JPH04287700A - Ｄｎａプローブへのニトロフェニル誘導体リガンドの化学付着に有用な新規標識試薬 - Google Patents

Ｄｎａプローブへのニトロフェニル誘導体リガンドの化学付着に有用な新規標識試薬

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JPH04287700A
JPH04287700A JP3293264A JP29326491A JPH04287700A JP H04287700 A JPH04287700 A JP H04287700A JP 3293264 A JP3293264 A JP 3293264A JP 29326491 A JP29326491 A JP 29326491A JP H04287700 A JPH04287700 A JP H04287700A
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dna
chromosome
dinitrophenyl
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reagent
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Kenneth A Cruickshank
ケネス・アレキサンダー・クリュックシャンク
Douglas J Taron
ダグラス・ジェームズ・タロン
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BP Corp North America Inc
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡの標識方法および
化合物に関する。本発明はまた、種々の染色体−特異的
プロ−ブの多様性のハイブリダイゼ−ションによって染
色体または染色体領域の検出および同定に関する。より
詳細には、本発明は、本質的に細胞内の自然な染色体構
造を残し、種々の染色体間、同一染色体の種々の部分間
、または染色体とその他の細胞構造との間の物理的関係
を維持するように調製された破壊細胞からの染色体と、
これら染色体特異的プロ−ブとの　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハ
イブリダイゼ−ションに関する。
【０００２】
【従来の技術】ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼ−ショ
ンは当業者に周知であり、染色体または染色体領域の検
出について種々の応用例がある。これらの応用例には限
定的ではなく、胎児期における診断、遺伝子マッピング
、体細胞ハイブリダイゼ−ションおよび悪性腫瘍および
その他の疾病の特異的染色体遺伝子マ−カ−の検出を含
む。ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼ−ションは、染色
体標的ＤＮＡ配列と、ハイブリダイゼ−ション後に種々
の物理的または化学的手段によって検出可能となるよう
に修飾されたプロ−ブ配列との間で達成される。標的染
色体ＤＮＡの調製は、染色体及び細胞構造の破壊が最少
量で、プロ−ブとのハイブリダイゼ−ションがなされる
ように達成される。染色体標的ＤＮＡの調製法は当業者
に周知である。 （ＧａｌｌおよびＰａｒｄｕｅのＰｒｏｃ．　Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　６４：６００（１９６９
），ＪｏｈｎらのＮａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２２３
：５８２（１９６９），Ｒｕｄｋｉｎ　　および　　Ｓ
ｔｏｌｌｅｒのＮａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２６５：
４７２（１９７７）を参照）　　ＤＮＡおよびＲＮＡか
ら成る多種のハイブリダイゼ−ションプロ−ブが当業者
に周知である。
【０００３】ＧａｌｌおよびＰａｒｄｕｅ（同上）は、
ランプブラシ染色体上の特異的配列の検出用にトリチウ
ム−含有ヌクレオチド標識相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）プ
ロ−ブの使用を開示している。
【０００４】ＭａｎｕｅｌｉｄｉｓらはＪ．Ｃｅｌｌ　
Ｂｉｏｌ．９５：６１９−６２５（１９８２）で、標識
マウスサテライト−特異的ＤＮＡプロ−ブとハイブリダ
イズ後のマウス染色体中のマウスサテライトＤＮＡ配列
の検出を開示している。
【０００５】Ｈｏｐｍａｎらは、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　８５：１−４（１９８６）で標識全ヒトＤＮ
Ａでハイブリダイゼ−ション後にマウス中のヒト染色体
：ヒト体細胞雑種の検出、およびクロ−ン化マウスサテ
ライトＤＮＡ配列でハイブリダイゼ−ションした後のマ
ウス染色体の検出を開示している。
【０００６】Ｌａｎｄｅｇｅｎｔら、Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ
ｔ　７３：３５４−３５７（１９８６）はクロ−ンゲノ
ムＤＮＡプロ−ブとハイブリダイゼ−ションの後、ヒト
染色体４の特異的部分の検出を開示し、これは遺伝子的
にハンチントン症の遺伝子と連結された。
【０００７】ｖａｎ　ＤｅｋｋｅｎおよびＢａｕｍａｎ
は、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ，．Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ．４
８：１８８−９（１９８８）で動原体およびテロメアで
見いだされる繰り返し配列に特異的な蛍光的に標識した
クロ−ンプロ−ブでハイブリダイゼ−ション後にヒト染
色体１の検出を開示している。
【０００８】Ｅｍｍｅｒｉｃｈらは、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ
　Ｒｅｓ．１８１：１２６−１４０（１９８９）で縦に
繰り返されたヒトＤＮＡへのクロ−ンプロ−ブでハイブ
リダイゼ−ション後にヒト染色体１および１５の特異的
検出を開示している。
【０００９】Ｐｉｅｔｅｒｓらは、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ
．Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｔ．５３：１５−１９（１９９０
）で標識染色体−特異的プロ−ブでハイブリダイゼ−シ
ョン後に個々の精子細胞中にヒト染色体の検出を開示し
ている。
【００１０】ｖａｎ　Ｄｅｋｋｅｎらは、Ｃｙｔｏｍｅ
ｔｒｙ　１１：１５３−１６４（１９９０）で染色体−
特異的標識ＤＮＡプロ−ブでハイブリダイゼ−ション後
に正常ヒト血液細胞中の間期および中期核中の染色体１
およびＹをフロ−サイトメトリ−による検出を開示して
いる。
【００１１】ＫｉｅｖｉｔｓらはＣｙｔｏｍｅｔｒｙ　
１１：１０５−１０９（１９９０）で、マウス：ヒト体
細胞雑種の標識全ゲノムＤＮＡでのハイブリダイゼ−シ
ョン、ならびに非標識全ヒトゲノムＤＮＡで標識ＤＮＡ
を前処理した後に、ヒトリンパ球調製物中の特異的な染
色体または染色体部分の検出を開示している。
【００１２】ＤＮＡおよびＲＮＡプロ−ブの標識法は当
業者に周知である。これらの方法は、修飾塩基の酵素的
結合、修飾塩基を含有するプロ−ブの化学合成および塩
基の直接修飾法を含む。修飾法は、標識またはハプテン
を加えることに関するヌクレオチドの誘導化および標識
またはハプテンの直接添加を含む。典型的な方法として
は、３Ｈ，１４Ｃ，３５Ｓ，３２Ｐおよび１２５Ｉなど
の放射性同位元素の取り込みを含む。個別の不安定性お
よび放射活性標識を取り込んだプロ−ブの対応する有効
期限の短さは、健康上および廃棄処理との関連と同様に
、プロ−ブＤＮＡおよびＲＮＡの標識に関して、多くの
非放射性化合物の適用を促進した。
【００１３】米国特許第４，８３３，２５１号では直接
的および合成的なＤＮＡプロ−ブの誘導方法を開示して
おり、ＤＮＡの誘導化をＮ［４］（アミノ置換）シトシ
ンとして開示している。この誘導化は、誘導化ヌクレオ
チドをＤＮＡに合成的および酵素的に取り込むか、また
は固相化学によるものである。誘導化はまた、当業者に
周知な技術を使用して、原核生物ゲノムから、および有
核生物内でクロ−ン化されたＤＮＡから調製された一本
鎖ＤＮＡの直接誘導化によっても開示される。
【００１４】米国特許第４，６２６，５０１号は、ＤＮ
ＡおよびＲＮＡ配列のアデノシンおよびシトシン残基の
それぞれのＮ−６およびＮ−４の窒素部位で、化合物３
−（４−ブロモ−３−オキソブタン　　１−スルホニル
）−プロピオン酸をこれらの塩基に結合させることによ
る誘導化を開示する。
【００１５】ＢａｕｍａｎらはＥｘｐ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅ
ｓ．１２８：４８５−４９０（１９８０）で、過ヨウ素
酸ナトリウムで処理した後、蛍光化合物を直接ＲＮＡ分
子の３’水酸化部分への化学結合を開示する。
【００１６】Ｔｃｈｅｎらは、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：３４６６−３４７０（
１９８４）で一本鎖ならびに二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ
の特にグアノシンヌクレオチドに、ハプテン２−アセチ
ルアミノフルオレンを加えることを開示する。
【００１７】ＤｒａｐｅｒはＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ
　Ｒｅｓ．　１２：９８９−１００２（１９８４）で、
重亜硫酸−触媒アミノ基転移によるポリヌクレオチドの
誘導化を開示し、蛍光化合物であるニトロベンゾフラザ
ンで誘導化ポリヌクレオチドの標識化を開示する。
【００１８】ＤＮＡの標識化に２，４−ジニトロフェニ
ル標識の使用は従来よく知られている。
【００１９】米国特許４，９４８，８８２号は、ジアミ
ノアルキルリンカ−ア−ムを介してＤＮＰ標識に結合し
たデオキシヌクレオチド三リン酸を使用してニックトラ
ンスレ−ションにより調製したＤＮＰ−標識ＤＮＡプロ
−ブの使用を開示する。
【００２０】米国特許４，８９８，９５１号は、光活性
のあるＤＮＰ誘導体でＤＮＡの直接標識化を開示する。
【００２１】米国特許４，８７６，３９５号は、ポリ−
リジン結合基を介してＤＮＰを使用して５’末端水酸基
で合成オリゴヌクレオチドプロ−ブの標識化を開示する
。
【００２２】米国特許４，８４９，３３６号は、直鎖ま
たは枝状鎖炭化水素基を介してＤＮＰを使用して５’末
端水酸基で合成オリゴヌクレオチドプロ−ブの標識化を
開示する。
【００２３】米国特許４，８３３，２５１号は、ジアミ
ノアルキルリンカ−ア−ムを介してＤＮＰ標識に結合し
たデオキシヌクレオチド三リン酸を使用したニックトラ
ンスレ−ションにて、特にシトシン残基を標識して調製
されたＤＮＰ−標識ＤＮＡプロ−ブの使用を開示する。
【００２４】米国特許４，６２６，５０１号は、３−（
４−ブロモ−３−オキソブタン−１−スルホニル）−プ
ルピオン酸　　Ｎ−ヒドロオキシサクシイミドエステル
であるリンカ−ア−ムを介してＤＮＰ−リジンでＤＮＡ
プロ−ブの標識化を開示する。
【００２５】Ｈｏｐｍａｎらは、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
ｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：６４７１−６４８８（１９８６
）で標識水銀結合ＤＮＡへのトリニトロフェニル−リジ
ン−Ｂ−メルカプトエタノ−ルリガンドの使用を開示す
る。
【００２６】Ｍｏｒｉｕｃｈｉらは、Ｎｕｃｌｅｉｃ　
Ａｃｄｓ　Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．　Ｓｅｒ．１９：７７−
８０（１９８８）で、２，４−ジニトロベンズアルデヒ
ドをアルカリ条件で反応させ、ＤＮＡの末端標識化を開
示する。
【００２７】Ｋｅｌｌｅｒ　らはＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．１７０：４４１−４５０（１９８８）で６−（２
，４−ジニトロフェニルアミノ）−１−アミノヘキサン
で臭素化ＤＮＡの標識化を開示する。
【００２８】Ｋｅｌｌｅｒ　らはＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．１７７；３９２−３９５（１９８９）で、ＤＮＰ
の光活性誘導体である６，−（２，４−ジニトロフェニ
ルアミノ）−１−アミノヘキシル−６’−（４’−アジ
ド−２’−ニトロフェニルアミノ）ヘキサネ−トでアル
カリ−ニックＤＮＡの標識化を開示する。
【００２９】Ｓｉｎｇｈらは，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉ
ｄｓ　Ｒｅｓ．１８：３３３９−３３４５（１９８０）
でω−ＤＮＰ−アルキル−アミノ−標識オリゴヌクレオ
チドの調製を開示する。
【００３０】多くの公知方法が非−放射的標識プロ−ブ
の検出のために開発された。これらの方法は、蛍光標識
化合物の直接的検出を含み、間接的方法としては、その
後に直接または間接的に検出されるレ−ポ−タ−分子（
ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の結合に依存す
る。これらのレポ−タ−に基づく方法は免疫的手法を含
み、それでは抗体が標的：プロ−ブハイブリッド分子自
体、またはプロ−ブを誘導化したハプテンを認識する。 親和性による方法はプロ−ブを誘導化したハプテンへの
特異的相互作用に基づく。これらのレポ−タ−分子の検
出は、蛍光標識の付着、後にその基質を検出可能な生産
物に酵素的に転換する酵素との組み合わせ、または金、
鉄または銀のような電子密度の高い原子との組み合わせ
、ならびに視覚または電子顕微鏡によって達成された。
【００３１】ＲｕｄｋｉｎおよびＳｔｏｌｌｅｒは、Ｎ
ａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１７：４７２−４７３で
ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに対する蛍光標識抗体を使
用して　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼ−ションの検
出を開示する。
【００３２】Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓらは、Ｊ．Ｃｅｌｌ
　Ｂｉｏｌ．９５：６１９−６２５（１９８２）で、　
ビオチン化マウスサテライトＤＮＡプロ−ブでのｉｎ　
ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼ−ションを検出するために、
蛍光的標識抗体の使用を開示する。
【００３３】Ｌａｎｄｅｇｅｎｔらは、Ｈｕｍ．Ｇｅｎ
ｅｔ．７３−３５４−３５７（１９８６）でハンチント
ン症遺伝子用に、２−アセチルアミノフルオレン−結合
コスミドプロ−ブの　ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼ−
ションを検出するために、西洋ワサビパ−オキシダ−ゼ
−結合抗体の使用を開示する。
【００３４】Ｈｏｐｍａｎらは、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ
ｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４：６４７１−６４８８（１９８６
）で、　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイズ水銀化プロ−
ブＤＮＡの検出のために、トリニトロフェニル　　ハプ
テン誘導化スルフヒドリルリンカ−分子の使用を開示す
る。
【００３５】Ｍｏｒｉｕｃｈｉら（同上）は、ｃ−ｍｙ
ｃおよびＴ−細胞レセプタ−Ｂ鎖遺伝子発現、ならびに
ヒト成人Ｔ−細胞白血病細胞中のＨＴＬＶ−１による感
染の　ｉｎ　ｓｉｔｕ検出に直接ＤＮＰ−標識ｃＤＮＡ
プロ−ブの使用を開示する。
【００３６】Ｋｅｌｌｅｒら（同上）は、６，−（２，
４−ジニトロフェニルアミノ）−１アミノヘキサンで標
識したＤＮＡを使用して、ニトロセルロ−スに固定化さ
れた肝炎ウイルス配列の検出を開示する。
【００３７】Ｋｅｌｌｅｒら（同上）は、６，−（２，
４−ジニトロフェニルアミノ）−１−アミノヘキシル−
６’−（４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ）
ヘキサノエ−トでＤＮＡプロ−ブを標識して、ニトロセ
ルロ−スに固定化されたヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ
）を検出するための使用を開示する。
【００３８】Ｌｉｃｈｔｅｒらは、（同上）ＤＮＰ−標
識ｄＵＴＰでのニックトランスレ−ションでジニトロフ
ェニル（ＤＮＰ）を標識したコスミドクロ−ンを使用し
、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼ−ションを開示する。
【００３９】
【発明が解決しようとする課題】従来の技術には、核酸
プロ−ブの標識化及び誘導化に関する種々の酵素的及び
化学的方法の例がある。そのようなプロ−ブは、数多く
の直接的および間接的な検出系で検出される。特に、従
来の技術にはジニトロフェニルでＤＮＡを標識し、この
標識ＤＮＡを免疫的手段で検出する例がある。しかし従
来技術にはＤＮＰの使用に関して数多くの実験的制限が
見い出され、それはＤＮＰ−標識ＤＮＡの溶解性の制限
およびＤＮＰ−標識ＤＮＡの直接的および内部的検出感
度の減少である。本発明は、１から３個のニトロ基で置
換されたフェニル置換体からなる多標識でＤＮＡを標識
化する方法および化合物に関し、該標識がそれらにアミ
ノ酸結合基の手段によって共有結合している。これらの
標識ＤＮＡの合成化試薬および方法によって、従来知ら
れていたニトロ基置換フェニル標識の使用に伴う制限を
克服する。これらの試薬は染色体および染色体領域のｉ
ｎ　ｓｉｔｕ検出を可能にする。ニトロ基置換フェニル
標識は、染色体の染色体領域または他の標的に結合し、
免疫的技術で便利に検出できる。
【００４０】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、１．１
から３個のニトロ基で置換されたフェニル置換体からな
る多標識でＤＮＡを標識化する方法および化合物に関し
、該標識がそれらにアミノ酸結合基の手段によって共有
結合している２．染色体および染色体領域のｉｎ　ｓｉ
ｔｕ検出用の試薬　　３．そのような試薬の調製法　　
４．染色体および染色体領域のｉｎ　ｓｉｔｕ検出用の
試薬の使用方法、を提供する。
【００４１】本発明は、抗原性標識をＤＮＡに共有的に
結合させる方法、および化合物ならびに抗原−標識ＤＮ
Ａを提供する。ここで標識の抗原性部分はニトロ置換フ
ェニルであり、ＤＮＡに共有結合している。共有結合の
性質は、アミノ酸結合基の手段による。本発明の目的に
関し、アミノ酸結合基は式Ｉの化合物からなるように定
義される：ここでＲ１およびＲ２は独立に水素またはア
ルキルまたはアリ−ル置換基であり、好ましくは水素で
あり、ｎ＝１−６ある。好ましいリンカ−ア−ム（ｌｉ
ｎｋｅｒ　ａｒｍ）は、単純な低級アルキルアミノ酸で
あり（ここでＲ１およびＲ２は水素）、限定的ではなく
、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸およびカプ
ロン酸誘導体、天然および合成Ｌ−アミノ酸、およびそ
れらの重合体および共重合体を含む。最も好ましい標識
は、ε−アミノ−ｎ−カプロン酸およびグリシルグリシ
ルグリシンの２，４−ジニトロフェニル誘導体である。
【００４２】本発明は、検出すべき核酸に相補的な１以
上のＤＮＡからなる核酸配列の　ｉｎ　ｓｉｔｕ検出用
の試薬を提供する。ここでＤＮＡ配列は１から３個のニ
トロ基で置換されたフェニルからなる多標識を含み、該
標識は、それらにアミノ酸結合基の手段によって共有結
合している。好ましい標識はε−アミノ−ｎ−カプロン
酸およびグリシルグリシルグリシンの２，４−ジニトロ
フェニル誘導体である。
【００４３】本発明は、ハイブリダイズしていないＤＮ
Ａ配列からなる染色体または染色体の領域をｉｎ　ｓｉ
ｔｕ検出する試薬を含む。ハイブリダイズしていないＤ
ＮＡ配列は、検出すべき該染色体または染色体領域と種
々の部分に関する本来的相補的核酸配列、ならびにアノ
ミ基転移された多数のシトシン塩基を有し、多くのアミ
ノ基転移シトシン塩基は共有結合したニトロ基置換フェ
ニル標識を有し、該ニトロ基置換フェニル標識を有する
シトシン塩基数は試薬が検出すべき染色体または染色体
配列群とに関して特異的結合性を保持する間、免疫的技
術によって検出するに十分である。
【００４４】本発明はまた、染色体の　ｉｎ　ｓｉｔｕ
　検出用の試薬調製法であって： （ａ）　　検出すべき染色体および染色体領域に相補的
なＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡを破壊して断片とし、
（ｂ）　　該ＤＮＡ断片をアミノ基転移し、そして（ｃ
）　　ニトロ基置換フェニル標識をアミノ基転移ＤＮＡ
にアミノ酸結合基の手段によって共有結合する、試薬調
製法を含む。
【００４５】より詳細には、本発明は染色体および染色
体領域の　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼ−ション用
の試薬調製法であって （ａ）　　検出すべき染色体および染色体領域に関して
本来相補的な塩基配列を有するハイブリダイズしないＤ
ＮＡ配列に含まれる多数のシトシン塩基をアミノ基転移
し：そして （ｂ）　　１から３個のニトロ基で置換されたフェニル
置換体から成る多数の標識を少なくともアミノ基転移し
たシトシン塩基部分に共有結合して（該標識は、アミノ
酸結合基の手段によって共有結合している）、共有結合
しているニトロ基置換フェニル標識を有するシトシン塩
基部分は、試薬が検出すべき染色体および染色体領域に
関して特異的結合性を有する間、検出できるニトロ基置
換フェニル信号を産生するに十分である、試薬調製法を
含む。
【００４６】加えて本発明は、染色体および染色体領域
の　ｉｎ　ｓｉｔｕ　検出法であって、（ａ）　　過剰
量のブロッキングＤＮＡを本発明の試薬にハイブリダイ
ゼ−ション条件下で加えて試薬中の非特異的結合ＤＮＡ
に結合させ、これによってブロックされた試薬を形成し
、 （ｂ）　　検出すべき染色体および染色体領域にハイブ
リダイズする条件下でブロックされた試薬を接触させ、
（ｃ）　　検出すべき染色体および染色体領域へのブロ
ック試薬の結合を免疫技術で検出する、 ｉｎ　ｓｉｔｕ　検出法を提供することを目的とする。
【００４７】本発明のさらなる目的はニトロ基置換フェ
ニル標識で共有的に標識されたＤＮＡを試薬として提供
することである。本発明の特別な目的は、染色体または
染色体領域の　ｉｎ　ｓｉｔｕ　検出用の試薬を提供す
ることである（ここで試薬は、検出すべき染色体または
染色体領域と種々の部分に相補的な多ＤＮＡ配列を含有
する）。試薬中の多ＤＮＡ配列は、１から３個のニトロ
基で置換されたフェニル置換基、好ましくはアミノ酸結
合基の手段によってＤＮＡに共有結合している２，４−
ジニトロフェニル標識を含む。これらのニトロ−置換フ
ェニル、好ましくは２，４−ジニトロフェニル標識は目
的として検出する染色体および染色体領域とハイブリダ
イズするＤＮＡを免疫的技術で検出することを可能とす
る。このニトロ−置換フェニル、好ましくは２，４−ジ
ニトロフェニル標識は、ＤＮＡ配列を構成する任意のア
デノシン、グアノシン、シトシンおよびチミジン塩基に
共有結合されている。好ましい態様ではニトロ−置換フ
ェニル、好ましくは２，４−ジニトロフェニル標識は、
ＤＮＡ配列中の数多くのアミノ基転移シトシン塩基に共
有結合されている。ニトロ−置換フェニル、好ましくは
２，４−ジニトロフェニル標識を有するアミノ基転移シ
トシン塩基の数は、免疫的技術で検出されるに十分なニ
トロ−置換フェニル、好ましくは２，４−ジニトロフェ
ニル標識の量であり、一方同時にＤＮＡ配列の性質は目
的とする染色体および染色体領域に対する結合性を本来
的に保持する。
【００４８】本発明のさらに特別な目的は、　染色体お
よび染色体領域の　ｉｎ　ｓｉｔｕ　検出用の試薬調整
法を提供することである。好ましい方法の第一工程は、
ファ−ジ染色体ライブラリ−由来のプラスミドＤＮＡを
破壊して断片とする。これらのＤＮＡ断片はアミノ基転
移され、１から３個のニトロ基で置換されたフェニル基
から成る多標識の官能基性誘導体であって、好ましくは
２，４−ジニトロフェニルであり、アミノ酸結合基の手
段によってその後アミノ基転移ＤＮＡ断片に共有的に結
合する。本発明では、試薬が検出する染色体および染色
体領域に対して特異的結合性を本質的に保持する間、ニ
トロ−置換フェニル、好ましくは２，４−ジニトロフェ
ニル標識が共有結合するアミノ基転移シトシン塩基の数
は、免疫的に検出できる量のニトロ−置換フェニル、好
ましくは２，４−ジニトロフェニルを生成するのに十分
である。
【００４９】本発明のさらに特別な目的は、染色体およ
び染色体領域の　ｉｎｓｉｔｕ　検出用の方法を提供す
ることである。一般的に好ましい方法は、本発明の試薬
を検出すべき染色体および染色体領域とハイブリダイゼ
−ションの条件下で接触させて行う。加えて本発の目的
は、ニトロ−置換フェニル、好ましくは２，４−ジニト
ロフェニルで共有的に標識されたＤＮＡ配列に相補的な
任意の核酸の検出方法を提供するとである。ニトロ−置
換フェニル、好ましくは２，４−ジニトロフェニルは蛍
光または酵素標識抗体のようなレポ−タ−分子を任意の
プロ−ブ−標的複合体に導入することをを可能とする。 標的は染色体ＤＮＡでよいが、メッセンジャ−またはリ
ボゾ−ムＲＮＡのようなＲＮＡ：ミトコンドリアＤＮＡ
のような染色体外ＤＮＡ：バクテリアまたウイルスなど
の原核生物ＤＮＡも加えられる。ＤＮＡプロ−ブアッセ
イには　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼ−ション、液
相ハイブリダイゼ−ション、固相に固定化された核酸の
ハイブリダイゼ−ション、任意の多くのトランスファ−
媒体（限定的にではなく、ニトロセルロ−ス、ナイロン
、およびその他周知の合成誘導体を含む）に固定化され
た核酸またはタンパク質をブロットしてハイブリダイズ
する方法を含むことができる。 ニトロ−置換フェニル、好ましくは２，４−ジニトロフ
ェニルの存在は、免疫的技術によって検出される。ニト
ロ−置換フェニル標識は、増加できた抗体に対するハプ
テンである。例えば抗−ジニトロフェニル抗体は、標的
染色体に結合した試薬の２，４−ジニトロフェニル部分
と反応する。抗−ジニトロフェニル抗体と特異的に反応
する第２抗体を、酵素または蛍光マ−カ−で標識して、
その後抗−ジニトロフェニル抗体に結合して間接的に２
，４−ジニトロフェニルを含有するＤＮＡの染色体への
結合を測定する。免疫的技術の当業者は２，４−ジニト
ロフェニルのようなハプテンの存在を免疫的に測定する
数多くの免疫的測定を認識している。
【００５０】好ましい態様では、過剰のブロッキングＤ
ＮＡをハイブリダイゼ−ション条件下で試薬に加える。 このブロッキングＤＮＡは、試薬中の任意の非特異的結
合ＤＮＡと結合し、これによってブロッキング試薬が形
成される。このブロックされた試薬は、その後目的とす
る染色体または染色体領域とハイブリダイゼ−ション条
件下で接触する。
【００５１】本発明は、１から３個のニトロ基で置換さ
れたフェニル基から成る１以上の標識を有するＤＮＡか
ら成る試薬を付加的に含み、ＤＮＡはそれらにアミノ酸
結合基の手段によって結合しており、ここでニトロ基置
換フェニル標識は免疫技術によって検出でき、該ＤＮＡ
は結合性を保持する。
【００５２】本発明はまた６−Ｎ−（２，４−ジニトロ
フェニル）カプロン酸−Ｏ−（Ｎ−ヒドロキシサクシイ
ミジル−３−スルホン酸）エステルである化合物を含む
。
【００５３】本発明はまたＮ−（２，４−ジニトロフェ
ニル）グリシルグリシルグリシン−Ｏ−（Ｎ−ヒドロキ
シサクシイミジル−３−スルホン酸）エステルである化
合物を含む。
【００５４】本発明はまた検出する核酸に相補的な１以
上のＤＮＡ配列から成る核酸配列のｉｎ　ｓｉｔｕ　検
出用の試薬を含み、ここでＤＮＡ配列はＤＮＡにε−ア
ミノ−ｎ−カプロン酸およびグリシルグリシルグリシン
の活性化誘導体の手段によって共有結合したジニトロフ
ェニル多標識を含む。
【００５５】本発明はまたＤＮＡの標識試薬の調整法で
あって； （ａ）　　共有結合を形成するように、アミノ酸結合基
を１から３個のニトロ基で置換されたフェニル基から成
る標識と反応させ； （ｂ）　　生成した標識−リンカ−化合物をエステル化
によって３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシサクシイミドと活
性化し； （ｃ）　　活性化した標識−リンカ−化合物をアミノ基
転移されたＤＮＡに共有結合する、 調製法を含む。
【００５６】好ましい態様においては、サンガ−試薬（
Ｓａｎｇｅｒ’ｓＲｅａｇｅｎｔ）（２，４−ジニトロ
フルオロベンゼン）をε−アミノ−ｎ−カプロン酸と反
応させて、６−（２，４−ジニトロアミノ）カプロン酸
を形成する。 この化合物をその後３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシサクシ
イミドと反応させエステル化することにより活性化エス
テルを形成する。この活性化エステルはその後アミノ基
転移ＤＮＡを標識するために使用される。もうひとつの
好ましい態様としては、トリペプチドであるグリシルグ
リシルグリシンのアミノ末端をサンガ−試薬と反応させ
て（２，４−ジニトロアミノ）−グリシルグリシルグリ
シンを形成する。この化合物はその後３−スルホ−Ｎ−
ヒドロキシサクシイミドと反応させてエステル化し、活
性化エステルを形成する。この活性化エステルはその後
アミノ基転移ＤＮＡの標識に使用される。
【００５７】本発明のさらなる目的および好ましい態様
については、以下の好敵な実施例および請求の範囲で吟
味される。
【００５８】
【実施例】本発明は１から３個のニトロ基で置換された
フェニル基から成る標識がアミノ酸結合基の手段によっ
て共有結合しているＤＮＡ標識化の方法および化合物、
ならびに染色体または染色体領域の　ｉｎ　ｓｉｔｕ　
同定用の試薬および方法を包含する。本発明は、検出す
べき染色体または染色体領域の種々の部分で相補的であ
るＤＮＡ配列の多様性から成る試薬を発明し、ここでＤ
ＮＡ配列は多部位でアミノ化され、アミノ化された部位
でアミノ酸結合基の官能性誘導体の共有結合手段によっ
てニトロ置換フェニル標識で標識される。
【００５９】本発明で使用されるＤＮＡの起源は，限定
的ではなく、当業者に周知な方法で調製された特別な染
色体またはライブラリ−から単離されたようなＤＮＡで
ある。ＤＮＡが単離される個々の染色体は、例えば微生
物細胞または体細胞雑種のフロ−サイトメトリ−、また
は個々の間期または中期細胞からの直接単離など任意の
いかなる標準的方法でも調製できる。もうひとつのこの
ようなＤＮＡの起源としては特定の染色体ライブラリ−
があり、標準的な技術で調製され、当業者に公知な起源
から入手できる。例えば、アメリカンタイプカルチャ−
コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔ
ｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：ＡＴＣＣ）またはヒト
または他のクロ−ン化ゲノム物質の他の保存機関からで
ある。ＡＴＣＣから多くのライブラリ−が入手でき、代
表的なライブラリ−は、
【００６０】
【００６１】
【００６２】このＡＴＣＣ寄託物はメリ−ランド州、ロ
ックビル、パ−クラウンドライブ１２３０１（１２３０
１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ，　Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）　のアメリカンタイプカルチャ
−コレクションから入手できる。本発明では、当業者に
周知である任意の多くの酵素的手段によって、これらの
ＤＮＡ配列をｉｎ　ｖｉｔｒｏで合成もできることを考
察する。”ヒト染色体−特異的ＤＮＡライブラリ−　（
Ｈｕｍａｎ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
　ＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）”Ｂｉｏｔｈｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ　４；５３７（１９８６）　　という題名の
文献も参考にされたい、それにはヒト染色体ライブラリ
−の調製法が記載されている。本発明で使用されるＤＮ
Ａはこれらの起源から当業者に周知な方法で調製される
。このＤＮＡはその後、任意の多くの物理的、化学的お
よび酵素処理手段（限定的にではなく、超音波、ＤＮａ
ｓｅＩ限定消化、マングビ−ン（ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ）
ヌクレア−ゼ限定消化および細いゲイジ針を通してＤＮ
Ａを分けることなどを含む）によって種々の大きさの断
片の均一な混合物に縮小される。生成したＤＮＡ断片混
合物は長さが１００−５００塩基対の範囲（ｂｐｓ）で
あるが、断片の好ましい平均長は約３００ｂｐｓである
。これらの手段は検出すべき染色体の種々の部分に相補
的である多数のＤＮＡ配列を提供する。事実、染色体Ｄ
ＮＡの種々の部分に相補的なＤＮＡ配列が、１万までは
ないとしても数千提供される。
【００６３】ＤＮＡ断片は当業者に周知である任意の多
くの化学的手段によって誘導化され、好ましくはヌクレ
オチド塩基シトシンの第４炭素原子アミノ基（Ｃ−４）
アミノ基転移による。誘導化によって塩基のＣ−４位に
種々のジアミン化合物が付加されるであろう。そのよう
な化合物としては限定的ではなく、例えばエチレンジア
ミン、アミノ酸、ペプチド、エ−テル誘導体またはその
他の有機または無機結合分子のような、２から１０個の
炭素原子を有するヒドラジンおよびアルキレンジアミン
が含まれる。５−２５％のシトシン残基を含有するＤＮ
Ａ断片を、２０％の至適アミノ基転移率でアミノ基転移
する。全ヌクレオチドの約３−６％の残基が，全塩基ア
ミノ基に対する至適転移率５％でアミノ基転移された。
【００６４】アミノ基転移されたＤＮＡ配列を、任意の
数の標識（該標識は、１から３個のニトロ基で置換され
たフェニルから成る）とアミノ酸結合基の手段（これは
アミノ基転移したＤＮＡ配列と共有結合を形成できる官
能基を有する）によって共有結合する。アミノ基転移さ
れたＤＮＡ配列をジニトルフェニル（ＤＮＰ）で標識す
るために使用できる好ましい化合物は６−Ｎ−（２，４
−ジニトロフェニル）カプロン酸−Ｏ−（Ｎ−ヒドロキ
シサクシイミジル−３−スルホン酸塩）エステルである
。アミノ基転移されたＤＮＡは１００−２００倍、好ま
しくは約１５０倍過剰量の官能化ＤＮＰ化合物と反応す
る。６０−８０％のアミノ基転移部位が標識され、好ま
しいのは２，４−ジニトロフェニル標識である。
【００６５】１から３個のニトロ基が共有結合して置換
されたフェニル基から成る、アミノ酸結合基の手段によ
る多標識で標識されたＤＮＡ配列は標的染色体への　ｉ
ｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼ−ションに使用される。本
発明の目的に関して、”ｉｎ　ｓｉｔｕ”とは、染色体
の実質的な破壊または染色体同士の再配置無く、染色体
がニトロ基置換フェニル、好ましくは２，４−ジニトロ
フェニル−標識ＤＮＡプロ−ブへの接近を維持し、染色
体が細胞核から晒されることを意味する。このハイブリ
ダイゼ−ションの標的には、限定的にではなく、間期ま
たは減数分裂または有糸分裂の任意の時期の正常、疾患
または悪性のヒト、他の動物または植物細胞中の染色体
または染色体領域、ならびに生存または死組織、器官ま
たは体液の抽出または誘導物である染色体または染色体
領域；精子および卵子を含む生殖細胞、種子、花粉また
は接合子、胚、絨毛性または羊膜性細胞または他の発生
体由来の細胞；長期または短期培養由来の　ｉｎ　ｖｉ
ｔｒｏ　成長細胞および正常または不滅化または形質転
換細胞；異なる型の細胞またはこれらの細胞の分化段階
での異種間または同種間雑種；当業者に任意の種々の手
段によって単離された、個々の染色体または染色体領域
、またはその他の再配置、削除または損傷を受けた染色
体（当業者に周知な手段によってクロ−ン化し原核また
は他のクロ−ニングベクタ−内で増殖した、または　ｉ
ｎｖｉｔｒｏ　増幅した、そのような染色体ライブラリ
−を含む）；または限定的にではなく、精液、血液、髪
または他の試料のような法医学的物質；を含む。
【００６６】ハイブリダイゼ−ションに先立ち、標識Ｄ
ＮＡ配列を対応する過剰の非標識ＤＮＡ、または非標識
ＤＮＡの再結合分画と反応させ、試料中の非特異的結合
ＤＮＡと結合させて、この非特異的ＤＮＡのブロッキン
グによってブロッキング試薬を提供する。このブロッキ
ングＤＮＡは全ゲノムＤＮＡ１０マイクロリットル当た
り１−１０マイクログラム濃度で使用され、このましい
範囲はハイブリダイズした染色体に応じて、１０マイク
ロリットル当たり２．２５から６．７５マイクログラム
の間であるか、または１０マイクロリットル当たり１か
ら４マイクログラムの間であり、好ましくは１０マイク
ロリットル当たり１．３マイクログラムである。このブ
ロッキングＤＮＡはヒト胎盤ＤＮＡまたはＣｏｔ１　Ｄ
ＮＡ（Ｃｏｔ１　ＤＮＡはメリ−ランド州ゲチスバ−グ
のライフテクノロジ−（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ，　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　ＭＤ，　Ｃａｔ．　
＃５２７９ＳＡ）が販売している）　であってもよく、
全ヒトゲノムＤＮＡを平均４００塩基対以下に機械的に
剪断して調製される。この物質を変性し、その後、高度
に反復された二本鎖ＤＮＡ配列の長い断片にするのに十
分な期間ハイブリダイズする。一本鎖および二本鎖ＤＮ
Ａ種の混合物を、一本鎖を特異的にモノ−およびオリゴ
−ヌクレオチドに分解するヌクレア−ゼＳ１で処理する
。消化されない二本鎖Ｃｏｔ１ＤＮＡ　をこの混合物か
ら回収する。
【００６７】染色体は次に視覚化するために好ましくは
任意のカウンタ−染色（Ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎｓ）
で染色される。 限定的にではなく、ヨウ化プロピディウム、キナクリン
、またはジスタマイシン／４．６−ジアミノ−２−フェ
ニルインド−ル（ＤＡＰＩ）またはギムザのような非蛍
光色素での染色を含む。これらのカウンタ−染色はすべ
ての染色体の視覚化を可能にする。
【００６８】本発明は、数多くのＤＮＡ配列の混合物で
あって、１から３個のニトロ基で置換されたフェニル基
から成り、アミノ酸結合基の手段によって共有結合され
る多標識を含み、好ましくは２，４−ジニトロフェニル
−標識ＤＮＡ配列を提供し、それは検出すべき染色体と
種々の部分に相補的である。本発明の方法は、検出され
る染色体に相補的である数万とまではいかないが数千の
種々のＤＮＡ配列を提供し、それらはニトロ−置換フェ
ニル、最も好ましくは２，４−ジニトロフェニル標識で
標識される。この数多くの種々の標識ＤＮＡ配列を染色
体部分に実質的にハイブリダイゼ−ションさせることは
、ハイブリダズした標識ＤＮＡを標識に対する抗体に反
応させること、並びに標識に結合した抗体と酵素または
蛍光マ−カ−で標識された抗体との相互結合（標識に結
合した抗体に特異的である）によって染色体の検出を可
能にする。これらの免疫的技術の当業者は、検出できる
ニトロ−置換フェニル標識、最も好ましくは２，４−ジ
ニトロフェニル標識による多くの免疫的技術を認識する
であろう。ニトロ−置換フェニル標識は、公知技術とし
てよくもちだされる抗体に対するハプテンである。蛍光
、ロ−ダミン等の蛍光マ−カ−での抗体標識化技術は公
知である。西洋ワサビパ−オキシダ−ゼおよびアルカリ
ホォスホァタ−ゼのような酵素での抗体の標識化は公知
である。例えば標的染色体にハイブリダイズしたＤＮＡ
断片上の２，４−ジニトロフェニル標識は、蛍光または
酵素で標識した抗−ＤＮＰ抗体と直接反応させて検出で
きた。複合体は以下に示される　　：染色体ＤＮＡ／相
補的ＤＮＡ−２，４−ジニトロフェニル 標識／抗−ＤＮＰ抗体（蛍光または酵素標識）もうひと
つの形態としては、２，４−ジニトロフェニル標識を抗
−ＤＮＰ抗体と反応させ、これは次に蛍光または酵素標
識を有する抗−ＤＮＰ抗体に対する抗体に結合させる。 例えば、ウサギ抗−ＤＮＰ抗体を初めにＤＮＰ標識に結
合させ、そして次に蛍光または酵素を有するヤギ抗−ウ
サギ抗体に結合させる。この態様は以下に示される： 染色体ＤＮＡ／相補的ＤＮＡ−２，４−ジニトロフェニ
ル　　標識／ウサギ　　抗−ＤＮＰ抗体／ヤギ　　抗−
ウサギ抗体（蛍光または酵素標識） 蛍光または酵素標識は標準的技術で検出される。免疫学
の当業者は、蛍光標識並びにニトロ−置換フェニル、好
ましくは２，４ジニトロフェニルのようなハプテンを検
出する酵素標識の多くのアッセイ態様を認識するであろ
う。ニトロ−置換フェニル、特に２，４ジニトロフェニ
ルのアッセイ態様において、他のアビジン／ビオチンの
ような特異的結合基質は有利に利用されるであろう。
【００６９】本発明は以下の実施例でさらに説明される
。しかしここに特別記載されない態様であっても本発明
の精神および思想に包含される。
【００７０】
【実施例１】ヒト染色体−特異的ＤＮＡプロ−ブの単離
ヒト染色体−特異的ＤＮＡプロ−ブを、Ｖａｎ　Ｄｉｌ
ｌａ，　Ｍ．Ａ．ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４
：５３７−５５２，１９８６）に述べられにように構築
された組み替えファ−ジライブラリ−としてロ−レンス
リバ−モア国立研究所（Ｌａｗｒｅｎｃｅ　Ｌｉｖｅｒ
ｍｏｒｅ　　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）から得た。これらのライブラリ−はＥ．Ｃｏｌｉ
宿主で成長させて増幅させた。増幅したファ−ジを精製
し、それらのＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを制限酵素Ｈ
ＩｄＩＩＩで消化した。挿入ＤＮＡはラムダベクタ−Ｄ
ＮＡから精製されプラスミドベクタ−ｐＢＳ（カリホォ
ルニア州ストラテジ−ン、ラ　　ジョラ：Ｓｔｒａｔｅ
ｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＨｉｎｄＩＩＩ
部位にクロ−ン化した。生成したプラスミドはＥ．Ｃｏ
ｌｉ（ＤＨ５α）（ベセスダリサ−チライブラリ−、ゲ
チスバ−グ、メリ−ランド州）中で形質転換した。ここ
で例示されるプラスミドは、ＡＴＣＣ＃’ｓ５７７３８
，５７７５３および５７７５４（染色体１）；ＡＴＣＣ
番号５７７４９，５７７４８および５７７５１（染色体
３）；ＡＴＣＣ番号５７７２３および５７７０２（染色
体８）およびＡＴＣＣ番号５７７２７および５７７３６
（染色体１２）である。 このライブラリ−は凍結細胞の１ｍｌアリコ−トとして
保存された。これらのバイアルは発酵用の保存菌種の生
産のために、まず最初に使用された。
【００７１】微生物は発酵で成長させた。ＡＴＣＣから
入手したカルチャ−を３７℃，２４時間、アンピシリン
（２００マイクログラム／ｍｌ）およびＹＴブロ−ス（
８グラム／リットル（ｇ／ｌ）バクトトリプトン（Ｂａ
ｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎ：Ｄｉｆｃｏ），　５ｇ／ｌ　
バクトイ−ストエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ）および５
ｇ／ｌ　塩化ナトリウムを含有する）を含有する１．６
％アガ−プレ−トで培養した。培養細胞は、１６ｇ／ｌ
のバクトトリプトン（ＢａｃｔｏＴｒｙｐｔｏｎ：Ｄｉ
ｆｃｏ）、１０ｇ／ｌのバクトイ−ストエキストラクト
（Ｄｉｆｃｏ）、１５ｇ／ｌのバクトアガ−（Ｄｉｆｃ
ｏ）および５ｇ／ｌ　塩化ナトリウムを含有する４ｍｌ
で回収し、それぞれに４ｍｌの２０％グリセロ−スを加
えた。 このＥ．Ｃｏｌｉ細胞カルチャ−は、０．５　ｍｌのア
リコ−トでバイアルを液体窒素に浸して凍結し−８０℃
で使用するまで保存した。
【００７２】発酵器接種は、種カルチャ−をカザミノ酸
培地３５０ｍｌ中（１３．２ｇ／ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４−
７Ｈ２Ｏ，　３．０ｇ／ｌ　ＫＨ２ＰＯ４，　０．０５
ｇ／ｌ　ＮａＣｌ，　１．０ｇ／ｌＮＨ４Ｃｌ，　１０
．０ｇ／ｌ　カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ），　０．０３ｇ
／ｌ　ＭｇＳＯ４，０．００４ｇ／ｌ　ＣａＣｌ２−２
Ｈ２Ｏ，　３．０ｇ／ｌ　グルコ−ス，０．０２５ｇ／
ｌ　チアミン−塩酸，　０．００５４ｇ／ｌ　ＦｅＣｌ
３，　０．０００４ｇ／ｌ　ＺｎＳＯ４，　０．０００
７ｇ／ｌ　ＣｏＣｌ２，　０．０００７ｇ／ｌ　Ｎａ２
ＭｏＯ４，　０．０００８ｇ／ｌ　ＣｕＳＯ４，　０．
０００２ｇ／ｌ　Ｈ２ＢＯ３，　および０．０００５ｇ
／ｌ　ＭｎＳＯ４を含有する）で２リットルの遮断され
たシェ−カ−フラッシュ中でｐＨ７および３７℃で培養
することにより調製した。この３５０ｍｌのカルチャ−
を４．２リットルの発酵培地（１％グルコ−ス、１３．
２ｇ／ｌ　Ｎａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ，　３．０ｇ／ｌ
　ＫＨ２ＰＯ４，　０．０５ｇ／ｌ　ＮａＣｌ，　１．
０ｇ／ｌ　ＮＨ４Ｃｌ，　１０．０ｇ／ｌ　カザミノ酸
（Ｄｉｆｃｏ），　０．０３ｇ／ｌ　ＭｇＳＯ４，０．
００４ｇ／ｌ　ＣａＣｌ２−２Ｈ２Ｏ，　０．０２５ｇ
／ｌチアミン−塩酸，　０．００５４ｇ／ｌ　ＦｅＣｌ
３，　０．０００４ｇ／ｌ　ＺｎＳＯ４，　０．０００
７ｇ／ｌ　ＣｏＣｌ２，０．０００７ｇ／ｌ　Ｎａ２Ｍ
ｏＯ４，　０．０００８ｇ／ｌ　ＣｕＳＯ４，　０．０
００２ｇ／ｌ　Ｈ２ＢＯ３，　および０．０００５ｇ／
ｌ　ＭｎＳＯ４を含有する）に接種して使用した。
【００７３】微生物細胞を、細発酵終了後すぐに細胞−
濃縮膜および高速遠心を採用して回収した。発酵細胞液
は、０．４５ミクロン（μｍ）膜フィルタ−（２平方フ
ィ−ト）で５リットルから約８００ｍｌに濃縮した。細
胞濃縮液を次に冷却遠心機中で７，０００×ｇ，１０分
間遠心した。微生物細胞ペレットは上澄を捨て回収した
。
【００７４】プラスミドＤＮＡを微生物細胞ペレットか
ら抽出した。細胞を細胞ペレット塊（Ｍ）（ミリリット
ルで）の３倍の５０ｍＭグルコ−ス（フィルタ−滅菌）
、１０ｍＭ　ＮａＥＤＴＡ（　ｐＨ　７．５−８．０）
，および２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（　ｐＨ　８．０
））で完全に再懸濁した。細胞を０．２Ｍ　ＮａＯＨ　
および１％　（Ｗ／Ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）を含有する６×Ｍ（ミリリットルで）を加えた後
、渦巻き状に撹拌して溶菌した。溶液が透明になった時
、５５．５　ｍｌの氷酢酸、１４７．５グラムの酢酸カ
リウムを最終溶量５００ｍｌとなるように４．５×Ｍ（
ミリリットルで）に加え、完全に混合して、綿状の生成
物を得た。綿状の生成物沈殿から上澄を回収し、この上
澄を１５分間、７０００×ｇで遠心して存残する沈殿を
除去した。微生物細胞ペレットは、上澄を捨た後回収し
た。
【００７５】プラスミドＤＮＡを微生物細胞ペレットか
ら抽出した。３倍量の細胞ペレット塊（Ｍ）（ミリリッ
トルで）溶液（５０ｍＭ　　グルコ−ス（フィルタ−滅
菌）、１０ｍＭ　ＮａＥＤＴＡ（ｐＨ　７．５−８．０
）および　２５　ｍＭ　トリス−塩酸（ｐＨ　８．０）
を含有する）に完全に再懸濁した。細胞を６×Ｍ（ミリ
リットルで）（　０．２　Ｍ　ＮａＯＨ　および１％（
Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有する
）の溶液を加えた後、渦巻き状に激しく撹拌して溶解し
た。溶液が透明になった時、５５．５　ｍｌ　の氷酢酸
および　１４７．５　グラムの酢酸カリウム（最終容量
　５００　ｍｌ）を完全に混合して、綿状沈殿物を生成
した。上澄を綿状生成物から回収し、この上澄を１５分
間，７０００×ｇ　で遠心し存残する沈殿物を除去した
。
【００７６】１容量のエタノ−ルで上澄から核酸を沈殿
させ、１０分間　７０００×ｇ　で遠心し、核酸ペレッ
トを全容量　０．５４×Ｍ（ミリリットルで）中で再懸
濁した。核酸を次に１／２容量の中性化フェノ−ルおよ
び１／２容量のクロロホルムで抽出し、２容量のエタノ
−ルで沈殿させた。核酸を０．３×Ｍ（ミリリットルで
）の５０　ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ　７．０）および１
００　ｍＭ　酢酸ナトリウム溶液に再懸濁した。　０．
７７×Ｍ（マイクロリットルで）のＲＮａｓｅ（１０　
ｍｇ／ｍｌ：熱処理）を次ぎに加え、３０分間室温で、
または４℃で一昼夜消化する。０．６１５×Ｍ（マイク
ロリットルで）のプロテナ−ゼＫ（２０　ｍｇ／ｍｌ）
を次ぎに加えて、５５℃で３時間インキュベ−トした。 核酸を次に１／２容量の中性化フェノ−ルおよび１／２
容量のクロロホルムで抽出し、２容量のエタノ−ルで沈
殿させた。
【００７７】ＤＮＡを０．４１５×Ｍ（ミリリットルで
）の水に再懸濁し、０．０５×Ｍミリリットルの５Ｍ　
ＮａＣｌおよび　０．１５５×Ｍミリリットルの　５０
％　（Ｗ／Ｖ）ポリエチレングリコ−ル（ＰＥＧ）（分
子量　　６０００−８０００）を加え、氷水中で３時間
インキュベ−トし、１５分間，７０００×ｇ　で遠心し
て沈殿させた。　ＤＮＡを０．０４×Ｍミリリットルの
水および１／１０容量の酢酸ナトリウムに再懸濁して、
１／２容量の中和化フェノ−ルおよび１／２容量のクロ
ロホルムで抽出し、２容量のエタノ−ルで沈殿させた。 精製ＤＮＡを０．０４７６×Ｍミリリットルの脱イオン
Ｈ２Ｏに再懸濁した。ＤＮＡの濃度を蛍光定量法で測定
した。
【００７８】最終的に精製したＤＮＡをブランソン　　
ソニファ−　４５０（Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｓｏｎｉｆｉｅ
ｒ　４５０；コネクチカット州ダンブリ−）を使用し、
超音波で約３００塩基対の小断片に破壊した。断片の大
きさは、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼ−ション用に
使用されるＤＮＡプロ−ブ用に好適となるように実験的
に定められた。上述のように調製された４ミリグラムの
精製プラスミドＤＮＡを２ミリリットルの水に再懸濁し
、超音波処理中の沸騰を防止するためにドライアイス／
エタノ−ル浴に浸した。超音波装置のマイクロチップを
、チップの底から２−５ｍｍまでこの溶液に浸した。超
音波は出力　２５−３０　ワットで、仕事量サイクル８
０％（８０％稼働、２０％停止）で断続的に５分間行っ
た。超音波処理の後、ＤＮＡを０．２　ｍｌの３Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ５．５）および４　ｍｌのエタノ−ル
を加えて沈殿させた。沈殿物を５分間、８０００×ｇで
遠心して回収し、真空乾燥した。
【００７９】
【実施例２】ＤＮＡの重亜硫酸触媒アミノ基転移ＤＮＡ
は、シトシン塩基の第４炭素原子へのエチレンジアミン
の添加によってアミノ基転移された。この反応は、重亜
硫酸ナトリウムによって触媒される。存在するデオキシ
シチジンヌクレオチド部位の約３から６％が、ジニトロ
フェニル化アミノ酸、特に６−Ｎ−（２，４−ジニトロ
フェニルアミノ）カプロン酸−Ｏ−（Ｎ−ヒドロキシサ
クシイミド）−３−スルホン酸塩および６−Ｎ−（２，
４−ジニトロフェニルアミノ）グリシルグリシルグリシ
ル−Ｏ−（Ｎ−ヒドロキシサクシイミド）−３−スルホ
ン酸塩で標識するためにアミノ化された。
【００８０】重亜硫酸バッファ−を調製するために、１
．７　ｍｌの発煙塩酸を氷上の１ｍｌの脱イオンＨ２Ｏ
にゆっくり加えた。新鮮な１ｍｌのエチレンジアミン（
シグマ　　カタログ番号＃Ｅ−４３７９：Ｓｉｇｍａ　
）を氷上でゆっくり加えた。エチレンジアミンの溶解後
、溶液を室温にまで暖め、０．４７５ｇのメタ重亜硫酸
ナトリウム（アルドリッチカタログ番号＃２５，５５５
−６：Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。発煙塩酸を重亜硫酸
混合液のｐＨが　７．０　になるまで加えた。脱イオン
水を最終溶量５．０ｍｌになるように加えた。
【００８１】ＤＮＡをアミノ基転移するために、１ミリ
グラムの超音波処理ＤＮＡを０．３ｍｌの水に再懸濁し
た。 ＤＮＡを１００℃、５分間沸騰して変性させ、つぎにす
ぐにアイスウォ−タ−浴中で冷却した。アミノ基転移反
応をこの　０．３　ｍｌのＤＮＡ溶液を　２．７　ｍｌ
の重亜硫酸バッファ−に加えて開始し、反応を３７℃で
２日間インキュベ−トした。ＤＮＡ溶液は、５−１０　
ｍＭ　ホウ酸ナトリウム（ｐＨ　８．０）に対して通常
の脱塩によって脱塩した。脱塩後、０．３　ｍｌの３Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を脱塩物に加えた。アミ
ノ化ＤＮＡを　２．５　容量のエタノ−ルで沈殿させ、
８，０００×ｇで１０分間遠心した後回収した。ペレッ
トを真空乾燥し３　ｍｇ／ｍｌＤＮＡに再水和した。こ
の溶液を−８０℃で使用するまで保存した。
【００８２】
【実施例３】アミノ酸のニトロフェニル誘導体の調製２
０　ｍＭのε−アミノ−ｎ−カプロン酸を、２．６２ｇ
のこの化合物を　４０　ｍｍｏｌの重曹を含有する　２
０　ｍｌの水に加えて調製した。この溶液を　２０　ｍ
ｌの　２０　ｍＭサンガ−溶液（２，４ジニトロ−フル
オロベンゼン）と混合し、室温に１時間おいた。混合液
を緩やかに加熱し、これにより溶液が黄色になり、少量
の可溶化した重曹が沈殿した。 この沈殿物を十分な濃塩酸を加えて再び可溶化し、４℃
で結晶化を誘導した。この結晶を真空中で回収し水で洗
い、４．２ｇ　のε−ｎ−ジニトロフェニルアミノ−カ
プロン酸黄色結晶（ＤＮＰ−ＮＣＡ）を生成した。
【００８３】ＤＮＰ−ＮＣＡは、３−スルホ−Ｎ−ヒド
ロキシサクシイミドとのエステル化によって以下のよう
にを活性化された。０．５９４ｇのＤＮＰ−ＮＣＡ，０
．４６８ｇのジシクロヘキシルカルボジイミドおよび　
　０．４３４ｇの３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシサクシイ
ミド　を７ｍｌのジメチルホルムアミド中で室温で一昼
夜、激しく撹拌した。反応は、薄層クロマトグラフィ−
でによって９０％以上達成されたことが確認された。混
合液を０℃に冷却し、さらに１時間撹拌した。混合液を
濾過し黄色溶液を濃い黄色油にまで蒸発したが結晶化は
しなかった。この油を　５０　ｍｌのエタノ−ルと撹拌
し、０．９９６ｇの微細な黄色パウダ−を濾取しエタノ
−ルで洗浄した。この化合物は６−Ｎ−（２，４−ジニ
トロフェニルアミノ）カプロン酸−Ｏ−（Ｎ−ヒドロキ
シサクシイミド）−３−スルホン酸塩（ナトリウム塩）
であり、Ｓ−ＮＨＳ−ＤＮＰとして本発明の目的に付さ
れるであろう。
【００８４】
【実施例４】自然に起こるニトロフェニル誘導体および
合成ペプチドの調製 ペプチド　ＧｌｙＧｌｙＧｌｙ　のジニトロフェニル誘
導体は３．７８ｇのペプチド（２０　ｍｍｏｌ）を３．
７２ｇのサンガ−試薬とを、総容量１　ｍｌ／ｍｍｏｌ
　の４０　ｍｍｏｌの重曹ペプチド溶液で混合すること
により調製した。溶液を初めに４０−５０℃に暖め、反
応を開始した。
【００８５】十分な濃塩酸を、わずかに沈殿を形成した
重曹を再び溶解するために加え、次に混合液を４℃にイ
ンキュベ−トして結晶の形成を誘導した。生成した結晶
を真空中で濾過し１Ｍ　　ＨＣｌで洗浄し、乾燥して６
．９９ｇのジニトロフェニルアミノグリシルグリシルグ
リシン（ＤＮＰ−ＧＧＧ）を生成した。
【００８６】ＤＮＰ−ＧＧＧを３−スルホ−Ｎ−ヒドロ
キシサクシイミドのエステル化によって以下のようにを
活性化した。１．４２ｇのＤＮＰ−ＧＧＧ，０．９４１
ｇのジシクロヘキシルカルボジイミドおよび０．８６８
ｇの３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシサクシイミドを１０　
ｍｌのジメチルホルムアミド中で室温にて一昼夜激しく
撹拌した。混合物を０℃に冷却し、さらに１時間撹拌し
た。混合物を次に濾過し、溶液を蒸発させてＤＭＦを除
去した。濃い黄色の非−結晶状油を５０　ｍｌのエタノ
−ルと撹拌し２．２６ｇの微細パウダ−が生成し、これ
を濾過により回収して、エタノ−ルで洗浄し真空中ドラ
イヤ−ト（Ｄｒｉｅｒｉｔｅ）で乾燥した。この化合物
は、（２，４−ジニトロフェニル）アミノ−グリシルグ
リシルグリシン−Ｏ−（Ｎ−ヒドロサクシイミド）−３
−スルホン酸塩（ナトリウム塩）で、本発明においてＳ
−ＮＨＳ−ＧＧＧ−ＤＮＰとして付されるであろう。
【００８７】
【実施例５】実施例１の手順によって得た平均長３００
ｂｐのヒト染色体１に染色体−特異的ＤＮＡプロ−ブを
、実施例２に記載したように、エチレンジアミンを使用
した重亜硫酸触媒アミノ基転移反応により誘導化した。 約５％の塩基がアミノ化した。１．５ｍｌ　のプラスチ
ック製遠心管中のアミノ化ＤＮＡ溶液（総ＤＮＡ１００
μｇ）を減圧下で蒸発させた。この溶液に　０．２　Ｍ
の３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸（ＭＯＰ
Ｓ）バッファ−を　０．５　ｍｌ加え、次に１００マイ
クロリットルのＳ−ＮＨＳ−ＤＮＰ（３０ｍｇ／ｍｌ　
　Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）を残渣に加え、この
混合物を２５℃で一昼夜インキュベ−トした。標識ＤＮ
Ａは、６０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ　５．５）
、次に　１．５　ｍｌの氷冷エタノ−ルを加えて沈殿さ
せ、混合物を少なくとも２時間、−２０℃でインキュベ
−トして沈殿させた。この溶液を１０分間、１０，００
０×ｇの遠心に供した。ＤＮＡペレットを、０．６　ｍ
ｌの氷冷エタノ−ルで２回洗浄し、次に１００　μｌの
滅菌水に溶解した。ベット体積　０．８　ｍｌの２本の
　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０　選択Ｄクロマトグラフ
ィ−カラム（５プライム−＞３プライム、有限会社：５
Ｐｒｉｍｅ−＞３Ｐｒｉｍｅ、Ｉｎｃ．）を調製した。 ５０　μｌの溶解ペレットを各のカラムに添加し、４分
間、１０，０００×ｇで遠心した。１０　μｌの精製Ｄ
ＮＡを４９０μｌの２０ｍＭ　ＮａＯＨ　に希釈し、Ｄ
ＮＡ濃度を評価するために吸光度を２６０ｎｍで測定し
た。精製ＤＮＡは水で希釈し、実験濃度がｍｌ当たり１
００マイクログラムのＤＮＡを調製した。
【００８８】ｉｎ　ｓｉｔｕ　　ハイブリダイゼ−ショ
ンＤＮＰ−標識ＤＮＡプロ−ブは、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハ
イブリダイゼ−ションにより試験された。標的ＤＮＡは
、中期の培養正常白血球細胞から成るものであった。細
胞を顕微鏡ガラススライド上に約３フィ−トの間隔で、
核を破壊し開くために滴下した。ハイブリダイゼ−ショ
ンの前に、このスライドを変性溶液（７０％ホルムアミ
ド／０．３Ｍ　ＮａＣｌ／３０ｍＭ　　クエン酸ナトリ
ウム（ｐＨ７））中、７０℃においた。このスライドを
７０％，８５％および１００％エタノ−ル溶液を通すこ
とによって（それぞれ２分間）脱水した。
【００８９】各々のスライド上のハイブリダイゼ−ショ
ン混合物は、５０％　ホルムアミド／０．３Ｍ　ＮａＣ
ｌ／３０　ｍＭ　　クエン酸ナトリウム（ｐＨ７）から
成るものであった。 ヒト胎盤ＤＮＡ（２．２５マイクログラム／１０ミリリ
ットル）をブロッキングＤＮＡとして使用した。このＤ
ＮＰ−標識ＤＮＡを１０ｎｇ／μｌの濃度で加えた。１
０マイクロリットルの完全ハイブリダイゼ−ション混合
物を７０℃に１０分間加熱して変性させた。プロ−ブお
よびブロッキングＤＮＡを６０分間、３７℃でプレハイ
ブリダイゼ−ションさせた。この混合物を次にスライド
上に置いて、カバ−スリップで覆い、ラバ−セメント（
ｒｕｂｂｅｒ　ｃｅｍｅｎｔ）で密閉した。ハイブリダ
イゼ−ションを湿潤容器内で３７℃で一昼夜行った。
【００９０】翌日、スライドを３回、１５分間、４５℃
で、５０％　ホルムアミド／０．３Ｍ　ＮａＣｌ／３０
　ｍＭ　　クエン酸ナトリウム（ｐＨ７）中で洗浄して
過剰のプロ−ブを除去し、次にそれぞれ　０．３　Ｍ　
ＮａＣｌ／３０ｍＭ　クエン酸ナトリウム（ｐＨ７）お
よび　０．１　Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７）／０．１
　％ＮＰ４０界面活性剤（オクチルフェノキシポリエト
キシエタノ−ル、非イオン性界面活性剤であり、カリホ
ォルニア州、ラジョラのカルビオケムで販売されている
；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　Ｃａ
ｌｉｆｏｒｎｉａ）（ＰＮバッファ−：　ＰＮ　Ｂｕｆ
ｆｅｒ）で１５分間、４５℃で洗浄した。スライドを　
ＰＮ　バッファ−，２５℃で２回、２分間洗浄した。こ
のスライドを、ウサギ抗−ＤＮＰ（シグマ：Ｓｉｇｍａ
）をＰＮＭバッファ−で１：２５０に希釈した溶液中で
２５℃で、２０分間インキュベ−トした。ＰＮＭバッフ
ァ−は０．１　Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７）／０．１
％ＮＰ４０界面活性剤／０／５％脱脂乾燥ミルクである
。 スライドを２５℃のＰＮバッファ−中で、３回、各２分
間洗浄した。スライドを次にアルカリホォスファタ−ゼ
−抗−ウサギ　免疫グロブリンＧ（シグマ）を１：２５
０にＰＮＭバッファ−中で希釈した溶液中で２０分間イ
ンキュベ−トした。スライドを２５℃のＰＮバッファ−
で３回、各２分間洗浄した。スライドを次に　１７ｍｌ
　のＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液［４μｌ／ｍｌのニトロブル
−テトラゾリウム（ＮＢＴ）および３ｍｇ／ｍｌの５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸（ＢＣＩ
Ｐ，ケムプロ−ブから供給される）を含有する］に３７
℃で３０分間インキュベ−トした。スライドを蒸留水で
濯ぎ、風乾して顕微鏡で観察した。 ｉｎ　ｓｉｔｕ　ハイブリダイゼ−ション結果アルカリ
ホォスホァタ−ゼ標識は、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ　気質を、
顕微鏡で黒く見える濃紺の色素に転換する反応を触媒す
る。非標識染色体は無色かまたはギムザ染色でカウンタ
−染色された青色に出現する。
【００９１】実質的に上述した手順に従って、染色体２
，４，６および１２について結果を得た。
【００９２】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　視覚による観察
結果　　　　　染色体番号　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　特異性　　　　　　　　　　　　　
　濃さ　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　＋＋＋　　　　　　　　
　　　　　＋＋＋　　　　　　　　　　２　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋＋＋　　　
　　　　　　　　　　＋＋＋　　　　　　　　　　４　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＋
＋＋　　　　　　　　　　　　　＋＋＋　　　　　　　
　　　　　　　６　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　＋＋＋　　　　　　　　　　　　　＋
＋＋　　　　　　　　　１２　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　＋＋＋　　　　　　　　　　
　　　＋＋コ−ド： 特異性：（−）出現せず、（標的染色体においてかすか
に強く染色、（＋＋）適度な特異性、（＋＋＋）良好な
特異性強さ：（−）見えず、（＋）層のみ可視、（＋＋
）暗い染色、透過で可視、（＋＋＋）大変濃い染色、層
下で反射
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は６−Ｎ−（２，４−ジニトロフェニル）
カプロン酸−Ｏ−（Ｎ−ヒドロキシサクシイミジル−３
−スルホン酸）エステルの調製法を説明する。
【図２】図２は６−Ｎ−（２，４−ジニトロフェニル）
カプロン酸−Ｏ−（Ｎ−ヒドロキシサクシイミジル−３
−スルホン酸）エステルとエチレンジアミンでアミノ基
転移されたＤＮＡとの反応を説明する。

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　検出される核酸配列に相補的な１以上
    のＤＮＡ配列からなる核酸配列の　ｉｎ　ｓｉｔｕ　　
    検出試薬であって、該ＤＮＡ配列が１から３個のニトロ
    基で置換されたフェニルから成る多標識を含有し、該標
    識はアミノ酸結合基によってＤＮＡ配列と共有結合して
    おり；（ａ）　　該結合基は低級アルキルアミノ酸なら
    びにそれらの重合体および共重合体から成り； （ｂ）　　フェニル標識は４−ニトロフェニル、２，４
    −ジニトロフェニルまたは２，４，６−トリニトロフェ
    ニルから成る群から選択され；そして （ｃ）　　標識前のＤＮＡ配列は検出される染色体また
    は染色体領域の組み換えファ−ジライブラリ−から得ら
    れ、平均長が約３００ｂｐである、 核酸配列の　ｉｎ　ｓｉｔｕ　検出試薬。
  2. 【請求項２】　　前記標識がＤＮＡ配列にアミノ化シト
    シン部位で共有結合しており、 （ａ）　　該ＤＮＡ配列のシトシン部位の約２−５０％
    が、２から１０個の炭素原子を含有するジアミノアルカ
    ンで重亜硫酸触媒アミノ基転移によってアミノ化され；
    そして （ｂ）　　該標識数は、該ＤＮＡが検出する相補的標的
    配列または配列群とに関して特異的結合性を保持する間
    、免疫的技術によって検出されるに十分である、請求項
    １記載の試薬。
  3. 【請求項３】　　ハイブリダイズしていないＤＮＡ配列
    から成る染色体または染色体領域の　ｉｎ　ｓｉｔｕ　
    検出用試薬であって、該ＤＮＡ配列は検出すべき該染色
    体または染色体領域と種々の部分に関して本来的に相補
    的な核酸配列、ならびにアノミ基転移された複数のシト
    シン塩基を有し、多くのアミノ基転移シトシン塩基は１
    から３個のニトロ基で置換されたフェニルから成る標識
    を有し、該標識はアミノ酸結合基の手段によってシトシ
    ン塩基に共有結合しており、標識シトシン塩基数は、試
    薬が検出すべき染色体または染色体配列群とに関して特
    異的結合性を保持する間、免疫的技術によって検出され
    るに十分であり、ここで標識前の該ＤＮＡ配列は検出さ
    れる染色体または染色体領域の組み換えファ−ジライブ
    ラリ−から得られ、該ＤＮＡは平均長が約３００ｂｐで
    あるＤＮＡ配列からなる検出用試薬。
  4. 【請求項４】　　前記標識が、ＤＮＡと６−Ｎ−（２，
    ４−ジニトロフェニル）カプロン酸−Ｏ−（Ｎ−　ヒド
    ロキシサクシイミジル−３−スルホン酸塩）エステルま
    たはＮ−（２，４−ジニトロフェニル）グリシルグリシ
    ルグリシン−Ｏ−ヒドロキシサクシイミジル−３−スル
    ホン酸塩）エステルとを反応させて形成される請求項１
    または３記載の試薬。
  5. 【請求項５】　　低級アルキルアミノ酸の活性化誘導体
    の手段によって塩基に共有結合した１以上のジニトロフ
    ェニル基を有するＤＮＡ、ここで該ジニトロフェニルは
    免疫技術で検出でき、ＤＮＡは本質的な結合性を保持し
    、ならびに１つ以上のシトシン塩基が２から９個の炭素
    原子を含有するアルキレンジアミンによってアミノ基転
    移され、アミノ基転移されたＤＮＡを６−Ｎ−（２，４
    −ジニトロフェニル）カプロン酸−Ｏ−（Ｎ−　ヒドロ
    キシサクシイミジル−３−スルホン酸塩）エステルまた
    はＮ−（２，４−ジニトロフェニル）グリシルグリシル
    グリシン−Ｏ−（Ｎ−ヒドロキシサクシイミジル−３−
    スルホン酸塩）エステルと反応させる、から成る試薬。
  6. 【請求項６】　　ＤＮＡ中の約５−２５％のシトシン部
    位がエチレンジアミンで重亜硫酸触媒アミノ基転移によ
    って標識される請求項５記載の試薬。
  7. 【請求項７】　　染色体または染色体領域を　ｉｎ　ｓ
    ｉｔｕ　検出する試薬の調製方法であって、 （ａ）　　検出される染色体または染色体領域に相補的
    なＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡを平均長約３００
    ｂｐの断片に分解し； （ｂ）　　該ＤＮＡ断片をエチレンジアミンで重亜硫酸
    触媒によるアミノ基転移によってアミノ化し；（ｃ）　
    　１から３個のニトロ基で置換したフェニルから成る標
    識を共有結合させ、該標識はアミノ酸結合基の手段によ
    って１から３個のニトロ基で置換したフェニルから成る
    標識に共有的に結合を形成するように、共有結合され、
    生成した標識リンカ−化合物を３−スルホ−Ｎ　−ヒド
    ロサクシイミドとのエステル化により活性化し、活性化
    標識−リンカ−化合物を該アミノ基転移活性化ＤＮＡに
    共有結合させる、ここで該アミノ酸結合基は低級アミノ
    酸およびそれらの重合体および共重合体である、から成
    る試薬の調製方法。
  8. 【請求項８】　　標識がＤＮＡと６−Ｎ−（２，４−ジ
    ニトロフェニル）カプロン酸−Ｏ−（Ｎ−　ヒドロキシ
    サクシイミジル−３−スルホン酸塩）エステルまたはＮ
    −（２，４−ジニトロフェニル）グリシルグリシルグリ
    シン−Ｏ−ヒドロキシサクシイミジル−３−スルホン酸
    塩）エステルとを反応させることから成る請求項４記載
    の試薬調製方法。
  9. 【請求項９】　　染色体および染色体領域の　ｉｎ　ｓ
    ｉｔｕ　検出方法であって、 （ａ）　　試薬中の非特異的結合ＤＮＡに結合するハイ
    ブリダイゼ−ション条件で、過剰量のブロッキングＤＮ
    Ａを請求項１または３の試薬に加えることによってブロ
    ッキング試薬を調製し、 （ｂ）　　ブロックされた試薬を、検出する染色体また
    は染色体領域とハイブリダイズする条件下で接触させ、
    （ｃ）　　検出すべき染色体または染色体領域にハイブ
    リダイズした試薬によって提供される標識の存在または
    不存在を免疫技術で検出する方法。
  10. 【請求項１０】　　染色体または染色体領域の　ｉｎ　
    ｓｉｔｕ　検出用の試薬調製法であって、 （ａ）　　検出すべき染色体および染色体領域に関して
    本来的に相補的である塩基配列を有するハイブリダイズ
    していないＤＮＡに含有される多数のシトシン塩基をア
    ミノ基転移し、ここで該シトシン塩基はエチレンジアミ
    ンで重亜硫酸触媒によってアミノ基転移される；そして
    （ｂ）　　１から３個のニトロ基で置換されたフェニル
    から成る共有結合標識、該標識は、アミノ酸結合基の手
    段により共有的に結合している、を少なくともアミノ基
    転移塩基の部分まで共有結合させ、共有結合した標識を
    有するシトシン塩基の部分は、検出すべき染色体および
    染色体領域に関して試薬が特異的結合性を本質的に保持
    する間、免疫技術によって検出するに十分である、試薬
    の調製方法。
  11. 【請求項１１】　　ＤＮＡ中の１以上のシトシンを、２
    から９個の炭素原子を有するアルキレンジアミンでアミ
    ノ基転移し、アミノ基転移したＤＮＡと６−Ｎ−（２，
    ４−ジニトロフェニル）カプロン酸−Ｏ−（Ｎ−　ヒド
    ロキシサクシイミジル−３−スルホン酸塩）エステル、
    またはＮ−（２，４−ジニトロフェニル）グリシルグリ
    シルグリシン−Ｏ−（Ｎ−ヒドロキシサクシイミジル−
    ３−スルホン酸塩）エステルとを反応させることから成
    るＤＮＡの標識方法。
  12. 【請求項１２】　　６−Ｎ−（２，４−ジニトロフェニ
    ル）カプロン酸−Ｏ−（Ｎ−ヒドロキシサクシイミジル
    −３−スルホン酸塩）エステルまたはＮ−（２，４−ジ
    ニトロフェニル）グリシルグリシルグリシン−Ｏ−（Ｎ
    −ヒドロキシサクシイミジル−３−スルホン酸塩）エス
    テルである化合物。
JP3293264A 1990-11-08 1991-11-08 Ｄｎａプローブへのニトロフェニル誘導体リガンドの化学付着に有用な新規標識試薬 Pending JPH04287700A (ja)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/611,161 US5258507A (en) 1990-11-08 1990-11-08 Labeling reagents useful for the chemical attachment of nitrophenyl derivative ligands to DNA probes
US611161 1990-11-08

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