に限定されるものではなく、例えば平板状であ
ってもよい。そして、この底部に一方の端を開口させて
設けられる排液用管部６の内径および長さＬ３　も特に
限定されるものではなく、適宜変更可能である。また、
本発明のペプチド合成用反応容器は、予めガラス、ポリ
プロピレン樹脂、ポリエチレン樹脂、テトラフルオロエ
チレン樹脂、またはジフルオロエチレン樹脂等を材料と
する目皿を備えていてもよい。この目皿は、円筒状側壁
部における底部側の壁面に内接して置けられていること
が好ましい。さらに、本発明のペプチド合成用反応容器
は上キャップおよび下キャップを備えていることが好ま
しい。

【００２８】上キャップは、横断面の外径がペプチド合
成用反応容器における円筒状側壁部の内径と同等以上で
ある中空円柱状または中密円柱状の挿入部と、この挿入
部に連接された把持部とを有していることが望ましい。 図１に示したペプチド合成用反応容器１に具備される上
キャップとしては、例えば図２に示す上キャップが例示
される。図２に示した上キャップ１０はポリプロピレン
製であり、外径ｄ１　が１７．５ｍｍで長さｌ１　が６
ｍｍの中空円柱状の挿入部１１と、外径ｄ２　が１９．
３ｍｍで長さｌ２　が１０ｍｍの円筒状の把持部１２と
を有している。そして挿入部１１の外周には、密封度を
高めるために３条の凸部１３が設けられている。また把
持部１２の外周には、把持しやすいように線状の溝１４
が複数本設けられている。

【００２９】また、下キャップは、ペプチド合成用反応
容器における排液用管部の外径と同等以上の内径を有し
、かつ一方の端部に長径が配管係止部の外径と同等以上
で内径が排液用管部の外径と同等以上の楕円状つばを有
する円筒状の挿入部と、この挿入部において前記楕円状
つばが設けられた側とは反対側の端部に連接された把持
部とを有していることが好ましい。図１に示したペプチ
ド合成用反応容器１に具備される下キャップとしては、
例えば図３（Ａ）〜（Ｃ）示す下キャップが例示される
。図３（Ａ）［挿入端側から見た上面図］、図３（Ｂ）
［縦断面図］および図３（Ｃ）［底面図］に示した下キ
ャップ２０もポリプロピレン製であり、挿入端側の内径
ｄ３　が４．２ｍｍで他端側の内径ｄ４　が４．０ｍｍ
で長さｌ３　が８ｍｍの挿入部２１を有している。そし
て、この挿入部２１の挿入端側の端部には、長径ｄ４　
が７．３ｍｍで短径ｄ５　が６．６ｍｍの楕円状つば２
２が設けられている。この楕円状つば２２は、挿入部２
１がペプチド合成用反応容器１における雌ネジ状の配管
係止部７に捩じ込まれるように雄ネジのネジ山の役割を
果たすものである。また、挿入部２１の前記他端側には
、底面が一辺７ｍｍ（＝ｌ５　）の正方形で高さｈが６
ｍｍの中密角柱状の把持部２３が連接されている。

【００３０】このような上キャップ１０および下キャッ
プ２０を具備することにより、例えば全工程を手動で行
う際の各操作（例えば試薬の注入や振盪）や、合成後の
ペプチドの保管がし易くなる。なお、ペプチド合成用反
応容器や上キャップおよび下キャップの材質はポリプロ
ピレンに限定されるものではなく、ポリエチレン樹脂、
テトラフルオロエチレン樹脂、ジフルオロエチレン樹脂
等であってもよい。

【００３１】実施例２（ペプチド合成用キット）（１）
キット 下記の構成品からなるペプチド合成用キットを製造した
。 ・ペプチド合成用反応容器…実施例１のペプチド合成用
反応容器と同形の反応容器内にガラス製目皿を予め設け
たもの；１個。 ・Ｃ末端用アミノ酸樹脂…Ｆｍｏｃ−アラニン（Ａｌａ
　）のカルボキシル基が、ｐ−アルコキシベンジルアル
コール基を導入したポリスチレン−１％ジビニルベンゼ
ンコポリマー（粒径２００〜４００メッシュ）により保
護されてなるもの；０．５ｇ（Ｆｍｏｃアミノ酸の導入
量０．３ｍｍｏｌ　／０．５ｇ）。

【００３２】・縮合用アミノ酸…Ｆｍｏｃ−フェニルア
ラニン（Ｐｈｅ　）；１ｍｍｏｌ　。 Ｆｍｏｃ−リジン（Ｌｙｓ　。ただし、側鎖がＢｏｃ基
により保護されているもの）；１ｍｍｏｌ　×３個。

【００３３】Ｆｍｏｃ−グルタミン酸（Ｇｌｕ　。ただ
し、側鎖がｔ−ブチルエステル基により保護されている
もの）；１ｍｍｏｌ　×２個。 Ｆｍｏｃ−アルギニン（Ａｒｇ　。ただし、側鎖が４−
メトシキ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル
基により保護されているもの）；１ｍｍｏｌ　。 Ｆｍｏｃ−グルタミン（Ｇｌｎ　）；１ｍｍｏｌ　。 Ｆｍｏｃ−トレオニン（Ｔｈｒ　。ただし、側鎖がｔ−
ブチル基により保護されているもの）；１ｍｍｏｌ　。 Ｆｍｏｃ−アスパラギン（Ａｓｎ　）；１ｍｍｏｌ　。 Ｆｍｏｃ−チロシン（Ｔｈｒ　。ただし、側鎖がｔ−ブ
チル基により保護されているもの）；１ｍｍｏｌ　。 Ｆｍｏｃ−イソロイシン（Ｉｌｅ　）；１ｍｍｏｌ　×
２個。 Ｆｍｏｃ−プロリン（Ｐｒｏ　）；１ｍｍｏｌ　。 Ｆｍｏｃ−バリン（Ｖａｌ　）；１ｍｍｏｌ　。 Ｆｍｏｃ−グリシン（Ｇｌｙ　）；１ｍｍｏｌ　。

【００３４】・脱保護剤…２０　ｍｏｌ％ピペリジン／
ＤＭＦ溶液；２００ｍｌ。 ・縮合剤…ＨＯＢｔ；３０ｍｌ。 ＤＩＰＣＩ；３０ｍｌ。 ・縮合反応モニタリング試薬…ニンヒドリン／エタノー
ル溶液；１０ｍｌ。 フェノール／エタノール混液；１０ｍｌ。 青酸カリウム／ピリジン溶液；２５ｍｌ。 ・切断用試薬…ＴＦＡ；４０ｍｌ。 …ＴＦＡとフェノールとの９５／５混液；１０ｍｌ。 …エチルエーテル（無水物）；４５０ｇ。 ・ＤＭＦ；５００ｍｌ。 ・メタノール；５００ｍｌ。

【００３５】（２）ペプチド合成用キットを用いてのペ
プチドの固相合成 まず、Ｃ末端用アミノ酸樹脂の樹脂粒上に、下記アミノ
酸配列Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙ
ｓ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ
−Ａｒｇ−ＧＬｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｌａのペプチド
を下記１．〜６．の手順に沿って合成した。

【００３６】１．洗浄工程（１） ０．５ｇのＣ末端用アミノ酸樹脂と６ｍｌのＤＭＦとを
ペプチド合成用反応容器に入れて、Ｃ末端用アミノ酸樹
脂を３回洗浄する。１回の洗浄は、１分間振盪すること
により行い、１回の洗浄が終わる度にＤＭＦをろ過する
。 なお振盪は、旋回撹拌方式の振盪器を用いて３６０〜４
００ｒ．ｐ．ｍ　で行った（以下、同じ）。

【００３７】２．脱保護工程 ６ｍｌの２０　ｍｏｌ％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を入れ
、３分間の振盪を２回繰り返した後、６ｍｌの２０　ｍ
ｏｌ％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を入れて２０分間振盪す
ることにより、脱保護を行う。なお、２０　ｍｏｌ％ピ
ペリジン／ＤＭＦ溶液は１回の振盪が終わる度にろ過す
る。

【００３８】３．洗浄工程（２） ６ｍｌのＤＭＦを入れて６回洗浄する。１回の洗浄は、
１分間振盪することにより行い、１回の洗浄が終わる度
にＤＭＦをろ過する。なお、６回の洗浄が終了した後、
樹脂粒を２０粒程小試験管に取っておく。これらの樹脂
粒は、縮合反応の成否の確認のときにブランクテストと
して使用する。

【００３９】４．縮合工程 まず、縮合させるべき１種の縮合用アミノ酸とＨＯＢｔ
と６ｍｌのＤＭＦとを入れて１分間振盪し、次いで、ろ
過はせずにＤＩＰＣＩを加えて１〜２時間振盪する。こ
の後、反応容器内の液体をろ過する。このとき使用する
縮合用アミノ酸、ＨＯＢｔおよびＤＩＰＣＩの量は、Ｃ
末端用アミノ酸樹脂におけるＦｍｏｃ−アミノ酸の含量
の２．５倍モルとする。この場合、反応容器に一度に入
れる反応液（樹脂粒も含める）の最大量は約１４ｍｌと
なる。

【００４０】５．縮合の成否の確認 まず、縮合工程を終えた樹脂粒約２０粒を小試験管にと
り、メタノールを加えて振盪し、振盪後の上澄をデカン
テーションにより除く。この操作を２〜３回繰り返した
後、縮合反応モニタリング試薬（計３種）を２〜３滴ず
つ加えて１００℃で数分間加熱する。加熱後、樹脂粒と
反応液を観察し、常法により縮合の成否を判定する。こ
のとき、洗浄工程（２）の終了時に取っておいた樹脂粒
に対しても同様の操作を行って、ブランクテストとする
。なお、縮合が不十分の場合は、縮合工程の反応時間を
延長するか、洗浄工程（２）と縮合工程を再度繰り返す
。

【００４１】６．アミノ酸配列の延長 Ｃ末端用アミノ酸樹脂に代えて５．で得られたペプチド
用いて上記１．〜５．の操作を必要回数繰り返して、目
的ペプチドを合成する。このとき、目的ペプチドのアミ
ノ酸配列に応じて、縮合工程で用いる縮合用アミノ酸の
種類を適宜選択する。

【００４２】次に、下記イ．およびロ．の手順にそって
、合成したペプチドを乾燥した。 イ．前記６．の操作終了後、前述した１．および２．の
操作を行ってＮ末端アミノ酸のアミノ基に結合している
保護基（Ｆｍｏｃ基）を除去した後、メタノールまたは
ジクロルメタンで３回洗浄する。１回の洗浄は、１分間
振盪することにより行う。 ロ．樹脂粒が入ったままのペプチド合成用反応容器を五
酸化リンの入ったデシケータ中で減圧乾燥することによ
り、合成したペプチドを乾燥する。

【００４３】この後、下記７ａ．〜７ｅ．の手順に沿っ
て、ペプチドの切り出しおよび精製（切断工程）を行っ
た。

【００４４】７．切断工程 ａ．合成したペプチドが結合したままの樹脂粒を５０〜
１００ｍｌのナスフラスコに移し変え、ＴＦＡ−フェノ
ール（９５／５）混液５ｍｌを加えて１時間撹拌した後
、使用したＴＦＡ−フェノール（９５／５）混液をろ過
する。ＴＦＡ−フェノール（９５／５）混液を加えての
撹拌およびろ過は２度行う。 ｂ．合成したペプチドが結合したままの樹脂粒をＴＦＡ
　　５ｍｌで洗浄する。洗浄は３回行う。 ｃ．上記７ａ．および７ｂ．のろ液を同一フラスコに集
め、エポレーターによりＴＦＡを減圧留去する。 ｄ．１〜２ｍｌにまで濃縮した後、エチルエーテル（無
水物）を加えてペプチドを固体として析出させ、この固
体をろ過または遠心分離により集めて、エチルエーテル
（無水物）で数回洗浄する。 ｅ．集めた固体を減圧乾燥した後、イオン交換クロマト
グラフィー、ゲルクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣに
より精製する。

【００４５】前述したペプチド合成、乾燥、上述したペ
プチドの切り出しおよび精製の結果、８０％以上の純度
で前記アミノ酸配列のペプチド３０ｍｇを得た。なお、
ペプチドの精製は、下記条件 カラム：μ−ボンドアスフェー５Ｃ１８−１００Ａ（商
品名、ウォーターズ社製。３．９×１５０ｍｍ）溶離液
：ＣＨ３　ＣＮの０．１％ＴＦＡ溶液［リニア・グラジ
エント：０〜７０％（３０分）］ 流　　速：１．０ｍｌ／分 検出波長：２１０ｎｍ のＨＰＬＣにより行った。

【００４６】なお、本発明のペプチド合成用キットは、
前述した構成品からなるキットに限定されるものではな
く、種々の変形例および応用例を含むものである。例え
ば、切断工程７ａ．で使用する試薬の組合わせは実施例
のものに限定されるものではなく、合成するペプチドの
種類に応じて、例えば、ｍ−クレゾールとエタンジチオ
ールとチオアニソールとＴＦＡとトリフルオロシリルブ
ロマイドとの組合わせ、ｍ−クレゾールとエタンジチオ
ールとチオアニソールとＴＦＡとトリメチルシリルフル
オライドとの組合わせ、ｍ−クレゾールとエタンジチオ
ールとチオアニソールとＴＦＡとトリメチルシリルメタ
ンスルホネートとの組合わせ等により、実施例と同等な
いしそれ以上の収率で目的ペプチドを得ることができる
。

【００４７】

【発明の効果】以上説明したように、本発明のペプチド
合成用反応容器またはペプチド合成用キットを用いるこ
とにより、手作業や工程の一部を自動化した固相合成法
によりアミノ酸残基数の少ないペプチドを固相合成した
場合でも、基礎研究段階で必要となる所望量の目的ペプ
チドを効率よく合成することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】は本発明のペプチド合成用反応容器の一例を示
す縦断面図である。

【図２】は本発明のペプチド合成用反応容器に具備され
る上キャップの一例を示す一部切欠き側面図である。

【図３】は本発明のペプチド合成用反応容器に具備され
る下キャップの一例を示す上面図［（Ａ）］、縦断面［
（Ｂ）］および底面図［（Ｃ）］である。

【図４】ペプチド合成用反応容器の内径と得られるジペ
プチドの収率との関係を示すブラフである。

【符号の説明】

１　　ペプチド合成用反応容器 ２　　円筒状側壁部 ３　　ガラス製目皿 ５　　底部 ６　　排液管部 ７　　配管係止部 １０　　上キャップ １１　　挿入部 １２　　把持部 ２０　　下キャップ ２１　　挿入部 ２２　　楕円状つば ２３　　把持部

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　内径が１５〜２５ｍｍで長さが１００
   〜３６ｍｍの円筒状側壁部と、この円筒状側壁部の一端
   に連接された平板状または漏斗状の底部と、この底部に
   一方の端を開口させて設けられた排液用管部と、前記底
   部に連接して前記排液用管部を取囲む位置に設けられた
   雌ネジ状の配管係止部とを少なくとも有することを特徴
   とするペプチド合成用反応容器。
2. 【請求項２】　　円筒状側壁部における底部側の壁面に
   内接して配置された目皿を備えた、請求項１に記載のペ
   プチド合成用反応容器。
3. 【請求項３】　　横断面の外径がペプチド合成用反応容
   器における円筒状側壁部の内径と同等以上である中空円
   柱状または中密円柱状の挿入部と、この挿入部に連接さ
   れた把持部とを有する上キャップと、ペプチド合成用反
   応容器における排液用管部の外径と同等以上の内径を有
   し、かつ一方の端部に長径が配管係止部の外径と同等以
   上で内径が排液用管部の外径と同等以上の楕円状つばを
   有する円筒状の挿入部と、この挿入部において前記楕円
   状つばが設けられた側とは反対側の端部に連接された把
   持部とを有する下キャップとを具備した、請求項１また
   は請求項２に記載のペプチド合成用反応容器。
4. 【請求項４】　　請求項１〜請求項３のいずれか１項に
   記載したペプチド合成用反応容器と、カルボキシル基が
   樹脂粒と化学結合し前記カルボキシル基以外の反応基が
   保護基により保護されてなる１種または複数種のＣ末端
   用アミノ酸樹脂と、カルボキシル基以外の反応基が保護
   基により保護されてなる１種または複数種の縮合用アミ
   ノ酸と、前記Ｃ末端用アミノ酸樹脂のアミノ基および前
   記縮合用アミノ酸のアミノ基に結合している保護基をそ
   れぞれ離脱させる脱保護剤と、この脱保護剤によりアミ
   ノ基に結合していた前記保護基が離脱した後の前記Ｃ末
   端用アミノ酸樹脂または前記脱保護剤によりアミノ基に
   結合していた前記保護基が離脱した後の前記縮合用アミ
   ノ酸とカルボキシル基以外の反応基が保護基により保護
   されてなる前記縮合用アミノ酸とを縮合させる縮合剤と
   、前記縮合剤による縮合の成否をカイザーテストにより
   確認する縮合反応モニタリング試薬と、前記Ｃ末端用ア
   ミノ酸樹脂のカルボキシル基とこのカルボキシル基と化
   学結合している樹脂粒との結合を化学的に切断する切断
   用試薬と、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよび／また
   はＮ−メチルピロリドンとを少なくとも備えた、ペプチ
   ド合成用キット。