JPH04120096A

JPH04120096A - プロテアーゼインヒビターＢｂｒＰＩ及びその製造法

Info

Publication number: JPH04120096A
Application number: JP2238976A
Authority: JP
Inventors: Juzo Udaka; 重三鵜高; Akio Tsuboi; 昭夫坪井; Yasuhiro Shiga; 志賀　靖弘
Original assignee: Higeta Shoyu Co Ltd
Current assignee: Higeta Shoyu Co Ltd
Priority date: 1990-09-11
Filing date: 1990-09-11
Publication date: 1992-04-21
Anticipated expiration: 2010-04-05
Also published as: JPH0730118B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は新規プロテアーゼインヒビター及びその製造方
法に関するものである。

（従来技術及び問題点）細胞内の蛋白質分解は、細胞内で起こる非常に多くの生
理的反応、例えば自己蛋白質の代謝回転、外来性蛋白質
、ペプチドの分解・異常蛋白質の除去、細胞内小器管と
分泌蛋白質のプロセッシング、情報伝達、細胞増殖・分
化などの酵素反応あるいは調節に関与している。細胞内
は多数のコンパートメントからなる複雑な構造をしてお
り、直接、蛋白質分解に関与するプロテアーゼは厳密な
コントロールが必要となる。プロテアーゼインヒビター
はプロテアーゼの作用をただちに抑制する物質としてき
わめて有効であり、重要なプロテアーゼの制御系の一要
素である。

また微生物工業や発酵工業において、微生物が目的とす
る蛋白質をたとえ分泌生産しても、プロテアーゼが存在
する場合には、このプロテアーゼによって目的蛋白質が
分解されてしまう。しかしながらこのような系において
プロテアーゼインヒビターが存在すれば、プロテアーゼ
の作用が抑制され、その結果として目的蛋白質が効率的
に得られることになる。

プロテアーゼインヒビターは動物・植物・微生物界に広
く存在し、特にトリプシン、キモトリプシン、パパイン
に対応するインヒビターの存在が良く知られている。し
かし、産業上必要な量を供給する迄に至っていないのが
現状である。

（問題点を解決するための手段）プロテアーゼインヒビターの有用性に鑑み、本発明者ら
は、プロテアーゼインヒビターの有利な製造方法を開発
するため鋭意検討を進めた所、バチルス・プレビス菌体
外にプロテアーゼインヒビターを生産していることを見
出した。

ここに単票したプロテアーゼインヒビターは２０５から
３０２個のアミノ酸から構成される蛋白質で、そのアミ
ノ酸配列から今までに知られているプロテアーゼインヒ
ビターとは相違する新規なプロテアーゼインヒビターと
認め、このインヒビターをプロテアーゼインヒビターＢ
ｂｒＰＩと命名するに至った・本発明は、上記新知見を基礎とし、更に研究した結果完
成されたものであって、新規プロテアーゼインヒビター
ＢｂｒＰＩ及びその製造法に関するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明に係るプロテアーゼインヒビターＢｂｒＰＩ（以
下、プロテアーゼインヒビターないし単にインヒビター
ということもある）は、トリプシン、プラスミン、α−
キモトリプシン、ズブチリシン等の蛋白質分解酵素を阻
害する作用するものであり、その主要な性質は次のとお
りである。

ａ）第１図に示されるアミノ酸配列。

ｂ）第２図に示される第２図のアミノ酸配列を含有する
アミノ酸配列。

。ｃ）第３図に示される第２図のアミノ酸配列を含有す
るアミノ酸配列。

ｄ）阻害作用スプクトルトリプシン、プラスミン、α−キモトリプシン、ズブチ
リシンに作用し、その酵素活性を阻害する。

ｅ）作用至適ｐｌ（；　６〜９ｆ）作用至適温度；２０〜４０℃ また、このプロテアーゼインヒビターは、セリンプロテ
アーゼの中でもカリクレインについては。

その酵素活性は阻害しない。そしてまた、金属プロテア
ーゼであるサーモライシンや、チオールプロテアーゼで
あるブロメライン、パパインについても、その酵素活性
は阻害しない。

本発明に係るインヒビターは、バチルス属に属するイン
ヒビター生産菌を培養することによって得られる。

このプロテアーゼインヒビターＢｂｒＰＩ生産菌として
は、例えばバチルスブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅ
νｉｓ）が好適であって、具体的には、バチルス・プレ
ビスＨＰＤ３１（バチルス・プレビス１０２．　ＦＥＲ
ＭＢＰ−１０８７）、バチルスブレビス４７（ＦＥＲＭ
　Ｐ−７２２４）が例示される。

プロテアーゼインヒビターＢｂｒＰＩを製造するには、
このインヒビター生産菌であるバチルス属菌を培養し、
培養物から目的とするインヒビターを分離、採取すれば
よい。

これらの処理は常法にしたがって行えばよく、例えばバ
チルス　プレビスを生育する培地に接種し、２０〜５０
℃で１２〜１５０時間、好ましくは２４〜１２０時間培
養するがそれには通気撹拌培養等各種の培養法が適宜利
用される。

培地としては、グルコース、マルトース、澱粉、コーン
スターチ等の炭素源、ペプトン、肉エキス。

尿素、アンモニア、無機窒素化合物等の窒素源、酵母エ
キス、コーンステイープリカーなどの栄養素等から選ば
れたものを適宜含むものがよい。

得られた培養液は、菌体を除き、上清にプロテアーゼイ
ンヒビターを含有しているので、上清そのままで使用す
ることができる。また、使用する微生物によっては、プ
ロテアーゼインヒビターを菌体内に含有することがある
。その場合には、培養液を遠心分離等に付して菌体を分
離、取得し、菌体を超音波や細胞壁溶解酵素等で処理し
、破砕菌体を遠心分離して除き、粗インヒビター液とす
ればよい。

二のようにして得たインヒビター含有上清や粗インヒビ
ター液は、蛋白質精製の常法にしたがい、塩析、透析、
イオン交換樹脂、ゲル濾過、クロマトグラフ処理、電気
泳動等によって単離、精製することかできる。

例えば、プロテアーゼインヒビターは上清から硫安沈澱
法によって沈澱させて、透析したりして粗プロテアーゼ
インヒビターを得ることができ、更には、透析内液をＤ
ＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィー、トヨパ
ルＨＷ　−５５カラムグロマトグラフイーなどにより精
製プロテアーゼインヒビターを得ることができる。

次に本発明の実施例を示すが、プロテアーゼインヒビタ
ー活性は０．ＯＩＭの塩化カルシウムを含む０．１Ｍ　
トリス・塩酸（ｐＨ７，５）緩衝液６００μＱ、プロテ
アーゼインヒビターを含有する試料１０μＱ、　トリプ
シン（２００μｇ／ｍ１２）　５μΩを混合、５分後、
基質（０，０２Ｍ　Ｎ　−ｂｅｎｚｏｙｌ−Ｌ−ａｒｇ
ｉｎｉｎｅ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）１０μＱ
を加え直ちに４０５ｎｍの吸光度を測定する。

対照としてプロテアーゼインヒビターを含まない時の活
性（ＯＤ値の増加）を測定し、１Ｍｇのトリプシンの活
性を５０％抑える時のプロテアーゼインヒビターの量を
１ｕｎｉｔとして示した。

実施例１゜Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂｒｅｖｉｓ　ＨＰＤ３１（ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−１０８７）　　を液体培地２００ｍＱ（グル
コース１％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．２％、
肉エキス０．５％、ｐｉ（７，０）で３０℃、３日間培
養後、遠心分離することによって菌体を除き、培養上澄
を得た。この培養上澄のプロテアーゼインヒビター活性
を測定したところ９０Ｕ／１ＩＩＱの活性を示した。

この上澄液に０．８飽和になるように硫安を加え、遠心
分離することによってこの沈澱画分を集めた。

この沈澱画分を透析後、５ｅｐｈａｃｒｙＬ　Ｓ　−２
００にゲル濾過を２回行った。この活性画分に０．８飽
和になるように硫安を加え遠心分離によって沈澱を集め
、透析後、モノＱカラムによるイオン交換カラムクロマ
トグラフィーを行い、その活性画分を集めてから、　５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、その活
性のあるバンドを切り出し、プロテアーゼインヒビター
Ｂ　ｂ　ｒ、Ｐ　Ｉを電気溶出した後透析した。透析内
液を凍結乾燥後、活性を測定した結果、約２８０倍に精
製されたプロテアーゼインヒビターＢｂｒＰＩを０　、
０７９ｍｇ得た。精製の過程を第１表に示した。

２、沈澱　　　　　３９０　１１０００　　３．９３、
第１回目ゲノ随鼠過　　　　（ト）　　　７３００　　
　１１４、第２回目ゲノＬ／？ｇＪ　　　　３２　　　
羽００　　　１９５、ＭｏｎｏＱ溶出液　　　　　　２
．６　　９４０　　５０実施例２．プロテアーゼインヒ
ビターＢｂｒＰＩのアミノ酸配列の決定実施例１で精製したプロテアーゼインヒビターＢｂｒＰ
Ｉ　をトリス塩酸緩衝液に溶解し、５ＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行った所、プロテアーゼインヒ
ビターは活性のある各々分子置駒３００００のａ、ｂ、
ｃの三つのバンドに分かれたく第４図）。更にＷｅｓｔ
ｅｒｎ　ｂｌｏｔを行うことにより更に分子量４０００
０程のバンドｄに分かれた（第５図）。

ａ、ｂ、ｃ、ｄ共にプロテアーゼインヒビター活性を有
していた。

ａ、ｂ、ｃ、ｄ各々のアミノ酸配列を自動分析機（ＡＢ
Ｉ　４７７Ａ−１２０Ａ　　プロティンシーケンサ−）
で分析した結果ａ（第１図）、ｂ　（＝　ｃ　）（第２
図）、ｄ（第３図）のアミノ酸配列を得た。　ａ、ｂ（
＝ｃ）、ｄは大部分共通の配列を有していることから、
プロテアーゼインヒビターＢｂｒＰＩは第３図に示され
る成熟蛋白質として生産され一部自己消化のような修飾
過程を得てｂ（＝ｃ）、ａが生じるものと推定された。

（発明の効果）本発明によって、新規物質であるプロテアーゼインヒビ
ターＢｂｒＰＩを大量に生産することがはじめて可能と
なった。

したがって、本発明は、プロテアーセ制御系の解明に有
用であるばかりでなく、医薬としての利用も太いに期待
することができる。またこのインヒビターを利用すれば
、微生物利用工業において、分泌生産された目的とする
蛋白質がプロテアーゼによって破壊変成することがなく
なるので、従来得られなかったりあるいは充分量得るこ
とができなかった蛋白質も自由に得ることも可能となる
。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は、プロテアーゼインヒビターのアミノ
酸配列を示し、第４図はＢｂｒＰＩの５ＤＳ−ＰＡＧＥ
のパターンを示したものであり、第５図はＢｂｒＰＩの
ウェスタン・プロッティングの結果を図示したものであ
る。代理人　弁理士　戸　１）親　男第図糖図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）第１図に示されるアミノ酸配列を含有することを
特徴とするプロテアーゼインヒビターＢｂｒＰＩ。
（２）下記の性質を有することを特徴とするプロテアー
ゼインヒビターＢｂｒＰＩ：ａ）第１図のアミノ酸配列で示されるプロテアーゼイン
ヒビター。ｂ）第２図のアミノ酸配列で示される第１図の配列を包
含するプロテアーゼインヒビター。ｃ）第３図のアミノ酸配列で示される第２図の配列を包
含するプロテアーゼインヒビター。ｄ）阻害作用スプクトル；トリプシン、プラスミン、α−キモトリプシン、ズブチリシンに作用し、その酵素活性を阻害する
。ｅ）作用至適ｐＨ；６〜９ｆ）作用至適温度；２０〜４０℃
（３）バチルス属に属するプロテアーゼインヒビターＢ
ｂｒＰＩ生産菌を培養することを特徴とする請求項１又
は２に記載のプロテアーゼインヒビターＢｂｒＰＩの製
造法。
（４）バチルス属菌がバチルスブレビスであることを特
徴とする請求項３に記載のプロテアーゼインヒビターＢ
ｂｒＰＩの製造法。
（５）バチルスブレビスがバチルスブレビスＨＰＤ３１
（ＦＥＲＭＢＰ−１０８７）及び／又はバチルスブレビ
ス４７（ＦＥＲＭＰ−７２２４）であることを特徴とす
る請求項４に記載のプロテアーゼインヒビターＢｂｒＰ
Ｉの製造法。