JPH0394678A - 新規アスパラギン酸ラセマーゼ - Google Patents
新規アスパラギン酸ラセマーゼInfo
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- JPH0394678A JPH0394678A JP23139589A JP23139589A JPH0394678A JP H0394678 A JPH0394678 A JP H0394678A JP 23139589 A JP23139589 A JP 23139589A JP 23139589 A JP23139589 A JP 23139589A JP H0394678 A JPH0394678 A JP H0394678A
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、Ｄ−アミノ酸の製造に用いるＤ 一トランス
アミナーゼ反応のアミノ基供与体としてのＤ−アスパラ
ギン酸をＬ−アスパラギン酸のラセミ化により供給する
のに有用なアスパラギン酸ラセマーゼ及びその製造方法
に関する。
アミナーゼ反応のアミノ基供与体としてのＤ−アスパラ
ギン酸をＬ−アスパラギン酸のラセミ化により供給する
のに有用なアスパラギン酸ラセマーゼ及びその製造方法
に関する。
（従来技術及びその問題点）
アスパラギン酸ラセマーゼについてはストレブトコッ力
ス フェーカリス（ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａ
ｅｃａｌｉｓ） ＡＴＣＣ９７９０菌株にその存在が示
唆されているに過ぎず単一蛋白としての存在が確認され
ていないばかりかアスパラギン酸のみ成らずアラニンも
ラセミ化する事が知られている。
ス フェーカリス（ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａ
ｅｃａｌｉｓ） ＡＴＣＣ９７９０菌株にその存在が示
唆されているに過ぎず単一蛋白としての存在が確認され
ていないばかりかアスパラギン酸のみ成らずアラニンも
ラセミ化する事が知られている。
（Ｊ．Ｂｉｏ１．Ｃｈｅｍ．２４７（１６）５１０３（
１９７２） ）従って本酵素によりＤ−アミノ酸の製造
に用いるＤ一トランスアミナーゼ反応のアミノ基供与体
としてのＤ−アスパラギン酸をＬ−アスパラギン酸のラ
セミ化により供給することを考えた場合、本酵素の基質
特異性が大きな問題となる。
１９７２） ）従って本酵素によりＤ−アミノ酸の製造
に用いるＤ一トランスアミナーゼ反応のアミノ基供与体
としてのＤ−アスパラギン酸をＬ−アスパラギン酸のラ
セミ化により供給することを考えた場合、本酵素の基質
特異性が大きな問題となる。
（問題を解決するための手段）
本発明者らは、アスパラギン酸をラセミ化しうる酵素の
探索を目的に、アスパラギン酸ラセマーゼ産生能を有す
る菌株を求めて、公知の保存菌株も含めて鋭意に研究を
続けた結果、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属
にアスパラギン酸ラセマーゼ産生能を見出し、ストレプ
トコッカス，サーモフィラスＩＡＭ１００６４にその中
で最も高度に安定性を示すアスパラギン酸ラセマーゼを
産生ずる事を見出し本発明に至った。
探索を目的に、アスパラギン酸ラセマーゼ産生能を有す
る菌株を求めて、公知の保存菌株も含めて鋭意に研究を
続けた結果、ストレプトコッカス属、ラクトバチルス属
にアスパラギン酸ラセマーゼ産生能を見出し、ストレプ
トコッカス，サーモフィラスＩＡＭ１００６４にその中
で最も高度に安定性を示すアスパラギン酸ラセマーゼを
産生ずる事を見出し本発明に至った。
本発明のアスパラギン酸ラセマーゼの理化学的性質につ
いて以下に説明する。
いて以下に説明する。
（ａ）作用：
Ｌ−アスパラギン酸からＤ−アスパラギン酸及びＬ−ア
スパラギン酸を精製するラセミ化反応、ならびにＤ−ア
スパラギン酸からＬ−アスパラギン酸及びＤ−アスパラ
ギン酸を生産するラセミ化反応を触媒する。
スパラギン酸を精製するラセミ化反応、ならびにＤ−ア
スパラギン酸からＬ−アスパラギン酸及びＤ−アスパラ
ギン酸を生産するラセミ化反応を触媒する。
（ｂ）基質特異性：
ラセミ化反応はアスパラギン酸に特異的に作用し、他の
アミノ酸には殆ど作用しない。
アミノ酸には殆ど作用しない。
（Ｃ）至適ｐＨ：
反応測定に於では、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（
ｐＨ５．５−ｓ）［第１図○］、１００ｍＭビロリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐｉ｛７．９ − ９．０） ［
第ｌ図Δ］を用いて検討した。
ｐＨ５．５−ｓ）［第１図○］、１００ｍＭビロリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐｉ｛７．９ − ９．０） ［
第ｌ図Δ］を用いて検討した。
その結果、第１図に示すように、至適ｐＨは、ｐＨ８．
０付近である。
０付近である。
（ｄ）安定ｐＨ範囲
本酵素液０．１ｍｌに対して、後述する各ｐＨ値の緩衝
液を０．４ｍｌ加え、５０℃でｌＯ分間処理し、氷冷し
てサンプルとした。これについて比活性を求めた。緩衝
液はｐＨ４〜６に対しては５０ｍ Ｍ酢酸一酢酸ナトリ
ウム、ｐＨ６〜８にたいしては５０ｍ Ｍリン酸カリウ
ム、ｐＨ８〜９に対しては５０ｍＭ｝リスー塩酸をそれ
ぞれ使用した。
液を０．４ｍｌ加え、５０℃でｌＯ分間処理し、氷冷し
てサンプルとした。これについて比活性を求めた。緩衝
液はｐＨ４〜６に対しては５０ｍ Ｍ酢酸一酢酸ナトリ
ウム、ｐＨ６〜８にたいしては５０ｍ Ｍリン酸カリウ
ム、ｐＨ８〜９に対しては５０ｍＭ｝リスー塩酸をそれ
ぞれ使用した。
その結果、第２図に示すように、本酵素は４５℃、６０
分間の処理ではｐＨ６．５〜８．０付近まで安定である
。
分間の処理ではｐＨ６．５〜８．０付近まで安定である
。
（ｅ）熱安定性：
本酵素液０．１ｍｌに対し、５０ｍ Ｍリン酸カリウム
緩衝液（ｐ Ｈ７．０ ） ０．４ ｍ ｌを加えた試
験管を６本用意し、２５、３７、４５、５０、５５、６
０℃の温度でそれぞれを６０分間処理し氷冷してサンプ
ルとした。これについて比活性を求めた。
緩衝液（ｐ Ｈ７．０ ） ０．４ ｍ ｌを加えた試
験管を６本用意し、２５、３７、４５、５０、５５、６
０℃の温度でそれぞれを６０分間処理し氷冷してサンプ
ルとした。これについて比活性を求めた。
その結果、第３図に示すように、本酵素は６０分間の処
理では５０℃まで安定であるが、５５℃では活性は殆ど
残存しない。
理では５０℃まで安定であるが、５５℃では活性は殆ど
残存しない。
（ｆ）分子量
全分子量の測定は、スーパーローズ１２Ｈ Ｒ１０／
３０のカラム（ファルマシア製）を用いるゲル濾過法で
行なった。標準蛋白質には、牛血清アルブミン（分子量
６７，０００） 、卵白アルブミン（分子量４３，００
０） 、キモトリブシノーゲンＡ（分子量２５，０００
） 、リボヌクレアーゼ（分子量１３， ７００）を用
いた。
３０のカラム（ファルマシア製）を用いるゲル濾過法で
行なった。標準蛋白質には、牛血清アルブミン（分子量
６７，０００） 、卵白アルブミン（分子量４３，００
０） 、キモトリブシノーゲンＡ（分子量２５，０００
） 、リボヌクレアーゼ（分子量１３， ７００）を用
いた。
サブユニットの分子量測定は、ＳＤＳ−スラブ電気泳動
法で行なった。標準蛋白質には、ホスホリラーゼｂ（分
子量９４，０００） 、牛血清アルブミン（分子量６７
，０００） 、卵白アルブミン（分子量４３，０００）
、カルボニツクアンヒドラーゼ（分子量３０，０００
） 、大豆トリプシンインヒビター（分子量２０，００
０） 、α−ラクトアルブミン（分子量１４， ０００
）を用いた。
法で行なった。標準蛋白質には、ホスホリラーゼｂ（分
子量９４，０００） 、牛血清アルブミン（分子量６７
，０００） 、卵白アルブミン（分子量４３，０００）
、カルボニツクアンヒドラーゼ（分子量３０，０００
） 、大豆トリプシンインヒビター（分子量２０，００
０） 、α−ラクトアルブミン（分子量１４， ０００
）を用いた。
その結果、全分子量は６０， ０００である。また、サ
ブユニットの分子量は２８， ０００であり、ＳＤＳ蛋
白質バンドが１つであったことから、本酵素は同一サブ
ユニットの２量体構造であることがわかる。
ブユニットの分子量は２８， ０００であり、ＳＤＳ蛋
白質バンドが１つであったことから、本酵素は同一サブ
ユニットの２量体構造であることがわかる。
（ｇ）アミノ末端側アミノ酸配列
アミノ酸配列の決定は本酵素標品２０ｕｇを用い自動エ
ドマン分解による気相シークエンサーで行なった。
ドマン分解による気相シークエンサーで行なった。
Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｉ
ｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｘ −Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ
−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ本
発明のアスパラギン酸ラセマーゼは、例えばストレプト
コッカス属に属するアスパラギン酸ラセマーゼ産生菌を
培養し、培養物から、アスパラギン酸ラセマーゼを採取
する事によって製造する事が出来る。
ｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｘ −Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ
−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ本
発明のアスパラギン酸ラセマーゼは、例えばストレプト
コッカス属に属するアスパラギン酸ラセマーゼ産生菌を
培養し、培養物から、アスパラギン酸ラセマーゼを採取
する事によって製造する事が出来る。
本発明のアスパラギン酸ラセマーゼの製造方法に用いら
れる微生物は、アスパラギン酸ラセマーゼを産生ずる事
が出来るストレプトコッカス属に属する全ての菌株、突
然変異株、変種を含む。その好ましい具体例は、ストレ
プトコッカス サーモフィラスであり、この種に属する
保存菌としては、ストレプトコッカス サーモフィラス
ＩＡＭ１００６４を挙げる事が出来る。
れる微生物は、アスパラギン酸ラセマーゼを産生ずる事
が出来るストレプトコッカス属に属する全ての菌株、突
然変異株、変種を含む。その好ましい具体例は、ストレ
プトコッカス サーモフィラスであり、この種に属する
保存菌としては、ストレプトコッカス サーモフィラス
ＩＡＭ１００６４を挙げる事が出来る。
本発明のアスパラギン酸ラセマーゼを得るにあたっての
アスパラギン酸ラセマーゼ産生菌の培養は通常の乳酸菌
培地中で行なう事が出来る。例えば、ベプトン、酵母エ
キス、肉エキス、無機塩類などを含む培地が用いられる
。
アスパラギン酸ラセマーゼ産生菌の培養は通常の乳酸菌
培地中で行なう事が出来る。例えば、ベプトン、酵母エ
キス、肉エキス、無機塩類などを含む培地が用いられる
。
培養は固体培地または液体培地のいずれを用いて行なっ
ても良いが、目的酵素を大量に得るためには、液体培地
を用い、静地培養などにより嫌気的条件下で培養を行な
う事が望ましい。
ても良いが、目的酵素を大量に得るためには、液体培地
を用い、静地培養などにより嫌気的条件下で培養を行な
う事が望ましい。
培養温度は菌が生育しアスパラギン酸ラセマーゼが生産
される温度範囲内であれば良いが好ましくは２５〜４５
℃である。培養時間は酵素活性が発現される時間を選べ
ば良いが好ましくは６〜２４時間である。培養のｐＨは
５〜７が好ましい。この培養によって本酵素の大部分は
菌体内に蓄積される。
される温度範囲内であれば良いが好ましくは２５〜４５
℃である。培養時間は酵素活性が発現される時間を選べ
ば良いが好ましくは６〜２４時間である。培養のｐＨは
５〜７が好ましい。この培養によって本酵素の大部分は
菌体内に蓄積される。
培養終了後は培養物をそのまま酵素源として利用しても
良いが、通常は分離精製を行なう。
良いが、通常は分離精製を行なう。
精製法としては通常の酵素精製法を用いる事が出来る。
例えば遠心分離により菌体を集め超音波処理、グイノミ
ルなどの機械的方法によって菌体を破砕する。続いて遠
心分離等により細胞片等の固形物を除き粗酵素液を得る
。つぎにこの粗酵素演を硫安沈殿法により分画し、疎水
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル濾過などによって均一の酵素標品を単離することが
出来る。
ルなどの機械的方法によって菌体を破砕する。続いて遠
心分離等により細胞片等の固形物を除き粗酵素液を得る
。つぎにこの粗酵素演を硫安沈殿法により分画し、疎水
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル濾過などによって均一の酵素標品を単離することが
出来る。
つぎに本発明のアスパラギン酸ラセマーゼの活性測定に
ついて説明する。
ついて説明する。
Ｌ−アスパラギン酸からアスパラギン酸ラセマーゼによ
り生成するＤ−アスパラギン酸をＤ−アミノ酸オキシグ
ーゼによりオキサロ酢酸に酸化的脱アミノし、生じたオ
キサロ酢酸を２．４−ジニトロフェニルヒドラシンと反
応させて、ヒドラゾンを形成せしめ、ヒドラゾンの生成
量を定量する事で反応速度を決定する。表１にしめず様
な反応液を３０〜６０分間、３７℃でインキユベートし
、２．４−ジニトロフェニルヒドラゾン塩酸液を加え、
３０分間３７℃でインキユベートし、ＮａＯＨ溶液を加
え更に３０分間３７℃でインキユベートしヒドラゾンの
生成を４３５ｎｍの吸光度により測定する。
り生成するＤ−アスパラギン酸をＤ−アミノ酸オキシグ
ーゼによりオキサロ酢酸に酸化的脱アミノし、生じたオ
キサロ酢酸を２．４−ジニトロフェニルヒドラシンと反
応させて、ヒドラゾンを形成せしめ、ヒドラゾンの生成
量を定量する事で反応速度を決定する。表１にしめず様
な反応液を３０〜６０分間、３７℃でインキユベートし
、２．４−ジニトロフェニルヒドラゾン塩酸液を加え、
３０分間３７℃でインキユベートし、ＮａＯＨ溶液を加
え更に３０分間３７℃でインキユベートしヒドラゾンの
生成を４３５ｎｍの吸光度により測定する。
本酵素に於ける酵素活性単位は、１μｍｏｌ／ｍｉｎの
Ｄ−アスパラギン酸を生成する酵素量をｌ ｕｎｉｔ
（単位）と定義する。比活性は酵素蛋白質１ｍｇ当り０
単位数で表す。
Ｄ−アスパラギン酸を生成する酵素量をｌ ｕｎｉｔ
（単位）と定義する。比活性は酵素蛋白質１ｍｇ当り０
単位数で表す。
つぎに実施例によって本発明のアスパラギン酸ラセマー
ゼの製造方法を説明するが本発明はこれに限定されるも
のではない。
ゼの製造方法を説明するが本発明はこれに限定されるも
のではない。
（実施例）
ストレプトコッカス サーモフィラスＩＡＭ１００６４
を表２にしめず培地で３７℃、５〜２０時間静地培養を
行ない得られた菌体を超音波で破砕後遠心分離等の手段
にて無細胞抽出液を調製し、粗酵素液を得る。
を表２にしめず培地で３７℃、５〜２０時間静地培養を
行ない得られた菌体を超音波で破砕後遠心分離等の手段
にて無細胞抽出液を調製し、粗酵素液を得る。
粗酵素液を先ず硫安分画し以後フエニルーセファローズ
、セフアクリルＳ−３００．ＤＥＡＥ一セファセル、セ
フアクリルＳ−２００、モノＱ（ファルマシア製、商品
名）の各カラムクロマトグラフィーの手段を駆使して精
製し、電気泳動的に単一な酵素標品とする事が出来る。
、セフアクリルＳ−３００．ＤＥＡＥ一セファセル、セ
フアクリルＳ−２００、モノＱ（ファルマシア製、商品
名）の各カラムクロマトグラフィーの手段を駆使して精
製し、電気泳動的に単一な酵素標品とする事が出来る。
つぎにこの各精製段階でえられた酵素液について総蛋白
質量、総活性及び比活性を測定した。その結果を表３に
しめす。総蛋白質量の測定は最終段階を除いてはＬｏｗ
ｒｙ法で、最終段階は２８０ｎｍの吸光度により求めた
。総活性の測定は前述した活性測定法にしたがって行な
った。
質量、総活性及び比活性を測定した。その結果を表３に
しめす。総蛋白質量の測定は最終段階を除いてはＬｏｗ
ｒｙ法で、最終段階は２８０ｎｍの吸光度により求めた
。総活性の測定は前述した活性測定法にしたがって行な
った。
４．
図面簡単な説明
第１図は、本発明酵素の活性とｐＨとの関係を示したグ
ラフであり、第２図は本酵素のｐＨ安定性を示したグラ
ブであり、第３図は本酵素の温度安定性を示したグラフ
である。 表一 表−２ 表−３ 簗ｌ図 鱒３１”ｊｊ Ｍｈ展（・こつ
ラフであり、第２図は本酵素のｐＨ安定性を示したグラ
ブであり、第３図は本酵素の温度安定性を示したグラフ
である。 表一 表−２ 表−３ 簗ｌ図 鱒３１”ｊｊ Ｍｈ展（・こつ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）つぎの理化学的性質を有するアスパラギン酸ラセ
マーゼ （ａ）作用： Ｌ−アスパラギン酸からＤ−アスパラギン酸及びＬ−ア
スパラギン酸を生成するラセミ化反応、ならびにＤ−ア
スパラギン酸からＬ−アスパラギン酸及びＤ−アスパラ
ギン酸を生成するラセミ化反応を触媒する。 （ｂ）基質特異性： ラセミ化反応はアスパラギン酸に特異的に作用し、他の
アミノ酸には殆ど作用しない。 （ｃ）至適ｐＨ： ３７℃の反応でｐＨ８付近。 （ｄ）安定ｐＨ範囲： ４５℃、１時間の処理でｐＨ６．５〜８の範囲で活性の
低下は全く見られない。 （ｅ）熱安定性： ｐＨ７で、５０℃、６０分間の処理で活性の低下は全く
見られない。 （ｆ）分子量： 全分子量約６万（ゲルろ過法） サブユニットの分子量２８，０００（同一サブユニット
の２量体構造） （ｇ）アミノ末端側アミノ酸配列： Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｉ
ｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−
Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ（２
）ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）
属に属するアスパラギン酸ラセマーゼ生産菌を培養し、
培養物からアスパラギン酸ラセマーゼを採取する事を特
徴とするアスパラギン酸ラセマーゼの製造方法。 （３）ストレプトコッカス属に属するアスパラギン酸ラ
セマーゼ生産菌がストレプトコッカス・サーモフィラス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）ＩＡＭ１００６４である特許請求の範囲第２項記載
の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23139589A JP2950865B2 (ja) | 1989-09-08 | 1989-09-08 | 新規アスパラギン酸ラセマーゼ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23139589A JP2950865B2 (ja) | 1989-09-08 | 1989-09-08 | 新規アスパラギン酸ラセマーゼ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0394678A true JPH0394678A (ja) | 1991-04-19 |
| JP2950865B2 JP2950865B2 (ja) | 1999-09-20 |
Family
ID=16922934
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23139589A Expired - Fee Related JP2950865B2 (ja) | 1989-09-08 | 1989-09-08 | 新規アスパラギン酸ラセマーゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2950865B2 (ja) |
-
1989
- 1989-09-08 JP JP23139589A patent/JP2950865B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2950865B2 (ja) | 1999-09-20 |
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