JPH04145100A - イヌ上皮細胞成長因子、該イヌ上皮細胞成長因子を有効成分とする抗炎症剤又は化粧料、及び該イヌ上皮細胞成長因子ｃＥＧＦの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明は、新規の構造を有するポリペプチド、該ポリペ
プチドを有効成分とする医薬、化粧料、並びに該ポリペ
プチドの製造方法に関する。

〔従来の技術〕

１９７２年にコーエン（Ｃｏｈｅｎ）　らは、雄マウス
顎下腺より新生マウスに対して眼瞼開裂促進作用及び切
歯助出促進作用を奏するポリペプチドとしてマウス上皮
細胞成長因子（ｍ　Ｅ　Ｇ　Ｆ　：　ｍｏｕｓｅ　ｅｐ
ｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）を単離
し、その構造を決定したＣＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ
、、　２４７．７６１２−７６２０１９７２＞）。

続いて、１９７５年にグレゴリ−（Ｈ，Ｇｒｅｇｏｒｙ
）は、人尿より胃酸分泌抑制活性を有するポリペプチド
としてβ−ウロガストロン（ヒトＥＧＦ）を単翻し、そ
の構造を決定した［Ｎａｔｕｒｅ、　２５７．３２５−
３２７（Ｉ９７５）　）。

更に１９８５年になって、シンプソン（Ｒ，Ｊ、　Ｓｉ
ｍｐｓｏｎ）らは、ＥＧＦレセプターとの結合性を指標
として、ラット顎下腺から４８アミノ酸残基からなるポ
リペプチドの単離に成功し、ラットＥＧＦの一次構造を
初めて報告したＣＥｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｒｍ、
。

１５３、６２９−６３７（Ｉ９８５）参照〕。上記シン
プソンらの報告中には、またモルモットＥＧＦの一次構
造も記載されている。上記報告された各種ポリペプチド
はいずれも４８乃至５３個のアミノ酸残基からなり、３
個の分子内ジスルフィド結合を有しており、之等のアミ
ノ酸配列の相同性は７０％と高値を示している。

上記各ポリペプチドは、各生成源である、それぞれの種
牛体に対して成長因子として生理的機能を有するもので
あることが知られており、例えばマウスＥＧＦは新生マ
ウスに対して眼瞼開裂促進作用及び切歯助出促進作用を
奏することが知られているが、上記したＥＧＦのうちヒ
トＥＧＦを除く他のＥＧＦが人体に対してどのような生
物活性を有するかは十分に解明されていない。

また、ＥＧＦは哺乳動物に普遍的に存在し、それが存在
する動物の種に対してその動物を構成する種々の細胞の
増殖に重要な役割を演するポリペプチドであることは概
略的にわかっているが、個々の種の動物におけるＥＧＦ
の実態はほとんど解明されておらず、現在までその構造
が明らかにされたＥＧＦは、ヒト、マウス、ラット、ウ
サギ及びモルモットの５種だけに過ぎない。

〔発明が解決しようとする課題〕

今まで知られたＥＧＦ以外に、多数の哺乳動物に存在す
る各種ＥＧＦの中から有用性のある新規なＥＧＦを見出
すことができれば、医薬などの各分野において実用性が
高いものである。

本発明の目的は、従来知られているマウス、ヒト、ラッ
ト、ウサギ等の各ＥＧＦを構成するポリペプチドとは異
なる、新規なアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供
することにある。

本発明の他の目的は、前記の新規なポリペプチドを有効
成分とする医薬及び化粧料を提供することにある。

また、本発明の他の目的は、前記の新規なポリペプチド
を容易に、高純度でかつ大量に製造できる製造方法を提
供することにある。

〔発明を解決するための手段〕

本発明は、各種哺乳動物の中から犬に注目し、それがも
つ大上皮細胞成長因子（Ｃａｎｉｎｅ　　Ｅ　Ｇ　Ｆ、
以下ｒｃＥＧＦＪという）の生物活性に着目し、その構
造を解明し、その医薬及び化粧料の有用性を調べ、その
実用的な製造方法を検討することによって、上記目的を
達成したものである。

本発明によれば、下記の式（Ｉ）で示されるアミノ酸一
次配列を有するポリペプチド、及び前記ポリペプチドを
有効成分とする医薬、化粧料が提供される。（以下、式
（Ｉ）でＸの係数ｍ＝１のときのポリペプチドをｒｃＥ
ＧＦｌ」といい、Ｘの係数ｍ＝ｏのときのポリペプチド
をｒｃＥＧＦ２Ｊという。） 式（Ｉ） ％式％ Ｌｅｕ−Ｘｍ　　（ＸはＡｒｇであり、ｍの数はＯ又は
１である。） 〔Ｃ末端側］ 上記及び以下の本明細書におけるアミノ酸、核酸塩基、
その他に関する略号は、ＩＵＰＡＣ，ＩＵＢの規定乃至
当該分野における慣用記号に従うものとする。その例は
次の通りである。

Ａｌａ・・・アラニン　　　Ａｒｇ・・・アルギニンＡ
ｓｎ・・・アスパラギン　Ａｓｐ・・・アスパラギン酸
Ｃｙｓ・・・システィン　　Ｃ１ｎ・・・グルタミンＧ
ｌｕ・・・グルタミン酸　Ｇｌｙ・・・グリシンＨｉｓ
・・・ヒスチジン　　ｌｉｅ・・・イソロイシンＬｅｕ
・・・ロイシン　　　Ｌｙｓ・・・リジンＮｅｔ・・・
メチオニン　　Ｐｈｅ・・・フェニルアラニンＰｒｏ・
・・プロリン　　　Ｓｅｒ・・・セリンＴｒｐ・・・ト
リプトファン　Ｔｙｒ・・・チロシンＶａｌ・・・バリ
ン 本発明のポリペプチド（以下ｒｃＥＧＦ」という）の中
、ｃＥＧＦｌは、上記式（Ｉ）のＸの係数ｍ＝１のとき
、そしてＣＥＧＦ２は上記式（Ｉ）のＸの係数ｍ＝０の
ときのアミノ酸一次配列を有する点に特徴付けられ、そ
の構造は、既知物質にも認められない新規なものであり
、これはその有する生物活性を利用して、後述するよう
に、各種分野において有効に利用することができる。

以下、本発明ｃＥＧＦの製造方法につき詳述すれば、該
ｃＥＧＦは、犬の尿または顎下腺等の組織から通常の抽
出法に従い製造できる。また本発明ｃＥＧＦは、上記式
（Ｉ）のアミノ酸配列に基づいて、通常のペプチドの化
学合成法によっても製造でき、更に遺伝子組換え技術に
従っても製造できる。

上記抽出法につきまず説明すれば、これは通常の方法に
従い実施できる。その詳細は後記実施例に示す通りであ
る。

上記各種の方法に従い得られるｃＥＧＦの単離、精製は
該ｃＥＧ−Ｆを含有する組成物、例えば人尿等より、−
船釣操作に従い、疎水クロマト担体、ゲルろ過クロマト
担体、逆相高速液体クロマト担体、陽イオン交換クロマ
ト担体、陰イオン交換クロマト担体等の、分画原理の異
なる数種のカラムクロマト担体を組合せ用いることによ
り行ない得かくして得られた本発明ｃＥＧＦのｎ認は、
例えば各種の細胞表面に存在するＥＧＦリセブターに、
ｃＥＧＦが結合することを利用したラジオリセプターア
ッセイ（ＲＲＡ）等の手法によって行ない得る。

また上記ｃＥＧＦが高純度に精製されていることの確認
は、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に
より単一ピークになること、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法（ＰＡＧＥ）でクマシーブリリアントブルー染
色した結果、単一ハンドになること等を指標として容易
に行ない得る。

上記のごとくして得られる精製されたｃＥＧＦｌおよび
ＣＥＧＦ２は、通常のポリペプチド乃至蛋白質の構造解
析手段と同様の手段、例えばアミノ酸分析器を用いたア
ミノ組成の測定、プロテインシークエンサーを用いたア
ミノ酸配列の決定等により、その構造を決定できる。

また他のＥＧＦに見られるようなＥＧＦ分子内に見られ
るようなＳ−８結合部位は、精製ｃＥＧＦをサーモライ
シン、キモトリプシンまたはペプシンを用いて酵素消化
させた後、陽イオン交換カラム担体及び陰イオン交換カ
ラム担体を用いたＨＰＬＣ及び逆相ＨＰＬＣで分離する
ことにより、システィンを１つだけ含むフラグメントに
分離し、アミノ酸分析及びシーフェンス分析をすること
で確認できる。

更に、本発明ｃＥＧＦの生物活性は、例えば以下の各種
方法により確認できる。

■　細胞増殖促進活性 ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３等の培養細胞または成熟ラット肝細
胞等の培養細胞等を、低血清条件下にＣＥＧＦ又は対照
としてのヒトＥＧＦを添加した培地で培養し、培養液中
に標識さたデオキシウリジン、チミジン等を加えること
により、新たに合成されたＤＮＡ中に取り込まれるラジ
オアイソトープの量を測定する。このラジオアイソトー
プ量に比例して、新たなりＮＡ中に取り込まれるラジオ
アイソトープの量を測定する。このラジオアイソトープ
量に比例して、新たなりＮＡ合成が行われたこと、即ち
細胞の増殖が促進されたことがわがる。

■　軟寒天上コロニー形成活性 ＮＲＫ４９ＦＣラット腎繊維芽細胞）等の細胞は軟寒天
培地では殆んど増殖しないが、ＴＧＦ−β（トランスフ
ォーミンググロースファクタータイプβ）の存在下に、
ＥＧＦが共存すると増殖してコロニーを形成する（Ｊ、
Ｅ、　ＤｅＬａｒｃｏ　ａｎｄ　Ｇ、　Ｊ。

Ｔａｄａｒｏ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、、　ＵＳ＾、、　７５４００１−（Ｉ９７８
）　、Ａ、　Ｂ、　Ｒｏｂｅｒｔｅｔ　　ａｉ、、　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＬＩＳＡ、、　７７、３４９
４−３４９８（Ｉ９８０）等参照〕。

即ち、ＥＧＦは上記軟寒天上コロニー形成活性を有して
いる。

■　新生仔マウス眼瞼開裂及び切歯萌出促進活性新生仔
マウスに、ｃＥＧＦを２４時間毎に皮下注射し、各被検
動物の眼瞼が開裂する日及び切歯の出現する日を記録す
る。

ｃＥＧＦの投与によれば、之等に要する日数は顕著に短
縮される。

本発明のポリペプチドは、上記■〜■に示されるような
生物活性を有し、これは上皮細胞成長因子の性質を有し
ているため、薬理作用があり、特にその組成物は医薬や
化粧料として有用である。

医薬としては胃酸分泌抑制剤、抗カイヨウ剤、消化管粘
膜保護剤、カルシウム遊離促進剤、鎮痛剤、抗炎症剤、
発育促進剤、腸機能改善剤、肝疾患治療剤、皮膚科用剤
、創傷治療促進剤、あるいは角膜修復剤、点眼剤などの
眼科用側などとして有用であり、また化粧料としては、
種々の化粧料基剤と共に化粧水、乳液などの基礎化粧料
、口紅などのメイクアップ化粧料として有用である。

本発明の肝疾患治療剤は、本発明のポリペプチドを雌雄
マウス、ラット各１群６匹に対して皮下注射で１０ｍｇ
／ｋｇ、静脈内注射で１ｍｇ／ｋｇ（ヒト血中ＥＧＦ濃
度の約１００万倍及び１０万倍量に相当）を投与しても
一般症状に変化なく、低毒性である。

その投与量は患者の年令、体重、病状に応して決めれば
よい。経口的及び非経口的（注射を含む）には通常成人
の１日当りの有効成分として１０ｎｇ〜１１０Ｔｌ１程
度が望ましい。また、投与に当っての望ましい具体例は
、この１日当りの投与量を１日１回ないし数回投与させ
ることによって与えろる単位量をもつ形態、例えば錠剤
、カプセルなどを用いることである。

本発明のポリペプチドを用いた鎮痛剤は、例えば外傷、
疾病による痛み全般を抑制する作用を有し、その作用は
酢酸によって引き起こされる苦悶（ライジング）の回数
を抑制するかどうかを指標とした薬理学的側面からの実
験に基づいて確認することができる。その投与量は、年
令、体重により適宜増減するが、非経口的には通常成人
の１日当りの有効成分として１７７ｇ〜１ｍｇを用いる
のが望ましい。

本発明のポリペプチドを用いた抗炎剤による抗炎症作用
は、１）ヒスタミンによるラット皮膚血管透過性抑制作
用、及び２）酢酸によるマウス腹腔血管透過性抑制作用
の二つの薬理学的側面とした実験によりｎ認することが
できる。

実験によりその効果を確認した。

実験例１ 四塩化炭素肝障害モデルを用い、本薬剤の有効成分の効
果を以下のようにして調べた。

モー゛ル　　いた （Ｉ）実験動物 ｄｄＹ系雄性マウス、恒温（２３±０，５°Ｃ）恒４　
（６０±５％）室で１週間以上予備飼育したのち、健康
と思われる体重３５〜３８ｇのマウスを選び、５〜８匹
を１群として本実験に用いた。

（２）実験方法 ｄｄＹ系雄系中マウス検液を５１１１／ｋｇ皮下注射し
、３０分後に３％四塩化炭素２　ｄ／ｋｇを皮下注射し
た。そして、この時より２５時間後に眼窩静脈叢より採
血して、血清を調製した。この血清を希釈し、トランス
アミナーゼＣローテスト（Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ　
ＣＩＩ　−ｔｅｓｔ）　（和光）を用いて（、ＯＰおよ
びＧＰＴ値を測定した。なおこれらの測定値はカーメン
（Ｋａｒｎｅｎ）単位／ｄを表現した。

被検液は下記のものを用いた。

（イ）生理食塩水（０，０１％Ｔｗｅｅｎ　８０を含む
）（対照） ５１１１／ｋｇ （ｏ）ｃＥｃＦ　（０，Ｉ　Ｎ酢酸に溶解させたのち、
上記の生理食塩水で希釈した。） １０ｐｇ／ｋｇ→５　ａｔ！／ｋｇ （Ａ）ＣＥＧＦ　　　１１００ｕ／ｋｇ→５ｍ／ｋｇ（
３）実験結果 実験によると、ｃＥＧＦは十分大きな肝障害抑制作用を
有することが認められた。

実験例２ 一イジング （Ｉ）実験動物 ｄｄＹ系雄性マウス恒温（２３±０．５°Ｃ）、恒温（
６０±５％）室で１週間予備飼育したのち、健康と思わ
れる体重２８〜３５ｇのものを１群６〜７匹として実験
に供した。

（２）実験方法 マウスにｃＥＧＦを皮下投与し、３０分後に０．６％酢
酸（０，１ｄ／ｋｇ）を腹腔内投与してからさらに１０
分間経過した後１０分間に観察されたライジング数（特
有の苦悶症状数）を測定した。

なお、供試被検液は下記の通りである。

（イ）生理食塩水（０，０１％　Ｔｗｅｅｎ　８０を含
む）（対照） Ｉｏｎ／ｋｇ （ｏ）ｃＥＧＦ　（０，Ｉ　Ｎ酢酸に溶解させたのち、
生理食塩水で希釈したもの） ３０ｐｇ／ｋｇ→１０ｍ／ｋｇ （３）実験結果 上記の実験の結果によると、十分大きな抑制作用がある
ことが認められた。

実験例３ ヒス　ミンによる−　ト （Ｉ）実験動物 ＳＤ系雌雄性ラット恒温（２３±０．５°Ｃ）、恒温（
６０±０．５％）室で少なくとも１週間予備飼育したの
ち、健康と思われる体重２１０〜２３０ｇのランドを１
群４匹として実験に使用した。

（２）実験方法 あらかじめラットの背部を剪毛し、被検液を起炎剤投与
３０分前に皮下投与しておき、ついでラットの背部にお
いて正中線に対象の位置に、起炎剤として塩酸ヒスタミ
ン１００μｇ１０．１ｄを皮肉注射し、直ちにエバンス
・ブルー（Ｅｖａｎｓ　ｂｌｕｅ）　２０ｍｇ　／ｋｇ
を静脈内に注射した。１５分後にラットを放血致死させ
たのち、背部の皮膚をはがして、色素漏出部の面積（長
径×短径）を測定した。ついで、上記色素漏出部分をパ
ンチ（直径μ輪）で打抜いたのち、これを細切し、つい
で０．３％硫酸ナトリウム（Ｎａｚｓｏａ）　：アセト
ン（＝１７）の混液を用いて色素を抽出し、抽出液を濾
過後、吸光度６２０ｎｍを測定し、あらかじめ作成して
おいた検査線により色素濃度を算出して、色素漏出部分
あたりの色素漏出量（μｇ／部分）を求めた。

なお、被検液は下記のものを用いた。

（イ）生理食塩水（０，０１％Ｔｗｅｅｎ　８０を含む
）（対照） ２紙／ｋｇ （ｏ）　　ｃＥＧＦ　（０，Ｉ　Ｎ酢酸に溶解させたの
ち、生理食塩水で希釈した。） １００ａｇ／ｋｇ→２雌／ｋｇ （ハ）インドメサシン（０，５％カルボキシメチルセル
ロース−ナトリウム含有生理食塩水に？Ａ濁させた。） ２０ｐｇ／ｋｇ→２ｄ／ｋｇ （３）実験結果 上記の実験の結果によるとｃＥＧＦは十分大きな抗炎症
作用を有することが認められた。

本発明のポリペプチドを用いて前記の各種医薬を構成す
るさいには、通常用いられている各種添加剤を使用する
ことが出来、このような各種添加剤としては具体的には
次のようなものを用いることができる。

担体（賦形剤、結合剤、希釈剤等）、安定剤、熔解補助
剤などがある。担体としては、たとえば炭酸カルシウム
、乳糖、ショ糖、ソルビット、マンニット、デンプン、
アミロペクチン、セルロース誘導体、ゼラチン、カカオ
脂、水、パラフィン、油脂等がある。水、パラフィンお
よび油脂の場合は、これを溶液として使用する外に本発
明の医薬をエマルジョンないしサスペンションの状態に
することもある。

投与の剤形としては、粉末、顆粒、細粒剤、錠剤、丸剤
、カプセル材、トローチ、生薬、ローション剤、注射薬
（たとえば注射用蒸留水や種々の液に本発明のポリペプ
チドを溶解又は懸濁させる）軟膏剤、パップ剤など投与
可能な任意のものがある。これらは、経口的または非経
口的（注射を含む）に投与することができるうえ、必要
に応して他の薬剤を調合させてもよい。

本発明の化粧料に含有される前記ポリペプチドの含有量
は、通常０．００１〜５．０重量％、好ましくは０．０
０５〜２．５重量％である。０．００１重量％より少な
い量では充分な効果が得られない。また５重量％を超え
る量では効果の増強がないので不経済である。

また、各種生化学、薬理学等の分野で人類が実験動物と
して用いられており、そのｃＥＧＦの組織、体液中の増
減を正確に測定する系が必要であるが、このｃＥＧＦを
抗原としてｃＥＧＦ特異抗血清乃至特異モノクローナル
抗体を作成し、之等を利用したｃＥＧＦを正確に測定す
るアッセイ系をつくることができ、このｃＥＧＦはその
ための抗原として有用である。更に加えて、これは他の
動物由来のＥＣＦと同様に、組織培養培地の成分として
も有用である。

〔実施例〕

以下に、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げ
る。

なお、各実施例におけるｃＥＦＧのＥＧＦ活性の測定は
、以下にラジオリセプターアソセイ（ＲＲＡ）により実
施した。

ＲＲＡによるＥＧＦ活性の測定 ｃＥＧＦのＥＧＦ活性の測定を、Ａ４３１細胞を用いた
ＲＲＡにより実施した。

用いたＡ４３１細胞は、ヒト類上皮癌由来の細胞株であ
り、細胞表面に多くのＥＧＦレセプターを持つことが知
られている（Ｒ，Ｎ、　Ｆａｂｒｉｃａｎｔ　ｅｔ。

ａｌ、　　Ｐｒｏｃ、　ｎＮａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、、　ＵＳ＾、、　７４．５６５゜（Ｉ９７７）　
）。

本ＲＲＡは、上記Ａ４３１細胞表面のＥＣＦリセプター
に対するｃＥＧＦとヒトＥＧＦの結合の競合反応を利用
したものであり、以下の各操作に従い実施された。

Ａ４３１細胞の調整 Ａ４３１細胞を下記組成の１０％生胎児血清（Ｆｅ２）
添加ＤＭＥ培地２Ｏｄ中で、５％ＣＯ□の存在下に３７
°Ｃの条件で３日間培養した。

１０％ＦＣ３添加ＤＭＥ培地 ダルベツコ変法イーグル培地　　　　９０〇−Ｌ−グル
タミン　　　　　　　　　０．６ｇ１０％炭酸水素ナト
リウム水溶液　　１０ｍストレプトマイソン　　　　　
　　２００ｍｇペニシリン　　　　　　　　　　　２０
万ＵＦＤ３　　　　　　　　　　　　　１００ｍその後
、細胞を懸濁させ、細胞数を計数後、２０ｄの１０％中
性ホルマリン液を加え、３０分間、４°Ｃに放置した。

次いで各の組成のＤ−ＰＢＳで数回洗浄し、分注後、凍
結乾燥させて保存した。

−ＰＢＳ 塩化ナトリウム　　　　　　　　　８．０ｇ塩化カリウ
ム　　　　　　　　　　０・２ｇリン酸二ナトリウム　
　　　　　　１．１５ｇリン酸−カリウム　　　　　　
　　　０．２ｇ合計　　　　　　　　　　　　　　Ｉｆ
測定方法 スタンダードとしてヒトＥＧＦを用いた。またヒトＥＧ
Ｆをクロラミン法によりヨード化して１２Ｓｌ−ヒトＥ
ＧＦを調整した。スタンダード、２５１−ヒトＥＧＦ、
Ａ４３１細胞及び測定検体は、全て０．１％生血清アル
ブミンを含むＤ−ＰＢＳの溶液または懸濁液として利用
した。

まず、スタンダードまたは測定検体０゜２Ｉ１１と約３
０万ｃｐｍ／ｍの＋２５】−ヒトＥＧＦ　０．１ｍとを
混合し、次いで混合液に約１００万細胞／ｄのＡ４３１
細胞０．２−を加えて２５°Ｃで２０時間放置した。そ
の後、０．１％生血清アルブミン（ＢＳＡ）添加Ｄ−Ｆ
ＢＳ　　ｌａｆを加えて、４　’Ｃにて遠心分１　（３
０００回転／分、　３０分間）を行ない、上澄を捨てた
。次に沈渣の放射能をＴ−カウンターにて測定し、スタ
ンダートから得られる標準曲線に基づいて、検体のＥＧ
Ｆ活性をヒ）ＥＧＦ換算値として求めた。

標準曲線の一例を第１図に示す。図において、縦軸はＡ
４３１細胞に対する＋２５■−ヒ）ＥＧＦ結合比（Ｂ／
Ｂｏ（％）〕を、横軸はヒトＥＧＦ量（ｐｇ／アッセイ
チューブ）をそれぞれ示す。

実施例１ ’ＥＧＤの　　　　１ ■、ビーグル大５０頭から人尿を採取した。採取直後に
ガーゼにて尿より固形物を除去し、酢酸濃度が１０％（
Ｖ／Ｖ）になるよう氷酢酸を加え、必要量の尿が採取さ
れる迄冷凍保存した。採取した約５５Ｅの人尿を室温に
て融解し、ろ紙（Ｎｏ、２）でろ過したのち、２Ｍにな
るように硫酸アンモニウム粉末を添加熔解した。次に該
尿を２Ｍｆｆｆｉ酸アンモニウムで平衡化したブチルト
ヨパール６５０Ｃ（東ソー社製）を約２０００１１１充
填したカラム（９，８Ｘ２７ｃｍ）に吸着させた。該カ
ラムを０．８Ｍ硫酸アンモニウム溶液４１で洗浄した後
、０．４Ｍ硫酸アンモニウム溶液、０．２ＭｆＬ酸アン
モニウム溶液、水ついでアセトニトリル及び１０％酢酸
溶液の１＝１混合液にて溶出し各溶出液をプールした。

これらの溶出液のうちアセトニトリル及び１０％ｈ　酸
ｍ液の１：１混合液中にＥＧＦ活性が張られ、回収され
たｃＥＧＦ量、すなわち人尿５５１から得られたｃＥＧ
Ｆ活性量は１２９０μｇ　（組換えヒトＥＧＦ換算値）
であり、蛋白質量は１１３０１ｍｇ（牛血清アルブミン
換算値）であった。

■、上記■のブチルトヨパール６５００カラムクロマト
グラムによって得られた尿５５！分のｃＥＧＦ画分を、
ロータリーエバポレータＮＥ−１（東京理化機械株式会
社製）を用い約３０°Ｃにて減圧ｆｉ縮し、水に対して
透析した後、１０％（Ｖ／Ｖ）になるよう氷酢酸を加え
、３０００ｄのｃＥＧＦ含有試料を得た。かくして得ら
れた試料を１０％（Ｖ／Ｖ）酢酸溶液で平衡化したＳＰ
−トヨパール６５０Ｍ　（東ソー社製）を２００−充填
したカラム（６Ｘ１（ｌｄ）に吸着させた。該カラムを
１０％（Ｖ／Ｖ）酢酸溶液で洗浄した後、塩化ナトリウ
ムを段階的（Ｉ度０、ＩＭ、０．２Ｍ、０．４Ｍ、０．
６Ｍ、　１．０　Ｍ）に添加した酢酸アンモニウム緩衝
液（ｐＨ４，５）を用いて溶出し各溶出液をプールした
。これらの溶出液のうち０．４Ｍおよび０．６Ｍ塩化ナ
トリウム添加酢酸緩衝液中にＥＧＦ活性が見られた。こ
のＥＧＦ活性が見られた両分を合わせて水に対して透析
し凍結乾燥した。

凍結乾燥した該試料を１９０ｄの２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ６，５）で溶解し、更に同２ｍＭリン酸緩衝液で
平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍ（東ソー社製
）を２０Ｗ１充填したカラム（２，５Ｘ４Ｃ■）に吸着
させて、２０ｍＭリン酸緩衝液で洗浄した結果、ＥＧＦ
活性は非吸着画分にのみ見られた。

この非吸着画分は水に対して透析し凍結乾燥した。

■０次に■、で得られた試料を２０ｍＭ）リス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７，７）　３　Ｉｌｌに溶解し、同２０ｍＭ
）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，７）で平衡化したＤＥＡ
Ｅ＝トヨパール６５０５　（東ソー社製）を７６ｍ充填
したカラム（２，２Ｘ２０ｄ）にアプライした後、ＭＰ
ＬＣ（ウォーターズ社製、ポンプ：　Ｍ６００マルチソ
ルベント送液システム、検出器＝４９０型超高感度多機
能検出器）による分取を行った。また、溶出には同２０
ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐ！（７，７）にＯＭからＩ
Ｍまで塩化ナトリウム濃度を変化させたリニアグラシュ
エンド溶出を流速４１１１！／分で行い、２８０ｎｍの
吸光度を測定し、同時に各溶出液に対しＥＧＦ活性を調
べた。

その測定結果Ｈ第２図に示す。

図において縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度を、横軸は
溶出時間（分）を示す。また図には各溶出液にＲＲＡに
て測定したＥＣＦ活性を斜＆！にし棒グラフとして示し
た。

図に示されるようにＥＧＦ活性を有する溶出画分は２ピ
ークを示し、以後溶出順にＡ画分、Ｂ画分とする。

Ａ画分、Ｂ画分は各々水に対して透析し凍結乾燥した。

０１次に■、で得られたＡ画分、ＢＷｉ分を別々に精製
を進める。まず、２〆の５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６
，３）にＡ画分を溶解し、ＴＳＫゲル−〇ＤＳ−１２０
Ｔカラム（東ソー社製、内径４．Ｅ＋ｗｍ　Ｘ　２５ｍ
ｍ）を用い、先のＭＰＬＣと同様の液体クロマトグラフ
ィーのシステムを用いたＨＰＬＣを、５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ６，３）　ニｌＯ％（Ｖ／Ｖ）から３０％（
Ｖ／Ｖ）までアセトニトリル濃度を変化させたリニアグ
ラシュエンド溶出を流速１ｄ／分で行い、ＥＧＦ活性を
有する画分を分取した。該試料をＴＳＫゲル−ＯＤ　Ｓ
−１２０Ｔカラムを用い０．０５％トリフルオロ酢酸に
２０％（Ｖ／Ｖ）から４５％（Ｖ／■）までアセトニト
リル濃度を変化させたリニアグラシュエンド溶出を流速
１ｍ１／分で行うＨＰＬＣをくり返し分取精製した。更
にＡ分画はＴＳＫゲル−〇　Ｄ　Ｓ−１２０Ｔカラムを
用い、精製と同一の条件で分析し、単一のピークになる
事を確認し、ｃＥＧＦｌとした。

また、Ｂ画分についてもＡ画分と同様にＴＳＫゲル−〇
　Ｄ　Ｓ−１２０Ｔカラムを用いた５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐ）Ｉ　６．３）　／　（Ｉ０％→３０％）アセト
ニトリル・リニアグラシュエンド溶出および０．０５％
トリフルオロ酢酸／（２０％→４５％）アセトニトリル
・リニアグラシュエンド溶出をくり返し行いｃＥＧＦ２
を単離した。

第３関においてはＡ画分およびＢ画分のＴＳＫゲル−０
ＤＳ−１２０Ｔカラムを用いた０、０５％トリフルオロ
酢酸／　（２０％→４５％）アセトニトリル・リニアグ
ラシュエンド熔出ＨＰＬＣの結果を示す。

図において縦軸は２８０ｎｍにおける吸光度を、横軸は
保持時間を（分）を示す。咳図よりｃＥＧＦｌおよびｃ
ＥＧＦ２の単一でシャープなピークが保持時間約１６分
および約１８分に溶出されることがわかった。

また、上記各精製ステ・ノブの要約を示せば、下記第１
表の通りである。表において総蛋白量（μｇ）は生血清
アルブミン（ＢＳＡ）を標準としてローリ−法により測
定し、全活性（μｇ、　ｅｑ、）は前記ＲＲＡ法により
測定した。

第 表 等電点の測定はファーストゲル］ＥＦ３−９（Ｐｈａｓ
ｔ　Ｇｅｌ　　Ｉ　Ｅ　Ｆ　３−９　　ファルマソア社
製）を支持体として電気泳動を行った。

即ち、ファーストゲル１ＥＦ３−９にｃＥＧＦｌ、ｃＥ
ＧＦ２をアプライしファーストシステム（ファルマシア
製）を用いて等電点電気泳動を行った。その後クマソー
プリリアントブルーＲ２５０にて染色しファルマシア社
製ＩＥＦマーカー（ｐｌ（２，５〜６．５）と比較した
。その結果ｃＥＧＦ１は５．０付近またｃ　ＥＧＦ２は
４．９付近に各々単一のバンドが見られた。

実施例２ ±ｌΩＬ吏巷立 （Ｉ）アミノ酸組成 ｃＥＧＦｌ及びｃＥＧＦ２ｉ液（実施例１で得た物）約
２ｐｇ相当量を、硬質ガラスサンプル管（日型理化硝子
社製、６　Ｘ５０＋ｎ＋＋＋）に取り、加水分解用反応
バイアル（ピース社製）に入れ、真空乾固後、６Ｎ塩酸
（含１％フェノール）２００ｔ！ｇを該反応バイアルに
入れ、減圧密封し、１３０°Ｃで４時間加水分解反応を
行なった。

反応後、サンプル管に０．０２Ｎ塩酸４００ｐｌを加え
、アミノ酸分析用サンプル管に移し、その２５０ｐ！を
日立高速アミノ酸分析計（日立社製）に自動注入し、ア
ミノ酸組成に分析を行なった。なお、検出はＯＰＡ　（
オルトフタルアルデヒド）法を用いた。

この方法ではＰｒｏ（プロリン）　、Ｃｙｓ　（システ
ィン）およびＴｒｐ（）リプトファン）は検出されない
。

Ｐｈｅ（フェニルアラニン）を１個含むものとして、 その組成比を算出した結果を以下第２表に示す。

第 表 （２）アミノ酸配列の分析 ｃＥＧＦｌおよびｃＥＧＦ２を還元カルボキサミトメチ
ル化を行なった後、アミノ酸配列の分析を行なった。す
なわち各Ｅ　Ｇ　Ｆ　溶液（３０ｐｌから５０ｐｌ）に
対し、５Ｍ塩酸グアニジンを添加した０、０８Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８，３＞４００μ！を添加し、ＤＤ
Ｔ溶液（２０μ！〜３０ｐＺ）をｃＥｃ；Ｆｌ試料には
２０ｐｌ、そしてＥＧＦ２試料には３０μ！添加後、５
０°Ｃの水浴中で２時間反応させて還元カルボキサミト
メチル化した。その後各試料に４．４５％（Ｗ／Ｖ）ヨ
ードアセトアミド溶液をｃＥＧＦ１試料には４０μ！、
そしてｃＥＧＦ２試料には６０μ！添加し３０分間反応
させた後１０％（ｗ／ｖ）トリフルオロ酢酸溶液を各５
０ｐｌずつ加え反応を停止させた。かくして還元カルボ
キサミド、メチル化されたｃＥｃ；ＦｌおよびｃＥＧＦ
２のアミノ酸配列を、４７７Ａ／１２ＯＡ型気相式プロ
ティン・シークエンサー（アブライドハイオシステムズ
社製）を用いて分析した。

その結果は、前記式（Ｉ）に示した通りであり、かくし
て本発明ｃＥＧＦ１およびｃＥＧＦ２の一次構造が決定
された。

（３）生物活性の測定（軟寒天中コロニー形成活性）０
．６％寒天（Ａｇｅｒ　Ｎｏｂｌｅ、デイフコ社製）お
よび５％仔牛血清を含むダルベツコ改変イーグル培地（
ＤＭＥ）を、直径３５１Ｉ！１のシャーレに２ｄづつ分
注して固化させた。別に０．３％寒天、５％仔牛血清、
ｌｎｇ／ｄヒトＴＧＦ−βおよび種々の濃度のｃＥＧＦ
ｌ、ｃＥＧＦ２またはヒトＥＧＦを含むＤＭＥ培地３．
５　ｍに７．５　ＸＩＯ’細胞／ｄのＮＲＫ−４９に細
胞１４０ｐｌを加え、このもの１−を前記０．６％寒天
培地上に注ぎ、３０分間室温にて放置して固まらせた。

これを炭酸ガス培ｔｉ中で３７℃で５％ＣＯ２の条件下
で７日間培養した後、３１００、ａ”以上（６０−直径
）のＮＲＫ−４９Ｆ細胞のコロニーを顕微鏡下で計数し
た。

得られた結果を第４図に示す。図において緬軸はコロニ
ーｆｉｌＸ１０！／シャーレを、横軸は用いたＥＧＦの
濃度（ｎｇ／ａｆ）を示す。また図中、Ｏ○、・−・、
は本発明犬ＥＧＦ、Δ−Δは対照とするヒトＥＧＦをし
めす。

第４１２１より、本発明のｃＥＧＦｌおよびＣＥＧＦ２
は、ヒトＥＧＦと同様に、ＴＧＦ−βの共存下で軟寒天
中のコロニー形成活性を有することがあきらかである。

実施例３ 化［水 次の各成分を均一に溶解して化粧水を調製した。

各成分の含有割合は重量％である。以下の例も同様であ
る。

グリセリン　　　　　　　　５．０ エチルアルコール　　　　　　５．０ クエン酸　　　　　　　　　　　　０．１クエン酸ナト
リウム　　　　　０．１ ｃＥＧＦ　　　　　　　　　　　　Ｏ，０５バラオキシ
安息香酸メチル　　０．１ 香料　　　　　　　　　　　　適宜 精製水　　　　　　　　　　８９．６ 実施例４ １丘 次の成分Ａ及び成分Ｂをそれぞれ７０〜７５°Ｃに加熱
熔解した後、成分Ａに成分Ｂを加えて乳化し、冷却途上
にて成分Ｃを加えて混合し、３０℃まで冷却し、目的と
する乳液を得る。

Ａ）ステアリン酸　　　　　　　　　　５．０セチルア
ルコール　　　　　　　　５．０スクワラン　　　　　
　　　　　　２．０グリセリンモノスチアレート　　　
１．３ソルビタンモノオレート　　　　　　１．５ポリ
オキシエチレンソルビタン モノオレート　　　　　　　　　　０．８Ｂ）グリセリ
ン　　　　　　　　　　６，０トリユクノールアミン　
　　　　　０，７パラヒドロキシ安息香酸メチル　　０
．１精製水　　　　　　　　　　　　７７．６Ｃ）　ｃ
ＥＧＦ　　　　　　　　　　　　　Ｏ，０１香料　　　
　　　　　　　　　　　適宜実施例５ Ｌユニ人 次の各成分を均一に混合してクリームを調製した。

Ａ）ステアリン酸　　　　　　　　　　５．０七チルア
ルコール　　　　　　　１．０流動パラフイン　　　　
　　　　６．０ワセリン　　　　　　　　　　　　５．
０セレシンワンクス　　　　　　　５．０グリセリンモ
ノスチアレート２．５ ソルビタンモノスチアレート　　　０．５Ｂ）プロピレ
ングリコール　　　　　５．０水酸化カリウム　　　　
　　　　　０．５バラヒドロキシ安息香酸メチル　０．
１精製水　　　　　　　　　　　　６９．４Ｃ）ｃＥＧ
Ｆ　　　　　　　　　　　　０．０１香料　　　　　　
　　　　　　　適宜 実施例６ 歎清１１ 次の成分を６０°Ｃに加熱して熔解した後、混合し、徐
々に温度を下げて軟膏剤を得た。

ポリエチレングリコール４００　　　　　４０．０ポリ
エチレングリコール６０００　　　　５９．８メントー
ル　　　　　　　　　　　　０．１防腐剤　　　　　　
　　　　　　　　　適宜ｃ　Ｅ　Ｇ　Ｆ　　　　　　　
　　　　　　　　Ｏ，０５実施例７ 口紅 次に示す成分Ａを加熱熔解し均一に混合す−る。

これに成分Ｂを加え、ロールミルを用いて練り均一に分
散させる。これを再度、融解し成分Ｃを加える。脱泡後
、型に流し込み、ついで急冷して固め目的とする口紅を
得る。

Ａ）ヒマシ油　　　　　　　　　　　　４５．０ヘキサ
デシルアルコール　　　　２５．０ラノリン　　　　　
　　　　　　　５．０ミツロウ　　　　　　　　　　　
　４．０キヤンデリラロウ　　　　　　　６．０カルナ
ウバロウ　　　　　　　　　５．０酸化防止剤　　　　
　　　　　　適宜 防腐剤　　　　　　　　　　　　適宜 Ｂ）カラーヘース　　　　　　　　　０．５Ｃ）　ｃＥ
ＧＦ　　　　　　　　　　　　　Ｏ，０１香料　　　　
　　　　　　　　　適宜 〔発明の効果〕 本発明のポリペプチドは新規なものであって、従来知ら
れているｃＥＧＦを構成する物質に対応するものである
が、ｍＥＧＦと同様に巾広い生物活性を有するもので、
有用である。

これらの物質はこれらを抗原とするアッセイ系の測定に
有用である。

また、これらの物質は、細胞増殖促進活性、新生仔マウ
ス眼瞼開裂促進作用、切歯助出促進作用を初めとする多
様な生物活性を有しているため、これらの作用を利用し
た医薬品あるいは化粧料として用いることができる。

本発明の製造方法は、本発明のポリペプチドを分離法あ
るいは合成法により容易に製造することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＥＧＦの測定のためのＲＲＡ法の標準曲線を示
すグラフである。 第２図は本発明犬ＥＧＦのＤＥＡＥ−）コバールＳカラ
ムを用いたイオン交換法によるクロマトグラム、及び各
画分のＥＧＦ活性をＲＲＡ法で測定した結果を棒グラフ
で示したものである。 第３図は本発明ｃＥＧＦ１及びｃＥＣ；Ｆ２のＯＤ　Ｓ
−１２０Ｔカラムを用いた逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃノクロマト
グラムである。 第４図は本発明ｃＥＧＦＩ及びｃＥＧＦ２の有する軟寒
天中コロニー形成活性の測定結果を示すグラフである。 第１図 ３２０　　　６４０　　１２８０　　２５６０’５１２
０組換えヒトＥＧＦ　　（ｐｑ／１ｕｂｅ）溶出時間（
’ｍ１ｎ） 第３図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の式（ I ）で示されるアミノ酸一次配列を有
   することを特徴とするポリペプチド。 式（ I ） 〔Ｎ末端側〕 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 Ｌｅｕ−Ｘｍ（ＸはＡｒｇであり、ｍの数は０又は１で
   ある） 〔Ｃ末端側〕 ２、請求項１記載のポリペプチドを有効成分として含有
   することを特徴とする医薬。 ３、請求項１記載のポリペプチドを有効成分として含有
   することを特徴とする化粧料。 ４、イヌ尿より抽出精製により請求項１記載のポリペプ
   チドを分離することを特徴とするポリペプチドの製造方
   法。